Αφηρημένο

Οι μελέτες έχουν δείξει ότι το miR-221 και miR-222 είναι απελευθερωμένη σε πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη. Παρ ‘όλα αυτά, ο βιολογικός ρόλος και οι υποκείμενοι μηχανισμοί της miR-221 και miR-222 στην παθογένεση της ανδρογόνο-ανεξάρτητων καρκίνο του προστάτη δεν είναι ακόμη σαφής. Ο πολλαπλασιασμός, η απόπτωση, η διάκριση του κυτταρικού κύκλου, και της ικανότητας μετανάστευσης των κυττάρων του προστάτη προσδιορίστηκαν ακόλουθη επιμόλυνση miR-221 ή miR-222 αναστολέα. Η βιολογική επίδραση και η ρύθμιση της SIRT1 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη διερευνήθηκαν. MiR-221 και miR-222 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε κύτταρα PC-3 σε σύγκριση με τα LNCaP κύτταρα. Μετά miR-221 ή miR-222 έκφραση ανεστάλη, τα ποσοστά πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των PC-3 κυττάρων μειώθηκε και το ποσοστό απόπτωσης αυξήθηκε. Επιπλέον, SIRT1 πρωτεΐνη ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κύτταρα μετά επιμολύνθηκαν με miR-221 ή miR-222 αναστολέα. Κύτταρα μετεμβολιασμένα με siSIRT1 έδειξαν αυξημένη μετανάστευση και μειωμένο ρυθμό απόπτωσης, αλλά δεν υπήρξε καμία σημαντική επίδραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με τους ελέγχους. Υπήρξε μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ miR-221 ή miR-222 και SIRT1, αλλά εντοπίστηκε καμία άμεση σχέση στόχο. Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι miR-221 και miR-222 είναι εντόνως εκφρασμένη σε κύτταρα PC-3. η αναστολή τους οδηγεί σε μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και τη μετανάστευση και την αυξημένη απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Αυτά τα αποτελέσματα είναι πιθανώς διαμεσολαβείται από τα πάνω ρύθμιση της SIRT1

Παράθεση:. Yang Χ, Γιανγκ Υ, Gan R, Zhao L, Λι W, Zhou H, et al. (2014) κάτω ρύθμιση των mir-221 και mir-222 Συγκρατήστε τον καρκίνο του προστάτη τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση Αυτό οφείλεται εν μέρει προκαλείται από την ενεργοποίηση του SIRT1. PLoS ONE 9 (6): e98833. doi: 10.1371 /journal.pone.0098833

Επιμέλεια: Γιώργος Καλίν, το Πανεπιστήμιο του Τέξας, MD Anderson Cancer Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 Φλεβάρη του 2014? Δεκτές: 7 Μαΐου 2014? Δημοσιεύθηκε: 3 Ιούνη του 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας και Zhejiang Ίδρυμα Επιστημών επαρχιακή Φυσικό (81170257 και Y2110513). Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται επίσης εν μέρει από το MD Anderson Cancer Center Ταμείο εκκίνησης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο για τους άνδρες στο δυτικό κόσμο. Περίπου 238.590 νέες περιπτώσεις διαγνώστηκαν το 2013 [1]. Οι περισσότεροι ΠΑΠ αναπτύσσονται αργά και εξαρτώνται από ανδρογόνα για την ανάπτυξη? ως εκ τούτου, να ανταποκρίνονται στις ανδρογόνων θεραπεία στέρησης (ADT). ADT είναι αποτελεσματική, αλλά νόσο οι περισσότεροι ασθενείς »θα γίνει τελικά πυρίμαχα και την πρόοδο από ανδρογόνο-εξαρτώμενη προστάτη σε ανεξάρτητο από ανδρογόνο (ευνουχισμός ανθεκτικά) ΣΕΣΣ, η οποία έφερε μεγάλες προκλήσεις για τη θεραπεία του προστάτη [2]. Έτσι, προσδιορίζοντας μια νέα και αποτελεσματική θεραπευτική προσέγγιση έχει γίνει το επίκεντρο για την καταπολέμηση της ΣΕΣΣ.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά (περίπου 21-23 νουκλεοτίδια), μη-κωδικοποίησης πρωτεΐνης RNA που λειτουργούν ως μετα μεταγραφική ρυθμιστές των γονιδίων στόχων. Αυτά τα μόρια βρίσκονται κυρίως στα ευκαρυωτικά και είναι πλήρως ή εν μέρει ενσωματωθεί, κατά τρόπο συμπληρωματικό, με τον στόχο mRNA 3’UTR, με αποτέλεσμα την υποβάθμιση ή μετάφραση αναστολή του mRNA στόχου. miRNA λειτουργίες στην μεταγραφική και μετα-μεταγραφική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, επηρεάζοντας πολλές κυτταρικές βιολογικές διεργασίες [3]. Τα miRNAs εμπλέκονται σε πολλές διεργασίες κυτταρική διαφοροποίηση, πολλαπλασιασμό και την απόπτωση που συνδέονται στενά με την ογκογένεση [3]. Πρόσφατα, κάποιοι παρεκκλίνοντα εκφράζεται miRNAs ανακαλύφθηκαν σε PCa και άλλους καρκίνους, υποδεικνύοντας ότι παίζουν κρίσιμο ρόλο στον μοριακό μηχανισμό παθογένεσης και εξέλιξης του καρκίνου [2], [4] – [8]. Επιπλέον, μελέτες έχουν δείξει ότι miR-221 και miR-222 είναι απορυθμισμένη σε πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του προστάτη [9] – [14], και οι δύο miRNAs παίζουν σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση και την πρόοδο από εξαρτώμενων από ανδρογόνα PCa να ανεξάρτητος από ανδρογόνο προστάτη [15] – [17]. Παρ ‘όλα αυτά, τα αποτελέσματα είναι ασυνεπής και ακόμη αμφιλεγόμενο και οι υποκείμενοι μηχανισμοί δεν είναι ακόμη σαφές.

