Αφηρημένο

Ιστορικό

Ανίχνευση των κρίσιμων μεταλλάξεις γονιδίων του καρκίνου σε κλινικά δείγματα όγκων μπορεί να προβλέψει την έκβαση των ασθενών και να ενημερώσει τις επιλογές θεραπείας? Ωστόσο, υψηλής απόδοσης προφίλ μετάλλαξη παραμένει υπανάπτυκτη ως διαγνωστική προσέγγιση. Αναφέρουμε την εφαρμογή ενός γονότυπου και επικύρωσης αλγόριθμο που επιτρέπει την δημιουργία προφίλ ισχυρή μετάλλαξη του όγκου στο κλινικό περιβάλλον.

Μεθοδολογία

Έχουμε αναπτύξει και να εφαρμόσει ένα βελτιστοποιημένο μετάλλαξη προφίλ πλατφόρμα ( «OncoMap») για να ανακρίνουν ~ 400 μεταλλάξεις σε 33 γνωστά ογκογονίδια και καταστολείς όγκων, πολλά από τα οποία είναι γνωστά για να προβλέψει απόκριση ή αντίσταση σε στοχευμένες θεραπείες. Η απόδοση του OncoMap αναλύθηκε χρησιμοποιώντας DNA που προέρχονται τόσο από τα κατεψυγμένα και FFPE κλινικό υλικό σε ένα ποικίλο σύνολο τύπων καρκίνου. Μια μετέπειτα σε βάθος ανάλυση διεξήχθη σε ιστολογικά και κλινικά σχολιασμένη παιδιατρική γλοιώματα. Η ευαισθησία και η ειδικότητα της OncoMap ήταν 93,8% και 100% σε φρέσκο ​​κατεψυγμένο ιστό? και 89,3% και 99,4% σε FFPE προερχόμενο DNA. Διαπιστώσαμε γνωστές μεταλλάξεις στις αναμενόμενες συχνότητες σε κοινούς καρκίνους, καθώς επίσης και νέες μεταλλάξεις σε ενήλικες και παιδιατρικούς καρκίνους που είναι πιθανό να προβλεφθεί αυξημένη απόκριση ή αντίσταση στις υπάρχουσες ή αναπτυξιακές θεραπείες για καρκίνο. OncoMap προφίλ υποστηρίζουν επίσης ένα νέο μοριακό διαστρωμάτωση των παιδιατρικών γλοιώματα χαμηλής ποιότητας που βασίζονται στο

BRAF

μεταλλάξεις που μπορεί να έχουν άμεσες κλινικές επιπτώσεις.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν την κλινική σκοπιμότητας της υψηλής απόδοσης προφίλ μετάλλαξη ερώτημα για μια μεγάλη ομάδα «προσβληθεί» μεταλλάξεις του γονιδίου του καρκίνου. Στο μέλλον, αυτό το είδος της προσέγγισης μπορεί να ενσωματωθεί σε δύο μελέτες του καρκίνου επιδημιολογικές και κλινικές λήψης αποφάσεων για να καθορίσετε τη χρήση πολλών στοχευμένων αντικαρκινικών παραγόντων

Παράθεση:. MacConaill LE, Campbell CD, Kehoe SM, Bass AJ, Hatton C, Niu L, et al. (2009) Profiling Κρίσιμη Cancer Gene Μεταλλάξεις σε κλινικά δείγματα όγκων. PLoS ONE 4 (11): e7887. doi: 10.1371 /journal.pone.0007887

Επιμέλεια: Chris Jones, Ινστιτούτο Έρευνας για τον Καρκίνο, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 25 Αύγ 2009? Αποδεκτές: 20, Οκτωβρίου του 2009? Δημοσιεύθηκε: 18, Νοέμβρη 2009

Copyright: © 2009 MacConaill et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το National Cancer Institute (R21CA126674) με χρονική υστέρηση, (K08CA134931) να AJB, και το Ινστιτούτο Καρκίνου Dana-Farber. A.J.B. υποστηρίχθηκε από το Πρόγραμμα Κατάρτισης κλινικός ερευνητής του Χάρβαρντ. Χρηματοδότηση για την ανάλυση των όγκων του γαστρεντερικού παρασχέθηκαν της Αμερικανικής Εταιρείας Κλινικής Ογκολογίας, Φίλοι του Ινστιτούτου Dana-Farber Cancer και το Η.Τ. Ίδρυμα Berry. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Όσον αφορά την οικονομική αποκαλύψεις, Levi Garraway είναι σύμβουλος για και /ή λαμβάνει χορηγία έρευνα από τη Novartis, Inc. Καμία από αυτές τις σχέσεις συνιστούν σύγκρουση συμφερόντων για την εργασία αυτή. Αυτό δεν μεταβάλλει την προσήλωσή του σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Πολλοί όγκοι περιέχουν σήμα κατατεθέν μεταλλάξεις στο ογκογονίδια ή ογκοκατασταλτικών (TS) γονίδια που μπορεί να προσδώσει αυξημένη ευαισθησία σε στοχευμένες αντικαρκινικών θεραπειών. Καθιερωμένη παραδείγματα περιλαμβάνουν

KIT

μεταλλάξεις στο στρωματικών όγκων του γαστρεντερικού (GISTs) που προβλέπουν την ανταπόκριση στο imatinib ή nilotinib, και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα με το

EGFR

μεταλλάξεις που είναι ευαίσθητες στην erlotinib [ ,,,0],1], [2], [3]. Η παρουσία άλλων μεταλλάξεων προβλέπει μια έλλειψη ανταπόκρισης σε στοχευμένη θεραπεία. Για παράδειγμα, του πνεύμονα και του παχέος εντέρου που φιλοξενούν μεταλλάξεις στο

KRAS

ογκογονίδιο δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία με αντι

EGFR

παράγοντες [4], και απενεργοποιώντας

PTEN

μεταλλάξεις ( ή απώλεια πρωτεΐνης) σε γλοιοβλαστώματα προβλέψει την αντίσταση στην erlotinib [5]. Έτσι, τη λήψη κλινικών αποφάσεων βασίζεται σε όγκο γενετικών πληροφοριών θα όλο και περισσότερο να ενημερώνονται από το μεταλλάξεων κατάσταση πολλαπλών γονιδίων του καρκίνου. Ωστόσο, δημιουργώντας ένα ολοκληρωμένο προφίλ των μεταλλάξεων του DNA του όγκου-στόχου σε θέση ή αλλιώς «προσφυγής» στην κλινική αρένα παραμένει πρόκληση.

