Αφηρημένο

Ιστορικό

microRNA-21 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε μια ποικιλία καρκίνων, όπως του μαστού, του παχέος εντέρου , του πνεύμονα, της κεφαλής και του τραχήλου κ.λπ. Ωστόσο, η ρύθμιση του miR-21 στο νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC), δεν έχει ακόμη μελετηθεί συστηματικά.

Μέθοδοι και Αποτελέσματα

Εμείς μετριέται miR-21 επίπεδα σε 54 ζεύγη των καρκίνων του νεφρού και κανονική συμφωνημένα ιστούς τους με πραγματικού χρόνου PCR. Το επίπεδο έκφρασης του miR-21 συσχετίστηκε με 5 ετής επιβίωση και την παθολογική στάδιο. Λειτουργικές μελέτες έγιναν μετά την αναστολή miR-21 σε κυτταρικές σειρές RCC. Μελετήσαμε

in vitro

και

in vivo

επιδράσεις της χημειοθεραπείας genistein προληπτικό παράγοντα για miR-21 έκφρασης. Σε 48 περιπτώσεις (90%), miR-21 αυξήθηκε. Όλοι οι ασθενείς με χαμηλή έκφραση του miR-21 επέζησαν από 5 χρόνια, ενώ με την υψηλή έκφραση του miR-21, μόνο το 50% επέζησε. Υψηλότερη έκφραση του miR-21 συνδέεται με μια αύξηση στο στάδιο του νεφρικού καρκίνου. Λειτουργικές μελέτες μετά την αναστολή miRNA-21 σε κυτταρικές γραμμές RCC δείχνουν διακοπή κύκλου κυττάρου, επαγωγή απόπτωσης και μειωμένη επεμβατικές και μεταναστευτικές δυνατότητες. ανάλυση κηλίδας Western έδειξε μια αύξηση στην έκφραση της ρ21 και ρ38 ΜΑΡ κινάσης γονίδια και μείωση της κυκλίνης Ε2. Η γενιστεΐνη ανέστειλε την έκφραση του miR-21 σε Α-498 κύτταρα και στους όγκους που σχηματίζονται μετά την έγχυση genistein αντιμετωπίζεται μια-498 κυττάρων σε γυμνά ποντίκια εκτός από την παρεμπόδιση του σχηματισμού όγκου.

Συμπεράσματα

Η τρέχουσα μελέτη δείχνει μια σαφή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης miR-21 και κλινικά χαρακτηριστικά του νεφρικού καρκίνου. Έτσι πιστεύουμε ότι miR-21 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης όγκου και η αναστολή της μπορεί να αποδειχθεί χρήσιμη στον έλεγχο καρκίνων με πάνω ρυθμισμένα miR-21

Παράθεση:. Zaman MS, Shahryari V, Deng G, Thamminana S, Saini S, Majid S, et al. (2012) Up-κανονισμός του microRNA-21 συσχετίζεται με λιγότερο Νεφρού Καρκίνος επιβίωσης. PLoS ONE 7 (2): e31060. doi: 10.1371 /journal.pone.0031060

Συντάκτης: Dean G. Τανγκ, το Πανεπιστήμιο του Τέξας ΜΌ Anderson Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Νοεμ 2011? Αποδεκτές: 1η Ιανουαρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 8 Φεβρουαρίου, 2012 |

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται από την Merit Αναθεώρηση Συνδέσμου Βετεράνων, Πρόγραμμα Συνδέσμου Βετεράνων Βραβείο Έρευνας Ενίσχυση και Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορήγησης RO1CA130860 (με την κύρια ερευνητής, Dr. R. Dahiya). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs είναι μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs που παίζουν σημαντικό ρόλο σε πολλές κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης, πολλαπλασιασμού και απόπτωσης [1]. Δεδομένου ότι οι miRNAs εμπλέκονται σε κρίσιμες κυτταρικές διεργασίες, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι είναι επίσης εμπλέκονται στην παθογένεση διαφόρων ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων εκείνων του νεφρού. έχουν χαρακτηριστικές υπογραφές miRNA για αρκετές επιθηλιακών καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του πνεύμονα, του παγκρέατος, του στομάχου και του νεφρικού καρκίνου, έχουν αναφερθεί [2], [3], [4], [5]. Η ιστολογική στοιχεία δείχνουν ότι υπάρχουν αρκετές παραλλαγές των κακοήθων νεφροκυτταρικό καρκίνωμα,

δηλ.