Στα θηλαστικά, σιωπηλή ρυθμιστή πληροφοριών 1 (SIRT1) είναι ένα μέλος της οικογένειας sirtuin και έχει αποδειχθεί ότι είναι εξαιρετικά ομόλογο με SIRT2 σε ζύμη [18]. SIRT1 είναι επίσης γνωστή ως εξαρτώμενη από ΝΑϋ αποακετυλάσης ιστόνης και εμπλέκεται στην ρύθμιση πολλών φυσιολογικών διεργασιών, όπως του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της φλεγμονώδους απόκρισης, του κυτταρικού κύκλου, και η κυτταρική μετανάστευση [19]. Ωστόσο, είναι άγνωστο αν SIRT1 δρα ως ένα γονίδιο υποκινητή γονιδίου ή καταστολέα, λόγω της πολυπλοκότητας του [20] – [23]. ο ρόλος της στον καρκίνο δεν έχει καλά καθορισμένο. Για παράδειγμα, SIRT1 έδειξε αντι-ογκογόνο δράση και επίπεδο έκφρασης του συνδέθηκε με πρόγνωση στον καρκίνο του παχέος εντέρου [24], [25]. Παρ ‘όλα αυτά, θεωρείται ένα ογκογονίδιο στον καρκίνο του μαστού [26]. Στο προστάτη, ωστόσο, ο ρόλος της SIRT1 είναι ακόμα αμφιλεγόμενη [27], [28].

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε ρυθμιστικό ρόλο τους miR-221 και miR-222 και το δυναμικό τους μοριακούς μηχανισμούς τους σε προστάτη με επιμόλυνση miR-221 ή miR-222 αναστολέα στα κύτταρα του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση πλασμιδίου

Ανθρώπινο προστάτη κύτταρα PC-3 (ανδρογόνα-ανεξάρτητους ) και LNCaP κύτταρα (εξαρτώμενη από ανδρογόνο) αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο Βιοχημείας και Βιολογίας Κυττάρου, κινεζική Ακαδημία Επιστημών. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε F12 (Gibco, Carlsbad, CA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Gibco, Carlsbad, CA) στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO2.