Οι πρόσφατες τεχνολογικές εξελίξεις καθιστούν εφικτή κατ ‘αρχήν στην οθόνη μια βιοψία του όγκου για πολλούς τύπους γονιδιωματικής αλλαγές . Ωστόσο, η ενσωμάτωση των εν λόγω πληροφοριών στην κλινική λήψη αποφάσεων απαιτεί αξιόπιστη γονιδιακό προφίλ των κατεψυγμένων, παραφίνη που προέρχονται, και αρχειακό DNA των όγκων. Σε αυτό το πλαίσιο, τα νουκλεϊκά οξέα συχνά υπόκεινται σε αποδόμηση ή /και χημική τροποποίηση, και η διαθεσιμότητα του ιστού του όγκου μπορεί να είναι περιοριστική.

Έχουμε αναφερθεί προηγουμένως την προσαρμογή μιας προσέγγισης γονοτύπησης υψηλής απόδοσης για την ανακρίνει κλειδί μεταλλάξεις σε μια ομάδα 17 γνωστά ογκογονίδια. Έχουμε αποδείξει τώρα την κλινική εφικτότητα με φασματομετρία μάζας με βάση προφίλ γονιδιακής μετάλλαξης του καρκίνου για ένα μεγάλο πάνελ ογκογονιδίου και του γονιδίου TS μεταλλάξεις. Για να επιτευχθεί αυτό, θα δημιουργείται μια προσέγγιση ονομάζεται OncoMap, η οποία χρησιμοποιεί μια διευρυμένη συλλογή από 460 δοκιμασίες ανακρίνει γνωστές μεταλλάξεις σε 33 γονίδια του καρκίνου. Χρησιμοποιώντας αυτή τη γονιδιωματική προσέγγιση των χαρακτηριστικών σε συνδυασμό με ένα αναλυτικό αλγόριθμο μετάλλαξη-κλήση και ορθογώνια στάδιο επικύρωσης, εντοπίσαμε πολλές μεταλλάξεις που υπάρχουν στο γονιδιακό DNA τόσο από κατεψυγμένα και FFPE ιστούς όγκων. Επιπλέον, η εφαρμογή της συστηματικής προφίλ μετάλλαξης σε & gt? 120 παιδιατρική χαμηλού βαθμού αστροκυτώματα αποκαλύπτει μια κλινικά ενημερωτικό μοριακή διαστρωμάτωση δεν είχε αναγνωριστεί προηγουμένως σε αυτόν τον τύπο του όγκου. Οι πληροφορίες αυτές, αν έγινε ευρέως διαθέσιμες, θα μπορούσε να ενημερώσει τόσο την κλινική λήψη αποφάσεων και τη βέλτιστη κλινική σχεδιασμό δίκη για στοχευμένη θεραπευτική.

Μέθοδοι

Οι ασθενείς και οι Συλλογή όγκου ιστών

ανώνυμα όγκου δείγματα ελήφθησαν από τη Συνεργατική Ανθρώπινο Δίκτυο Tissue (CHTN), Χειρουργικής Ογκολογίας του Πανεπιστημίου της Σιένα, Ιταλία, και Dana-Farber Cancer Institute? δείγματα ανθρώπινου γλοιώματος ελήφθησαν από τις κλινικές αρχεία των υπηρεσιών της Παθολογίας στο Νοσοκομείο Παίδων της Βοστόνης και Νοσοκομείου Brigham and Women της. (Η απαιτούμενη περιεκτικότητα σε όγκο ήταν & gt? 70%? Νέκρωση & lt?. 10%) επιτροπή δεοντολογίας (IRB) απαλλαγή αποκτήθηκε για όλα τα δείγματα από την Dana-Farber /Συνεργάτες Γραφείο Εξυπηρέτησης του καρκίνου για την προστασία των υποκειμένων της έρευνας. εκχύλιση του DNA εκτελέστηκε όπως περιγράφεται στις Μεθόδους S1.

OncoMap Assay Design και γονοτυπικός

Επιλογή των γονιδίων του καρκίνου μεταλλάξεων για το σχεδιασμό και δοκιμασία μάζας γονοτυπική φασματομετρίας διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6] με υποδεικνύεται τροποποιήσεις στις μεθόδους S1. Οι ακολουθίες δοκιμασίας, εκκινητή και ανιχνευτή υποδεικνύεται στον Πίνακα S1.

Σήμανση των δειγμάτων και αλληλουχίας

Αστάρια συνοδευτικά

KRAS

κωδικόνιο 12 χρησιμοποιήθηκαν για PCR-ενίσχυση γονιδιακού DNA από 91 φρέσκα κατεψυγμένα και 93 δείγματα FFPE (αλληλουχίες εκκινητών που υποδεικνύονται στον πίνακα S2). αμπλικόνια PCR αναλύθηκαν δια προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger. Εναλλακτικά,

KRAS

κωδικόνιο 12 ενισχύθηκε με PCR με γραμμωτό κωδικό εκκινητές όπως περιγράφεται στις Μεθόδους S1. αμπλικόνια PCR συνενώθηκαν και αναλύθηκαν (Illumina Genome Analyzer II? μόνο λωρίδα). Τα δεδομένα αλληλουχίας αναλύθηκαν όπως περιγράφεται στις Μεθόδους S1.

