Αφηρημένο

Η ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε γεμσιταβίνη είναι μια σημαντική ανησυχία στη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, και ο μηχανισμός παραμένει ασαφής. Eg5 έχει πρόσφατα αναγνωριστεί ως ένα ελκυστικό στόχο σε χημειοθεραπεία καρκίνου, έτσι νέα στοχευμένη χημειοθεραπεία με αναστολέα Eg5 αναμένεται να βελτιώσει την αντικαρκινική δράση σε γεμσιταβίνη ανθεκτικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Σε αυτή την έρευνα, τα κύτταρα RT112-Gr ήταν 350 φορές λιγότερο ευαίσθητος προς gemcitabine από τα γονικές κυτταρικές σειρές, ενώ τα κύτταρα KU7-Gr ήταν 15 φορές λιγότερο ευαίσθητη σε gemcitabine από τα γονικές κυτταρικές σειρές. Ανθρώπινα ανάλυση OneArray Microarray διεξήχθη για να ληφθεί ευρύ φάσμα πληροφοριών σχετικά με τα γονίδια διαφορικά εκφραζόμενα σε κύτταρα RT112 και RT112-Gr. Η αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα του S (MeO) TLC, ένα Eg5 αναστολέα, αναλύθηκε σε κυτταρικές σειρές RT112-Gr χρησιμοποιώντας δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας. Επιπλέον, η ανασταλτική επίδραση αξιολογήθηκε σε βιολογικό περιβάλλον χρησιμοποιώντας υποδόριο μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου. Σύμφωνα με το αποτέλεσμα των Ανθρωπίνων OneArray® GeneChip, RRM1 και RRM2 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω, ενώ δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή στην Eg5. Trypan blue χρώση επιβεβαίωσε ότι σε συνδυασμό S βιωσιμότητα ομάδα κυττάρων (MeO) TLC S (MeO) TLC και γεμσιταβίνη μειώθηκαν σημαντικά σε κύτταρα RT112-Gr σε σύγκριση με άλλες ομάδες. S (MeO) TLC και S (MeO) TLC + ομάδες γεμσιταβίνης ευδιάκριτα κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με άλλες ομάδες «in vivo. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην ομάδα S (MeO) TLC S (MeO) TLC και gemcitabine + στην επίδραση της αναστολής του καρκίνου της ουροδόχου κύστης in vivo και in vitro. Τα δεδομένα μας απέδειξαν ότι συλλογικά S (MeO) TLC αντιπροσωπεύει μία νέα στρατηγική για τη θεραπεία του ανθεκτικού gemcitabine καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Sun L, Lu J, Niu Ζ, Ding Κ, Bi D, Liu S, et al. (2015) ένας ισχυρός στρατηγική χημειοθεραπευτικά με Eg5 αναστολέα έναντι Γεμσιταβίνη ανθεκτικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 10 (12): e0144484. doi: 10.1371 /journal.pone.0144484

Επιμέλεια: Ιρίνα Β Λεμπέντεβα, το Πανεπιστήμιο Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 16 Οκτωβρίου του 2014? Αποδεκτές: 19 Νοεμ 2015? Δημοσιεύθηκε: 10 του Δεκεμβρίου του 2015

Copyright: © 2015 Sun et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Έχουμε ανεβάσει τα δεδομένα να ArrayExpress. Επανεξέταση των δεδομένων URL:. https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-3495/

Χρηματοδότηση: Το έργο υποστηρίχθηκε από τις επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81202017) (https://www.nsfc.gov.cn), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Shandong (Αρ ZR2011HQ027 και Νο ZR2014HQ041) (https://www.sdnsf.gov.cn), και το Ίδρυμα Επιστήμης και Τεχνολογίας της επαρχίας Shandong (Αρ 2012YD18049) (https://www.sdnsf.gov.cn). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης (BCA) αποτελεί την τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις Ηνωμένες Πολιτείες [1,2]. Περίπου το 25% των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης διαγιγνώσκονται με διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (MIBC), αν και το 75% των νεοδιαγνωσθέντων όγκοι είναι μη-μυϊκή επεμβατική (Ta, Tis, και Τ1)? οι περισσότεροι από αυτούς επαναληφθεί και 15-20% προόδου για να εισβάλει μυϊκός χιτώνας. Και η συντριπτική πλειοψηφία των ειδική για τον καρκίνο θανάτους οφείλονται σε MIBC, οδηγώντας σε τοπική εισβολή και απομακρυσμένη μετάσταση [3, 4]. Η θνησιμότητα της νόσου προτρέπει ουρολόγοι να διερευνήσουν νέες μεθόδους για τη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [5]. Χημειοθεραπεία με γεμσιταμπίνη και σισπλατίνη είναι η πιο δημοφιλής επιλογή για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Η γεμσιταβίνη είναι ένα ανάλογο της δεοξυκυτιδίνης με υψηλή δραστηριότητα εναντίον πολλών ειδών συμπαγών όγκων, συμπεριλαμβανομένων του παγκρέατος, του τραχήλου της μήτρας, των ωοθηκών, του μαστού, της ουροδόχου κύστης, και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [6,7]. Ωστόσο, η ανάπτυξη της αντίστασης στην γεμσιταβίνης είναι τώρα μια σημαντική ανησυχία για ουρολόγους. Παρά ένα λογικό ποσοστό ανταπόκρισης μετά την αρχική χημειοθεραπεία σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης, το 60-70% των ασθενών ανταποκρίνονται υποτροπιάζουν κατά το πρώτο έτος, με μέση επιβίωση 12-14 μηνών. Αυτή η περιορισμένη αποτελεσματικότητα μπορεί να οφείλεται σε de novo ανθεκτικότητας στα φάρμακα και την ανάπτυξη του κυτταρικού φαινοτύπου ανθεκτικών στα φάρμακα κατά τη διάρκεια της θεραπείας [8].