Σαφείς κυττάρων, θηλώδες, χρωμόφοβο και τη συλλογή καρκινώματα αγωγού [6], [7], [8], [9]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει διαφορική έκφραση miRNA σε αυτές τις παραλλαγές της νεφροκυτταρικό καρκίνωμα [10], [11], [12]. MicroRNA-21 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε μια ποικιλία καρκίνων, όπως του μαστού, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, της κεφαλής και του αυχένα, κ.λπ. Ωστόσο, η ρύθμιση και λειτουργικός ρόλος του miR-21 σε καρκίνο του νεφρού δεν έχει ακόμη μελετηθεί συστηματικά. Σε αυτή τη μελέτη μετρήθηκαν τα επίπεδα miR-21 σε 54 ζεύγη ανθρώπινου νεφρού καρκίνων και φυσιολογικών ιστών συμφωνημένα τους με πραγματικού χρόνου PCR. Το επίπεδο έκφρασης του miR-21 συσχετίστηκε με 5 ετής επιβίωση και το στάδιο των ασθενών. Για να προσδιοριστεί ο ρόλος του miR-21 σε νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC) λειτουργικές δοκιμασίες όπως του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, εισβολή, και η μετανάστευση, έγιναν μετά να χτυπήσει κάτω miR-21 έκφραση σε ένα-498 κύτταρα. Ανάλυση Λογισμικό και ανάλυση της σειράς PCR έδειξε μια αύξηση στην έκφραση της ρ21 και ρ38 ΜΑΡ κινασών μετά την αναστολή της miR-21 και μειωμένη έκφραση των κυκλινών και των εξαρτώμενων από κυκλίνη κινασών. Τα αποτελέσματα αυτά επικυρώθηκαν με ανάλυση Western. Επιπλέον, αξιολογήθηκε επίσης το αποτέλεσμα ενός διαιτητικού παράγοντα χημειοπροφύλαξη, γενιστεΐνη (ένα προϊόν σόγιας), σχετικά με την έκφραση του miR-21 σε όγκους ποντίκια. Η γενιστεΐνη μείωσε την έκφραση του miR-21 σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα που κατεργάζονται genistein σύγκριση με τους ελέγχους οχήματος. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που δείχνει τη συσχέτιση της έκφρασης miR-21 με κλινικές παραμέτρους και είναι λειτουργικό ρόλο στην RCC. Εν κατακλείδι, up-ρυθμίζεται miR-21 στον καρκίνο των νεφρών μπορεί να είναι ένας καλός δείκτης όγκου για τη διάγνωση του καρκίνου του νεφρού.

Αποτελέσματα

miR-21 είναι μέχρι ρυθμιζόμενη σε δείγματα νεφρικό ιστό καρκινώματος και καρκίνο του νεφρού κυτταρικές σειρές

Για να κατανοήσουμε την κλινική σημασία του miR-21 σε καρκίνο του νεφρού μετρήσαμε τα επίπεδα miR-21 σε 54 ζεύγη των καρκίνων του νεφρού και συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς τους με PCR πραγματικού χρόνου. Σε 48 περιπτώσεις (89%), miR-21 βρέθηκε να είναι αυξημένη (T /N [Tumor /Normal] ήταν μεγαλύτερη από 1,2). Η έκφραση του miR-21 μετρήθηκε επίσης σε καρκίνο του νεφρού κυτταρικές σειρές, Α-498, Caki-1, Caki-2 και φυσιολογικά κύτταρα ΗΚ-2. miR-21 έκφρασης σε Α-498 κύτταρα ήταν περίπου 7,3 × εκείνη των κυττάρων HK-2, ενώ εκείνη του Caki-1 ήταν 1.6 ×, και Caki-2, 3 ×.

Συσχέτιση του miR-21 έκφρασης με στάδιο και την επιβίωση σε νεφρικό καρκίνο

Το επίπεδο έκφρασης του miR-21 συσχετίζεται με 5 ετής επιβίωση και το στάδιο των ασθενών. Για τους ασθενείς με χαμηλά miR-21 έκφρασης (Σχήμα S1), όλα επιβίωσαν 5 χρόνια μετά την επέμβαση, ενώ για τα άτομα με υψηλή miR-21 έκφρασης (Σχήμα S2), μόνο το 50% επιβίωσαν (Εικόνα 1). Η καμπύλη επιβίωσης με βάση τον αριθμό των ασθενών (36) για τις οποίες είχαμε πληροφορίες επιβίωση έξω από ένα σύνολο 54 ασθενών. Σε ομάδες των ασθενών που έχουν χαμηλή έκφραση του miR-21 (T /N & lt? 1.2), υψηλή έκφραση (Τ /Ν = 1,2 – 10) και πολύ υψηλή έκφραση (Τ /Ν & gt? 10), το ποσοστό εκείνων που βρίσκονται στο αρχικό στάδιο (Στάδιο Ι) μειώθηκαν κατά 80%, 51,5% και 37,5%, αντίστοιχα. Αυτό σημαίνει ότι η αυξημένη έκφραση του miR-21 συσχετίζεται με αυξημένο στάδιο του καρκίνου του νεφρού. Η πληροφορία αυτή βασίζεται στον αριθμό των ασθενών για τους οποίους είχαμε την πληροφορία στάδιο (46 από τις 54 ασθενείς). Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ του βαθμού των όγκων και των επιπέδων miRNA-21.

Η

Η έκφραση του miR-21 σε διάφορες μορφές καρκίνου των νεφρών

Η έκφραση του miR-21 βαθμολογήθηκε είτε ως χαμηλή (T /N & lt? 1.2), υψηλή (Τ /Ν = 1,2 – 10) και πολύ υψηλή (T /N & gt? 10). Οι διάφορες μορφές καρκίνου στα οποία αναλύθηκε η έκφραση του miR-21 ήταν σαφείς κυτταρικό καρκίνωμα, θηλώδες καρκίνωμα και σωληνοειδή καρκίνωμα. Από το σύνολο των 54 δειγμάτων, 45 δείγματα ήταν σαφές καρκίνωμα, 8 ήταν θηλώδες και 1 ήταν σωληνοειδή καρκίνωμα. Σε τόσο σαφές κελί (71,1%) και θηλώδες καρκίνωμα (75%), η πλειοψηφία των δειγμάτων που είχαν υψηλή έκφραση του miR-21 (T /N = 1,2 – 10). 17,7% των σαφές καρκίνωμα είχαν πολύ υψηλή έκφραση. Το μόνο δείγμα καρκίνωμα σωληνοειδή νεφρικών κυττάρων είχαν πολύ υψηλή έκφραση του miR-21.