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά of Clinical δείγματα όγκων

Ένα σύνολο 903 κλινικά δείγματα όγκων που προέρχονται από 12 διαφορετικές θέσεις ιστού αξιολογήθηκαν για Η μελέτη αυτή (Πίνακας 1). Η πλειονότητα των δειγμάτων ήταν αδενοκαρκινώματα (n = 625) από όγκους του μαστού, του πνεύμονα, του προστάτη, και GI οδού. Επίσης περιλαμβάνεται μια συλλογή από GISTs (n = 34) και γλοιώματα (n = 155). Από αυτά, 643 δείγματα ελήφθησαν από φρέσκο ​​κατεψυγμένο ιστό και 260 που προέρχονται από το μπλοκ FFPE. Εκτιμώμενη περιεκτικότητα του όγκου ξεπέρασε το 70% σε όλα τα δείγματα, όπως μετράται με παθολογική επανεξέταση (βλέπε Μέθοδοι).

Η

Απόδοση του όγκου μετάλλαξης Profiling Αλγόριθμος

Για να διευκολυνθεί το γονίδιο του καρκίνου του προφίλ μετάλλαξη σε κλινικές όγκου δείγματα, αναπτύξαμε OncoMap, ένα πάνελ των δοκιμασιών του γονότυπου που αξιολόγησε 396 μοναδικές μεταλλάξεις σε 33 γονίδια του καρκίνου. Η πλήρης αλγόριθμος μετάλλαξη προφίλ (Σχήμα 1Α) που συμμετέχουν μάζα γονοτυπική φασματομετρίας που ακολουθείται από τα δύο αυτοματοποιημένη κλήση και μη αυτόματου ελέγχου για να δημιουργήσετε μια λίστα των υποψήφιων μεταλλάξεων. Οι εν λόγω υποψήφιοι υποβλήθηκαν σε δευτερεύουσα επικύρωση του γονότυπου (βλέπε Μέθοδοι S1). Υποθέτοντας ότι όλες οι πρωτογενείς προφίλ και την επικύρωση δοκιμασία αντιδραστήρια είναι στη θέση τους, οι 7-10 ημέρες που απαιτούνται για να ολοκληρωθεί η όλη OncoMap ακολουθία.

Α. Μια επισκόπηση της OncoMap διαδικασία από όγκο στο προφίλ μετάλλαξης. Δείτε κείμενο για λεπτομέρειες. B. Δέκτης χειριστής χαρακτηριστικές καμπύλες (ROCs) δείχνουν την ευαισθησία και την ειδικότητα για διάφορες τιμές αποκοπής για το αποτέλεσμα του δείγματος των δειγμάτων επικύρωσης. ROCs σχεδιάζονται για τα νωπά κατεψυγμένα (αριστερά) και FFPE που προέρχονται από (δεξιά) DNA, χρησιμοποιώντας αμφίδρομη

KRAS

αναλύσεις και τα δεδομένα Illumina ως αλήθεια-set (βλέπε Μέθοδοι S1).

Η

OncoMap απόδοση αξιολογήθηκε μετά τον καθορισμό του «εδάφους-αλήθεια» κατάστασης μεταλλάξεων στο

KRAS

κωδικόνιο 12 χρησιμοποιώντας μια barcoding DNA και μαζικά παράλληλη αλληλουχίας-από-σύνθεση στρατηγική (βλέπε Μέθοδοι S1), που εφαρμόζεται σε 91 κατεψυγμένα και 93 FFPE προερχόμενο ΟΝΑ όγκου. Όταν αυτά τα αποτελέσματα αλληλούχισης βαθιά συγκρίθηκαν με αναλύσεις προσδιορισμού του γονότυπου ανακρίνει τον ίδιο

KRAS

κωδικόνιο, βρήκαμε την OncoMap ευαισθησία και ειδικότητα να είναι 93.8% και 100%, αντίστοιχα, σε DNA από φρέσκο ​​/κατεψυγμένο ιστό? και 89,3% και 99,4% σε FFPE προερχόμενο DNA (Σχήμα 1Β). Αντίθετα, η ευαισθησία των συμβατικών αλληλούχισης Sanger ήταν 83,3% για το νωπό κατεψυγμένο ιστό και 76,0% για FFPE προερχόμενο DNA, επιβεβαιώνοντας την αυξημένη απόδοση του προσδιορισμού του γονότυπου με βάση προφίλ μετάλλαξη [7].

OncoMap απόδοση αξιολογήθηκε περισσότερο εκτενώς με τη δοκιμή 215 κατεψυγμένα δείγματα όγκων που εκτείνονται σε πολλούς τύπους όγκων στα οποία η μεταλλαξιογόνος κατάσταση για τα νουκλεοτίδια ανακρίθηκε από 52 OncoMap δοκιμασίες είχαν καθοριστεί προηγουμένως. Με την ανάλυση αυτή, η μετάλλαξη προφίλ επιτευχθεί μια παρόμοια υψηλή εξειδίκευση του 99,8%. Δοκιμασία ευαισθησίας ήταν βέλτιστη σε ιστούς όγκων όπου η περιεκτικότητα του όγκου υπερέβη το 50% (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Παρόλο που οι μεμονωμένες τιμές ευαισθησίας δεν μπορεί να προσδιοριστεί για όλες τις μεταλλάξεις αναλύθηκαν, οι υπολογισμοί με τη χρήση μίας κατεύθυνσης

KRAS

δοκιμασίες (ανακλαστικά της πλειοψηφίας των OncoMap προσδιορισμούς) απέδωσε σχεδόν όμοια ευαισθησία και ειδικότητα τιμές (Σχήμα S1). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η γονοτυπική που βασίζεται μετάλλαξη προφίλ πλατφόρμα ήταν κατάλληλο για πολλές κλινικές εφαρμογές.