Ωστόσο, οι υποκείμενοι μηχανισμοί πρόκλησης αντίστασης σε χημειοθεραπεία με γεμσιταβίνη παραμένουν άγνωστα. Πρόσφατα, μέσα από τη μελέτη του καρκίνου του παγκρέατος, Nakahira S et al ανέφεραν ένα σημαντικό παράγοντα για την γεμσιταβίνη αντίσταση ήταν η υπερέκφραση του αναγωγάσης ριβονουκλεοτιδίων (RR) [9]. RR αποτελείται από τα διμερισμένου μεγάλες και μικρές υπομονάδες, Μ1 και Μ2, αντίστοιχα. Η υπομονάδα Μ1 κατέχει μια θέση σύνδεσης για την ρύθμιση του ενζύμου (ρυθμιστική υπομονάδα), και το υπομονάδα Μ2 εμπλέκεται με δραστηριότητα RR (καταλυτική υπομονάδα) [10]. RRM1 υποτίθεται ότι παίζει ένα ρόλο στην αντίσταση γεμσιταβίνη της ποικιλίας του καρκίνου ως μεταβολικών ενζύμων του φαρμάκου [9, 11]. RRM1 δεν είναι μόνο ένα κυτταρικό στόχο για γεμσιταβίνη, αλλά και ένα ογκοκατασταλτικό. Προκλινικές μελέτες έχουν αποδείξει τη συμμετοχή της στην καταστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, μετανάστευση, και μετάσταση [12, 13]. Σε ορισμένες μορφές καρκίνου, ένα υψηλό επίπεδο RRM2 mRNA συσχετίζεται με χημειοθεραπευτικούς αντίσταση, κυτταρική διεισδυτικότητα και ανικανοποίητη πρόγνωση, γεγονός που υποδηλώνει ότι RRM2 συμβάλλει σε κακοήθη εξέλιξη και είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος. Ωστόσο, υπάρχουν περιορισμένες πληροφορίες σχετικά με RRM1 και η έκφραση πρωτεΐνης RRM2 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, και στη γνώση μας δεν υπάρχουν αναφορές που περιγράφουν το ρόλο της ΜΤΑ στη διαδικασία της αντίστασης στα φάρμακα στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Επιπλέον, μερικές πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι ΜΤΑ παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την πρόοδο των ανθρώπινων καρκινωμάτων, αλλά η κλινική σημασία της έκφρασης ΜΤΑ σε BCA παραμένει ασαφής.

Από την άλλη πλευρά, έχει μεγάλη σημασία να διερευνήσει μυθιστόρημα του καρκίνου της ουροδόχου κύστης στρατηγική χημειοθεραπευτικά. Στοχευμένη φάρμακα στην αγωγή των όγκων του ουροποιητικού συστήματος κατά τα τελευταία χρόνια έδειξαν υποσχόμενα αποτελέσματα. πρώιμες μελέτες μας έχουν δείξει ότι οι αναστολείς Eg5 ως στοχευμένα φάρμακα in vivo και in vitro θεραπεία του καρκίνου του προστάτη και καρκίνου της ουροδόχου κύστης θα πρέπει να έχουν ικανοποιητική θεραπευτική δράση [14, 15]. Eg5, ένα βασικό μόριο εμπλέκεται στο σχηματισμό της διπολικής ατράκτων, είναι ένα από τα πιο ελκυστικά ένζυμα στόχου σε αντιμιτωτική ανακάλυψη φαρμάκων [16]. Eg5 λογαριασμούς για πολλές από τις κινήσεις της ατράκτου και χρωμοσωμάτων στα διαιρούμενα κύτταρα και εντοπίζεται στην άτρακτο σε μιτωτική διαίρεση των κυττάρων [17]. Ένα ενδιαφέρον χαρακτηριστικό του Eg5 είναι ότι εντοπίζεται σε μικροσωληνίσκους στη μίτωση, αλλά όχι να μεσόφαση μικροσωληνίσκους, γεγονός που υποδηλώνει ότι ένας αναστολέας Eg5 μπορεί να είναι χρήσιμη για να στοχεύουν συγκεκριμένα πολλαπλασιαζόμενα ιστό του όγκου [18]. Διάφοροι τύποι χημικών μικρού μορίου αναστολείς Eg5 αναφερθεί [16]. S- (4-μεθοξυτριτυλ) -L-κυστεΐνη (S (MeO) TLC), ένα παράγωγο του S-τριτυλί L-κυστεΐνη (STLC), μπορούν να αναστείλουν ειδικά Eg5, και επάγουν μονοπολικές σχηματισμός μιτωτικής ατράκτου [14, 15]. Η αποτυχία της Eg5 λειτουργίας οδηγεί σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη μίτωση με monoastral συστοιχίες μικροσωληνίσκων. Ο σημαντικός ρόλος του Eg5 στο μιτωτικό εξέλιξη καθιστά ένα ελκυστικό υποψήφιο για την ανάπτυξη στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου [19]. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία μελέτη Eg5 θεραπεία με αναστολείς των ανθεκτικών γεμσιταβίνη καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Σε αυτή τη μελέτη, η γεμσιταμπίνη ανθεκτικό ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρική σειρά ιδρύθηκε, και ο ρόλος των RRM1 και RRM2 στην ανάπτυξη της γεμσιταβίνης αντίσταση αρχικά διερευνήθηκε. Εκτιμήσαμε επίσης την αποτελεσματικότητα του αντικαρκινικού αποτελέσματος της Eg5 στοχευμένη θεραπεία in vitro και in vivo, με σκοπό να προσφέρει μια καλύτερη στρατηγική κλινική θεραπεία για ασθενείς με ανθεκτική γεμσιταβίνη καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα από Επαρχιακό Νοσοκομείο Συνδεδεμένων στο Πανεπιστήμιο Shandong (Αριθμός Άδειας: 2013-026). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Κύστης καρκινικούς ιστούς συλλέχθηκαν από Shandong Επαρχιακό Νοσοκομείο Ενταγμένο στο Πανεπιστήμιο Shandong. Πριν από τη μελέτη, το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του επαρχιακού νοσοκομείου Συνδεδεμένων στο Πανεπιστήμιο Shandong (Αριθμός Άδειας: 2012-033). Γραπτή ενημερώνεται συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς.