Λειτουργική ρόλο του miR-21 σε A-498 κύτταρα

Για να διαλευκανθεί ο λειτουργικός ρόλος του miR-21 σε καρκίνο του νεφρού εμείς ανέστειλε την έκφραση του miR-21 σε Α-498 νεφρικά καρκινικά κύτταρα με ένα εμπορικά διαθέσιμο αναστολέα miR-21. Αντι-miR-Αρνητικός έλεγχος # 1 χρησιμοποιήθηκε ως το πρότυπο αρνητικού ελέγχου για αυτά τα πειράματα. Το επίπεδο miR-21 μειώθηκε κατά περισσότερο από 99%, σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο (Σχήμα S3). Στην περίπτωση των αντι miR-21-διαμόλυνση σε Caki-2 κύτταρα στο ίδιο επίπεδο μείωσης του miR-21 έκφραση παρατηρήθηκε (Σχήμα S4).

Επίδραση επί Α-498 κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης.

Οι επιδράσεις της αναστολής miR-21 επί του κυτταρικού κύκλου και την απόπτωση αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Το κυτταρικό κύκλο έδειξαν σημαντική αύξηση (9,1%) στη φάση G0 /G1, με ταυτόχρονη μείωση (6,8%) στην G2 /M φάση, υποδεικνύοντας ότι η μείωση του miR-21 έκφραση σε ένα-498 κύτταρα ανέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη και προκάλεσε G0 /G1 σύλληψης (Σχήμα 2α). δοκιμασία απόπτωση χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής έδειξε μια οριακή αύξηση του αριθμού των συνολικών αποπτωτικών κυττάρων (πρώιμη αποπτωτική συν αποπτωτικών) (5,17%) σε ΜΙΚ-21 αντι-miRNA αναστολέας επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο (1,79%) και ψευδο ( 2,49%) (Σχήμα 2β). Σε περίπτωση Caki-2 κύτταρα αναστολή της miR-21 είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική αύξηση στην απόπτωση χωρίς αλλαγή στη κυτταρικού κύκλου (τα δεδομένα δεν φαίνονται)

(α) Επίδραση επί του κυτταρικού κύκλου:. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της κυτταρικού κύκλου παρουσίασαν σημαντική αύξηση σε G0 /G1 φάση (9,1%), με ταυτόχρονη μείωση της G2 /Μ φάσης (6,8%), υποδεικνύοντας ότι η αναγκαστική μείωση του miR-21 έκφραση σε ένα-498 κύτταρα θα μπορούσε να αναστείλει την κυτταρική την ανάπτυξη και την αιτία G0 /G1 σύλληψη (τιμή p 0,010). (Β) Επίδραση επί της απόπτωσης: Προσδιορισμός απόπτωσης έδειξαν μία οριακή αύξηση του αριθμού των συνολικών αποπτωτικών κυττάρων (5.17%) σε ΜΙΚ-21 αντι-miRNA αναστολέας επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο (1,79%) και ψευδο (2,49% ) (τιμή p 0,017).

η

Επίδραση στην κυτταρική εισβολή και τη μετανάστευση ιδιότητες.

για να προσδιορίσετε αν το miR-21 επηρεάζει τη νεφρική μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή σε cytoselect 24 και τη μετανάστευση των κυττάρων και σετ εισβολή χρησιμοποιήθηκε. Α-498 κύτταρα επιμολύνθηκαν με αναστολέα αντι-miR-21 και αντι-miR-αρνητικό έλεγχο. Both εισβολή Α-498 κυττάρων και μετανάστευση μειώθηκαν σε σύγκριση με αρνητικό έλεγχο. Λιγότερο απορρόφηση παρατηρήθηκε στα 560 nm με-miR-21 αντι επιμολυσμένα κύτταρα από τον αρνητικό μάρτυρα τόσο στην εισβολή και προσδιορισμούς μετανάστευσης (σχήματα 3α και 3β). Η αναστολή της έκφρασης miR-21 είχαν μια πιο έντονη επίδραση επί εισβολή σε σύγκριση με τη μετανάστευση, (μείωση 50% έναντι 25%). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στην περίπτωση των κυττάρων Caki-2 και στα δύο δοκιμασίες εισβολή και τη μετανάστευση (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα)

(α) Επίδραση επί κυττάρων εισβολή:. Επεμβατική ιδιότητες των A-498 κύτταρα μειώθηκαν μετά την αναστολή του miR-21 σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα, Βιτρώ Α-498 κύτταρα (μεγέθυνσης-40 ×)? Απορρόφηση στα 560 nm (τιμή p 0,026). (Β) Επίδραση στην κυτταρική μετανάστευση: μεταναστευτικών ιδιοτήτων των A-498 κύτταρα επίσης μειώθηκαν μετά την αναστολή της miR-21 σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο, βάφονται Α-498 κύτταρα (Μεγέθυνση-40 ×)? Απορρόφηση στα 560 nm (τιμή p 0,016).

Η

miR-21 αυξάνει την έκφραση των εξαρτώμενων από κυκλίνη CDKN1A αναστολέα κινάσης (p21).