«Πράξεις» Cancer Gene Μεταλλάξεις σε όλη διαφορετικούς τύπους καρκίνου

Από τα κλινικά δείγματα όγκου 903 προφίλ, το 37% (n = 335) περιείχαν μία ή περισσότερες μεταλλάξεις. Συνολικά, 417 μεταλλάξεις ταυτοποιήθηκαν με 63 δείγματα που εμφανίζουν συνυπάρχουσες μεταλλάξεις. Ενώ 286 μεταλλάξεις βρέθηκαν από δοκιμασίες ανακρίνει γνωστή ή υποψήφιο ογκογονίδια, 131 μεταλλάξεις παρατηρήθηκαν στα γονίδια TS. Έτσι, η OncoMap πλατφόρμα παρέχονται εκτενέστερες πληροφορίες μετάλλαξη από τις προηγούμενες μετάλλαξη προφίλ προσπάθειες που εστιάζεται αποκλειστικά στην ογκογονίδιο μεταλλάξεις. Όπως ήταν αναμενόμενο, η κατανομή των μεταλλάξεων αντανακλάται πρότυπα που παρατηρήθηκαν προηγουμένως σε ανθρώπινους όγκους, αν και η συχνότητα των μεταλλάξεων TS ήταν χαμηλότερη (αντανακλαστική του μειωμένου κάλυψη τέτοιων μεταλλάξεων με OncoMap). Παραδείγματα περιλαμβάνουν

PIK3CA

(26%) και

TP53

(13%) μεταλλάξεις στον καρκίνο του μαστού?

APC

(11%),

BRAF

(10%),

KRAS

(38%),

PIK3CA

(11%) και

TP53

(9%) μεταλλάξεις σε καρκίνο του παχέος εντέρου, και

EGFR

(12%),

KRAS

(23%) και

STK11

(8%) μεταλλάξεις σε καρκίνο του πνεύμονα. Οι αναμενόμενες κατανομές μετάλλαξη παρατηρήθηκε σε δύο κατεψυγμένα και FFPE δείγματα, υπογραμμίζοντας την πιθανή χρησιμότητα της OncoMap σε κλινικό περιβάλλον.

Μεταλλάξεις Πρόβλεψη Απάντηση σε στοχευμένες θεραπείες

Ο Πίνακας 2 δείχνει ένα σύνολο » προσφυγής «γονίδιο του καρκίνου μεταλλάξεις που ταυτοποιούνται εδώ. Η πλατφόρμα OncoMap ανιχνεύεται σθεναρά μεταλλάξεις που αποτελούν ιδρύθηκε δείκτες της ανταπόκρισης σε στοχευμένες θεραπείες. Για παράδειγμα,

EGFR

μεταλλάξεις πρόβλεψης της ανταπόκρισης στην erlotinib και gefitinib εντοπίστηκαν κατά την αναμενόμενη συχνότητα (12%) σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, και

KIT

μεταλλάξεις που συνδέονται με την ευαισθησία στην imatinib και nilotinib εντοπίστηκαν στο 76% των GISTs. Είναι ενδιαφέρον ότι,

ERBB2

μεταλλάξεις ανιχνεύτηκαν σε τέσσερα γαστρική αδενοκαρκινώματα, αυξάνοντας την πιθανότητα της δοκιμής ενός αναστολέα HER-2 όπως trastuzumab σε ασθενείς με γαστρικό καρκίνο που επιλέγεται με βάση αυτή τη γενετική κριτήριο [8].

Η

Πολλοί όγκοι έτρεφε μεταλλάξεις που μπορούν να προβλέψουν την ανταπόκριση στην δοκιμαζόμενων παραγόντων. Για παράδειγμα,

BRAF

V600E

μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε ορθοκολικό (n = 16), ωοθηκών (η = 1), του θυρεοειδούς (n = 4) και του ενδομητρίου (n = 1) καρκίνους, καθώς και παιδιατρική gangliogliomas (n = 22? βλέπε παρακάτω). Οι όγκοι που φιλοξενούν αυτές τις μεταλλάξεις μπορεί να ανταποκριθεί σε μια επιλεκτική

BRAF

αναστολέα [6], [9]. Ταυτοποιήσαμε επίσης 96 δείγματα σε επτά διαφορετικούς τύπους καρκίνου (του μαστού n = 14, ορθοκολικό n = 24, του ενδομητρίου n = 15, του οισοφάγου η = 4, γαστρικό n = 34, του προστάτη η = 3, και παιδιατρική αστροκύτωμα n = 2) που φέρουν μεταλλάξεις είτε σε

PIK3CA

ή

ΡΤΕΝ.

Αυτές οι μεταλλάξεις μπορεί να αναμένεται να εμπλουτίσουν για όγκους ανταποκρίνεται στους αναστολείς ΡΙ3 κινάσης σήμερα σε εξέλιξη.

μεταλλάξεις Πρόβλεψη Αντοχή σε στοχευμένες θεραπείες

μαζί με μεταλλάξεις οι οποίες προσδίδουν αυξημένη ευαισθησία σε στοχευμένες θεραπείες, OncoMap σθεναρά ανιχνεύονται μεταλλάξεις που σχετίζονται με την αντίσταση σε διάφορες ουσίες. Ιδρύθηκε παραδείγματα περιλαμβάνουν

KRAS

μεταλλάξεις σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (23%) και του παχέος εντέρου (38%) που προσδίδουν αντίσταση σε erlotinib, gefitinib (πνεύμονα) ή cetuximab (ορθοκολικό) [4], [10 ], [11]. Ενώ το 94% των

KRAS

μεταλλάξεις που αναγνωρίστηκαν εντοπισμένη σε κωδικόνια 12 ή 13, 6% σημειώθηκε αλλού στο γονίδιο (συνηθέστερα στο κωδικόνιο 61). Δεδομένου ότι οι περισσότερες μελέτες του

KRAS

-associated αντίστασης έχουν επικεντρωθεί αποκλειστικά στα κωδικόνια 12 και 13 [3], [12], [13], OncoMap εντοπίστηκαν πρόσθετα

KRAS

μεταλλάξεις που μπορούν να επηρεάσουν την ευαισθησία στην αντι-ΕΟΡΚ θεραπεία. OncoMap επίσης προσδιορίσει ένα

HRAS

μετάλλαξη σε ένα αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα και ένα

NRAS

μετάλλαξη σε ένα ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα. Οι μεταλλάξεις που αφορούν εναλλακτική ισομορφές RAS είναι σπάνια σε αυτούς τους τύπους καρκίνου? θεωρητικά, αυτά θα μπορούσαν επίσης να παρέχουν ανθεκτικότητα σε αντι-EGFR θεραπείας.

