Αφηρημένο

G503 είναι μια ένωση ανθρακινόνης απομονωθεί από τις δευτερογενείς μεταβολίτες της μαγκρόβια ενδοφυτικού μύκητα από τη Θάλασσα της Νότιας Κίνας. Η παρούσα μελέτη αποσαφηνίζει τη δράση κατά των όγκων και τον υποκείμενο μηχανισμό της G503. δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας διεξάγεται σε εννέα κυτταρικές σειρές καρκίνου και δύο φυσιολογικά κύτταρα απέδειξαν ότι ο γαστρικός καρκίνος κυτταρική γραμμή SGC7901 είναι το πιο G503 ευαίσθητα καρκινικά κύτταρα. G503 που προκαλείται SGC7901 κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης. έκθεσης G503 ενεργοποιηθεί κασπασών-3, -8 και -9. Προεπεξεργασία με τον αναστολέα κασπάσης παν-Z-VAD-FMK και ο αναστολέας κασπάσης-9-Z LEHD-FMK, αλλά όχι κασπάσης-8 inbibitor Ζ-IETD-FMK, εξασθένησε την επίδραση του G503. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η εγγενής μιτοχονδριακό μονοπάτι απόπτωσης, όχι ο εξωγενής οδός, είχε εμπλακεί σε G503 επαγόμενη απόπτωση. Επιπλέον, G503 αύξησε την αναλογία του Bax προς Bcl-2 στα μιτοχόνδρια και μείωσε την αναλογία στο κυτταρόπλασμα. θεραπεία G503 οδήγησε σε μιτοχονδριακή αποπόλωση, απελευθέρωση κυτοχρώματος c και την επακόλουθη διάσπαση της κασπάσης -9 και -3. Επιπλέον, αναφέρεται ότι η ενδοπλασματικό δίκτυο μονοπάτι απόπτωσης μπορεί επίσης να ενεργοποιηθεί με G503 επάγοντας Capase-4 διάσπαση. Κατά την εξέταση του κατώτερου 50% ανασταλτική συγκέντρωση για γαστρικά καρκινικά κύτταρα, G503 μπορεί να χρησιμεύσει ως μια πολλά υποσχόμενη υποψήφιος για γαστρικό χημειοθεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Huang L, Zhang Τ, Li S, Duan J, Ye F, Λι H, et al. (2014) Ανθρακινονο G503 προκαλεί απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του γαστρικού μέσω του μιτοχονδριακού Pathway. PLoS ONE 9 (9): e108286. doi: 10.1371 /journal.pone.0108286