Η pcDNA3.1- κενό φορέα (ρΕΧ-5), pcDNA3.1-HSA-miR-221 σφουγγάρια αναστολέα (miR-221 αναστολέα), pcDNA3.1-HSA-miR-222 σφουγγάρια αναστολέα (miR-222 αναστολέα), pGPU6-άδειο (pGPU6) και pGPU6-siSIRT1 (siSIRT1) συντέθηκαν από GenePharma (Σαγκάη, Κίνα). Η άγριου τύπου περιοχή SIRT1 3’ΙΙΤΡ κατασκευάστηκε σε psiCHECK-2 από GenePharma (Σαγκάη, Κίνα). PC-3 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% -90% συρροή και επιμολύνθηκαν με πλασμίδια χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (DNA /Λιποφεκταμίνη 2000 = 1/2) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​F12 που περιέχει 10% FBS. Μια σταθερή έκφραση επιμόλυνση των κυτταρικών γραμμών δημιουργήθηκε μετά κύτταρα είχαν επωάζονται σε πλήρες μέσο F12 με G418 (1000 μg /ml) για 15 ημέρες. Επαληθεύσαμε τη κλώνους χρησιμοποιώντας western blot και PCR σε πραγματικό χρόνο, και συγκέντρωσε τα επιτυχή κλώνων για τα πειράματα. Τα αποτελέσματα ελέγχου του δυτικού στυπώματος που φαίνεται στο Σχήμα S1. Επιπλέον, όλα τα πειράματα επιβεβαιώθηκε επίσης από παροδική επιμόλυνση.

πολλαπλασιασμού των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου

δοκιμασία

Για την ανίχνευση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, που σπέρνονται PC 3-κυττάρων με έδρα σταθερή έκφραση (pEX- 5, miR-221 αναστολέα, miR-222 αναστολέα, pGPU6, ή siSIRT1) σε 96-πηγαδιών μικροπλάκες σε πυκνότητα 2 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο και τους επωάστηκαν για διάφορες χρονικές περιόδους (1 έως 7δ). Μετά από αυτό, 10 μΐ μετρητή κυττάρων Kit-8 (CCK-8) αντιδραστήριο σε κάθε φρεάτιο και επωάζονται τα κύτταρα στους 37 ° C για 1,5 ώρες. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτροφωταύγειας ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) αναγνώστη.

Για τον προσδιορισμό του κυτταρικού κύκλου, επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 12 φρεατίων για 48 ώρες. Τα κύτταρα σε κάθε φρεάτιο συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με 70% παγωμένη αιθανόλη επί 24 ώρες στους -20 ° C. Αφού πλύθηκε με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) τρεις φορές, επωάστηκαν με RNase για 1 ώρα σε πάγο και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο για 15 λεπτά σε πάγο. Η κατανομή του DNA μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής σε 4 ώρες.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις 2000 rpm. Αφού πλύθηκε με PBS τρεις φορές, αυτά χρωματίστηκαν με αννεξίνη V-ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (FITC) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) για 15 λεπτά, προστατευμένο από το φως. Ο ρυθμός κυτταρικής απόπτωσης προσδιορίσθηκε με κυτταρομετρία ροής σε 1 ώρα.

επούλωσης τραυμάτων δοκιμασίας και transwell μετανάστευση δοκιμασία

Ένα επούλωσης πληγής δοκιμασία διεξήχθη για να μιμηθεί την κυτταρική μετανάστευση [26]. Εν συντομία, επιμολυσμένα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μια πλάκα έξι φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα ανά φρεάτιο. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή και πολλές γραμμές τραύματος γρατζουνιστεί κάθετα προς τα κάτω με ένα ρύγχος πιπέτας 200- μλ. Αφού πλύθηκε με PBS τρεις φορές, τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει 1.5% ορό. Το πλάτος της πληγής προσδιορίσθηκε κάθε 24 ώρες για μια περίοδο 72 h στους × 100 κάτω από ένα μικροσκόπιο Nikon Eclipse TS100 (Nikon, Ιαπωνία). Οι τιμές εκφράζονται ως ποσοστό του κλεισίματος του τραύματος, η οποία υπολογίζεται ως εξής: ποσοστό του κλεισίματος = 1- (πλάτος

t

/πλάτος

0

) × 100 τραυμάτων %.

για την δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων Transwell, τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής για 24 ώρες, επαναιωρήθηκαν με μέσο F12 χωρίς ορό, και εμβολιάζονται (5 × 10

4 κύτταρα) μέσα σε ένα 24-φρεατίων transwell με ένα ένθετο μεμβράνη πόρου 8- μm (Corning, USA). μέσου F12, συμπληρωμένο με 10% FBS, τοποθετήθηκε στον κάτω θάλαμο ως χημειοελκτικό. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες. Τα κύτταρα που διεισδύσει στην μεμβράνη μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά, χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο (Nikon, Ιαπωνία). Εισβολή κύτταρα εκλούστηκαν κάτω με οξικό οξύ. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 590 nm με συσκευή ανάγνωσης ELISA.