Για να δείτε το αποτέλεσμα του miR-21 έκφρασης σε διαφορετικά γονίδια που εμπλέκονται στον κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση χρησιμοποιήσαμε συστοιχίες PCR. Από τη στιγμή που είδε μια σημαντική επίδραση επί του κυτταρικού κύκλου με αναστολή των miR-21 σε A-498 κύτταρα, που για πρώτη φορά αποφάσισε να χρησιμοποιήσει συστοιχίες PCR που σχετίζονται με τα γονίδια του κυτταρικού κύκλου. συστοιχίες PCR βασίζεται κύκλου κυττάρων έδειξε μεταβολές στην έκφραση ενός αριθμού γονιδίων. Ένα από τα γονίδια που ρυθμίζονται επάνω στη συστοιχία PCR μετά την αναστολή της miR-21 ήταν η εξαρτώμενη από κυκλίνη αναστολέα κινάσης, CDKN1A επίσης γνωστή ως Cip1 ή ρ21. Άλλες συστοιχίες PCR έδειξε μια μεταβολή στην έκφραση του γονιδίου της κινάσης ΜΑΡ ρ38. Στη συνέχεια, διαπιστώσαμε αυτό το αποτέλεσμα χρησιμοποιώντας ΜΑΡ κινάσης συστοιχίες PCR με βάση και λαμβάνεται το ίδιο αποτέλεσμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αμφότερα τα αποτελέσματα επικυρώθηκαν με στύπωμα Western (Σχήμα 4). Western blotting πειράματα δείχνουν σαφώς επάνω ρύθμιση των δύο p21 και p38 ΜΑΡ κινάση γονίδια με miR-21 αναστολή σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο. Ελέγξαμε επίσης την έκφραση άλλων γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση και βρέθηκε αρνητική ρύθμιση της κυκλίνης Ε2. Εξετάσαμε επίσης mRNA έκφραση των εξαρτώμενων από κυκλίνη κινασών, CDK2, CDK4, CDKE1 και CDKE2 και βρέθηκε έκφραση τους μειώνεται σημαντικά μετά από αναστολή της miR-21 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε πειράματα κηλίδος Western ελέγξαμε CDK4, Ε1 και Ε2, όπως CDK2 είναι ήδη γνωστό ότι επηρεάζεται από το γονίδιο p21 [13], [14]. Παρατηρήσαμε μια αλλαγή στην έκφραση πρωτεΐνης για μόνο CDKE2.

Η έκφραση του p21, ρ38ΜΑΡ κινάσης και κυκλίνης Ε2 μετά την αναστολή της miR-21 σε Α-498 κύτταρα, σε σύγκριση με αρνητικό έλεγχο. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας ομαλοποίηση. p21 και p38 MAP κινάσης μέχρι ρυθμίζεται, ενώ η έκφραση της κυκλίνης Ε2 βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα κάτω.

Η

In vitro

και

In vivo

επιπτώσεις της genistein για νεφρικά καρκινικά κύτταρα

γενιστεΐνη μειώνει την έκφραση του miR-21 σε όγκους ποντικού.

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως ελέγξαμε την επίδραση ενός χημειοπροφύλαξη παράγοντα, γενιστεΐνη (ένα προϊόν σόγιας), σχετικά με την έκφραση του miR-21 στο γυμνό όγκους ποντικών. Πρώτον Α-498 νεφρικά καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 25 μΜ γενιστεΐνης για 4 ημέρες και μετά την εκχύλιση του RNA έκφραση miR-21 ελέγχθηκε. Η έκφραση παρατηρήθηκε να μειωθεί κατά 30% το genistein κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα όνες (Σχήμα 5α). Για να δείτε το αποτέλεσμα της αγωγής γενιστεΐνης σε όγκους ποντικών και miR-21 έκφραση κυττάρων Α-498 και πάλι σε επεξεργασία με γενιστεΐνη (25 μΜ) και μετά από 96 ώρες θεραπείας ενέθηκαν υποδόρια σε γυμνά ποντίκια. Χρησιμοποιήθηκαν δύο ομάδες των τριών ποντικών η κάθε μία. Σε όγκων ελέγχου DMSO οι τρεις ποντικοί ανέπτυξαν σημαντικά μεγάλου μεγέθους όγκων, περίπου 800 mm

3 κατ ‘όγκο (Σχήμα 5b, αριστερό πλαίσιο), ενώ με τα κύτταρα που κατεργάστηκαν genistein ένα μικρό όγκο μεγέθους παρατηρήθηκε σε ένα από τα τρία ποντίκια, περίπου 25 mm

3 σε όγκο (Σχήμα 5β δεξιά πάνελ,). Στις άλλες δύο ποντίκια ένας από αυτούς είχε ένα πολύ μικρό όγκο στο σημείο της ένεσης (Σχήμα 5β δεξιά πλευρά), ενώ η τρίτη ποντίκι δεν είχε όγκο. Μετά το σχηματισμό ψηλαφητών όγκων με κύτταρα ελέγχου, μπορούμε εκτομή τους όγκους και μέτρησαν την έκφραση του miR-21 μετά την ομογενοποίηση όγκου με Qiazol και εκχύλιση RNA. Η έκφραση του miR-21 βρέθηκε να είναι μειωμένη κατά -40% σε επεξεργασμένα δείγματα genistein σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα αυτά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(α) Επίδραση της γενιστεΐνης (25 μΜ) επί της έκφρασης του miR-21 σε Α-498 κύτταρα: έκφραση miR-21 βρέθηκε να είναι μειωμένη κατά περίπου 30% σε genistein αντιμετωπίζεται μια-498 κύτταρα σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. (Β)

In vivo

επίδραση της γενιστεΐνης στο μέγεθος του όγκου σε γυμνά ποντίκια:. Γενιστεΐνη ήταν σε θέση να μειώσει σημαντικά το σχηματισμό όγκων (μαύρα βέλη, δεξιά πλευρά)