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 19η Απριλίου, 2014? Αποδεκτές: 19 Αύγ 2014? Δημοσιεύθηκε: 30 Σεπτεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση: Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φύση Επιστημών της Κίνας, Αριθμός επιχορήγησης:. 30973449, 81172163, 81272515, 81272338, 81200706? Εθνικό Key Sci-Tech Ειδικό Πρόγραμμα της Κίνας, Αριθμός Grant: 2009ZX09103-642, 2013ZX09102053? Πρόγραμμα για το σταθμό Διδακτορικό στο Πανεπιστήμιο, Αριθμός Grant: 20120171110053, 20130171110053? Βασικό έργο της Φύσης Ιδρύματος Επιστημών της επαρχίας Guangdong, Κίνα, Αριθμός επιχορήγησης: 10251008901000009? Βασικά Sci-tech Ερευνητικό Πρόγραμμα της επαρχίας Guangdong, Κίνα, Αριθμός επιχορήγησης: 2011B031200006? Guandong Ταμείο Φυσικών Επιστημών, Grant Αριθμός: S2012010009250, S2012040006986? Βασικά Sci-tech Ερευνητικό Πρόγραμμα του Δήμου Guangzhou, Κίνα, Αριθμός Grant: 2011Y1-00017-8, 12A52061519? Πρόγραμμα Νέων Καθηγητών του Πανεπιστημίου, Αριθμός επιχορήγησης: 10YKPY28? Changjiang μελετητές και τα καινοτόμα ερευνητική ομάδα του Πανεπιστημίου, αριθμός:. 985 PCSIRT έργου 0947. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Η συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και η χημειοθεραπεία είναι οι κύριες κλινικές θεραπείες όγκου. Ωστόσο, η χειρουργική επέμβαση και η ακτινοθεραπεία είναι αναποτελεσματικές σε μεταστατικό καρκίνο? εάν η χημειοθεραπεία χρησιμοποιείται σωστά, μετάσταση μπορεί να ανασταλεί [1]. Όσον αφορά την ανάπτυξη φαρμάκων κατά του καρκίνου, ανθρακυκλίνες είναι τα πιο αποτελεσματικά αντικαρκινικά φάρμακα [2]. Φυσικά προϊόντα από τους ωκεανούς αποτελούν σημαντικές πηγές νέων αντικαρκινικών φαρμάκων [3]. Τα θαλάσσια μεταβολίτες μικροοργανισμού με μοναδικές δομές και φαρμακολογικές δραστηριότητες χρησιμοποιούνται συνήθως ως κορυφαία αντικαρκινικών ενώσεων [4]. ενώσεις ανθρακινόνης, όπως δαουνορουβικίνη, δοξορουβικίνη, επιρουβικίνη και μιτοξαντρόνη, είναι τα πιο αποτελεσματική κλινική αντικαρκινικά φάρμακα [2]. Το θαλάσσιο ανθρακινόνης SZ-685C καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων καρκίνου του μαστού [5] – [6] και ανθρώπινα κύτταρα ρινοφαρυγγικού καρκινώματος (NPC) [7]. Huang et al. έδειξαν ότι ανθρακινόνες από ραβέντι, όπως εμοδίνη, αλόη-εμοδίνη και Rhein, αναστέλλουν την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των διαφόρων καρκινικών κυττάρων, όπως αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, μυελογενή λευχαιμία, νευροβλάστωμα, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης και άλλων [8].

Ο μηχανισμός της αντικαρκινικής δραστηριότητας της ανθρακινόνες ασχολείται κυρίως με τα ακόλουθα στοιχεία [9] – [10]: αλληλεπιδράσεις DNA μέσω δέσμευσης, παρεμβαλλόμενα και παρεμβαίνοντας διαχωρισμό του διπλού έλικα του DNA? άμεσες μεμβράνη αποτελέσματα? βλάβη του DNA σε απόκριση σε τοποϊσομεράση II αναστολή ή την παραγωγή των ελευθέρων ριζών, όπως αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), και την επαγωγή απόπτωσης μέσω αναστολής της τοποϊσομεράσης II, λειτουργική ρ53 ή παραγωγή ROS. Επιπλέον, ανθρακινόνες ενεργοποιούν επίσης την απόπτωση διαμέσου της JNK (c-Jun Ν-τελική κινάση) [11], Akt /ΡΚΒ (Protein Kinase Β) [5], [12] και της μιτοχονδριακής οδών [13] – [14].

G503 είναι μια ένωση ανθρακινόνης απομονώνεται από τους δευτερογενείς μεταβολίτες της μαγκρόβια ενδοφυτικού μύκητα Νο 1403 από τη Θάλασσα της Νότιας Κίνας [15] .Ωστόσο, αν G503 διαθέτει αντικαρκινική δυναμικό ως ένωση ανθρακινόνης δεν έχει διερευνηθεί. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να διευκρινιστεί η δράση κατά των όγκων του G503 και ο υποκείμενος μηχανισμός που εμπλέκεται.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και Αντιδραστήρια

3- (4 , 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-diphenylterazolium (ΜΤΤ) και ROS καθαριστής Ν-ακετυλο-κυστεΐνη (NAC) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Hochest 33342, καρβοξυ-H2DCFDA, MitoProbe DiOC2 (3) κιτ δοκιμασίας και MitoProbe Μετάβασης Pore Assay Kit (M34153) ελήφθησαν από την Invitrogen (USA). Αννεξίνη V-FITC (ισοθειοκυανική φλουορεσκεϊνη) /ΡΙ (ιωδιούχο προπίδιο) απόπτωση Detection Kit αγοράστηκε από Keygen (Nanjing, Jiangsu, Κίνα). μέσο RPMI1640 και εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) ήταν από Hyclon (Logan, UT, USA

).