αντίστροφη μεταγραφή και σε πραγματικό χρόνο

αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, το ολικό RNA εκχυλίστηκε από καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen , USA) ακολουθώντας τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Για miRNA και SIRT1 αντίστροφη μεταγραφή, 500 ng ολικού RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα σε cDNA με miRNA-ειδικούς εκκινητές RT (RiboBio, Κίνα) και τυχαία εκκινητή (Takara, Japan), αντιστοίχως. Η γονιδιακή έκφραση μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου αλυσίδα ποσοτικής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιώντας ένα Applied Biosystems 7500 Fast Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας και SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Germany) υπό τις ακόλουθες συνθήκες: μετουσίωση στους 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα και ανόπτηση και επέκταση στους 60 ° C για 30 sec. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης miRNA και mRNA ομαλοποιήθηκαν με U6 και β-ακτίνη, αντίστοιχα.

Western

ανάλυση κηλίδος

Εβδομήντα δύο ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν με την παρουσία ενός κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και φυγοκεντρείται σε 12,500 rpm για 20 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο κλάσμα συλλέχθηκε και η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δικιγχονινικού οξέος προσδιορισμού πρωτεΐνης (Shenggong Bio-Tech Co, Ltd, Shanghai, Κίνα). Ένα κλάσμα 80 μα μετουσιωμένη πρωτεΐνη από κάθε δείγμα εφαρμόστηκε σε ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου δωδεκύλ θειικού νατρίου 10% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα για 2 ώρες σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, που ακολουθείται από επώαση με πρωτογενές αντίσωμα (αραίωση 1:2000, Abcam, USA) στους 4 ° C όλη τη νύκτα και υπεροξειδάση αρμορακίας δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο (1:1000 αραίωση, Abcam , USA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Οι κηλίδες κατόπιν επωάστηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια για 2 λεπτά. Τα σήματα ανιχνεύονται και προσδιορίζονται ποσοτικά με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας Ποσότητα Ένα λογισμικό. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος για δεδομένα κανονικοποιούνται έκφραση

πρόβλεψη στόχου SIRT1 και δραστικότητα λουσιφεράσης δοκιμασία

miRNA στόχους προβλέφθηκαν χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων Miranda (http:. //www.microrna. org /). Για την δοκιμασία δραστικότητας λουσιφεράσης, νουκλεοτίδια 2341 να 2 731 (ο πλήρης προβλεπόμενη miR-221 και miR-222 θέση στόχο του SIRT1-3’UTR) εισήχθησαν καθοδικά του γονιδίου της λουσιφεράσης της Renilla σε ένα /λουσιφεράση πυγολαμπίδας πλασμίδιο αναφοράς Renilla, psiCHECK- 2 (GenePharma, Σαγκάη, Κίνα). κύτταρα PC-3 επιμολύνθηκαν με 0.5 μg πλασμιδίων ανταποκριτή ανά φρεάτιο συν miR-221 ή miR-222 πλασμίδιο αναστολέα. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, Renilla /πυγολαμπίδας δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε με δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης διπλή (Promega, USA) σε μία αυτόματη συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (Thermo, USA).

Στατιστική ανάλυση

Όλα στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS έκδοση λογισμικού 17.0 (Chicago, Illinois, USA). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως η μέση τιμή ± SEM. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με ανάλυση διακύμανσης ή δύο-tailed t-test του Student. Μια τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Αποτελέσματα

Η έκφραση της mir-221 και mir-222 στα κύτταρα PCA

miR-221 ήταν άκρως εκφράζεται σε PC-3 κυττάρων σε σύγκριση με LNCap (Ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 1Α). Παρομοίως, miR-222 ήταν επίσης σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα PC-3 σε σύγκριση με LNCap (Ρ & lt? 0,01) (Σχήμα 1Β). Η επιμόλυνση με αναστολέα miR-221 κατέστειλε σημαντικά την έκφραση του miR-221 σε κύτταρα PC-3 (Ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 1 C). Ομοίως, miR-222 έκφρασης μειώθηκε σημαντικά μετά την επιμόλυνση του αναστολέα miR-222 (P & lt? 0,01). (Εικόνα 1Δ)

(Α) επίπεδα miR-221 στο PC-3 και LNCaP κύτταρα. (Β) επίπεδα miR-222 στο PC-3 και LNCaP κύτταρα. (C) miR-221 επίπεδα σε κύτταρα PC-3 μετά την επιμόλυνση με ρΕΧ-5 (κενός φορέας πλασμίδιο) ή αναστολέα miR-221. (D) miR-222 επίπεδα σε κύτταρα PC-3 μετά την επιμόλυνση με ρΕΧ-5 ή miR-222 αναστολέα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα.