Η

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη παρέχει αποδεικτικά στοιχεία ότι μέχρι ρύθμιση του miR-21 σε καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων σχετίζεται με την μείωση της επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο του νεφρού. Η έκφραση του miR-21 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του νεφρού και δείγματα ιστού καρκίνου του νεφρού του ανθρώπου βρέθηκε να είναι υψηλότερη σε σύγκριση με τα φυσιολογικά, η οποία είναι σύμφωνη με προηγούμενες μελέτες επί νεφροκυτταρικό καρκίνωμα και επίσης άλλους τύπους καρκίνου [15]. Η μελέτη μας δείχνει για πρώτη φορά ότι οι ασθενείς με υψηλότερη έκφραση του miR-21 σε καρκίνο του νεφρού έχουν μια μικρότερη πιθανότητα επιβίωσης. Επίσης, χαμηλότερη έκφραση του miR-21 οδηγεί σε ένα υψηλότερο ποσοστό επιβίωσης. Έχουμε συσχετίζεται επίσης την έκφραση του miR-21 με το στάδιο του καρκίνου για εκείνους τους ασθενείς που είχαμε πλήρη στοιχεία σχετικά με το στάδιο (34/39). Η ανάλυσή μας έδειξε ότι πολύ υψηλή έκφραση του miR-21 σε δείγματα ασθενών οδήγησε σε αύξηση στάδιο της νόσου. Για να διευκρινιστεί η σημασία του miR-21 σε ασθενείς με νεφρική λειτουργικές δοκιμασίες καρκίνωμα πραγματοποιήθηκαν. δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας έδειξαν μια αντι πολλαπλασιαστική επίδραση στο A-498 κύτταρα μετά την αναστολή του miR-21. Η πιο σημαντική μεταβολή παρατηρήθηκε στον κυτταρικό κύκλο, όπου η φάση G0 /G1 αυξήθηκε δραματικά (9,1%) με ταυτόχρονη μείωση στην G2 /M φάση (6,8%). Αυτό μας οδήγησε στην αναζήτηση για πιθανά γονίδια του κυτταρικού κύκλου επηρεάζεται από την αναστολή του miR-21 σε A-498 κύτταρα. του κυτταρικού κύκλου πειραμάτων σειρά PCR έδειξε ότι cDKN1A (p21) ήταν μέχρι ρυθμίζονται μετά την αναστολή των miR-21 σε A-498 κύτταρα. Προηγούμενες μελέτες χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες δείχνουν ότι η έκφραση του p21 συσχετίζεται θετικά με την καταστολή των γονιδίων που είναι σημαντικά για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [16]. ρ21 ανταποκρίνεται σε μια ποικιλία ερεθισμάτων που προωθεί δραστηριότητες ανασταλτική της ανάπτυξης ανάλογα με την ικανότητά του να αναστέλλει τη δραστικότητα της εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάσης, CDK2. Πολυάριθμες μελέτες έχουν αναφέρει ότι το γονίδιο p21 έχει επιπλέον ρόλους στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου που είναι ανεξάρτητες της CDK2. Μερικά παραδείγματα είναι η σύνδεσή της με το μεταγραφικό παράγοντα E2F1 και η καταστολή της μεταγραφικής δραστικότητας του [17]. Επιπλέον, p21 καταστέλλει επίσης παράγοντες μεταγραφής STAT3 [18] και MYC [19]. Επιπλέον ρ21 προωθεί επίσης την αναστολή του κυτταρικού κύκλου με τη μεσολάβηση του ρ53-εξαρτώμενη καταστολή των γονιδίων όπως CDC25C, CDC2, CCNB1 και BIRC5 επίσης γνωστή ως survivin [20], [21], [22]. Αν και ρ21 καταστέλλει τα γονίδια που εμπλέκονται στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, αναστέλλει επίσης την απόπτωση [23]. Όταν τα κύτταρα αντιμετωπίζουν γενοτοξική προσβολές ή παράγοντες μικροσωληνίσκων-αποσταθεροποίησης, p21 τους προστατεύει από την απόπτωση ως ένα ενεργό κυτταρικού κύκλου απαιτείται για την ανίχνευση αυτών των παραγόντων και να ενεργοποιούν την απόπτωση. Αυτό μπορεί να εξηγήσει την όχι και τόσο δραματική αύξηση του αριθμού των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση μετά την αναστολή της miR-21 σε Α-498 κύτταρα σε σύγκριση με τις αλλαγές στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σχήμα 2β. Ωστόσο, η επίδραση της ρ21 αντισταθμίζεται από διάφορους μηχανισμούς που περιλαμβάνει τη μετάβαση από διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην απόπτωση με την επιλεκτική μεταγραφική καταστολή του p21, η επιλεκτική ενεργοποίηση των προ-αποπτωτικών γονιδίων ή ελαττώματα στην έκφραση p21 κατάντη της p53 [24], [25 ], [26]. Σε ορισμένες περιπτώσεις p21 προωθεί επίσης την απόπτωση μέσω και των δύο ρ53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητους μηχανισμούς κάτω από κυτταρικό στρες αλλά ο μηχανισμός δράσης παραμένει άγνωστος [27]. Έτσι προσπαθήσαμε να δούμε αν p21 ήταν άμεσο στόχο του miR-21 χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία 3 ‘λουσιφεράσης, αλλά δεν μπορούσε να βρει μια άμεση αλληλεπίδραση. Έτσι ελέγξαμε την πρωτεΐνη έκφραση των εξαρτώμενων διαφορετικές κυκλίνη κινασών CDK4, Ε1 και Ε2 και θα μπορούσε να βρει τη διαφορά σε μόλις cyclinE2 (Σχήμα 4).

genistein, μία από τις κύριες ισοφλαβόνες σόγιας, έχει ένα ευρύ φάσμα των chemopreventive ενεργειών. Οι αντικαρκινικές δράσεις της genistein έχουν αποδοθεί σε διάφορες οδούς σηματοδότησης και οι μηχανισμοί που επηρεάζουν την διακοπή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, εισβολή, μετάσταση και την αγγειογένεση, ιδιότητες που θα μπορούσαν δυνητικά να εμποδίσει την έναρξη και την εξέλιξη [28] όγκου [29]. Η γενιστεΐνη (40,5,7- trihydroxyflavone) είναι άφθονη σε προϊόντα σόγιας και έχει ταυτοποιηθεί ως ένας αναστολέας των κινασών τυροσίνης πρωτείνης και έτσι μπορεί να παίξει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των κυττάρων και την απόπτωση [30], [31]. Εχει αναφερθεί ότι έχει οιστρογονικές ιδιότητες και αντι-νεοπλασματική δραστικότητα σε πολλαπλούς τύπους όγκου [32]. Έχει επίσης βρεθεί ότι έχει επιγενετικές επιδράσεις στον προστάτη ποντικού [33]. Σε μια προηγούμενη μελέτη Hillman

et. al.