κασπάση-8 αναστολέας Ζ-IETD-FMK, κασπάσης-9 αναστολέας Ζ-LEHD-FMK και κασπάσης-οικογένεια αναστολέα Z-VAD-FMK ήταν από την Calbiochem (Gibbstown, NJ, USA) και Beyotime (Κίνα). Αντισώματα έναντι της κασπάσης-3, κασπάσης-4, κασπάσης-8, κασπάσης-9 και COXIV αντίσωμα ήταν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ, USA). Αντισώματα έναντι του κυτοχρώματος

γ

, Bax, Bcl-2, p38, π-ρ38 και αντι-κατσίκα lgG-HRP ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Ποντικού αντι-β-ακτίνης και αντι-GAPDH πρωτογενές antibodywere από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Αντι-κουνελιού lgG-υπεροξειδάσης και αντι-ποντικού IgG-υπεροξειδάσης ήταν από την Vector (Burlingame, CA, USA) .Mitochondria κιτ απομόνωσης αγοράστηκε από την Pierce (Pierce, IL, USA), κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης αγοράσθηκαν από την Bio-Rad (Hercules , CA, USA), και το κιτ ανίχνευσης ECL ήταν από Applygen Technologies Inc (Πεκίνο, Κίνα).

ζύμωση, η εξαγωγή και η απομόνωση των G503 από το

Nigrospora

sp. Νο 1403

NO.1403 απομονώθηκε από ξύλο σε αποσύνθεση του

Kandeliacandel

(L.) Druce και reidentified ως

Nigrospora

sp. (Αριθμός Genebank ένταξη: HQ891110), που συλλέγονται από Mai Po, το Χονγκ Κονγκ, και μια αλμυρή λίμνη στις Μπαχάμες. G503 απομονώθηκε και καθαρίστηκε από τις δευτερογενείς μεταβολίτες του ΝΟ. 1403 [15]. εναρκτήριες καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε καλαμποκάλευρο άγαρ θαλασσινού νερού. Βύσματα άγαρος που υποστηρίζουν μυκηλιακής ανάπτυξης κόπηκαν και μεταφέρθηκε υπό άσηπτες συνθήκες σε μια φιάλη Erlenmeyer των 250 κ.εκ. που περιέχει 100 ml υγρού μέσου (γλυκόζη 10 g /L, πεπτόνη 2 g /L, εκχύλισμα ζύμης 1 g /L, ΝβΟΙ

2 g /L, ρΗ D 7.0). Η φιάλη επωάστηκε στους 28 ° C. Μετά από ανακίνηση σε ένα περιστροφικό αναδευτήρα για 3-5 ημέρες, το μυκήλιο ασηπτικά μεταφέρθηκε σε φιάλη Erlenmeyer των 500 ml που περιέχει το υγρό καλλιέργειας (200 ml). Η φιάλη στη συνέχεια επωάστηκε στους 28 ° C για 25 ημέρες.

Οι καλλιέργειες (150 L) διηθήθηκαν μέσω τουλουπάνι. Το διήθημα συμπυκνώθηκε σε 5 L κάτω από 50 ° C και εκχυλίζεται τρεις φορές με ανακίνηση με ένα ίσο όγκο οξικού αιθυλεστέρα. Τα συνδυασμένα οργανικά εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε μία στήλη σιλικαζέλ, και εκλούεται με μία βαθμίδα πετρελαϊκού αιθέρα σε οξικό αιθυλεστέρα για να δώσει την ένωση.