Cells, αντιδραστήρια και κλινικά δείγματα

κυτταρική σειρά καρκίνου της ουροδόχου κύστης RT112 και KU7 χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14,20]. κυτταρικές σειρές RT112 και KU7 αγοράστηκαν από την κυτταρική τράπεζα της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). RT112 και KU7 κύτταρα που χρησιμοποιούνται κυρίως στην ακόλουθη μελέτη, τα οποία προέρχονται από μη-διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, και επωάστηκαν στους 37 ° C με ένα υγροποιημένο

2 ατμόσφαιρα 5% CO.

Οι αναστολείς Eg5, S (MeO) TLC αγοράστηκαν από την Bachem (Bubendorf, Switzerland) και διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). Αντίσωμα αντι-RRM1 και αντι-RRM2 (Rabbit) αγοράστηκε από την Abcam (ΗΠΑ)? IRDye 800CW συζευγμένο γίδινο αντι-κουνελιού IgG ήταν από Li-Cor Biosciences (USA). κιτ Prime Script RT-PCR αγοράστηκε από TaKaRa (Κίνα). ΤΚΙζοΙ αγοράστηκε από την Invitrogen (ΗΠΑ).

140 περιπτώσεις ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης συλλέχθηκαν από Shandong Επαρχιακό Νοσοκομείο Ενταγμένο στο Πανεπιστήμιο Shandong από τον Δεκέμβριο του 2005 έως το Μάρτιο του 2007. Η ακτινοθεραπεία, χημειοθεραπεία και η ανοσοθεραπεία δεν πραγματοποιήθηκαν πριν από τη χειρουργική επέμβαση και όλα τα δείγματα ελέγχθηκαν από δύο παθολογίες μετά την επέμβαση.

Σύσταση των γεμσιταβίνης-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές

γεμσιταβίνη-ανθεκτικά κύτταρα αναπτύχθηκαν από τη χρόνια, επαναλαμβανόμενη έκθεση σε γεμσιταβίνη αν και κλίση καλλιέργεια. Η καθιερωμένη ανθεκτική κυτταρική γραμμή διατηρήθηκε σε μέσο που περιέχει 45 nmol /L γεμσιταβίνης. Για όλες τις μελέτες, ανθεκτικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για 1 εβδομάδα για την εξάλειψη gemcitabine. Οι γεμσιταβίνης-ανθεκτικά κύτταρα αναφέρονται ως κύτταρα RT112-Gr και KU7-Gr. IC50 της γεμσιταβίνη ανθεκτικά RT112 κύτταρα να Γεμσιταβίνη είναι 4.2umol /L. IC50 της γεμσιταβίνη-ανθεκτικά κύτταρα KU7 να Γεμσιταβίνη είναι 0.285umol /L. Γι ‘αυτό και επιλέγουν κύτταρα RT112-Gr ως μάθημα στα ακόλουθα πειράματα.

Ανθρώπινο OneArray μικροσυστοιχιών

Το συνολικό RNA εξήχθη από το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Σανγκάη, CN) και αποστέλλονται στο Biotech Φάλαγγα ομάδα (Σαγκάη, CN) για την ανάλυση μικροσυστοιχιών έκφρασης. υβριδοποιήσεις τριπλούν για κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το Ανθρώπινο Γονιδίωμα Ολόκληρο-OneArray 6.1.

RRM1 και ανάλυση της έκφρασης RRM2 από την IHC

Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση έγινε για να προσδιοριστεί RRM1 και την έκφραση RRM2 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Anti-RRM1 και αντι-RRM2 αντισώματα δύο χρησιμοποιούνται σε αραίωση 1: 100. Οι αρνητικοί έλεγχοι αποτελούνταν από διαφάνειες όπου είχαν παραλειφθεί το πρωτογενές αντίσωμα. Περιπτώσεις αξιολογήθηκαν ως έχουσες θετική χρώση αν & gt? Χρωματίστηκε το 10% του κυτταροπλάσματος των καρκινικών κυττάρων. Βαθμός όγκου και το στάδιο αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπες αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). χρώσης

Αναστολή της έκφρασης RRM1 /2 από την RNA

παρεμβολή

RT112-Gr κύτταρα (2×10

5) σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων εις τριπλούν και μετά από επώαση 12h, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις siRNA χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο HiPerfect (Qiagen) σε συμφωνία με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η μικρή παρεμβολή RNA που χρησιμοποιούνται για τη στόχευση αλληλουχία /2 mRNA RRM1 συνετέθη με Qiagen.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα μετά τη θεραπεία με αναστολείς Eg5 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την 3- (4, 5- διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, 5-διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο (ΜΤΤ), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Τα κύτταρα (2 χ 10

3) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάζονται για 24 ώρες. Μετά από αυτό, γεμκιταβίνη, S (MeO) TLC, γεμσιταβίνη + S (MeO) TLC και του οχήματος (DMSO) προστέθηκαν σε υποδεικνυόμενη συγκέντρωση σε φρεάτια εις τριπλούν και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε μετά από 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες της θεραπείας, αντίστοιχα . Οι συγκεντρώσεις αναστολής 50% της κυτταρικής ανάπτυξης (IC50) υπολογίστηκαν σύμφωνα με SPSS17.0 Λογισμικό.

