Αφηρημένο

Ένας ρόλος για τα μικρόβια έχει υποψίες στον καρκίνο του προστάτη, αλλά δύσκολο να επιβεβαιωθεί σε ανθρώπους ασθενείς. Δείχνουμε εδώ ότι μία γαστρεντερική (GI) σωλήνα βακτηριακή λοίμωξη είναι αρκετή για να ενισχύσει νεοπλασία ενδοεπιθηλιακή προστάτη (ΡΙΝ) και μικροεπεμβατική καρκίνωμα σε ένα μοντέλο ποντικού. Βρήκαμε ότι τα ζώα με γενετική προδιάθεση για την απορύθμιση των

Wnt

σηματοδότησης,

Αρο

Min /+

μεταλλαγμένα ποντίκια, ήταν σημαντικά επιρρεπείς σε καρκίνο του προστάτη σε ένα φλεγμονή-εξαρτώμενο τρόπο μετά από μόλυνση με το

Helicobacter hepaticus

. Περαιτέρω, στις αρχές νεοπλασία παρατηρείται σε μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια ήταν μεταδίδονται σε μη μολυσμένα ποντίκια με ενδοπεριτοναϊκή ένεση μεσεντερικών λεμφαδένων (ΜΙΝ) κύτταρα και μόνο από το

H. hepaticus

-μολυσμένα μεταλλαγμένα ποντίκια. Μεταδοτικότητα της νεοπλασίας ήταν να προληφθούν με προηγούμενη εξουδετέρωση της φλεγμονής με χρήση αντισώματος αντι-ΤΝΡ-α σε μολυσμένα ποντίκια δότες MLN. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώνουν ότι η συστηματική φλεγμονή που προκαλούνται από βακτήρια γαστρεντερική οδό διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην ογκογένεση του προστάτη αδένα

Παράθεση:. ΠΟΥΤΑΧΙΔΗΣ Τ, Cappelle K, Levkovich Τ, Lee CW, Doulberis Μ, Ge Ζ , et al. (2013) στην ανίχνευση εντεροβακτηριδίων Ενίσχυση του προστάτη ανάπτυξης του καρκίνου μέσω συστηματική ενεργοποίηση των κυττάρων του ανοσοποιητικού σε ποντίκια. PLoS ONE 8 (8): e73933. doi: 10.1371 /journal.pone.0073933

Επιμέλεια: Deyu Fang, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15, Απριλίου, 2013? Αποδεκτές: 24 Ιούλη 2013? Δημοσιεύθηκε: 26 Αυγούστου του 2013

Copyright: © 2013 ΠΟΥΤΑΧΙΔΗΣ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από RO1CA108854 (SEE) και CEHS βραβείο πιλοτικό πρόγραμμα P30-ES002109 (SEE). CEHS (Κέντρο Επιστημών Περιβαλλοντικής Υγείας) είναι ένα κέντρο επιχορήγησης που χορηγείται στο MIT από ΝΙΗ-NIEHS (Εθνικό Ινστιτούτο Επιστημών Περιβαλλοντικής Υγείας). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μόνο ένα μικρό ποσοστό των δυσπλαστικών και στις αρχές του νεοπλασματικές αλλοιώσεις που προκύπτουν σε επιθήλια σε όλο το σώμα πράγματι προχωρήσει σε καρκίνο [1-3]. Του καρκίνου συμβαίνει όταν τα κύτταρα με κακόηθες δυναμικό επιτύχει όλα τα ερεθίσματα που απαιτούνται για γενετικές και επιγενετικές την εξέλιξή τους σε κακοήθεια [4]. Είναι πλέον καλά τεκμηριωμένο ότι για πολλούς τύπους καρκίνου συμβάλλει σημαντικά είναι τα κύτταρα και οι παράγοντες του ανοσοποιητικού συστήματος [4-6]. Στον αδένα του προστάτη, αρκετές σειρές αποδείξεων δείχνουν ότι η χρόνια φλεγμονή οδηγεί τη διαδικασία του καρκίνου του προστάτη [5,7,8], αλλά την πηγή του παραμένει άπιαστο. Οι λοιμώδεις παράγοντες, χημικές ή σωματική βλάβη επιθηλιακών κυττάρων, ορμονικές ανισορροπίες και διατροφικών παραγόντων έχουν προταθεί ως οι πιο πιθανές αιτίες της χρόνιας φλεγμονής στον προστάτη [8-10].

Ο προσδιορισμός εάν κακοήθειας του προστάτη μπορούν να προληφθούν με τη στόχευση υποκείμενη φλεγμονή έχει ιδιαίτερη σημασία, δεδομένου ότι είναι η κύρια αιτία της αναπηρίας σχετιζόμενη με τον καρκίνο και θανάτου μεταξύ των ανδρών. Στην γαστρεντερική (GI) οδού, λοιμώξεις με παθογόνα μικρόβια, όπως με

Helicobacter pylori

, να οδηγήσει σε χρόνια φλεγμονή (γαστρίτιδα) και του καρκίνου (γαστρικό αδενοκαρκίνωμα) σε ανθρώπους και σε μοντέλα ποντικών [4]. Ομοίως, σε ανοσοκατεσταλμένους μοντέλα ποντικού το σχετικό κατώτερο βακτήριο εντέρου

Helicobacter hepaticus

(

H. Hepaticus

) ενεργοποιεί φλεγμονώδη νόσο του εντέρου (IBD) και ορθοκολικό καρκίνωμα (CRC) [11-13]. Στον αδένα του προστάτη, ωστόσο, μερικά ζωικά μοντέλα υπάρχουν για να δοκιμάσουν ενδεχόμενη άμεση ή έμμεση ακόμη και τους ρόλους των παθογόνων μικροβίων σε κακοήθεια του προστάτη [8,10,14].