Η ένωση διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) σε μία συγκέντρωση αποθέματος 50 mmol /L και αραιώνονται σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις πριν από τη χρήση

Κυτταροκαλλιέργεια

τα HUVECs απομονωθεί από το ανθρώπινο ομφάλιο λώρο φλέβα της κανονικής τοκετοί και καλλιεργούνται ακολουθώντας ένα πρωτόκολλο που περιγράφηκε προηγουμένως [16]. – [ ,,,0],17]. ηπατικά κύτταρα Chang και κυτταρικές γραμμές όγκου Hone-1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, Α549 και SGC7901, AGS διατηρήθηκαν από το εργαστήριο μας και καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 U /mL στρεπτομυκίνη και 100 U /mL πενικιλλίνη (Gibco) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Η μελέτη αυτή είναι σύμφωνη με τις αρχές που περιγράφονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι, που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ιατρικής Δεοντολογίας της Sun Yat-Sen University, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από το δότη.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

4 κύτταρα /mL σε πλάκες 24 φρεατίων (HUVECs σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων επικαλυμμένες με ζελατίνη). Όταν τα κύτταρα πέτυχαν πυκνότητα 60% -70%, αυτά υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του G503 για 48 ώρες σε μέσο RPMI1640 (1 mL /κυψελίδα) χωρίς FBS? οι αρνητικές ομάδες ελέγχου υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS. Στη συνέχεια, 100 μι ΜΤΤ (5mg /ml) διαλυμένο σε PBS προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για επιπλέον 4 ώρες για να επιτραπεί ο σχηματισμός του formazancrystals. Οι κρύσταλλοι διαλύθηκαν σε 1 mL DMSO σε κάθε φρεάτιο. Η οπτική πυκνότητα (OD) του διαλύματος μωβ που αντιπροσώπευε την κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκαν στα 570nm [18] – [19]. Μετά από τρία ανεξάρτητα πειράματα, η επιβίωση των κυττάρων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: επιβίωση (%) = (μέση πειραματική τιμή OD /μέση τιμή OD ελέγχου) χ 100%. Οι τιμές εκφράστηκαν ως η 50% ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50), το οποίο υπολογίζεται με τη μέθοδο παλινδρόμησης στην γραμμική περιοχή.

Hoechst χρώση 33342

δοκιμασία

SGC7901 κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε μια πυκνότητα των 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από G503 0 μmol /L έως 40 μmol /L για 24 ώρες. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με 10 μg /mL Hoechst 33342 [20] για 10 λεπτά στους 37 ° C και παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus X71-A12FL /PH).

αννεξίνης V FITC-/δοκιμασία χρώσης ΡΙ

SGC7901 κύτταρα συλλέχθηκαν σε πυκνότητα 5 × 10

5 έως 5 × 10

6 /mL μετά τη θεραπεία G503 σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 0 μmol /L έως 40 μmol /L για 24 ώρες σε τρυβλία 6 φρεατίων? κύτταρα κατεργασμένα με 25 μmol /L κολχικίνης χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και χρωματίστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Annexin V-FITC /ΡΙ Απόπτωση Detection Kit). Εν συντομία, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 500 μι 1 × δεσμευτικό ρυθμιστικό διάλυμα. Στη συνέχεια, 5 μL Αηηβχίην-FITC και 5 μL 20 μg /mL ΡΙ προστέθηκε στο δείγμα και επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά στο σκοτάδι. Τα βαμμένα δείγματα στη συνέχεια αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Becton Dickinson, NJ, USA) για να ταυτοποιηθούν τα αποπτωτικά κύτταρα.