Hoechst χρώση

Μετά από τη χορήγηση με 45nm γεμσιταβίνη, 0.5 μΜ S (MeO) TLC, 45nm γεμσιταβίνη + 0,5 μΜ S (MeO) TLC ή όχημα για 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες, τα κύτταρα RT112-Gr βάφτηκαν με 1 mM Hoechst 33342 διαλύματος (Santa Cruz, Dallas, USA) για την πυρηνική χρώση και αναλύθηκαν με ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Τα κύτταρα με χαρακτηριστική συμπύκνωση και τον κατακερματισμό των πυρήνων έγιναν ορατές και ταυτοποιήθηκε ως αποπτωτικά κύτταρα.

αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ ανάλυση

RRM1 και RRM2 εκφράσεις σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως προσδιορίστηκαν με RT-PCR ανάλυση χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από κυτταρικά ιζήματα RT112 και RT112-Gr χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ και ενισχύθηκαν με αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (RT-PCR) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, αντίστοιχα. Ένα γονίδιο housekeeping, γλυκεραλδεΰδες φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH), χρησιμοποιήθηκε ως ένα ενδογενές ελέγχου. GAPDH και RRM1 και RRM2 εκκινητές κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας Primer 5 Λογισμικό και επαληθεύεται με ανάλυση της αλληλουχίας του DNA. GAPDH (1382 bp) εκκινητών ήταν: Εμπρός: 5′-GATGCTGCGCCTGCGGTAGA-3′, Αντίστροφη: 5′-TTGGTTGAGCACAGGGTAC-3′? RRM1 (391bp) εκκινητών ήταν: Εμπρός: 5′-GTTGTATTCGGGCTACTGG-3′, Αντίστροφη: 5′-ACTTTGCGGACACGACCT-3′? RRM2 (882bp) εκκινητών ήταν: Εμπρός: 5′-GCCGCTTTGTCATCTTCC-3′, Αντίστροφη: 5′-TCCTCTGATACTCGCCTACT-3′. Τα προϊόντα της PCR στη συνέχεια σε ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης 1,0% και απεικονίστηκαν με ένα διαφανοσκόπιο. Η ένταση των εικονοστοιχείων για κάθε ζώνη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την AlphaImager

TM2200.

πείραμα των Ζώων

παλιά έξι έως οκτώ εβδομάδων θηλυκά BALB /c γυμνά ποντίκια αγοράστηκαν από Vital River Company (Πεκίνο, Κίνα). Η μελέτη λήφθηκε έγκριση από την Επιτροπή των Ζώων Ερευνών της Shandong Επαρχιακό Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου της Shandong και τη φροντίδα μας ήταν, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ίδρυμα.

Για τα μοντέλα υποδόριου ξενομοσχεύματος, περίπου 4 × 10

6 RT112-Gr κύτταρα (εναιωρημένα σε 100 μΙ PBS) εμβολιάστηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές ανά ποντίκι, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε ως εξής: Όγκος = Πλάτος

2 × Μήκος /2. Όταν οι όγκοι ήταν ψηλαφητοί και μετρήσιμα (περίπου 50 χιλιοστά

3), 20 ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες και έλαβαν μία φορά την ημέρα (πέντε ημέρες την εβδομάδα) με ενδοπεριτοναϊκή ένεση με DMSO (έλεγχος οχήματος), 20 mg /kg S (MeO ) TLC, 50 mg /kg γεμκιταβίνη ή 20 mg /kg S (MeO) TLC + 50 mg /kg γεμκιταβίνη για 5 ημέρες. Ποντίκια σώμα ζυγίζει και τα μεγέθη των όγκων μετρήθηκαν κάθε δεύτερη μέρα. Τα άλλα ποντίκια θανατώθηκαν την 21η ημέρα μετά την αρχική θεραπεία, και επίσης όγκοι αποκόπηκαν και ενσωματωμένες σε παραφίνη για την H & amp?. Ε χρώση

Η στατιστική ανάλυση

Η σημασία των σχέσεων μεταξύ RRM1 και η έκφραση RRM2 και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας chi-τετράγωνο τεστ και αμφίδρομη ANOVA. Μέσα συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας

t

δοκιμή δύο ουρών σπουδαστή και την ανασταλτική δράση του S (MeO) TLC και gemcitabine σε μοντέλα ξενομοσχεύματος διεξήχθησαν με αμφίδρομη ΑΝΟνΑ ακολουθούμενη από την δοκιμή S-Ν-Κ. Λογισμικό SPSS 17.0 χρησιμοποιήθηκε ως στατιστική ανάλυση.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Παγκόσμια ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης σε κυτταρικές σειρές RT112 και RT112-Gr

κυττάρων

RT112-Gr ήταν 350 φορές λιγότερο ευαίσθητη σε γεμσιταβίνη από τις γονικές κυτταρικές σειρές, η οποία ήταν IC50 4,2 umol /l σε πρώην. κύτταρα KU7-Gr ήταν 15 φορές λιγότερο ευαίσθητη σε gemcitabine από τα γονικές κυτταρικές σειρές, οι οποίες ήταν IC50 0.285umol /l σε πρώην. ανάλυση μικροσυστοιχιών διεξήχθη για να ληφθεί ευρύ φάσμα πληροφοριών σχετικά με τα γονίδια διαφορικά εκφραζόμενα σε κύτταρα RT112 και RT112-Gr. Τα RNA που λαμβάνονται από RT112 και τα κύτταρα RT112-Gr ενισχύθηκαν, κατακερματισμένη, επισημαίνονται και σε υβριδισμό με μικροσυστοιχίες GeneChip. Από τα 55.752 γονίδια που εκπροσωπούνται στο Ανθρώπινο OneArray® GeneChip, 442 παρουσίασαν σημαντικά up-ρυθμίζονται και 235 κάτω-ρυθμίζονται. Μεταξύ αυτών, P-value (διαφορικά εκφράζεται) του RRM1 είναι 0.046, και RRM2 είναι 0.021, ενώ Eg5 (KIF11) είναι 0,323. έχουν αποτελέσματα μικροσυστοιχιών μας έχουν φορτωθεί με επιτυχία σε ένα δημόσιο χώρο αποθήκευσης που ονομάζεται «ArrayExpress», Κριτική δεδομένων URL:. https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-3495/