έχουν δείξει ότι ο συνδυασμός της γενιστεΐνης με πρωτοπαθή πράξεις ακτινοβολία όγκου περισσότερο αποτελεσματικά ως θεραπευτική προσέγγιση, σε καθιερωμένους όγκους νεφρού, λόγω της ανάπτυξης του όγκου αναστέλλεται σε αμφότερες τις πρωτογενείς και μεταστατικές θέσεις. Σε genistein μελέτη τους και μόνο έδειξαν μια τάση να τονωθεί η ανάπτυξη του πρωτογενούς όγκου των νεφρών και την αύξηση της μετάστασης [34]. Στη μελέτη μας, παίρνουμε μια απλούστερη προσέγγιση και έχουν δείξει ότι η Α-498 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με genistein μόνο σχηματίζονται Μείωσε τους όγκους σε σύγκριση με τους ελέγχους οχημάτων.

miRNAs ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων με τη στόχευση γονιδίων που περιέχουν συμπληρωματικές ακολουθίες mRNA [35]. Πολλές κυτταρικές οδούς που πλήττονται από την ρυθμιστική λειτουργία των miRNAs και το πιο σημαντικό από αυτά τα μονοπάτια ελέγχουν αναπτυξιακές και ογκογόνων διαδικασιών [36]. miR-21 ήταν ένα από τα πρώτα miRNAs ανιχνεύεται στο ανθρώπινο γονιδίωμα [37] και έχει βρεθεί ότι υπερεκφράζεται σε μία ποικιλία τύπων καρκίνου [38]. Υπάρχουν μερικές μελέτες που τεκμηριώνουν τη λειτουργική σημασία των miR-21, δείχνοντας τη σχέση αιτίου και αιτιατού μεταξύ miR-21 και νεοπλασματικό μετασχηματισμό. Αυτές οι μελέτες έχουν γίνει σχετικά με γλοιοβλάστωμα [39], του καρκίνου του μαστού [40], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [41], ορθοκολικό καρκίνο [42] και σε κύτταρα μυελώματος [43]. Μια πρόσφατη έκθεση σχετικά με το ρόλο του miR-21 σε καρκίνο του νεφρού δείχνει ότι ρυθμίζει την απόπτωση μέσω της στόχευσης πολλά γονίδια από τον Zhang

et.al

[44]. Ωστόσο, μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν δεδομένα που αφορούν την κλινική συσχέτιση της έκφρασης miR-21 με το στάδιο και την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του νεφρού. Επιπλέον, δείχνουμε την χημειο προληπτικό ρόλο της genistein στην αναστολή του σχηματισμού όγκων

in vivo

με τη μείωση του miR-21 έκφραση σε όγκους ποντικών. Εν κατακλείδι αυτή είναι η πρώτη έκθεση που να συσχετίζει miR-21 επίπεδα με την επιβίωση και το στάδιο των ασθενών με καρκίνο των νεφρών και τεκμηριώνει την ογκογόνο ρόλο του miR-21 μέσα από διάφορα κυτταρικά μονοπάτια.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση ηθικής

φορμόλη-σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) νεφρική δείγματα καρκίνου ελήφθησαν από τους Σαν Φρανσίσκο Υποθέσεων Βετεράνων (VA) Ιατρικό Κέντρο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή UCSF για τα Ανθρώπινα Ερευνών (αριθμός έγκρισης: H9058-35751-01). Όλα φροντίδα των ζώων ήταν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του Ιατρικού Κέντρου του Σαν Φρανσίσκο Υποθέσεων Βετεράνων και η μελέτη εγκρίθηκε από το Σαν Φρανσίσκο VA IACUC (αριθμός πρωτοκόλλου: 08-003-01).

Οι κυτταρικές σειρές και κυτταρικής καλλιέργειας

Ανθρώπινο νεφρικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών Α-498, Caki-1, Caki-2, και φυσιολογική νεφρική κυτταρική σειρά HK-2 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Οι κυτταρικές σειρές ελέγχθηκαν με ATCC μέσω DNA (STR) προφίλ. Κανονική νεφρικά κύτταρα ΗΚ-2 καλλιεργήθηκαν ως μια μονοστοιβάδα σε κερατινοκυττάρων ορού Ελεύθερη Medium (Κ-SFM) συμπληρωμένο με 0.05 mg /ml εκχυλίσματος υποφύσεως βοοειδών (ΒΡΕ), 5 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) (Life Technologies /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και 10% ορό εμβρύου μόσχου (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, USA), 50 mg /ml πενικιλλίνη και 50 mg /ml στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Η νεφρική καρκινική κυτταρική σειρά Α-498 καλλιεργήθηκε ως μονοστιβάδα σε Ελάχιστο Απαραίτητο Μέσο Eagle, (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, USA). Caki-1 και Caki-2 καλλιεργήθηκαν με τον ίδιο τρόπο σε McCoy’s5A μέσα μαζικής ενημέρωσης (UCSF Cell Culture Διευκόλυνσης, San Francisco, CA, USA). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε έναν επωαστήρα με υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO2 στους 37 ° C. Υποσυρρέουσες 498cells Α-(60-70% συρροή) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γενιστεΐνη (25 μΜ). Η γενιστεΐνη (Sigma-Aldrich Corp., St Louis, ΜΟ, USA) διαλύθηκε σε DMSO, και κύτταρα επεξεργασμένα μόνο με φορέα (DMSO) χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Φρέσκο ​​genistein χορηγήθηκε καθημερινά μαζί με μια αλλαγή του μέσου, και τα κύτταρα επωάστηκαν για 4 ημέρες.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