Προσδιορισμός της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυνητικών

κύτταρα SGC7901 απλώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Κατά την επίτευξη μιας πυκνότητα 60%, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μmol /L G503 για 18 ώρες και στη συνέχεια συλλέγονται για την αξιολόγηση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (MitoProbe DiOC2 (3) Assay Kit). Εν συντομία, 1 χ 10 κύτταρα

6 /mL επαναιωρήθηκαν σε 37 ° C PBS. Οι θετικές ομάδες ελέγχου υποβλήθηκαν σε προ-θεραπεία με 1 μι 50 mmol /L CCCP στους 37 ° C για 5 λεπτά. Όλες οι ομάδες που υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε επεξεργασία με 5 μι 10 μmol /L DiOC

2 (3) για 30 λεπτά στους 37 ° C και αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης υπολογίστηκε με βάση την ακόλουθη εξίσωση:. Μιτοχονδριακής μεμβράνης δυνητικών = (κόκκινο ένταση φθορισμού) /(πράσινος ένταση φθορισμού)

Ανίχνευση το άνοιγμα των μιτοχονδρίων διαπερατότητας Μετάβασης Pore (ΜΡΤΡ)

κύτταρα SGC7901 απλώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Κατά την επίτευξη μιας πυκνότητα 60%, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μmοl /L G503 για 18 ώρες και συλλέγονται για την αξιολόγηση ΜΡΤΡ άνοιγμα με κυτταρομετρία ροής (Becton Dickinson, NJ, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (MitoProbe Μετάβασης Pore Assay Kit). Εν συντομία, κάθε δείγμα διαιρέθηκε σε 3 δείγματα και αντιμετωπίζονται ως εξής: κλάσμα 1 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 μL 2 μmol /L Calcein ΑΜ στο σκοτάδι? υποπολλαπλάσιο 2 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 μι Calcein ΑΜ και 5 μL 80 mmol /L CoCl

2 στο σκοτάδι? και κλάσμα 3 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 μL Calcein ΑΜ, 5 μL CoCl

2 και 5 μί 100 μmol /L ιονομυκίνη. Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για 15 λεπτά στο σκοτάδι. Μετά από πλύση με HBSS /Ca

2+ και επανα-εναιωρήθηκαν σε 400 μΙ HBSS /Ca

2+, τα κύτταρα αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής μέσα σε 1 ώρα. Η κατάσταση ανοίγματος ΜΡΤΡ υπολογίζεται ως εξής: (φθορισμός του κλάσματος 2- ο φθορισμός του κλάσματος 3) /(ο φθορισμός του κλάσματος 1- ο φθορισμός του κλάσματος 3). Calcein ΑΜ διαπερνά το κυτταρόπλασμα και οργανιδίων, συμπεριλαμβανομένων των μιτοχονδρίων. CoCl

2 αποσβένει Calcein ΑΜ φθορισμό στο κυτταρόπλασμα, αλλά όχι στα μιτοχόνδρια. Calcein ΑΜ μετατοπίζεται στο κυτταρόπλασμα από τα μιτοχόνδρια, όταν η ΜΡΤΡ ανοίγει, και ο φθορισμός εξασθενίζει από CoCl

2.

Απομόνωση μιτοχόνδρια των κυττάρων και κυτοπλάσματος

SGC7901 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες των 100 mm? Κάθε ομάδα τοποθετήθηκε σε δύο πλάκες. Μετά την επίτευξη του 60% -70% συρροή, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 20 μmol /L G503 για 18 ώρες. Μετά τη θεραπεία, οι μιτοχονδριακές και κυτταροπλασματικά κλάσματα που λαμβάνεται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (μιτοχόνδρια κιτ απομόνωσης).