Στους ανθρώπους, η αδενομάτωση πολυποδίασης coli γονίδιο (APC) είναι ένα κρίσιμο γονίδιο καταστολής όγκου που αποτρέπει κακοήθεια του προστάτη και άλλους ιστούς [15]. Εδώ, χρησιμοποιούμε μεταλλαγμένα ποντίκια που στερούνται ένα αντίγραφο του

Αρο

γονίδιο (

Αρο

Min /+

ποντίκια) και εκθεσιακό απορύθμιση της β-κατενίνης και η σηματοδότηση Wnt μονοπάτι και τα άλλα χρησιμοποιείται εκτενώς ως ένα μοντέλο εντερικής αδενωμάτων [16].

Αρο

Min /+

ποντίκια αυθόρμητα αναπτύσσουν νεοπλασία ενδοεπιθηλιακή του προστάτη (ΡΙΝ) και μικροεπεμβατική καρκίνωμα (μικροεπεμβατική CA) με την αύξηση της ηλικίας, που μιμείται τα αρχικά στάδια του καρκίνου του προστάτη παρατηρείται σε ανθρώπους πέμπτη ή έκτη δεκαετία της ζωής τους [15,17]. Δείχνουμε ότι orogastric δοσολογία με

H. hepaticus

, ένα μη colitigenic για αυτό το μοντέλο ποντικού βακτηριακή αποικιστής του εντέρου [17], αυξάνει σημαντικά τον καρκίνο του προστάτη. Σημαντικά, ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη ήταν μεταδοτική σε μη μολυσμένα ζώα αποκλειστικά με μεταφορά των κυττάρων κόμβου μεσεντερικά λεμφικά από

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

ποντίκια Min /+

δότη.

Αποτελέσματα

μόλυνση orogastric με

Helicobacter hepaticus

αυξάνει τον κίνδυνο του καρκίνου του προστάτη σε άνδρες

Αρο

Min /+

ποντίκια

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της εντερικής λοίμωξης, χρησιμοποιήσαμε

Αρο

Min /+

ποντίκια που είχαν καρκίνο-free (νεαρά ποντίκια στην ηλικία των 12 εβδομάδων δεν είχε καρκίνωμα του προστάτη ή πολυπόδων του εντέρου) [17]. Οι ποντικοί δοσολογήθηκαν στοματικά με

H. hepaticus

ή υποβλήθηκαν σε εικονική δοσολογία με τα μέσα ενημέρωσης σε ηλικία έξι εβδομάδων. Με την ηλικία των 12 εβδομάδων,

Αρο

Min /+

ποντίκια μολυσμένα με

H. hepaticus

εμφανίζονται χαρακτηριστικά του καρκινώματος του προστάτη συνεπείς με αυτές που παρατηρήθηκαν σε ανθρώπινα αρσενικά (Σχήμα 1Α, 1Β? Πίνακας S1).

Η. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια παρουσίασαν αυξημένη PIN (p & lt? 0,01) και microadenoCA (p & lt? 0,01) σε σύγκριση με την εικονική-δόση συμφωνημένα μη μολυσμένα ελέγχου

Αρο

Min /+

ποντίκια (Σχήμα 1C και S1). Ούτε

H. hepaticus

-μολυσμένα ούτε μη μολυσμένα 12-εβδομάδων

κβ

ποντίκια εμφάνισαν σημαντική παθολογία του προστάτη. Μαζί αυτά τα αποτελέσματα επιδεικνύουν ότι η μόλυνση του γαστρεντερικού σωλήνα με

H. hepaticus

ενισχύει γρήγορα καρκινογένεσης του προστάτη σε γενετικά ευαίσθητα ποντίκια.

Α) Από την ηλικία των 12 εβδομάδων,

Αρο

Min /+

ποντίκια αναπτύσσουν αυθόρμητα εστιακό χαμηλού και υψηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία του προστάτη (LGPIN, λευκό βέλος-κεφάλι? HGPIN, μαύρο βέλος-κεφάλι), αλλά μόνο σπάνια καρκίνωμα μικροεπεμβατική (α). Ηλικίας συμφωνημένα

Αρο

Min /+

ποντίκια με

Η

.

hepaticus

, να αναπτύξει σημαντικά περισσότερο PIN και βλάβες microinvasiveCA (αστερίσκο) χαρακτηρίζεται από εξαιρετικά άτυπα προστάτη αδένα επιθηλιακά κύτταρα τα οποία να σπάσει μέσω του βασικού υμένα και διεισδύσει το παρακείμενο στρώμα (β). Όταν μεσεντερικών λεμφαδένων κύτταρα από

Η

.

hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

τα ποντίκια μεταφέρονται μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα του

Η

.

hepaticus

-δωρεάν

Αρο

Min /+

ποντίκια οι δικαιούχοι ποντίκια αναπτύσσουν προνεοπλασματικών και στις αρχές του νεοπλασματικές αλλοιώσεις (microinvasiveCA-αστερίσκος) συγκρίσιμα με εκείνα που βρέθηκαν σε ποντίκια δότη (ντο). Καταστρέφουν TNF-α από

Η

.

hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια φέρνει προστάτη νεοπλασματικές αλλοιώσεις (LGPIN, λευκό βέλος κεφαλής) εμφάνιση στο επίπεδο του

Η

.

hepaticus

-δωρεάν ποντίκια (δ). Αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Γραμμές = 50 μm. Β) Η παρεκκλίνουσα β-κατενίνης και λαμινίνη ανοσοχρώση μοτίβο σε microinvasiveCA αλλοιώσεις σε καρκίνο του προστάτη. DLP από

WT Η

.

hepaticus-

θετική ποντίκια (α και γ),

Η

.

hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκι (β) και

Η

.

hepaticus

-δωρεάν

Αρο

Min /+

ποντίκι μεταφέρονται με μεσεντερικών λεμφαδένων κύτταρα από

Η

.

hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

δότη (δ). Κανονική αδένες DLP είχαν φυσιολογική β-κατενίνης πλευρική επιθηλιακών πρότυπο χρώσης κυτταρικής μεμβράνης (α) και ένα ανέπαφο βασικό έλασμα (γ). Σε αντίθεση, microinvasiveCA αλλοιώσεις χαρακτηρίζονται από κυτταροπλασματικό και πυρηνικό (αιχμές βελών) σταθεροποίηση της β-κατενίνης (β) και απουσία της λαμινίνης (αστερίσκος) που υποδηλώνουν αποικοδόμησης βασικής μεμβράνης σε κακοήθη επιθηλιακών κυττάρων εστίες της αρχόμενης εισβολής. Αιματοξυλίνης, DAB χρωμογόνου. Μπαρ = 25 μm. Γ) ιστόγραμμα που δείχνει τη συχνότητα του PIN και microinvasiveCA στις ομάδες θεραπείας. Το πιο σημαντικά αυξημένα εμφάνιση καρκίνου του προστάτη συμβολίζεται με αστερίσκο. Πρότυπο γραμμές σφάλματος αντιστοιχούν σε microinvasiveCA στατιστικές συγκρίσεις. Δ) DLP της

Η

.

hepaticus

-δωρεάν

Αρο

Min /+

ποντίκι μεταφέρονται με ΕΚΑΤ κύτταρα από ένα

Η

.

hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

δότη, HGPIN. Οι περισσότεροι μυελοειδή πρόδρομα κύτταρα με δακτυλιοειδείς πυρήνες που κατοικούν στο στρώμα έχουν το τυπικό κοκκιοκυτταρική φαινότυπο καταγωγή (μαύρο βέλος-κεφάλι), ενώ λιγότεροι φαίνεται να είναι μυελο /μονοκυτταρική στον τύπο (λευκό βέλος κεφαλής). Bar = 16 μm.

Η

Αυξήσεις των φλεγμονωδών κυτοκινών συμβεί χωρίς εμφανή φλεγμονώδη νόσο σε

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια

Είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν

H. hepaticus

μόλυνση οδηγεί σε αυξημένη φλεγμονώδεις αποκρίσεις όπως φαίνεται προηγουμένως [13]. Βρήκαμε ότι

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια παρουσίασαν αυξημένη συστημική προ-φλεγμονωδών κυτοκινών, συμπεριλαμβανομένων του παράγοντα νέκρωσης όγκων (TNF) -α (p = 0,013), IL- 1α (p = 0,024), IL-3 (ρ = 0,0009) και ηωταξίνη (p = 0,003) (Σχήμα 2Α αριστερά). Είναι ενδιαφέρον, προστάτες από το

Η hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια δεν είχαν εμφανή φλεγμονώδη νόσο, αλλά εμφάνισε περιστασιακά σιτευτικά κύτταρα, ουδετερόφιλα, και επίσης μυελοειδούς προδρόμου κύτταρα που φέρουν δακτυλιοειδείς πυρήνες [18] (Σχήμα 1D).

Α) τα επίπεδα ορού των προφλεγμονωδών κυτοκινών αυξήθηκαν σε ποσοστό

Αρο

Min /+

ποντίκια μετά από

Η

.

hepaticus

λοίμωξη. Εοταξίνη, IL-3, TNF-α και IL-1α ήταν σημαντικά αυξημένα σε σύγκριση με αντίστοιχης ηλικίας μη μολυσμένα

Αρο

Min /+

ελέγχους. Όταν σε σύγκριση με το

Η

.

hepaticus

μολυνθεί

κβ

ποντίκια, που έχουν μολυνθεί

Αρο

Min /+

ποντίκια είχαν σημαντικά υψηλότερα IL-17, IL-1α, IL -3, εοταξίνη και η συγκέντρωση IL-9 στον ορό του αίματος τους. Bio-Plex Δοκιμασία κυτοκίνης που χρησιμοποιείται ορούς

n

= 5 ποντίκια ανά ομάδα. *** P & lt? 0.001? * P & lt? 0,05. Β) παραφλοιώδη περιοχές μεσεντερικούς λεμφαδένες.

Η

.

hepaticus

μολυνθεί

Αρο

Min /+

ποντίκια που διατρέχουν υψηλό κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του προστάτη είχαν μεγάλα ποσά των κυτταροπλασματικών και εξωκυττάριο IL-17 που μειώθηκαν σημαντικά μετά την εξάντληση των TNF-α. IL-17-ειδικό ανοσοϊστοχημεία? Αιματοξυλίνης, DAB χρωμογόνου. Μπαρ = 25 μm. Γ) αξιολόγηση Μορφομετρική της IL-17 σε ανοσοϊστοχημικά χρωματισμένο τμήματα των μεσεντερικών λεμφαδένων. Τόσο

Αρο

Min /+

γενετική κατάσταση και εντερική λοίμωξη από

Η

.

hepaticus

συσχετίζονται σημαντικά με TNF-α-διαμεσολαβούμενη αύξηση της IL-17 έκφραση στα μεσεντέριους λεμφαδένες. *** P & lt? 0.001? ** P & lt? 0,01? * P & lt?. 0.05

Η

Εξουδετέρωση αναστέλλει τη φλεγμονή

H. hepaticus

επαγόμενη από το καρκίνωμα του προστάτη σε άνδρες

Αρο

Min /+

Pro-φλεγμονώδη κυτοκίνη ποντίκια

TNF-α βρέθηκε να είναι αυξημένη (p = 0,013) σε ορούς μετά

Η. hepaticus

μόλυνσης για έξι εβδομάδες σε τρεις-μηνών αρσενικό

Αρο

Min /+

ποντίκια (Εικόνα 2Α). TNF-α είναι στην κορυφή ενός καταρράκτη καρκινογόνου προ-φλεγμονωδών γεγονότων [5]. Για να εξετασθεί εάν η φλεγμονή απαιτείται για GI οδού βακτήρια ενεργοποιούνται παθολογία του προστάτη, πραγματοποιήσαμε συστημική εξουδετέρωση του TNF-α χρησιμοποιώντας ενδοπεριτοναϊκή ένεση αντισώματος αντι-ΤΝΡ-α για διάρκεια 3 εβδομάδες ξεκινώντας από την 3 εβδομάδες μετά τη μόλυνση (ΡΙ). Βρήκαμε ότι η θεραπεία αντι-ΤΝΡ-α οδήγησε σε σημαντικά λιγότερο (ρ & lt? 0,01) παθολογία του προστάτη σε

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια (Σχήμα 1Α, 1C και S1? Πίνακας S1). Σε συνδυασμό με τα προηγούμενα δεδομένα, αυτό αναφέρεται ότι

H. hepaticus

-triggered φιλοξενήσει φλεγμονώδεις αντιδράσεις ενισχυμένη νεοπλασματικές επιδράσεις στον ιστό του προστάτη.