* P & lt? 0,05,

** P & lt?. 0.01

Η

Επιπτώσεις της mir-221 αναστολέα και mir-222 αναστολέας στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την κατανομή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε PC- 3 κύτταρα

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα (ρΕΧ-5), κύτταρα επιμολυσμένα με miR-221 αναστολέα ή αναστολέα miR-222 έδειξαν μειωμένη σημαντικά τον πολλαπλασιασμό την πέμπτη, έκτη, και έβδομη ημέρα (Ρ & lt? 0,01 έως 0,05).

κύτταρα PC-3 επιμολύνθηκαν με άδειο φορέα πλασμιδίου αναστολέα (ρΕΧ-5), αναστολέα miR-221, ή miR-222. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία CCK-8. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων επιμολυσμένων με miR-221 αναστολέα ή αναστολέα miR-222 ήταν μειωμένη σε σύγκριση με εκείνη επιμολυσμένα με ρΕΧ-5. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα.

*, # Ρ & lt? 0.05 vs ρΕΧ-5,

**, ## Ρ & lt? 0.01 vs ρΕΧ-5

Η

Μια ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι 70,2 ± 1,8% της. κύτταρα επιμολυσμένα με ρΕΧ-5 ήταν στις φάσεις Ο0 /Ο1, ενώ 87.1 ± 2.0% και 81.9 ± 0.9% των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με miR-221 αναστολέα και miR-222 αναστολέα ήταν σε G0 /G1, αντίστοιχα (Ρ & lt? 0,01) ( Τα Σχήματα 3 Α και Β). Η επιμόλυνση με miR-221 αναστολέα ή αναστολέα miR-222 οδήγησε σε ένα πολύ χαμηλότερο ποσοστό των κυττάρων στη φάση S σε σύγκριση με εκείνους που μορφομετατρέπονται με ρΕΧ-5 (4.9 ± 1.9% ή 9.9 ± 1.1% έναντι 21.9 ± 1.7%, Ρ & lt? 0,01 ). Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στα κύτταρα σε G2 /M φάσεις μεταξύ των ομάδων.

(Α) Cell DNA διανομή περιεχομένου σε κάθε φάση. (Β) Ποσοστό κυττάρων που κατανέμεται σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου. **

## P & lt? 0.01 vs ρΕΧ-5

Η

Τα ποσοστά απόπτωσης των PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-221 αναστολέα ή miR-222 αναστολέα αυξήθηκαν κατά 2,8 φορές. και 2,6-φορές, αντίστοιχα, σε σύγκριση με εκείνους που μορφομετατρέπονται με ρΕΧ-5 (Ρ & lt? 0,05). (Σχήματα 4Α και Β)

(Α) διανομή αποπτωτικός κυτταρικός από PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με ρΕΧ-5 miR -221 αναστολέα ή miR-222 αναστολέα με κυτταρομετρία ροής. (Β) Ποσοστό σχετικής απόπτωση κάθε ομάδα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα (

*, # Ρ & lt?. 0.05 vs ρΕΧ-5

Η

Επιπτώσεις της mir-221 αναστολέα και αναστολέα mir-222 στο PC-. 3 κύτταρο μετανάστευση

Όπως φαίνεται στα Σχήματα 5Α και Β, τα ποσοστά κλεισίματος του αναστολέα miR-221 και miR-222 ομάδες αναστολέα ήταν χαμηλότερες από ότι ήταν του ρΕΧ-5 ομάδα. Για παράδειγμα, τα ποσοστά κλεισίματος ήταν 25 ± 1.5% και 34 ± 2,9% για miR-221 και αναστολείς miR-222, αντίστοιχα, έναντι 57 ± 7% για ρΕΧ-5 (Ρ & lt? 0,01 έως 0,05) στις 48 ώρες? και 47 ± 2,7% και 59 ± 9,9 % έναντι 100% (Ρ & lt? 0,01).. παρατηρήθηκαν σε 72 ώρες Παρόμοια ευρήματα για την αναστολή της μετανάστευσης χρησιμοποιώντας δοκιμασία transwell Όπως φαίνεται στα σχήματα 5C και D, η μετανάστευση των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά μετά την επιμόλυνση με miR-221 αναστολέα ή miR-222 αναστολέα σε σύγκριση με τα κύτταρα επιμολυσμένα με ρΕΧ-5 (Ρ & lt? 0,01).