πρώτου κλώνου cDNA παρασκευάστηκε από ολικό RNA (1 μg) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα αντίστροφης μεταγραφής (Promega, Madison, WI, USA). Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ RNeasy μίνι από την Qiagen (Valencia, CA, USA). Για πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), συμπληρωματικό DNA ενισχύθηκε με απογραφεισών Gene Assay Προϊόντα που περιέχουν δύο γονίδιο-ειδικούς εκκινητές και έναν TaqMan MGB ανιχνευτή (6-FAM dye-επισημασμένο) χρησιμοποιώντας ένα TaqMan καθολική Fast PCR Master Mix σε 7.500 γρήγορη Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Θερμικές συνθήκες ποδηλασίας περιλαμβάνονται 95 ° C για 20 δευτερόλεπτα (s), 40 κύκλοι των 95 ° C για 3 s και 60 ° C για 30 s, σύμφωνα με την TaqMan Fast πρωτόκολλο καθολική PCR. GAPDH χρησιμοποιήθηκε σαν ένα ενδογενές ελέγχου. Για τα πειράματα σε πραγματικό χρόνο miRNA ο κλώνος cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Applied Biosystems Taqman microRNA Reverse Transcription, με 200 ng του συνολικού εξαχθέντος miRNA. RNU48 χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενή έλεγχο. Για πραγματικού χρόνου PCR πειράματα, όπου miRNAs απομονώθηκαν από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) νεφρική δείγματα, let7-f χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενή έλεγχο. Σύνολο miRNA εξήχθη από δείγματα FFPE χρησιμοποιώντας ένα κιτ miRNA FFPE από Qiagen.

συστοιχίες PCR μέσω πραγματικού χρόνου PCR

Για να μελετήσει το προφίλ έκφρασης των γονιδίων που εμπλέκονται σε διάφορες κυτταρικές οδούς, διαδρομή-συγκεκριμένες συστοιχίες PCR (array κυτταρικού κύκλου, απόπτωση συστοιχία, συστοιχία ΜΑΡ κινάσης, SABioscience) χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το λογισμικό του κατασκευαστή.

μικρο ανατομή της νεφρικής καρκινικούς ιστούς και εκχύλιση RNA από FFPE δείγματα ανθρώπινου νεφρικού όγκου

Δίπλα φυσιολογικών και καρκινικών νεφρικούς ιστούς ελήφθησαν από 39 αντιπροσωπευτικές μπλοκ FFPE ιστούς του ριζική νεφρεκτομή δείγματα από το Τμήμα Παθολογίας των υποθέσεων παλαιμάχων (VA) Ιατρικό Κέντρο του Σαν Φρανσίσκο. Τα μπλοκ ήταν από ασθενείς με καρκίνο του νεφρού που χειρουργήθηκαν στο Ιατρικό Κέντρο VA μεταξύ 1980-2009. Ενότητες (4 μm) των μπλοκ ετοιμάστηκαν, H & amp? Ε βάφονται, και διαφάνειες εξετάστηκαν από μια σκάφους επικυρωμένο παθολόγος για να σηματοδοτήσει τις κανονικές και του καρκίνου περιοχές. Στη συνέχεια, 12 μm πλάκες κατασκευασμένες από τα μπλοκ και μικροδιατομής διεξήχθη χρησιμοποιώντας το επισημαίνονται Η &? Ε χρώση διαφάνειες ως πρότυπο. εξόρυξη microRNA έγινε χρησιμοποιώντας ένα κιτ εκχύλισης Qiagen FFPE miRNA. Τα επίπεδα του miR-21 αξιολογήθηκαν με την δοκιμασία Taqman miR όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά PCR, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης miR-21 σε καρκινικά περιοχές κανονικοποιήθηκαν σε γειτονικό φυσιολογικό αντίστοιχά τους.

διαμόλυνσης κυττάρων

Α498 και Caki-2 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με έναν αναστολέα του miRNA- 21 ή αντι-miR αρνητικός έλεγχος # 1 (από Ambion, Austin, ΤΧ, USA), χρησιμοποιώντας Χ-tremeGENE siRNA αντιδραστήριο επιμόλυνσης (Roche Diagnostics Indianapolis, ΙΝ, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων (Nunc, Roskilde, Denmark) 24 ώρες πριν την επιμόλυνση και επιμολύνθηκαν παροδικά σε συρροή 40-50%. Mock επιμόλυνση, με το αντιδραστήριο διαμόλυνσης, χρησιμοποιήθηκε επίσης ως μάρτυρας. Το μείγμα μετεμβολιασμού διαλύθηκε σε Ορίί-ΜΕΜ μέσου χωρίς ορό (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, USA) και κατά το χρόνο της επιμόλυνση τα κύτταρα σπάρθηκαν σε Minimum Essential Medium (UCSF διευκόλυνση κυτταρικής καλλιέργειας) Eagle, το με 10% FBS (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, USA) και χωρίς αντιβιοτικά. Την επόμενη ημέρα το μέσο άλλαξε σε Ελάχιστο Απαραίτητο Μέσο Eagle που περιέχει τόσο FBS και 1% αντιβιοτικό (πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη, 100 ×, UCSF Cell Culture Facility). Τα κύτταρα σβωλοποιήθηκαν, μετά από 72 ώρες επιμόλυνσης για κυτταρομετρία ροής, RNA και πρωτεϊνικής εκχύλισης.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέστηκε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με ψυχρό PBS, UCSF Cell Culture Facility, και επαναιωρήθηκαν στο πυρηνική χρώση 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Χρωματισμένα κύτταρα αναλύθηκαν αμέσως με ένα κυτταρόμετρο ροής (Cell Lab Quanta SC? Beckman Coulter).