φλεγμονωδών κυτοκινών ήταν αυξημένα σε

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια αλλά όχι σε

H. hepaticus

-μολυσμένα

κβ

ποντίκια της ίδιας γέννας

Ένα χαρακτηριστικό αυτού του μοντέλου ποντικού είναι ότι

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια εμφάνισαν σημαντικά αυξημένη PIN υψηλής ποιότητας (HGPIN) και καρκίνωμα του προστάτη? Ωστόσο, σε συνδυασμό

H. hepaticus

-μολυσμένα

κβ

ποντίκια της ίδιας γέννας αποτυγχάνουν να αναπτύξουν σημαντικές PIN ή καρκίνωμα αλλοιώσεις (Εικόνα 1Β, 1C και S1, Πίνακας S1). Κατά την ανάλυση των επιπέδων κυτοκίνης στον ορό, ανακαλύψαμε σημαντικές διαφορές στα επίπεδα πρωτεΐνης της IL-1α (p = 0.02) και IL-17 (ρ = 0,0005) μεταξύ

Αρο

Min /+

και το

κβ

νεογνά ποντίκια (Εικόνα 2Α δεξιά). Ομοίως,

in situ

επισήμανση της IL-17 έδειξαν αυξημένα επίπεδα IL-17 + έκφρασης ΕΚΑΤ στο

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια, αλλά όχι στο

H. hepaticus

-μολυσμένα

κ.β.

ελέγχους (Εικόνα 2Β και 2Γ). Θεραπεία του

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια με αντι-TNF-αντίσωμα μειώθηκε σημαντικά τη γονιδιακή έκφραση του mRNA (p & lt? 0,01) και πρωτεΐνες (p & lt? 0.001) επίπεδα IL-17Α στο MLN (Σχήμα 2Β και 2C). Στο σύνολό τους, αυτά τα συσσωρευμένα δεδομένα εγείρει την πιθανότητα ότι η συστηματική διαφορές που προέρχονται από βακτήρια προκάλεσε φλεγμονή του γαστρεντερικού σωλήνα προέλευσης μπορεί να συμβάλει σε καρκινογόνες διεργασίες σε απομακρυσμένες ιστούς όπως του προστάτη.

κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του προστάτη είναι μεταδοτικές να μη μολυσμένα παραλήπτες χρησιμοποιώντας μεσεντερίων λεμφοκύτταρα κόμβο (ΜΙΝ) από το

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια

Γνωρίζοντας ότι η καταγωγή γαστρεντερικό σωλήνα φλεγμονώδης αντίδραση είναι απαραίτητη για τον καρκίνο του προστάτη στο μοντέλο μας, υποθέσαμε ότι τα κύτταρα στο έντερο που σχετίζονται με λεμφαδένες (MLN) μπορεί να είναι καθοριστική για τον καρκίνο του προστάτη σε αυτό το μοντέλο. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, χρησιμοποιήσαμε τη μεταφορά των κυττάρων του ΕΚΑΤ συλλέγονται από

H. hepaticus

-μολυσμένα ή ψευδο-δόση δότη

Αρο

Min /+

ή

κβ

νεογνά ποντίκια (Σχήμα 3). Για αυτό το πείραμα, όλα τα ζώα αποδέκτης ήταν

Helicobacter

sp

-δωρεάν αρσενικό

Αρο

Min /+

ή

κατά βάρος

αδερφών. Αρσενικά ποντίκια ηλικίας 6-8 εβδομάδων υποβλήθηκαν σε ένεση ip της 5X10

6 αναστολής μόνο κύτταρο σε HBSS ανά ποντικό των κυττάρων που συλλέγονται από μεσεντερικούς λεμφαδένες του

H. hepaticus

-μολυσμένα ή ψευδο-δόση

Αρο

Min /+

ή

κβ

ποντίκια.

Σχηματική απεικόνιση ΕΚΑΤ κυττάρων πειράματα μεταφοράς σχεδιαστεί για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι οι τοπικές γαστρεντερική οδό ανοσοποιητικό εκδηλώσεις του δικτύου προκαλούν συστηματικές ανοσοποιητικού ανισορροπίες που καθορίζουν την τύχη των προ-νεοπλασματικών βλαβών σε τοπογραφικά μακρινό επιθήλια όπως αυτές του προστάτη αδένα. Δοκιμές που χρησιμοποιούνται 6 ποντίκια ανά ομάδα. Τα πειράματα έγιναν εις διπλούν

Η

Κατά συνέπεια, βρήκαμε σημαντικά αυξημένο σε χαμηλά επίπεδα (p & lt? 0,05). Και υψηλού βαθμού (p & lt? 0,01) PIN σε μη μολυσμένους

Αρο

Min /+

ποντίκια που είχαν απλώς λάβει ΕΚΑΤ κύτταρα από

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια (Σχήμα 1Α, Β, Γ και S1) στις 6 εβδομάδες μετά την ένεση ip, σε σύγκριση με τα κύτταρα του δότη ΕΚΑΤ από ψευδο-δόση

Αρο

Min /+

ποντίκια. Αυτά μολύνεται

Αρο

Min /+

που έλαβαν κύτταρα από

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

εμφανίζεται χαρακτηριστικά προνεοπλασίας και καρκινώματος συνεπείς με αυτές που παρατηρήθηκαν σε

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια (Εικόνα 1Α), και μοιάζουν με αυτές που παρατηρήθηκαν σε ανθρώπινα αρσενικά. Επιπλέον, μη μολυσμένα