(Α) τραύματος δοκιμασία επούλωσης δείχνει τα ποσοστά κλείσιμο των κυττάρων επιμολυσμένων με ρΕΧ-5 (κενό πλασμίδιο φορέα), αναστολέα miR-221, ή miR-222 αναστολέα. (Β) ποσοτικός προσδιορισμός της πληγής ποσοστά κλεισίματος σε διαφορετικά χρονικά σημεία. δοκιμασίας (C) Transwell δείχνει ότι τα κύτταρα διείσδυσαν το ένθετο μεμβράνη. (D) Ποσοτικός προσδιορισμός του αριθμού των κυττάρων τα οποία διείσδυσαν το ένθετο μεμβράνη. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα.

*, # Ρ & lt? 0.05 vs ρΕΧ-5,

**, ## Ρ & lt? 0.01 vs ρΕΧ-55)

Η

Η αναστολή της mir-221 και mir-222 αύξηση. έκφραση πρωτεΐνης SIRT1

ανάλυση κηλίδος Western κατέδειξε ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης SIRT1 κυττάρων επιμολυσμένων με miR-221 αναστολέα και miR-222 αναστολέα σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με εκείνα των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με ρΕΧ-5 (Ρ & lt? 0,05 και Ρ & lt ? 0,01, αντίστοιχα) (Σχήματα 6Α και Β). Ωστόσο, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα mRNA (Ημερομηνία δείχθηκε στο Σχήμα S2).

(Α) Εκφραση των επιπέδων SIRT1 πρωτεΐνης σε κύτταρα PC-3 μετά την επιμόλυνση προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. (Β) ποσοτικός προσδιορισμός της έκφρασης πρωτεΐνης SIRT1. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα.

* P & lt? 0.05 vs ρΕΧ-5,

## P & lt?. 0.01 vs ρΕΧ-5

Η

Επιδράσεις της SIRT1 στον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, και τη μετανάστευση σε κύτταρα PC-3

έκφραση SIRT1 ήταν σημαντικά κατέστειλε σε κύτταρα επιμολυσμένα με siSIRT1 σε σύγκριση με εκείνους που μορφομετατρέπονται με pGPU6 ως μάρτυρας (Σχήμα 7Α). Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ανάμεσα κύτταρα επιμολυσμένα με siSIRT1 και pGPU6 (Σχήμα 7Β). Εντούτοις, κύτταρα μετεμβολιασμένα με siSIRT1 οδήγησε σε διπλάσια μείωση του ποσοστού της απόπτωσης σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα επιμολυσμένα με pGPU6 (Ρ & lt? 0,01) (Σχήματα 8Α και Β). Είναι ενδιαφέρον ότι η μετανάστευση των κυττάρων επιμολυσμένων με siSIRT1 ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με pGPU6 (Ρ & lt? 0,05). (Σχήματα 9Α και Β)

(Α) τα επίπεδα πρωτεΐνης SIRT1 σε PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με pGPU6 (κενός φορέας πλασμίδιο) ή siSIRT1 (pGPU6-σι-SIRT1) με ανάλυση κηλίδας Western. πολλαπλασιασμό (Β) Cell ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία CCK-8. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων (Ρ & gt? 0,05). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα.

Η

(Α) Η απόπτωση μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής INPC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με pGPU6 ή pGPU6-siSIRT1. (Β) Ποσοστό σχετικής απόπτωση κάθε ομάδα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα.

** P & lt?. 0.01 vs pGPU6

Η

(Α) μεταξύ φρεατίων δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η μετανάστευση των κυττάρων επιμολυσμένων με pGPU6 ή pGPU6-siSIRT1. (Β) Αριθμός κυττάρων διεισδύσει το ένθετο μεμβράνη. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα.