Προσδιορισμός απόπτωσης

Για την απόπτωση, τα κύτταρα στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση ήταν διπλή χρώση με την χρωστική βιωσιμότητας 7 -αμινο-ακτινομυκίνη D και αννεξίνης V-FITC χρησιμοποιώντας ένα αννεξίνης V-FITC kit /7-αμινο-ακτινομυκίνη D (Beckman Coulter) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Βιτρώ κύτταρα αναλύθηκαν αμέσως με κυτταρομετρία ροής (Cell Lab Quanta SC? Beckman Coulter).

Μετανάστευση και την εισβολή δοκιμασίες

Ένα cytoselect μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή κιτ προσδιορισμού 24 φρεατίων (Cell Biolabs, Inc ., San Diego, CA) χρησιμοποιήθηκε για δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολή στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (8 μm, Χρωματομετρική μορφή) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

ανάλυση Western

ολόκληρου κυττάρου εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό δοκιμασίας ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA? Thermo Scientific, Rockford, IL, USA? 50 mmol λ-1 Tris (ρΗ 8.0), 150 mmol Γ1 NaCl, 0.5% δεοξυχολικό, 0.1% SDS και 1.0% ΝΡ-40) που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Βασιλεία, Ελβετία). δοκιμασίες πρωτεΐνης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας BCA κιτ δοκιμασίας Πρωτεΐνης (Pierce /Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συνολική πρωτεΐνη (40 μg) υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε 12% πηκτώματα SDS-PAGE, κηλίδωση Western και διεξήχθη με τη χρήση τυποποιημένων πρωτοκόλλων και ανιχνεύθηκαν με χημειοφωταύγεια. Όλα τα αντισώματα, η οποία περιελάμβανε ρ21 (αρ. Κατ. 2552), ρ38 MAPkinase (αρ. Κατ. 9212) και cyclinE2 (αρ. Κατ. 4132) αγοράστηκαν από την Cell Signaling (Danvers, ΜΑ, USA), ενώ GAPDH (cat. αρ. sc-32233) ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

θεραπεία γενιστεΐνη του Α-498 κύτταρα και υποδόρια ένεση σε γυμνά ποντίκια

Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, το Α -498 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 25 μΜ γενιστεΐνης για 96 ώρες. DMSO (όχημα) κατεργασμένων κυττάρων χρησίμευσε ως μάρτυρας. Μετά από 96 ώρες τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν και περίπου 2 εκατομμύρια κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως (100 μΙ) στη δεξιά πλευρά γυμνών ποντικών (4 έως 5 εβδομάδων? Charles River Laboratories). Δύο ομάδες ποντικών, με τρία ποντίκια η κάθε μία, χρησιμοποιήθηκαν για αυτό το πείραμα. Ένα σύνολο αντιπροσώπευαν το όχημα (DMSO) έλεγχοι και τα άλλα κύτταρα αντιμετωπίζονται genistein. Οι όγκοι από τον έλεγχο και κύτταρα επεξεργασμένα genistein αποκόπηκαν μετά από 8 εβδομάδες, όταν οι DMSO αγωγή ποντίκια μάρτυρες ανέπτυξαν όγκους περίπου 800 mm

3 κατ ‘όγκο (μήκος-16 mm, πλάτος 10 mm). Ολικό RNA εκχυλίστηκε με ομογενοποίηση των όγκων σε Qiazol και εκχύλιση RNA χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Qiagen). Έκφραση του miR-21 μετρήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου.

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση StatView έκδοση 5.0 για Windows. έλεγχος τ χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις διαφορετικές ομάδες. p-τιμές των & lt? 0,05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.. επίπεδα

miR-21 σε ασθενείς με χαμηλή έκφραση (& lt? 1.2): Χαμηλά επίπεδα miR-21 σε ασθενείς με 100% επιβίωση

doi: 10.1371 /journal.pone.0031060.s001

(ΔΕΘ. )

Εικόνα S2.

miR-21 επίπεδα σε ασθενείς που έχουν υψηλή έκφραση (& gt? 1.2): Υψηλά επίπεδα miR-21 σε ασθενείς με 50% επιβίωση

doi: 10.1371 /journal.pone.0031060.s002

(ΔΕΘ. )

Εικόνα S3.

επίπεδα έκφρασης του miR-21 μετά knockdown σε Α-498 κύτταρα: Το επίπεδο miR-21 μειώθηκε κατά περισσότερο από 99% (1,0 έως 0.030), σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο

doi:. 10.1371 /περιοδικό .pone.0031060.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

επίπεδα έκφρασης του miR-21 μετά knockdown σε κύτταρα Caki-2: Το επίπεδο miR-21 μειώθηκε κατά περισσότερο από 99% (1,0 έως 0,011), σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο

doi:. 10.1371 /περιοδικό .pone.0031060.s004

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Ρότζερ Erickson για υποστήριξη και βοήθεια σχετικά με την προετοιμασία του αντικειμένου.