Μετάλλαξη προφίλ επίσης εντοπίσει μεταλλάξεις οι οποίες προσδίδουν «δευτερεύουσες» αντίσταση σε στοχευμένες θεραπείες (π.χ., αλληλόμορφα αντίσταση που προκύπτουν κατά τη διάρκεια της στοχευμένη θεραπεία). Σε όγκους GIST, όπου 31

KIT

μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε 25 δείγματα? τόσο στην πρωτοβάθμια (imatinib-απόκρισης) και δευτερογενή (ανθεκτικών στο imatinib)

παρατηρήθηκαν KIT

μεταλλάξεις, σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες μετάλλαξη προφίλ [7]. Συγκεκριμένα, αρκετές

KIT

μεταλλάξεις που αφορούν εξόνιο 9 (

KIT

Y503_or F504insAY? 5 περιπτώσεις) ανιχνεύθηκαν στα ακατέργαστα όγκους GIST. Αυτές οι μεταλλάξεις σχετίζονται με αυξημένο απαίτηση φάρμακο να αποσπάσει μια κλινική ανταπόκριση [14], [15]. Ένα

PDGFRA

μετάλλαξη (D842V) προγνωστικά αντίσταση στο imatinib [15] Επίσης, εντοπίστηκαν σε ένα δείγμα GIST.

Το

ΑΚΤ1

E17K

μετάλλαξη έχει προηγουμένως αναφερόμενη στο στήθος, του παχέος εντέρου και του καρκίνου των ωοθηκών. Η OncoMap πλατφόρμα καθορίζει τις σπάνιες

ΑΚΤ1

μεταλλάξεις σε αυτούς τους τύπους όγκων, όπως επίσης και ενιαία

ΑΚΤ1

E17K

περιπτώσεις στις ενδομητρίου, οισοφαγικό πλακώδους, γαστρικό, και καρκίνοι του προστάτη. Αυτή η μετάλλαξη μπορεί να προβλέψει την αντίσταση στην PI3 αναστολή κινάσης (και θεωρητικά υποδοχέα τυροσινικής κινάσης αναστολή) σε ορισμένα πλαίσια [16].

Καρκίνοι με συνυπάρχουσες Μεταλλάξεις «Πράξεις»

Η παρουσία της συνεργασίας συμβαινόντων μεταλλάξεων που περιλαμβάνουν κρίσιμα γονίδια του καρκίνου μπορεί να τροποποιήσει η κλινική απόκριση σε μονοθεραπεία στοχευμένη θεραπεία. Εδώ, 20 αδενοκαρκινώματα (10 ορθοκολικό, δύο ενδομητρίου και 8 γαστρικό) παρουσίασαν συνυπάρχουσες

PIK3CA

και

KRAS

μεταλλάξεις. Ενώ συμπίπτει μεταλλάξεις σε αυτά τα γονίδια έχουν προηγουμένως αναφερθεί σε καρκίνους του παχέος εντέρου [17],

PIK3CA

και

KRAS

μεταλλάξεις τυπικά παρουσίασαν αλληλοαναιρούνται πρότυπο εμφάνισης σε καρκίνο του ενδομητρίου [18 ], [19]. Μια ενδομητρίου αδενοκαρκίνωμα με συνυπάρχουσες

FGFR2

και

επίσης εντοπιστεί PTEN

μεταλλάξεις. Δύο όγκοι έτρεφε συμπίπτει

BRAF

και

PTEN

μεταλλάξεις (ένα ενδομητρίου, παχέος ένα), και ένα επιπλέον παχέος δείγμα περιείχε τόσο μια

PIK3CA

και

BRAF

μετάλλαξη. Οι όγκοι αυτοί μπορεί να αναμένεται να επιδεικνύουν αντοχή στην αναστολή του υποδοχέα της κινάσης της τυροσίνης.

μοριακής ταξινόμησης Παιδιατρικής εγκεφαλικούς όγκους από Cancer Gene Mutation χαρακτηρισμού

Η ικανότητα να εκτελούν ισχυρή profiling μετάλλαξη των κλινικών και αρχειακό ιστό του όγκου μπορούν να προωθήσουν τη συστηματική μοριακό χαρακτηρισμό των καρκίνων «ορφανών», συμπεριλαμβανομένων και ορισμένων παιδιατρικών όγκων όπου επαρκής ιστός συχνά λείπει. Για να διερευνήσουν αυτή την υπόθεση, OncoMap χρησιμοποιήθηκε για την αναζήτηση μιας σειράς παιδιατρική γλοιώματα χαμηλής ποιότητας (LGGs) των οποίων η μετάλλαξη του φάσματος είναι ελλιπώς ορίζεται. Αυτή η ανάλυση περιελάμβανε γονιδιακού DNA από 127 παιδιά και 28 ενηλίκων γλοιώματα (για σύγκριση) που εκτείνονται σε πέντε ιστολογική υποτύπους του pilocytic αστροκύτωμα, ganglioglioma και διάχυτη αστροκύτωμα.