* P & lt?. 0.05 vs pGPU6

Η

SIRT1 δεν είναι άμεσος στόχος του mir-221 και mir-222

Όπως δείχνουν τα στοιχεία Miranda, miR-221 και miR -222 συνδέεται με μία από τις αλληλουχίες στόχου που βρίσκεται στο 3′-UTR του SIRT1 mRNA (Σχήμα 10Α). Για να εξακριβωθεί η άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ miR-221 ή miR-222 και SIRT1 mRNA-3’UTR, δοκιμασία λουσιφεράσης δραστηριότητα διεξήχθη. Ωστόσο, η λουσιφεράση δραστηριότητες δεν απεκάλυψε στατιστικά σημαντικές διαφορές στην miR-221 ή miR-222 επίπεδο σε PC-3 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με SIRT1-3’UTR δεσμευτικός πλασμίδιο ανταποκριτή αλληλουχία σε σύγκριση με τον έλεγχο (Σχήμα 10Β). Με άλλα λόγια, miR-221 και miR-222 δεν δεσμεύτηκε με την αλληλουχία SIRT1 άμεσα και δεν εξασκούν μία άμεση βιολογική αλληλεπίδραση.

(Α) οι συμπληρωματικές θέσεις πρόσδεσης του miR-221 και miR-222 σε SIRT1-3’UTR προβλέπεται από τη βάση δεδομένων Miranda. (Β) δραστηριότητα λουσιφεράσης πραγματοποιήθηκε για την επαλήθευση της δέσμευσης και της αλληλεπίδρασης του miR-221 και miR-222 με SIRT1. Δεν υπήρχαν διαφορές στην δραστικότητα λουσιφεράσης μεταξύ των ομάδων (Ρ & gt? 0,05). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα.

Η

Συζήτηση

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η miR-221 και miR-222 είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε διάφορους καρκίνους και έτσι είναι μελετημένη ογκογονίδια [9], [13], [29]. Πράγματι, μελέτες έχουν δείξει ότι miRNAs επηρεάζουν μια σειρά βιολογικών διεργασιών μέσω συμπληρωματικών σύνδεσης προς ένα ή περισσότερα γονίδια-στόχους. Για παράδειγμα, ρ27, TRPS1, PTEN, ΑΡΧΗ, Timp3, HECTD2 και RAB1A ήταν τα γονίδια στόχους του miR-221 και miR-222 [10], [11] ,. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι αυτά τα miRNAs είναι ένας θεραπευτικός στόχος. Έχουμε δείξει ότι τα επίπεδα του miR-221 και miR-222 ήταν σημαντικά αυξημένα σε κύτταρα PC-3 σε σύγκριση με το σε LNCaP κύτταρα, το οποίο είναι σύμφωνο με άλλα ευρήματα [34]. Κάτω ρύθμιση του miR-221 ή miR-222 έκφραση ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση και την αυξημένη απόπτωση σε κύτταρα PC-3. Επιπλέον, η αποτελεσματική διαμόλυνση miR-221 αναστολέα ή αναστολέα miR-222 οδήγησε σε υψηλότερο ποσοστό των κυττάρων σε φάσεις Ο0 /Ο1 και ένα χαμηλότερο ποσοστό των κυττάρων στη φάση S. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η αναστολή της miR-221 ή miR-222 έκφραση ασκεί σημαντικές βιολογικές επιδράσεις στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, απόπτωση, μετανάστευση κυττάρων, τη διανομή του κυτταρικού κύκλου, και τη μετάβαση των κυττάρων σε κύτταρα PC-3. Η έκφραση του SIRT1 ήταν αυξημένη σε κύτταρα PC-3 μετά miR-221 και miR-222 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η SIRT1 παίζει ένα κατασταλτικό ρόλο κατά του όγκου δράση προαγωγής του miR-221 και miR-222. SIRT1 έχει αναφερθεί να συγκρατήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCap [35]. Wang et al. κατέδειξε μειωμένη έκφραση SIRT1 σε PCa ιστό σε σύγκριση με τα καλοήθη προστατική υπερπλασία ιστό [27]. SIRT1 μπορεί να χρησιμεύσει ως προωθητής όγκου ή ογκοκατασταλτικό, ανάλογα με την ογκογόνο οδό ειδικά για συγκεκριμένα όγκων [19], [22], [24]. SIRT1 θα μπορούσε να δράσει ως ογκογονίδιο με αναστολή ογκοκατασταλτικά γονίδια, όπως το ρ53 [36], και θα μπορούσε να λειτουργήσει ως αντι-ογκογονίδιο με καταστολή αρκετά ογκογονίδια ή ογκοπρωτεϊνών όπως β-κατενίνης και survivin [37], [38].