Ομαδοποίηση διεξήχθη για να απεικονίσει τις συσχετίσεις μεταξύ των επαναλήψεων και μεταβαλλόμενες συνθήκες του δείγματος. επιλέχθηκαν Ένα υποσύνολο των διαφορικών γονίδια για ομαδοποίηση ανάλυση. Ένα φίλτρο ένταση χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή γονιδίων όπου η διαφορά μεταξύ των μέγιστης και ελάχιστης τιμών έντασης υπερβαίνει 1000 μεταξύ όλων των μικροσυστοιχιών. Για το έργο αυτό μικροσυστοιχιών, ο αριθμός των γονιδίων συμπλέγματος ήταν 227 (Σχήμα 1).

Ομαδοποίηση διεξήχθη για να απεικονίσει τις συσχετίσεις μεταξύ των επαναλήψεων και μεταβαλλόμενες συνθήκες του δείγματος. Τα πάνω και τα κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια εκπροσωπούνται σε κόκκινο και πράσινο χρώμα, αντίστοιχα. Ένα υποσύνολο των διαφορικών γονίδια επιλέχθηκε για ομαδοποίηση ανάλυση. Ένα φίλτρο ένταση χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή γονιδίων όπου η διαφορά μεταξύ των μέγιστης και ελάχιστης τιμών έντασης υπερβαίνει 1000 μεταξύ όλων των μικροσυστοιχιών. Για το έργο αυτό μικροσυστοιχιών, ο αριθμός των γονιδίων σε σύμπλεγμα ήταν 227.

Η

RRM1 και ανάλυση έκφρασης RRM2 σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης και κυτταρικές σειρές

Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση εκτελέστηκε για να προσδιοριστεί η έκφραση RRM1 και RRM2 σε χειρουργικά δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης. χρώση RRM1 και RRM2 εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα. Υπήρχαν 98 άνδρες και 42 γυναίκες, με 65 περιπτώσεις χαμηλού βαθμού και 75 περιπτώσεις υψηλής ποιότητας σε ιστολογικά βαθμού. Η χρώση αντιδραστικότητα των αντι-RRM1 και αντι-RRM2 ήταν έδειξε στο Πίνακα 1 και το Σχήμα 2, αντίστοιχα. ανάλυση RT-PCR σχεδιάστηκαν για τον εντοπισμό RRM1 mRNA και η έκφραση mRNA σε RRM2 RT112 και κυτταρικές γραμμές RT112-Gr. RT-PCR κατέδειξαν περαιτέρω ότι τα κύτταρα RT112-Gr είχαν σημαντικές αυξήσεις στα επίπεδα του RRM1 και RRM2 mRNA σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα (

ρ

& lt? 0.001)., Αντιστοίχως (Σχήμα 3)

Α: Ανοσοϊστοχημική χρώση των RRM1 και RRM2 σε κλινικές ιστούς. RRM1 και RRM2 ανοσοχρώση θεωρήθηκε θετικό αν & gt? 10% του κυτταροπλάσματος των καρκινικών κυττάρων έδειξαν ασθενή ή μεγαλύτερη ένταση. (Ι) Υψηλή έκφραση του RRM1 στην κλινική του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. (II) Χαμηλή έκφραση του RRM1 στην κλινική του καρκίνου της ουροδόχου κύστης (III) Υψηλή έκφραση του RRM2 στην κλινική του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. (Ⅳ) Χαμηλή έκφραση RRM2 στην κλινική του καρκίνου της ουροδόχου κύστης (όλα τα ποσά είχαν συλληφθεί στα 400 × μεγέθυνση). Β: (Ι) γράφημα ράβδων απεικονίζει συνδυασμένη ανοσοχρώση βαθμολογία για την έκφραση RRM1 ανάλογα με τον βαθμό του όγκου. (II) γράφημα ράβδων απεικονίζει συνδυασμένη βαθμολογία για την έκφραση RRM2 ανοσοχρώση σύμφωνα με το στάδιο του όγκου (το χρώμα του μαύρου και του γκρι αντιπροσωπεύουν ασθενώς και ισχυρώς θετική, αντίστοιχα).

Η

RT-PCR για RRM1 και RRM2 mRNA έκφρασης σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου της ουροδόχου κύστης. GAPDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. γράφημα ράβδων απεικονίζει RRM1 και έκφραση RRM2 mRNA σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης siRNA-RT112-Gr RT112, RT112-Gr και. (

σ

& lt? 0.001).

Η

siRNA μεσολάβηση Νοκ ντάουν του RRM1 /2 σε RT112-Gr καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα

Για να εκτιμηθούν τα αποτελέσματα του RRM1 /2 για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές RT112-Gr, γονίδιο RRM1 /2 ήταν knockdown, αντίστοιχα (Σχήμα 3). κύτταρα RT112-Gr αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 45nm Γεμσιταβίνη (GEM), μεσολάβηση RNAi Νοκ ντάουν του RRM1 και RRM2 σε RT112-Gr καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 45nm Γεμσιταβίνη (GEM). Εβδομήντα δύο ώρες αργότερα βιωσιμότητα αναλύθηκε με κυανή χρώση Trypan. Μεσολάβηση RNAi Νοκ ντάουν του RRM1 και RRM2 + GEM, ανασταλτική επίδραση του όγκου είναι η καλύτερη μεταξύ των τεσσάρων ομάδων. Η ποσοτικοποίηση της κάθε τιμή είναι από την εις τριπλούν ανεξάρτητα πειράματα (Σχήμα 4). Κύτταρα

RT112-Gr αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 45nm Γεμσιταβίνη (GEM), μεσολάβηση RNAi εξόντωση RRM1 (Α) και RRM2 (Β ) σε RT112-Gr καρκινικών κυττάρων κύστης αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 45nm γεμσιταβίνη (GEM). Εβδομήντα δύο ώρες αργότερα βιωσιμότητα αναλύθηκε με κυανή χρώση Trypan. Μεσολάβηση RNAi εξόντωση RRM1 (Α) και RRM2 (Β) + GEM, ανασταλτική επίδραση του όγκου είναι η καλύτερη μεταξύ των τεσσάρων ομάδων. Η ποσοτικοποίηση της κάθε τιμή είναι από τριπλά ανεξάρτητα πειράματα. (

σ

& lt? 0,01).