Υποψήφιος Πρόγνωσης ή θεραπευτική Στόχοι στην Παιδιατρική εγκεφαλικούς όγκους

Αρκετές δυνητικά «προσβληθεί» γονίδια του καρκίνου του διαπιστώθηκε ότι είχε μεταλλαχθεί σε παιδιατρικούς LGas. Παραδείγματα περιλαμβάνουν

PDGFRA

(n = 1) και

PIK3CA

(n = 2), το οποίο μπορεί να προβλέψει απάντηση σε υπάρχοντα φάρμακα (π.χ., imatinib ή nilotinib) ή παράγοντες για την ανάπτυξη (π.χ., ΡΙ3 αναστολείς κινάσης). Δύο παιδιατρικές LGas έτρεφε μεταλλάξεις στο

MYC

, μια καθιερωμένη ομόλογο ογκογονίδιο του

NMYC

, η οποία ενισχύεται και ενδεικτικό της κακής πρόγνωσης σε παιδιατρικούς νευροβλάστωμα [20], [21]. Έτσι, όγκου μετάλλαξη προφίλ μπορεί να βελτιώσετε τη διαστρωμάτωση των ασθενών ή /και την πρόγνωση της νόσου σε ορισμένες παιδιατρικούς καρκίνους του εγκεφάλου.

BRAF

μεταλλάξεις V600E είναι κοινές στην Παιδιατρική Gangliogliomas

Επανάληψη της

BRAF

τόπος έχει αναφερθεί ως η πιο συχνή ανωμαλία σε παιδιατρικούς LGas (66% [18]), ενώ ενεργοποιώντας σημειακές μεταλλάξεις στο

BRAF

συμβαίνουν λιγότερο συχνά (4-6%) [22], [23 ]. Εντοπίσαμε την ενεργοποίηση

BRAF

V600E

μεταλλάξεις στο 11% (10/88) των παιδιατρικών LGas-ένα υψηλότερο ποσοστό από ό, τι στο παρελθόν αναφερθεί [22], [23]. Είναι ενδιαφέρον ότι η

BRAF

V600E

μετάλλαξη ήταν πιο διαδεδομένη κατά την ganglioglioma υποτύπου παιδιατρικών LGas (κλασική και μη κλασική? 8/14 όγκους, ρ = 0,00005), όπως φαίνεται στο Σχ. 2.

BRAF

V600E

μεταλλάξεις δεν ταυτοποιήθηκαν σε κανένα από τα ενήλικα όγκων που εξετάστηκαν, αν και

TP53

μεταλλάξεις συνήθως συνέβη σε αυτή τη ρύθμιση (10/28 περιπτώσεις). Αντίθετα, μόνο το 2 παιδιατρική γλοιώματα έτρεφε μια

TP53

μετάλλαξη? και στις δύο περιπτώσεις, αυτό ήταν που συμπίπτει με μια άλλη μετάλλαξη (

EGFR

και

FLNB

, αντίστοιχα). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι OncoMap θα μπορούσε να διευκολύνει την ταξινόμηση των χαμηλής ποιότητας αστροκυτώματα και άλλα είδη σπάνιων όγκων με βάση γενετικά κριτήρια

Συντομογραφίες:. PA – pilocytic αστροκύτωμα, WHO βαθμού Ι? LGG, nos – χαμηλού βαθμού γλοίωμα, δεν ορίζεται διαφορετικά, WHO βαθμού Ι ή ΙΙ? GG – ganglioglioma? Α2 – αστροκύτωμα, βαθμού ΙΙ κατά WHO? HG – υψηλής ποιότητας γλοίωμα, WHO βαθμού ΙΙΙ ή IV. Οι παρενθέσεις δείχνουν συνολικό αριθμό των δειγμάτων (στο διάγραμμα) ή τον αριθμό των δειγμάτων με ενδεικνυόμενης μετάλλαξη (έξω από το διάγραμμα).

Η

Συζήτηση

Η κλινική ογκολογία είναι στη μέση της μετάβασης από ένα μοντέλο θεραπείας υπαγορεύεται κυρίως από την ανατομική περιοχή προέλευσης του όγκου σε εκείνο στο οποίο η γενετική ή /και μοριακά χαρακτηριστικά διαδραματίζουν αποφασιστικό ρόλο στην καθοδήγηση επιλογή της θεραπείας. Επιπλέον, ο πολλαπλασιασμός των στοχευμένων παραγόντων στην ανάπτυξη και κλινική πρακτική απαιτεί την ταυτόχρονη εφαρμογή του συντρόφου διαγνωστικές προσεγγίσεις που εμπλουτίζουν για υποπληθυσμών πιο πιθανό να ανταποκριθεί σε ένα φάρμακο. Κατά συνέπεια, οι νέες διαγνωστικές προσεγγίσεις που απαιτούνται για προφίλ οιουδήποτε όγκου για περιστροφική γενετικές μεταλλάξεις σε πολλαπλά γονίδια του καρκίνου ταυτόχρονα, σε αντίθεση με τις περισσότερες υπάρχουσες δοκιμές που εστιάζουν σε επιμέρους γονίδια (ή πρωτεΐνες).

Σε αυτή τη μελέτη, προσαρμόσαμε genotyping- με βάση προφίλ μετάλλαξης για τον χαρακτηρισμό των δύο κατεψυγμένων και FFPE που προέρχονται από τα δείγματα όγκων που εκτείνονται σε 12 τύπους καρκίνου. Εμείς σθεναρά ανιχνευθεί γονίδιο του καρκίνου μεταλλάξεις που άμεση κλινική χρήση και την αντοχή στα υπάρχοντα παράγοντες προβλέψουμε όπως αναστολείς κινάσης τυροσίνης (π.χ.,

EGFR

και

KRAS

μεταλλάξεις). Εντοπίσαμε επίσης πολλαπλές μεταλλάξεις που μπορεί να καθοδηγήσει τη χρήση των αναδυόμενων παραγόντων. Τέλος, σε μια ειδική έρευνα της παιδιατρικής αστροκύτωμα χαμηλού βαθμού, έχουμε αποδείξει την ιδιαίτερη αξία αυτή η πλατφόρμα μπορεί να έχει για το σπάνιο «ορφανά» καρκίνους με τον προσδιορισμό των μεταλλάξεων που μπορεί να ενημερώσει μοριακής ταξινόμησης καθώς και νέες θεραπευτικές προοπτικές για τα παιδιά με αυτές τις κακοήθειες.