κβ

παραλήπτη ποντίκια που έλαβαν κύτταρα λεμφαδένα από

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

ποντίκια Min /+

δότη, επίσης, είχε αυξηθεί LGPIN (p & lt? 0.001), HGPIN (p & lt? 0.001) και το αδενοκαρκίνωμα (p & lt? 0.001) (Σχήμα 1C και S1? Πίνακας S1) σε σύγκριση με μη μολυσμένα wt ποντίκια που έλαβαν κύτταρα λεμφαδένα από

H. hepaticus

-δωρεάν

Αρο

ποντίκια Min /+

δότη που δείχνει ότι η γενετική προδιάθεση του επιθηλίου του προστάτη δεν απαιτείται ειδικά για την καρκινογόνο δράση των

H. hepaticus

λοίμωξη. Αυτό το χαρακτηριστικό μεταδοτικότητα έδειξε ότι

H. hepaticus

-ενεργοποιημένου κύτταρα ήταν αρκετή για νεοπλασματικές διεργασίες σε εξω-εντερικών αδένων, όπως του προστάτη.

Εξουδετέρωση της φλεγμονής αποτρέπει κυττάρων μεταδοτικότητα ΕΚΑΤ του κινδύνου καρκίνου του προστάτη σε μη μολυσμένα ποντίκια

Τέλος, δοκιμαστεί εάν εξουδετερωτικά φλεγμονή ήταν επαρκή για να αναστείλει με τη μεσολάβηση MLN-κύτταρο μεταδοτικότητα του καρκίνου του προστάτη σε αυτό το μοντέλο ποντικού. Αξιοποιήσαμε τη μεταφορά των κυττάρων του ΕΚΑΤ συλλέγονται από

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με αντι-TNF-αντίσωμα για 3 εβδομάδες (Σχήμα 3). Για αυτό το πείραμα, όλα τα ζώα αποδέκτης ήταν

Helicobacter

sp

-δωρεάν αρσενικό

Αρο

Min /+

ή

κατά βάρος

ζώα της ίδιας γέννας. Αρσενικά ποντίκια ηλικίας 6-8 εβδομάδων υποβλήθηκαν σε ένεση ip της 5X10

6 αναστολής μόνο κύτταρο σε HBSS ανά ποντικό των κυττάρων που συλλέγονται από μεσεντερικούς λεμφαδένες του

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια. Όπως είχε προβλεφθεί, εμείς δεν διαπίστωσε σημαντικές διαφορές μεταξύ των μη μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια vs μη μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια που είχαν λάβει MLN από ποντικούς αντι-ΤΝΡ-α-θεραπεία (ρ & gt? 0,05). Ομοίως, δεν υπήρχε σημαντικά λιγότερη LGPIN (p & lt? 0,01) και HGPIN (p & lt? 0,05) σε μη μολυσμένους

Αρο

Min /+

αποδέκτες ΕΚΑΤ από αντι-TNF θεραπεία με

H. hepaticus

-μολυσμένα ποντίκια σε σύγκριση με το

Αρο

Min /+

παραλήπτη ποντίκια ΕΚΑΤ από

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια (Σχήμα 1C και S1? Πίνακας S1). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η προ-φλεγμονώδη ρόλο των κυττάρων ΕΚΑΤ είναι η βασική αιτία της παρατηρούμενης προστάτη μεταδοτικότητα τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου.

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, εμείς δοκιμή νεαρών αρσενικών

APC

Min /+

ποντίκια σε /6J υπόβαθρο C57BL ως πειραματικό μοντέλο για την ανίχνευση ενώσεων της φλεγμονής με την καρκινογένεση στον προστάτη. Όπως και με τους ανθρώπους όπου ο κίνδυνος καρκίνου του προστάτη έχει μια ισχυρή γενετική συνιστώσα,

Αρο

Min /+

μεταλλαγμένα ποντίκια έχουν γενετική προδιάθεση να επιθηλιακών νεοπλασιών [13,16,17]. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει στο παρελθόν ότι

Αρο

Min /+

ποντίκια και σταδιακά να αναπτύξουν καρκίνο του προστάτη βάσει της αυξημένης βλαβών PIN που ταιριάζουν αυτό που παρατηρήθηκε σε ανθρώπινο άνδρες [15, 17]. Στις μελέτες μας,

Αρο

Min /+

ποντίκια αναπτύσσουν νωρίς νεοπλασματικές αλλοιώσεις στον πλαγιοπίσθιο προστάτη ήδη σε ηλικία 3 μηνών που προηγούνται εμφανής πολυπόδων του εντέρου. Στην ηλικία = 6 μήνες, το 40% των

Αρο

Min /+

ποντίκια αναπτύσσουν μικροεπεμβατική αδενοκαρκίνωμα, ενώ το 10-20% έχουν επίσης πιο προηγμένες βλάβες του καρκίνου του προστάτη [15]. Η πτυχή αυτή δίνει το

Αρο

Min /+

χρησιμότητα του ποντικιού ως μοντέλο για να εξετάσει την εξέλιξη των προ-νεοπλασματικών και στις αρχές νεοπλασματικές αλλοιώσεις στον ανθρώπινο προστάτη [1-3].