Η

αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις της S (MeO) TLC και γεμσιταβίνη σε Τζεμσιταμπίνη-Resistant κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Για την εκτίμηση της αντι -proliferative επιδράσεις της γεμσιταβίνης και S (MeO) TLC σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές RT112-Gr, έμειναν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 45nm γεμσιταβίνη, 0.5 μΜ S (MeO) TLC ή και τα δύο μαζί (γεμσιταμπίνη + S (MeO) TLC) σε 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες, αντίστοιχα. Η γεμσιταβίνη και S (MeO) TLC κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο και εμφανίζονται τα πιο εξέχοντα χαρακτήρα καταστολής στις 72 ώρες. Οι IC50s του RT112 και RT112-Gr κατά gemcitabine σε 72 ώρες ήταν 0.012μM και 4.2μM, ενώ IC50s του RT112 και RT112-Gr κατά S (MeO) TLC ήταν 210μM και 290μM, αντίστοιχα (Σχήμα 5).

Α: Οι IC50s της γεμσιταβίνη σε KU7, KU7-Gr, RT112 και RT112-Gr σε 72 ώρες. Β: Οι IC50s της S (MeO) TLC της KU7, KU7-Gr, RT112 και RT112-Gr σε 72 ώρες. C: KU7-Gr και RT112-Gr κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 45nm Γεμσιταβίνη (GEM), 0.5 μΜ S (ΜθΟ) TLC ή και τα δύο μαζί (GEM + S (ΜθΟ) TLC). Εβδομήντα δύο ώρες αργότερα βιωσιμότητα αναλύθηκε με κυανή χρώση Trypan. S (MeO) TLC και GEM + S (ΜθΟ) TLC, ανασταλτική επίδραση του όγκου είναι η καλύτερη μεταξύ των τεσσάρων ομάδα. Η ποσοτικοποίηση της κάθε τιμή είναι από τριπλά ανεξάρτητα πειράματα. (

σ

& lt? 0,01).

Η

Η επαγωγή της απόπτωσης από την S (ΜβΟ) TLC και Γεμσιταβίνη σε Τζεμσιταμπίνη-Resistant κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Hoechst 33342 πυρηνική χρώσης έδειξαν ότι τυπικό μονοπολικό άτρακτος μιτωτικά κύτταρα με χαρακτηριστική ροζέτα φαινότυπο παρατηρήθηκαν στην μιτωτική φάση στις 24 ώρες μετά την έκθεση σε 45nm γεμσιταβίνη, 0.5 μΜ S (MeO) TLC, 45nm γεμσιταμπίνη + 0,5 μΜ S (MeO) TLC ή όχημα και διακριτικό αποπτωτικών κυττάρων με πυρηνική συμπύκνωση και την κατάτμηση επίσης εντοπιστεί σε 48 ώρες μετά την έκθεση (Σχήμα 6)

Α:. κύτταρα RT112-Gr έμειναν χωρίς θεραπεία? Β: κύτταρα RT112-Gr υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 45nm Γεμσιταβίνη? C: κύτταρα RT112-Gr υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 0.5 μΜ S (MeO) TLC? D:. Κύτταρα RT112-Gr υποβλήθηκαν σε αγωγή με τα δύο μαζί (45nm Γεμσιταβίνη + 0,5 μΜ S (MeO) TLC) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους και, στη συνέχεια, την πυρηνική μορφολογία εξετάστηκε με χρώση Hoechst και οπτικοποιήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού

Η

μπλε χρώση Trypan επιβεβαίωσε ότι σε γεμσιταμπίνη + S ομάδα (MeO) TLC και η βιωσιμότητα των κυττάρων ομάδα S (MeO) TLC μειώθηκαν σημαντικά σε RT112-Gr και τα κύτταρα KU7-Gr σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 5).

Επιδράσεις της S (MeO) TLC και γεμσιταβίνη στο μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Για την αρχική ανάλυση της αντικαρκινικής δραστικότητας του S (MeO) TLC σε μοντέλα ξενομοσχεύματος υποδόριο, ο όγκος του όγκου αξιολογήθηκε μετά από θεραπεία με DMSO (έλεγχος οχήματος), 20 mg /kg S (MeO) TLC, 50 mg /kg γεμσιταβίνης ή 20 mg /kg S (MeO) TLC + 50 mg /kg γεμκιταβίνη. Μετά από 3 εβδομάδες παρατήρησης βρέθηκε ότι S (MeO) TLC (20mg /kg) + gemcitabine (50mg /kg) και S (MeO) TLC (20mg /kg) ομάδες εμφανώς κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με γεμσιταβίνη (50 mg /kg ) και DMSO (έλεγχος οχήματος). η απώλεια βάρους σώματος δεν παρατηρήθηκε σε οποιαδήποτε από τις ομάδες θεραπείας. Η νέκρωση παρατηρήθηκε στην επιφάνεια του όγκου του S (MeO) TLC (20 mg /kg) και S (MeO) TLC (20mg /kg) + ομάδα θεραπείας γεμσιταβίνη (50mg /kg), αν και δεν παρατηρήθηκε προφανής νέκρωση στο ομάδα ελέγχου . μεταβολές του όγκου των όγκων των ποντικών σε σύγκριση μεταξύ των ομάδων θεραπείας και ελέγχου, η διαφορά στο μέσο τελικό όγκο σε μέγεθος μεταξύ των τεσσάρων ομάδων ήταν στατιστικώς σημαντική (Σχήμα 7).