Διαγνωστική παρεμβάσεις που εισάγουν επιτυχώς όγκου μετάλλαξη προφίλ στην κλινική πρακτική πρέπει να παρακάμπτουν αρκετές τεχνική και υλικοτεχνική εμπόδια. Η σημαντικότερη από αυτές είναι η επίτευξη ισχυρών επιδόσεων σε δείγματα που προέρχονται από FFPE ή /και αρχειακό υλικό όγκου. Βρήκαμε ότι η OncoMap πλατφόρμα επιτυγχάνεται σχεδόν 100% ειδικότητα τόσο φρέσκο ​​/κατεψυγμένο και FFPE DNA προερχόμενο όγκου, υποδεικνύοντας ότι ψευδώς θετικό κλήσεις μετάλλαξη είναι πιθανόν να είναι σχετικά σπάνια με αυτήν την προσέγγιση. Θα πρέπει να σημειωθεί, ωστόσο, ότι η επίτευξη αυτού του επιπέδου εξειδίκευσης που απαιτείται η εφαρμογή μιας αναλυτικής σειρά με την οποία τα ανεπεξέργαστα δεδομένα γονοτυπική υποβάλλεται σε αυτοματοποιημένη κλήση βάση που ακολουθείται από μη αυτόματο έλεγχο των υποψήφιων μεταλλάξεων και την επικύρωση όλων των υποψηφίων χρήση εναλλακτικών χημείες γονότυπου. Έτσι, η κλινική εφαρμογή της OncoMap πρέπει να ενσωματώνει τόσο γονιδιωματικής την παραγωγή δεδομένων και βιοπληροφορικής αναλυτικής εμπειρογνωμοσύνης σε μοριακή παθολογία ή κλινική διαγνωστική ρύθμιση.

Η ευαισθησία της OncoMap επηρεάζεται από εγγενείς τεχνολογικές παραμέτρους, τα ατομικά χαρακτηριστικά απόδοσης της ανάλυσης μετάλλαξης, και η την ποιότητα και την καθαρότητα του ιστού του όγκου. Η ευαισθησία της δοκιμασίας 89-94% που παρατηρήθηκε στη μελέτη αυτή είναι επαρκής για πολλούς μεταφραστική και κλινικές εφαρμογές? Ωστόσο, υπάρχουν περιστάσεις όπου βέβαια ακόμη υψηλότερες ευαισθησίες δοκιμασία θα είναι επιθυμητή. Εμπλουτισμός των καρκινικών κυττάρων με τη χρήση πυρήνα βελόνα ανατομή ή λέιζερ συλλαμβάνει μικροδιατομής πριν από προφίλ μετάλλαξη μπορεί να προσφέρει μια λεωφόρος για να ενισχύσει την ευαισθησία, ιδιαίτερα στους όγκους, όπου η στρωματικών ή φλεγμονωδών περιεχόμενο είναι υψηλή. Ταυτόχρονα, η ευαισθησία του OncoMap υπερβαίνει κατά πολύ εκείνη της αλληλούχισης Sanger, η οποία παραμένει το χρυσό πρότυπο για πολλές γενετικές διαγνωστικές προσεγγίσεις. Επιπλέον, το εύρος των γονιδίων του καρκίνου και των ειδικών μεταλλάξεων ανακρίθηκε από OncoMap που υποστηρίζεται από τις προαναφερθείσες αυστηρή ευαισθησία και ειδικότητα προσδιορισμοί-ουσιαστικά υπερβαίνει εκείνη των υφιστάμενων εμπορικών φασματομετρίας μάζας με βάση το γονιδιακό προφίλ προσεγγίσεις [24].

γονιδίωμά καθοδηγείται θεραπείες μπορεί να διαδραματίσει έναν ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο σε σπάνιες όγκους όπου μεγάλες τυχαιοποιημένες μελέτες είναι συχνά ανέφικτη. Για να δοκιμαστεί η ικανότητα του OncoMap για τον εντοπισμό ασυνήθιστο ή /και δείγμα περιορισμένη όγκους που μπορούν να επωφεληθούν από συγκεκριμένες κατηγορίες θεραπευτικών παραγόντων, μπορούμε προφίλ ενός πάνελ των παιδιατρικών γλοιώματα χαμηλής ποιότητας γονιδιακών μεταλλάξεων κοινή μορφή καρκίνου. Γνώση των γενετικών ανωμαλιών που υπάρχουν στο παιδιατρικό LGas είναι περιορισμένη, αν και πρόσφατες μελέτες έχουν εντοπίσει

BRAF

μεταθέσεις, χρωμοσωμικές επαναλήψεις, και περιστασιακές μεταλλάξεις βάσης σε χαμηλού βαθμού αστροκυτώματα [18], [25], καθώς και διάφορες μηχανισμοί για την ενεργοποίηση του μονοπατιού ERK /ΜΑΡΚ σε pilocytic αστροκυτώματα [23]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι αναστολείς μικρού μορίου του

BRAF

ήδη μελέτες σε ενήλικες μπορεί επίσης να αντιπροσωπεύει πολλά υποσχόμενη θεραπευτική για υποσύνολα αυτών των όγκων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η συχνότητα των

BRAF

σημειακές μεταλλάξεις σε παιδιατρικούς LGas ως σύνολο μπορεί να είναι υψηλότερη από ό, τι έχει ήδη αναφερθεί, και συγκεκριμένα ότι gangliogliomas κατέχουν

BRAF

V600E μεταλλάξεις σε πολύ υψηλή συχνότητα . Η παρατήρηση αυτή μπορεί επίσης να βοηθήσει στη διαγνωστική ταυτοποίηση αυτών των όγκων. Gangliogliomas, τα οποία τείνουν να είναι νωχελικός όγκους, μπορεί συνεπώς να μοιραστώ κάποιες ιδιότητες με δερματικό σπίλοι, των οποίων οι πρόδρομοι των μελανοκυττάρων και προέρχονται από το νευρικό σύστημα (νευρική ακρολοφία), παρουσιάζουν νωχελικός ανάπτυξη, και όπου η

BRAF

V600E μετάλλαξη είναι επίσης πολύ διαδεδομένη. Εντοπίσαμε επίσης αρκετές μεταλλάξεις που δεν έχουν προηγουμένως αναφερθεί σε παιδιατρικούς αστροκύτωμα, μερικές από τις οποίες (

EGFR

,

PIK3CA

,

PDGFRA

) αντιπροσωπεύουν δυνητικά προσφυγής στόχους. Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [22], [26], [27] παρατηρούμε ότι οι μεταλλάξεις στα γονίδια που παρατηρείται συχνά σε ενήλικες αναπλαστικό αστροκύτωμα ή /και γλοιοβλαστώματα, όπως

TP53

ή

PTEN

, σπάνια συναντώνται μόνο στην παιδιατρική pilocytic και χαμηλού βαθμού διάχυτη αστροκυτώματα.