κηλίδωση Western ανάλυση

Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA [21] . Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των μιτοχονδρίων, κυτταρόπλασμα και ολόκληρων κυττάρων ανιχνεύθηκαν με τη μέθοδο BCA χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτείνης Bio-Rad. Συνολικά, 60 μg πρωτεϊνών από κάθε ομάδα διαχωρίστηκαν με 12% ή 15% νάτριο ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλθειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Οι πρωτεΐνες από SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF. Αφού οι μη ειδικές θέσεις δέσμευσης των μεμβρανών αποκλείστηκαν για 1-2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με ρυθμιστικό TBST που περιέχει 10% άπαχο γάλα, οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτογενές αντίσωμα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δευτερεύοντα αντισώματα, με ή χωρίς φθορισμό συζευγμένο με τις σχετικές πρωτογενή αντισώματα επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες με φθορίζοντα δευτερεύοντα αντισώματα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα Οδύσσεια (Li-COR, Nebraska, USA) για τη σάρωση των φθορίζουσες ζώνες [22], και οι μεμβράνες με φυσιολογική δευτερογενή αντισώματα κατέστησαν ορατά χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης ECL για ανοσοστυπώματα. Οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν και επανα-διερευνήθηκαν με β-ακτίνη ή αντισώματα COXIV. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο για τη συνολική λύμα κυττάρων και κυτταροπλασματική εκχυλίσεις, ενώ COXIV χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για τις μιτοχονδριακές εκχυλίσεις. Πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Ποσότητα One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) [23].

Η στατιστική ανάλυση

παρουσιάστηκαν Όλα τα δεδομένα ως μέσοι όροι ± SD, τουλάχιστον εις τριπλούν προσδιορισμούς . SPSS 13.0 λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για t-test και μονόδρομη ανάλυση του Student διακύμανσης (ANOVA) σε όλες τις στατιστικές αναλύσεις. Ένα

P

αξίας 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική σε όλες τις περιπτώσεις.

Αποτελέσματα

G503 μεσολάβηση αναστολή στον πολλαπλασιασμό είναι το πιο ισχυρό σε SGC7901 κύτταρα από τις κυτταρικές σειρές 11 που εξετάστηκαν

Χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία ΜΤΤ για να προσδιοριστεί αν η ένωση ανθρακινόνης G503 είναι κυτταροτοξική στις ακόλουθες κυτταρικές σειρές: δύο φυσιολογικές κυτταρικές σειρές (Human ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) και τα κύτταρα του ήπατος Chang και εννέα κυτταρικές γραμμές όγκου (Hone -1, CNE-2, 5-8F, HepG2, B7402, Rb, PC3, Α549 και SGC7901). Όλα τα κύτταρα επωάστηκαν με 0, 2,5, 5, 10, 20 ή 40 μmol /L G503 για 48 ώρες. βιωσιμότητες κυττάρου μετρήθηκαν με χρήση της ανάλυσης ΜΤΤ όπως σημειώνεται, και το IC

50 τιμή για SGC7901 κύτταρα ήταν η χαμηλότερη, ενώ το IC

50 τιμές για τις κανονικές κυτταρικές σειρές, κύτταρα ήπατος HUVEC και Chang, ήταν σημαντικά μεγαλύτερες από ό, τι SGC7901 ( Πίνακας 1).