Ένα σημαντικό εύρημα αυτής της μελέτης είναι ότι η μόλυνση με το

H. hepaticus

, ένα βακτήριο που αποικίζει κυρίως το παχύ έντερο των C57BL /6

ApcMin

/

+

ποντίκια χωρίς εμφανή typhlocolitis [13,19- 21], αύξησε σημαντικά τη συχνότητα εμφάνισης και ΡΙΝ μικροεπεμβατική βλάβες αδενοκαρκίνωμα του προστάτη. Όπως ήταν αναμενόμενο, 3-μηνών-old

Αρο

Min /+

ποντίκια μολυσμένα με

H. hepaticus

δεν είχε ούτε εμφανή IBD ούτε μεγάλες αδενωματώδεις πολύποδες ακόμη σχηματιστεί στα σπλάχνα τους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, ακόμη και σε αυτή τη νεαρή ηλικία, αυτοί οι ποντικοί επέδειξαν αυξημένη συστηματική προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες, όπως TNF-α, IL-1α, IL-3, ηωταξίνη και IL-9, σε σύγκριση με μη μολυσμένα αντίστοιχά έλεγχό τους, ενδεικτική του ανοσοποιητικού συστήματος δραστηριοποίηση. Τα στοιχεία αυτά σε συνδυασμό με τα προηγούμενα στοιχεία ότι

H. hepaticus

λοίμωξη είναι σε θέση να διαμορφώνουν ογκογένεση σε εξω-εντερικές περιοχές [21,22], δείχνουν ότι κλινικά σιωπηλή γαστρεντερική οδό γεγονότα ανοσοποιητικό δίκτυο που προκλήθηκε από το έντερο μικροχλωρίδα μπορεί να προκαλέσει συστηματική ανοσοποιητικού ανισορροπίες. Με τη σειρά τους, οι ανισορροπίες αυτές μπορεί να επηρεάσουν την τύχη των προνεοπλαστικών βλαβών σε τοπογραφικά μακρινό επιθήλια όπως εκείνες του προστάτη αδένα.

Τα αλληλένδετα ρόλοι της αυξημένης προφλεγμονωδών κυτοκινών περιβάλλον και φλεγμονώδους κυτταρικό συστατικό που βρέθηκαν στον καρκίνο του προστάτη επιρρεπή

Η. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια είναι ενδιαφέρουσα. Εντός του αδένα του προστάτη, ΡΙΝ και μικροεπεμβατική αδενοκαρκινώματος χαρακτήρισε μαστοκύτταρα, τα ουδετερόφιλα, μυελοειδή και πρόδρομα κύτταρα που φέρουν δακτυλιοειδείς πυρήνες. TNF-α είχε προηγουμένως αποδειχθεί απαραίτητη πρόσληψη των μαστοκυττάρων και ογκογένεση στο

Αρο

Min /+

ποντίκια [13,17,23]. Η απελευθέρωση των παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων TNF-α και διάφορες πρωτεάσες από τα σιτευτικά κύτταρα που διαμένουν στο στρώμα του προστάτη μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση [10].

TNF-α και IL-1α έχουν μαζί εμπλακεί σε έναν NF -κB μεσολάβηση καταρράκτη σήματος που ανέστειλε την απόπτωση και αύξησε τον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων στην ανθρώπινη προνεοπλασίας προστάτη και του καρκίνου [24]. Επιπλέον, η IL-1α προάγει την ανώμαλο πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων ανθρώπινου προστάτη μέσω του παράγοντα ανάπτυξης ινσουλίνης και αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών-7 που σχετίζονται με σήματα ανάπτυξης [25,26]. Εοταξίνη και IL-3 ρυθμίζουν την ωρίμανση του μυελού των οστών, την απελευθέρωση και την εμπορία των ιστών του μυελοειδούς πρόδρομων κυττάρων [27], όπως αυτές που παρατηρήθηκαν σε αδένες του προστάτη του

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια. Πιθανές ρόλους των ηωταξίνης, IL-3 και σχετίζονται μυελοειδή πρόδρομα κύτταρα σε επιθηλιακά ένταλμα καρκινογένεση περαιτέρω έρευνα. Ο ισχυρός προφλεγμονώδης ρόλος της IL-9 είναι όλο και περισσότερο αντιληπτό. κύτταρα Th9 αποτελούν την τελευταία προσθήκη την επέκταση του πίνακα υπότυπο Τ-βοηθητικά. IL-9 διεγείρει την ανάπτυξη των αιμοποιητικών κυττάρων, ειδικά μαστοκύτταρα και την έκκριση αρκετών χημειοκινών που προσλαμβάνουν επιπλέον κύτταρα να φλεγμονώδεις ιστούς [28]. Ο σημαντικός ρόλος της IL-9 σε αυτοανοσία και αλλεργία [28] μπορούν να παρέχουν σημαντικές ενδείξεις, ιδίως υπό το φως των πρόσφατων υποθέσεων που συνδέουν τη φλεγμονή του προστάτη με τον καρκίνο. Προστάτη τραυματισμό των επιθηλιακών κυττάρων μπορεί στη συνέχεια να προκαλέσει απώλεια της ανοχής στην κανονική του προστάτη αντιγόνα και κατά συνέπεια να οδηγήσει σε μια αυτοδιαιωνιζόμενη αυτοάνοση αντίδραση [10]. Στην παρούσα μελέτη, το εύρημα μας ότι η εξουδετέρωση του TNF-α ήταν αρκετή για να αντισταθμίσει την ενίσχυση του κινδύνου καρκίνου του προστάτη σε ένα μοντέλο ποντικού υποδηλώνει ότι αυτή η κυτοκίνη έχει έναν κεντρικό ρόλο στη δημιουργία μιας προ-ογκογόνο συστηματική φλεγμονώδης μακρο-περιβάλλον που επιτρέπει την εξέλιξη του καρκίνου στον αδένα του προστάτη.

Μια άλλη προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών βρήκαμε σημαντικά αυξημένα συγκρίνοντας

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

ποντίκια με

H. hepaticus

-μολυσμένα

κβ

νεογνά ποντίκια ήταν Il-17Α. Οι σημαντικές διαφορές σε IL-17 ήταν ιδιαίτερου ενδιαφέροντος επειδή έχουμε δείξει προηγουμένως IL-17 + κύτταρα σε μεσεντερικά λεμφαδένα (MLN) ποντικών μετά την μόλυνση με

H. hepaticus

[20]. Ομοίως, η IL-17 έχει εμπλακεί στην ανάπτυξη του καρκίνου του εντέρου μόλυνση προκλήθηκε στο

Αρο

Min /+

ποντίκια [29,30]. Η συσχέτιση του

Αρο

Min /+

ποντίκι γονότυπο με συστηματική και ΕΚΑΤ αυξήσεις στο Il-17 έκφρασης μπορεί να έχει μια γενετική βάση, δεδομένου ότι Il-17 που σχετίζονται με ελλείμματα στο κυτταρική ανοσολογική λειτουργία αυτού του μοντέλου ποντικού έχουν αναφερθεί [30]. Είναι σημαντικό ότι, πρόσφατα στοιχεία τόσο από προκλινικές ποντίκι [31] και κλινικές μελέτες σε ανθρώπους υποστηρίζουν ένα σημαντικό ρόλο για την IL-17 στην καρκινογένεση του προστάτη [32,33].