Παρά το γεγονός ότι τα ευρήματά μας υποστηρίζουν την κλινική σκοπιμότητα της υψηλής απόδοσης προφίλ μετάλλαξη του όγκου, αναγνωρίζουμε ότι η προσέγγιση φασματομετρίας μάζας του γονότυπου έχει ορισμένους περιορισμούς που ενδέχεται να απαγορεύουν εφαρμογή της ως οριστική πλατφόρμα διάγνωσης του καρκίνου. Αυτές περιλαμβάνουν την πεπερασμένο αριθμό ειδικών σημειακών μεταλλάξεων που μπορεί να αναλυθεί (ορίζεται

a priori

εντός ενός υποσυνόλου γονιδίων καρκίνου), δυσκολίες στο σχεδιασμό δοκιμασίες προσδιορισμού του γονότυπου που αναγνωρίζουν μικρές παρεμβολές ή διαγραφές ( «in-dels») μεγαλύτερο από ~50bp σε μέγεθος, μια ανικανότητα να εντοπίσετε τις περισσότερες μεταλλάξεις TS γονίδιο (το οποίο μπορεί να συμβεί οπουδήποτε εντός του γονιδίου, και όχι μόνο «hotspot» περιοχές) ή πρόσθετα γονιδιωματική αλλοιώσεις, όπως ενισχύσεις γονίδιο υψηλού επιπέδου ή διαγραφές που μπορεί επίσης να επηρεάσει βασικά γονίδια του καρκίνου , και το κάπως υψηλής έντασης εργατικού δυναμικού χαρακτήρα του αυτόματου ελέγχου και ορθογώνια επικύρωση της δοκιμασίας. Μακροπρόθεσμα, η προσαρμογή των νέων τεχνολογιών γονιδιωματικής, όπως η αλληλούχιση δεύτερης γενιάς μπορεί να προσφέρει ένα ενοποιητικό προσέγγιση για την ολοκληρωμένη προφίλ μετάλλαξη του όγκου. Ωστόσο, η OncoMap πλατφόρμα μπορεί να προσφέρει μια άμεση οδός μέσω της οποίας θα μπορούσε να ξεκινήσει συστηματική προφίλ μετάλλαξης για την καθοδήγηση των κλινικών σχεδιασμό δίκη, καθώς και η χρήση των υφιστάμενων στοχευμένων παραγόντων σε πολλούς τύπους καρκίνου.

Εν κατακλείδι, η μελέτη αυτή αποτελεί την πρώτη μεγάλης κλίμακας εφαρμογή του OncoMap πλατφόρμα για προφίλ μετάλλαξης των όγκων στην κλινική και αρχειακό ρύθμιση. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα αυτά ζωντανέψει ένα πλαίσιο όπου η συστηματική προφίλ των όγκων μπορεί να αναδειχθεί ως ένα ευρέως εφικτά μέσα για να καθοδηγήσει τη διαστρωμάτωση των ασθενών για την ορθολογική θεραπευτική του καρκίνου. Παρά την εγγενή πολυπλοκότητα του καρκίνου, που ενσωματώνουν την αυξανόμενη γνώση της μοριακής βάσης του καρκίνου σε δύο μοριακές επιδημιολογικές μελέτες μεγάλης κλίμακας και, τελικά, την κλινική διαδικασία λήψης αποφάσεων θα πρέπει τελικά να επιταχύνει την έλευση των πιο αποτελεσματικών αντικαρκινικών θεραπειών.

Υποστήριξη πληροφορίες

Μέθοδοι S1.

Profiling κρίσιμες μεταλλάξεις του γονιδίου του καρκίνου σε κλινικά δείγματα όγκων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0007887.s001

(0,07 MB DOC)

Πίνακα S1.

OncoMap 3 βασικές αλληλουχίες εκκινητών PCR και ανιχνευτή επέκταση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0007887.s002

(0,13 MB XLS)

Πίνακας S2.

KRAS

αλληλουχίες των εκκινητών PCR G12 χρησιμοποιείται για να παράγει προϊόντα ενίσχυσης για Sanger και Illumina αλληλουχίας

doi:. 10.1371 /journal.pone.0007887.s003

(0,03 MB XLS)

Εικόνα S1.

Απόδοση των OncoMap σε νωπά κατεψυγμένα και FFPE που προέρχονται από DNA. Οι χειριστής του δέκτη χαρακτηριστικές καμπύλες (ROCs) σχεδιάζεται για τα νωπά κατεψυγμένα (αριστερό πάνελ) και FFPE που προέρχονται από (δεξιά πλευρά) DNA, έναντι μονής κατεύθυνσης αναλύσεις OncoMap KRAS, χρησιμοποιώντας δεδομένα Illumina ως αλήθεια-σετ (βλέπε Μέθοδοι S1).

doi : 10.1371 /journal.pone.0007887.s004

(0,06 MB PPT)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Νικολάου Wyhs, Benjamin Ebert και Sewit Tekki για τεχνική εμπειρογνωμοσύνη? Σουελί Marie για την παροχή δειγμάτων καρκινώματος. αλληλουχίας Sanger ολοκληρώθηκε σε Agencourt Bioscience Corporation, αλληλουχίας Illumina σε συμπαράγοντα Genomics.