η

G503 προκαλεί απόπτωση σε SGC7901 και AGS γαστρικά καρκινικά κύτταρα

Δεδομένου ότι η SGC7901 κυτταρική γραμμή ήταν η πιο ευαίσθητη σε G503 από τις κυτταρικές σειρές έντεκα εξετάστηκαν (Πίνακας 1 ), ερευνήσαμε περαιτέρω αυτή την κυτταρική σειρά χωριστά. SGC7901 κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 για να προσδιοριστεί κατά πόσον η ανασταλτική επίδραση σχετίζεται με την απόπτωση. Τα αποτελέσματα δείχνουν μια αύξηση στον αριθμό των κυττάρων που εμφανίζουν πυρηνικό συρρίκνωση και συμπύκνωση χρωματίνης με αυξανόμενες συγκεντρώσεις G503 (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, για να διερευνηθεί κατά πόσο G503 διεγείρει απόπτωση σε άλλα κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, εξετάστηκαν επίσης AGS γαστρικά καρκινικά κύτταρα. χρώσης αννεξίνη V /PI χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των επιπτώσεων της G503 στην SGC7901 και AGS γαστρικών καρκινικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Για αυτά τα πειράματα, 25 μmol /L κολχικίνης χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Μετά τη θεραπεία με 0 μmol /L, 2,5 μmol /L, 5 μmol /L, 10 μmol /L, 20 μmol /L και 40 μmol /L G503 και colchicines 25 μmol /L για 24 ώρες, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων SGC7901 ήταν 5,625% ± 0,50%, 6,19% ± 0,13%, 10,25% ± 0,47%, 16,99% ± 1,73%, 25,72% ± 0,55%, 31,03 ± 1,03% και 20,69% ± 1,91%, αντίστοιχα (Εικόνα 1Β)? το ποσοστό των αποπτωτικών AGS κύτταρα ήταν 15,37% ± 2,36%, 19,30% ± 4,45%, 22,72% ± 4,89%, 24,93% ± 4,76%, 30.44% ± 9,42%, 47,51% ± 18.29% και 31.49% ± 2,45%, αντίστοιχα (Σχήμα 1 C). Η ανίχνευση της απόπτωσης σε κύτταρα AGS και τα ανωτέρω αποτελέσματα έδειξαν ότι G503 επάγει απόπτωση γαστρικό καρκινικό κύτταρο με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο.

(Α) κύτταρα SGC7901 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις G503 (0-40 μmol /L ) για 24 ώρες και χρωματίστηκαν με Hoechst 33342. Red βέλη δείχνουν τα αποπτωτικά κύτταρα. (Β), (Γ) SGC7901 κύτταρα (Β) και κύτταρα AGS (C) αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής μετά από επεξεργασία με διάφορες G503 concentrations- για 24 ώρες. Για την ποσοτική ανάλυση του G503 επαγόμενης SGC7901 και την απόπτωση των κυττάρων AGS, όλα τα δεδομένα που παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Και ** αντιπροσωπεύουν

P

Όταν τα κύτταρα συν-επεξεργασία με Z-VAD-FMK και G503, Z-VAD-FMK αναστέλλει κασπάσης-9 και -3 ενεργοποίησης (Σχήμα 2C, D), και ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων που επάγεται από G503 μειώθηκαν (Σχήμα 2Ε), υποδεικνύοντας έτσι ότι το G503 επαγόμενη SGC7901 κυτταρικής απόπτωσης είναι κασπάσης-εξαρτώμενη. Για να διακρίνει αν G503-επαγόμενη απόπτωση εξαρτάται από κασπάση-8, -9 ή και τα δύο, SGC7901 κύτταρα προκατεργάστηκαν με Ζ-IETD-FMK και Ζ-LEHD-FMK και στη συνέχεια συν-κατεργασία με G503. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το Ζ-IETD-FMK δεν αναστέλλουν κασπάσης-9 και -3 ενεργοποίησης (Σχήμα 3C), ούτε μείωση του αριθμού των αποπτωτικών κυττάρων που επάγεται από G503 (Σχήμα 3D)? Ωστόσο, Ζ-LEHD-FMK μείωσε τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων (Σχήμα 4C). Έτσι, G503 επαγόμενη SGC7901 κυτταρικής απόπτωσης δεν εξαρτάται από την κασπάση-8, αλλά είναι σε κασπάση-9.

Τα μιτοχόνδρια αποτελούνται από μία εξωτερική μεμβράνη, ο χώρος της μεμβράνης και μήτρας. Η απόπτωση που σχετίζονται με πρωτεΐνες, όπως προένζυμα κασπάσης, Cyto

γ

και ΟΕΕ υπάρχουν στο χώρο μεμβράνη.