Για να παρέχουν πειραματική απόδειξη γι ‘αυτή την υπόθεση και να διατηρήσει το συγκρότημα ανοσολογική αλληλεπίδραση των διαφόρων κυτταρικών πληθυσμών που επιλέξαμε να μεταφέρει συνολική ΕΚΑΤ κυτταρικών πληθυσμών σε ποντίκια. Οι ανοσολογικές δραστηριότητες εντός συστημική ιστό λεμφαδένα [20] μπορεί να είναι ο σύνδεσμος που συνδέει GI μικροβιακής χλωρίδας με καθολικά προ-ογκογόνο συστηματική αλλοιώσεις του ανοσοποιητικού συστήματος. Παραδόξως, βρήκαμε ότι αυξημένο κίνδυνο για καρκίνο του προστάτη είναι μεταδοτικές να μη μολυσμένα

Αρο

Min /+

αποδέκτες ΕΚΑΤ κύτταρα που λαμβάνονται μόνο από το

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

δωρητές. Δεν υπήρξε καμία ένδειξη του

H. hepaticus

οργανισμών σε προστατικό ιστό από ποντικούς δέκτες μοσχεύματος χρησιμοποιώντας PCR ή με

in situ

εξέταση χρησιμοποιώντας χρωστική αργύρου (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), αλλά η μετατόπιση του

H. hepaticus

οργανισμούς ή αντιγόνα τους από έντερα σε λεμφαδένες παραμείνει δυνατή συμβάλλοντας παράγοντας. Η ανακάλυψή μας ότι ΕΚΑΤ κύτταρα που λαμβάνονται από αντι-TNFα θεραπεία με

H. hepaticus

-μολυσμένα

Αρο

Min /+

χαθεί ο καρκίνος του προστάτη προώθηση επιδράσεις παρέχει αποδείξεις ότι η φλεγμονή ενισχυμένη αυτή τη διεργασία καρκινογένεσης.

Εν κατακλείδι, ένα πιθανός ρόλος για τα μικρόβια στο κακοήθειας του προστάτη έχει υποψίες [9], αλλά παρέμεινε αναπόδεικτη μέχρι τώρα. Εδώ έχουμε καταδείξει ότι η κατάποση του

H. hepaticus

μόνη αυξημένη καρκινογένεση προστάτη στο

Αρο

Min /+

ποντίκια. Το εύρημά μας ότι η φλεγμονή ενισχυμένη αυτή καρκίνος διαδικασία σχηματισμού προσθέτει μηχανιστική στήριξη στις καλά τεκμηριωμένες οφέλη της μη-στεροειδή αντι-φλεγμονώδη φάρμακα (ΜΣΑΦ) σε ανθρώπους ασθενείς. Αξιοσημείωτα, μη-μολυσμένα ποντίκια που έλαβαν μόνο κύτταρα λεμφαδένων έγινε ιδιαίτερα επιρρεπείς σε καρκίνο του προστάτη. Αυτή η παρατήρηση ότι ο καρκίνος του προστάτη είναι επαγώγιμος με αποσταγμένο κύτταρα από άλλο όργανο μπορεί να εξηγήσει γιατί αιτιοπαθογένεση του καρκίνου του προστάτη σε ανθρώπους ήταν δύσκολο να φωτιστούν. Απομένει να καθοριστεί οριστικά κατά πόσον άλλα μικρόβια GI οδού σε ανθρώπους, όπως

H pylori

, μπορούν να έχουν παρόμοια αποτελέσματα σε προστάτη και άλλων μη γαστρεντερικών καρκίνων του ανθρώπου.

Υλικά και Μέθοδοι

πειραματόζωα

Όλα τα ζώα στεγάστηκαν και ο χειρισμός στην Ένωση για την Αξιολόγηση και διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα ζώων (AAALAC) -accredited εγκαταστάσεις με δίαιτες, πειραματικών μεθόδων, και τη στέγαση όπως αυτό έχει εγκριθεί ρητώς από τις θεσμικές Animal Care και την Επιτροπή Χρήσης. Το MIT CAC (IACUC) ενέκρινε συγκεκριμένα τις μελέτες, καθώς και το περίβλημα και το χειρισμό αυτών των ζώων.

Αρο

Min /+

ποντίκια σε ένα φόντο C57BL /6J αρχικά λαμβάνονται από τα Jackson Labs και εκτρέφονται σε σπίτι για να παρέχουν

Αρο

Min /+

ποντίκια και

άγριου τύπου

(

κβ

) αδερφάκια για πειραματικούς λήπτες και οι δότες.

Helicobacter

-δωρεάν κατάσταση των ποντικών επιβεβαιώθηκε με PCR χρησιμοποιώντας

Helicobacter

γένος-ειδικούς εκκινητές, όπως περιγράφεται προηγουμένως [20].

Πειραματικό

Helicobacter hepaticus

λοίμωξη

Ένα σύνολο από 44 πειραματικά ποντίκια σε δόσεις των 6 εβδομάδων με το

H. hepaticus

(στέλεχος 3B1, ATCC # 51449) και, στη συνέχεια, στεγάζονται χωριστά σε μια περιοχή βιο-συγκράτηση μέσα στην ίδια εγκατάσταση ζώων.