στη μελέτη μας, να χτυπήσει κάτω SIRT1 σε κύτταρα PC-3 οδήγησε σε αυξημένη κυτταρική μετανάστευση και μειωμένο ρυθμό απόπτωσης, αλλά δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι SIRT1 συμμετέχει στην καταστολή της μετανάστευσης και της προαγωγής απόπτωσης σε κύτταρα PC-3 αλλά έχει μικρή ρόλο στη ρύθμιση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Η αναστολή miR-221 και miR-222 έκφραση ενισχυμένη έκφραση SIRT1, γεγονός που υποδηλώνει ότι η παρατηρούμενη αυξημένη απόπτωση και μειωμένη μετανάστευση μετά την επιμόλυνση με miR-221 ή miR-222 αναστολέα ρυθμίζεται από ενεργοποίηση SIRT1. ικανότητα πολλαπλασιασμού-καταστολή αυτών των κυττάρων μετά miR-221 και miR-222 προς τα κάτω ρύθμιση μπορεί να διαμορφωθεί μέσω άλλων μοριακών οδών, όπως η p27 [31] ή ΑΡΧΗ [39]. Παρά το γεγονός ότι SIRT1-3’UTR υπάρχει στις θέσεις δέσμευσης του miR-221 και miR-222, μια δοκιμασία λουσιφεράσης δεν εντόπισε άμεση σχέση δέσμευσης μεταξύ SIRT1 και miR-221 ή miR-222. Αυτό υποδηλώνει ότι το miR-221 και miR-222 συγκρατήσει έμμεσα την έκφραση της SIRT1 μέσω άλλων μοριακών οδών. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για την ανάδειξη των μηχανισμών και των μοριακών μονοπατιών του miR-221, miR-222, και SIRT1 που εμπλέκονται στην παθογένεια του προστάτη από υπερεκφράζουν τα δύο microRNAs και ρυθμίζοντας την έκφραση της SIRT1 σε διάφορες κυτταρικές σειρές. Πρέπει επίσης να εξεταστεί Διερεύνηση των βιολογικών λειτουργιών του miR-221/222 και SIRT1 και η σχέση τους in vivo, χρησιμοποιώντας ζωικό μοντέλο.

Εν περιλήψει, miR-221 και miR-222 είναι εντόνως εκφρασμένη σε κύτταρα PC-3 . Αναστολή της miR-221 ή miR-222 έκφρασης μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τη μετανάστευση και αυξάνει την απόπτωση στα κύτταρα του προστάτη. SIRT1 πρωτεΐνη είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κύτταρα μετά την επιμόλυνση του miR-221 ή miR-222 αναστολέα. Κύτταρα μετεμβολιασμένα με siSIRT1 εμφανίζουν αυξημένη μετανάστευση και ένα μειωμένο ρυθμό απόπτωσης, αλλά καμία επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι οι βιολογικές επιδράσεις των miR-221 και miR-222 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη που σχετίζεται με SIRT1. Η διαμόρφωση της έκφρασης αυτών των μορίων θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ογκογένεση του καρκίνου του προστάτη. Τα ευρήματα αυτά μπορούν να παρέχουν μια πιθανή θεραπευτική προσέγγιση στον καρκίνο του προστάτη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1. Ταυτότητας των κυττάρων επιμολυσμένων με miR-221 ή miR-222 αναστολέα με κηλίδα Western. 1-8: αριθμημένα κλώνους. Επιτυχής κλώνοι που υποδεικνύεται από τα βέλη ενώθηκαν μαζί για να ελέγξει τα βιολογικά πειράματα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0098833.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2. Έκφραση της SIRT1 mRNA. Real Time PCR διεξήχθη για να μετρηθούν οι αλλαγές SIRT1 mRNA σε PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με ρΕΧ-5, miR-221 αναστολέα ή αναστολέα miR-222. Δεν υπήρξε καμία στατιστική διαφορά μεταξύ των ομάδων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0098833.s002

(ΔΕΘ)