A. Μετά την επιτυχή εγκατάσταση του υποδόριου ξενομοσχεύματος όγκων, DMSO (έλεγχος οχήματος), χορηγήθηκαν 20 mg /kg S (MeO) TLC, 50 mg /kg Γεμσιταβίνη ή και τα δύο (S (MeO) TLC + GEM) ενδοπεριτοναϊκά την ημέρα για 5 ημέρες (βέλη) . Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν κάθε δεύτερη μέρα. B. Η μέση βάρη σώματος των ποντικών αξιολογήθηκαν κάθε δεύτερη μέρα. Δεν υπάρχει σημαντική διαφορά μεταξύ των τριών ομάδων (

P

& gt? 0,05).

Η

Συζήτηση

χημειοαντίσταση είναι μια σημαντική αιτία της αποτυχίας στη θεραπεία για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης με gemcitabine. Ως εκ τούτου, είναι εξαιρετικά σημαντικό να αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός της χημειοαντίσταση και να εντοπίσει πρόβλεψης δείκτες των εγγενών και απέκτησε χημειοαντίσταση με γεμσιταβίνη [24]. Ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης (RR) είναι ένα ετεροτετραμερές, και η δραστηριότητα απαιτεί δύο 90kDa μεγάλες υπομονάδες και δύο 45kDa μικρές υπομονάδες. Το ένζυμο είναι ζωτικής σημασίας για την προμήθεια δεοξυνουκλεοζιτών για de novo σύνθεση των DNA και έτσι για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Αποτελείται από τα διμερισμένου μεγάλες και μικρές υπομονάδες, Μ1 και Μ2. RRM1 είναι ένα μεγάλο πεπτιδική αλυσίδα (α), ενώ RRM2 είναι μια μικρή πρωτεΐνη υπομονάδες της RR (β). Παρά το γεγονός ότι η ενζυμική δραστηριότητα της RR διαμορφώνεται από τα επίπεδα των RRM2, RRM1 θα μπορούσε να διαδραματίσει βασικό ρόλο μεταξύ των δύο υπομονάδων κατά τη διάρκεια της θεραπείας γεμσιταβίνη [9, 13]. Ο ρόλος των RRM1 στο σχηματισμό RR έχει επίσης γίνει μια ελκυστική μοριακός στόχος για την ανάπτυξη των χημειοθεραπευτικών παραγόντων, όπως είναι η γεμσιταβίνη [13].

προφίλ γονιδιακής έκφρασης με ανάλυση μικροσυστοιχιών παρέχει ένα ισχυρό μέσο για την απόκτηση μια επισκόπηση των γονιδιακής έκφρασης και φυσιολογικών διεργασιών εμπλέκονται στην αποκρίσεις σε συγκεκριμένα ερεθίσματα. Στην παρούσα μελέτη, ιδρύσαμε γεμσιταβίνη ανθεκτικά ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές RT112-Gr και KU7-Gr, κύτταρα RT112-Gr ήταν 350 φορές λιγότερο ευαίσθητος προς gemcitabine από τα γονικές κυτταρικές σειρές, ενώ τα κύτταρα KU7-Gr ήταν 15-πλάσια λιγότερο ευαίσθητη σε gemcitabine από τα γονικές κυτταρικές σειρές. Γι ‘αυτό και επιλέγουν κύτταρα RT112-Gr ως μάθημα στα ακόλουθα πειράματα. ανάλυση μικροσυστοιχιών χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστούν οι αλλαγές γονιδιακή έκφραση μεταξύ των κυττάρων RT112 και RT112-Gr. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι 442 γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των RRM1 και RRM2, ήταν ρυθμίζεται προς τα πάνω, ενώ 235 γονίδια προς τα κάτω σε κύτταρα RT112-Gr. Eg5 αλλαγή δεν ήταν εμφανής. παρούσα μελέτη μας δείχνει ότι RRM1 και RRM2 εμπλέκονται σε γεμσιταβίνη αντίσταση στον ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Στο κύτταρο, γεμσιταβίνη φωσφορυλιώνεται προς μονοφωσφορικό, διφωσφορικό, τριφωσφορικό ή πριν από την ενσωμάτωση του DNA, η οποία είναι απαραίτητη για την αναστολή της ανάπτυξης της δραστηριότητα. Η διφωσφοριλιωμένα μορφή της γεμσιταβίνης δρα ως αναστολέας RR, που είναι η αιτία της γεμσιταβίνης κυτταροτοξική δράση. RR αυξάνει την πισίνα δεοξυνουκλεοζιτών τριφωσφορική (dNTP) στα κύτταρα, τα οποία θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε μειωμένη ενσωμάτωση αναλόγων dNTP όπως τριφωσφορυλιωμένη γεμσιταβίνη σε DNA και μπορεί να μειώσει την αντικαρκινική δράση της γεμσιταβίνης [9]. Ένας αριθμός προκλινικές και κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι RRM1 μπορούσε να είναι η στοχευμένη μόριο να ρυθμίσει την αντίσταση gemcitabine. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης του θα μπορούσε να είναι ένας χρήσιμος δείκτης της αντίστασης γεμσιταβίνης. Shin Nakahira et al ανέφεραν ότι αυξημένη έκφραση RRM1 συσχετίστηκε σημαντικά με αντικαρκινικά αποτελέσματα και με κακή επιβίωση μετά από αγωγή με gemcitabine σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος [9]. Hao Xie et al ανέφεραν ότι μετά χειρουργική εκτομή σε παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα, να επιτευχθεί η καλύτερη επιβίωση, το επίπεδο της έκφρασης RRM1 μπορούν να χρησιμοποιούνται για τη διαστρωμάτωση των ασθενών να λάβουν είτε ανοσοενισχυτικό gemcitabine ή μη gemcitabine επικουρικής θεραπείας. Αυτό είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα από τις μελέτες πρώιμο στάδιο NSCLC [13], και αυτή η εμπλοκή υποστηρίζεται από το ρόλο του RRM1 ως καταστολέας όγκου [12]. Επιπλέον, RRM2 είναι γνωστό ότι εμπλέκονται σε χημειοαντίσταση. Καταστολή της RRM2 μπορούσε να ευαισθητοποιήσει του παχέος εντέρου και του καρκίνου του παγκρεατικών κυττάρων σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [25]. Η σχέση μεταξύ της έκφρασης RRM2 και χημειοθεραπευτικό αποτέλεσμα σε κλινικά δείγματα έχει επίσης διερευνηθεί. Itoi et al εξέτασαν τα επίπεδα RRM2 mRNA σε δείγματα βιοψίας από 35 ασθενείς με ανεγχείρητο καρκίνο του παγκρέατος σε μια προοπτική μελέτη, και διαπίστωσε ότι το ποσοστό ανταπόκρισης σε γεμσιταβίνη χημειοθεραπεία ήταν σημαντικά υψηλότερη στους ασθενείς με χαμηλή έκφραση RRM2 [26]. Ωστόσο, καμία από τις προηγούμενες μελέτες έχουν διερευνήσει την έκφραση της ΜΤΑ στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Η μελέτη μας διαπίστωσε ότι RRM1 και RRM2 εκφράστηκαν σε κλινικές ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης και κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Αναφέρεται ότι η έκφραση του RRM1 και RRM2 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε όγκους χαμηλής ποιότητας από τους όγκους υψηλής ποιότητας. Τα δεδομένα μας πρότειναν ότι RRM1 και RRM2 υπερέκφραση θα μπορούσε να συσχετιστεί με την εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως, τα αποτελέσματα RT-PCR έδειξε ότι τα κύτταρα RT112-Gr είχαν αυξηθεί στα επίπεδα των RRM1 και RRM2 mRNA σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα (

ρ

& lt? 0.001), αντίστοιχα. Για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της RRM1 /2 για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές RT112-Gr, του γονιδίου RRM1 /2 ήταν νοκ ντάουν. Η μελέτη μας έδειξε ότι μετά από νοκ ντάουν του RRM1 /2, RT112-Gr κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης ευαίσθητα σε γεμσιταβίνη και πάλι, δείχνει την υπερέκφραση του ΜΤΑ συνδέθηκε με γεμσιταμπίνη αντίσταση, και θα μπορούσε να είναι ένα μυθιστόρημα υποψήφιο βιοδείκτη για αντίσταση γεμσιταβίνη. Τα δεδομένα από πολυάριθμες κλινικές μελέτες έδειξαν ότι RRM1 έκφραση /2 σε κύτταρα όγκου συσχετίζεται αντίστροφα με την ευαισθησία των κυττάρων όγκου στη θεραπεία γεμσιταβίνη [9, 11, 12]. Για παράδειγμα, Woon-Gye Chung et al ανέφεραν ότι η αυξημένη έκφραση RRM1 ήταν πιθανώς υπεύθυνη για την αντίσταση στην gemcitabine στο TC-1-GR (αντίσταση gemcitabine TC-1) κύτταρα, τα οποία περαιτέρω υποστηρίζεται από την παρατήρηση ότι η επιμόλυνση του RRM1 siRNA σε TC-1-GR κύτταρα γίνονται τα κύτταρα περισσότερο ευαίσθητα σε γεμσιταβίνης HCl [27]. Zhang M et al ανέφεραν ότι μικρά παρεμβαλλόμενα RNA με τη μεσολάβηση RRM2 νοκ ντάουν αντιστραφεί σημαντικά την αντίσταση των κυττάρων SKOV3 /DDP με σισπλατίνη [28].

Τα στοιχεία έδειξαν ότι οι ασθενείς με αντίσταση γεμσιταβίνη θα αντιμετωπίσει μια χειρότερη έκβαση. Ως εκ τούτου, η θεραπεία του καρκίνου του gemcitabine αντίσταση της ουροδόχου κύστης είναι πολύ σημαντική. Αύξηση μελέτες έδειξαν ένα καλύτερο αποτέλεσμα με τη χρήση θεραπείας στοχεύουν στη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. πρώιμη μελέτη μας βρέθηκε αναστολείς Eg5 ως στοχευμένα φάρμακα in vivo και in vitro θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης μπορεί να έχει καλή θεραπευτική επίδραση, επιπλέον, δείξαμε αρχικά την αντικαρκινική δράση του αναστολέα Eg5 για καρκίνο της ουροδόχου κύστης αντίσταση gemcitabine στο παρόν έγγραφο.

Eg5 είναι ένας κινητήρας ομοτετραμερές που σχηματίζεται από την αντιπαράλληλη διευθέτηση των δύο διμερή. Το Eg5 τετραμερές έχει την ικανότητα να συνδέουν εγκάρσια αντιπαράλληλες μικροσωληνίσκων που εκπορεύονται από τους δύο κεντροσωμάτια στο G2 /M [29]. Η πρωταρχική λειτουργία του Eg5 είναι να σχηματίσει το διπολικής ατράκτου κατά την πρώιμη προμεταφασικά? αποτυχία να διαχωρίσει τις διπλές κεντροσωμάτια οδηγεί σε μιτωτική σύλληψη και τελικά προκαλεί αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε ορισμένες κυτταρικές γραμμές όγκου [30, 31].