Η. hepaticus

αναπτύχθηκε κάτω από μικροαερόβιο συνθήκες, παρασκευασμένα, και επιβεβαιώθηκε καθαρά όπως περιγράφεται αλλού [11,20]. Πειραματικό ποντίκια έλαβαν 0.2 ml από φρέσκο ​​εμβόλιο με γαστρικό καθετηριασμό κάθε δεύτερη ημέρα για ένα σύνολο τριών δόσεων. Τυφλό έντερο, μεσεντερική λεμφαδένα (MLN) και του προστάτη συλλέχθηκαν 6 εβδομάδες μετά τη μόλυνση κατά τη νεκροψία και αναλύονται με PCR για να επιβεβαιωθεί (εντέρου) ή αποκλείουν (MLN, προστάτη) αποικισμός.

Πειραματικός σχεδιασμός

Ένα σύνολο 96

Αρο

Min /+

ποντίκια και 60 wt ποντίκια είχαν συμπεριληφθεί σε διάφορες θεραπευτικές αγωγές ή ως πειραματικό ελέγχους. Διεξήχθησαν πειράματα χρησιμοποιώντας δύο ξεχωριστές δοκιμές με 5-6 ποντίκια η κάθε μία, όπως ορίζεται στον Πίνακα S1. Εξήντα

Αρο

Min /+

ποντικούς και 40 wt ηλικία ποντικούς 6 εβδομάδων εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς με 5 χ 10

6 ΕΚΑΤ κύτταρα αιωρούνται σε HBSS. Τα ποντίκια των κυττάρων του δότη ήταν άνδρες

H. hepaticus

μολυσμένους με έξι εβδομάδες νωρίτερα, ή

Helicobacter

-δωρεάν C57BL /6

κβ

ή

Αρο

Min /+

ποντίκια.

TNF-α εξουδετέρωση

Ένα σύνολο 24

H. hepaticus

μολυνθεί

Αρο

Min /+

ή

κβ

ποντίκια στην ηλικία των 9 εβδομάδων (ξεκινώντας από 3 εβδομάδες μετά

Η. hepaticus

μόλυνση) έλαβαν αντι-ΤΝΡ-α αντίσωμα (κλώνος XT-3?. BioExpress, Λίβανος, ΝΗ) στα 200 μg ανά ποντικό τρεις φορές την εβδομάδα για τρεις εβδομάδες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]

Ανίχνευση της συστημικής πρωτεϊνική έκφραση κυτοκίνης

ορού επίπεδα κυτοκίνης από 5-6 ζώα σε κάθε πειραματική ομάδα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας Pro Bioplex Mouse Cytokine (BioRad, Hercules, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία,

αξιολόγηση Η ιστολογική δείγματα ορού αραιώνονται χρησιμοποιώντας το κιτ διαλύτη δείγματος, επωάστηκε με σφαιρίδια επικαλυμμένα με αντίσωμα που ακολουθείται από ένα δευτερεύον αντίσωμα επώαση και αναλύθηκαν εις διπλούν για ένα Bio-Plex 200 σύστημα (BioRad, Hercules, CA). και ανοσοϊστοχημεία

Οι ιστοί φορμόλη σταθερό υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και ενσωματωμένα σε παραφίνη 5μm ιστού-τομές βάφτηκαν με η & amp? Ε, Warthin-Starry χρώση αργύρου ή IHC και αξιολογήθηκαν για βλάβες του προστάτη από κτηνιατρικό παθολόγο τύφλωσε να δοκιμάσουν ταυτότητα. Οι προνεοπλαστικών και στις αρχές του νεοπλασματικών βλαβών του προστάτη, που ανιχνεύεται με βάση την πρόσφατη κριτήρια συναινετική έκθεση [34], ποσοτικά αξιολογήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως από ΠΟΥΤΑΧΙΔΗΣ et al (2009) [17].

Rabbit πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημεία περιλαμβάνονται αντι -β-κατενίνης (Thermo, Fisher Scientific /Εργαστήριο Vision, Fremont, CA), αντι-λαμινίνη (Thermo, Fisher Scientific /Εργαστήριο Vision, Fremont, CA) και αντι-IL17 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Αντιγόνα ανακτήθηκαν με πρωτεάσης 1 (Roche Diagnostics /Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) για την ανίχνευση λαμινίνη. Heat-επαγόμενη ανάκτηση αντιγόνου διεξήχθη με ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού ρΗ 6 για β-κατενίνης ή με EDTA ρυθμιστικό ρΗ8 για ανίχνευση IL17. Πρωτογενής σύνδεση αντισώματος ανιχνεύθηκε με γίδινο αντι-κουνελιού Zytochem Plus HRP Polymer (Zytomed Systems, Βερολίνο, Γερμανία). Signal ανιχνεύθηκε με διαμινοβενζιδίνη (Invitrogen, Camarillo, CA) και οι ιστοί με αιματοξυλίνη.

Για την ποσοτικοποίηση της IL-17 έκφραση σε MLN, τριάντα 40χ εικόνες πεδίο υψηλής IHC-χρωματισμένες τομές ανά συλλήφθηκαν ομάδα θεραπείας. Δέκα εικόνες από κάθε ομάδα επιλέχθηκαν τυχαία για μετρήσεις. Αυτόματος υπολογισμός του αριθμού των pixels που αντιστοιχεί σε IL-17 σε εικόνες εμφανίστηκε σε ένα ιστόγραμμα, μετά την επεξεργασία κάθε εικόνα με το χρώμα κατώφλι plug-in του προγράμματος επεξεργασίας και ανάλυσης εικόνας ImageJ (ΝΙΗ, Bethesda, MD). μετρήσεις μορφομετρικών καταγράφηκαν ως ο αριθμός των IHC επισημανθεί pixels ανά εικόνα.

Στατιστικές αναλύσεις

Ο επιπολασμός της LGPIN, HGPIN και μικρο-adenoCa μεταξύ των ομάδων σε σχέση με το Kruskal-Wallis μονόδρομη ANOVA και μετά τη δοκιμή του Dunn. Άμεσες συγκρίσεις έγιναν από το Mann-Whitney U. Ορός ανάλυση δεδομένων κυτοκίνης διεξήχθη χρησιμοποιώντας t-test του 2-tailed σπουδαστή.