Αφηρημένο

Σε μη-κλινικές μελέτες, αναστολέα πρωτεασώματος ixazomib αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων σε ένα ευρύ πάνελ κυτταρικών σειρών συμπαγών όγκων

in vitro

. Σε αντίθεση, κατά του όγκου δραστικότητα σε ξενομοσχεύματος όγκους είναι εξαρτώμενες από το μοντέλο, με κάποιες συμπαγείς όγκους που δεν εμφανίζει καμία απόκριση σε ixazomib. Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε παράγοντες που ευθύνονται για την ευαισθησία ixazomib ή αντίστασης χρησιμοποιώντας μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού. Μια έρευνα του 14 μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και 6 ξενομοσχεύματα παχέος εντέρου έδειξε μια εντυπωσιακή σχέση μεταξύ της δραστηριότητας ixazomib και

KRAS

γονότυπο? όγκων με άγριου τύπου (WT)

KRAS

ήταν πιο ευαίσθητα σε ixazomib από τους όγκους που φιλοξενούν

KRAS

ενεργοποίηση μεταλλάξεων. Για να επιβεβαιώσετε τη συσχέτιση μεταξύ

KRAS

γονότυπο και ixazomib ευαισθησίας, χρησιμοποιήσαμε SW48 ισογονιδιακές παχέος εντέρου καρκινικές κυτταρικές σειρές. Είτε KRAS-G13D ή KRAS-G12V μεταλλάξεις εισαχθούν μέσα σε κύτταρα KRAS-WT SW48 για να δημιουργήσει κύτταρα που εκφράζουν σταθερά ενεργοποιηθεί KRAS. SW48 KRAS WT όγκους, αλλά ούτε όγκοι SW48-KRAS-G13D ούτε όγκους SW48-KRAS-G12V, ήταν ευαίσθητα σε ixazomib

in vivo

. Από ενεργοποιηθεί KRAS είναι γνωστό ότι σχετίζονται με μεταβολικές επαναπρογραμματισμό, συγκρίναμε μεταβολίτη προφίλ του SW48-WT και οι όγκοι SW48-KRAS-G13D αγωγή με ή χωρίς ixazomib. Πριν από τη θεραπεία υπήρχαν σημαντικές μεταβολικές διαφορές μεταξύ SW48 WT και όγκους SW48-KRAS-G13D, αντανακλώντας την αύξηση του οξειδωτικού στρες και τη χρησιμοποίηση της γλυκόζης στους όγκους KRAS-G13D. επεξεργασία Ixazomib οδήγησε σε σημαντική μεταβολική ρύθμιση, και μερικές από αυτές τις αλλαγές ήταν ειδικά για όγκους KRAS WT. Η εξάντληση των ελεύθερων συγκεντρώσεων αμινοξέων και ενεργοποίηση GCN2-eIF2α-πορείες παρατηρήθηκαν τόσο σε τύπους όγκου. Ωστόσο, παρατηρήθηκαν μεταβολές των λιπιδίων βήτα οξείδωση μόνο στα όγκων KRAS WT. Τα μη κλινικά δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ δείχνουν μια συσχέτιση μεταξύ

KRAS

γονότυπο και ixazomib ευαισθησία στον NSCLC και ξενομοσχεύματα του παχέος εντέρου και να παρέχουν νέα στοιχεία της ρύθμισης των βασικών μεταβολικών οδών από την αναστολή του πρωτεασώματος

Παράθεση:. Chattopadhyay Ν, Berger AJ, Koenig E, Bannerman Β, Garnsey J, Bernard H, et al. (2015) KRAS γονότυπος συσχετίζεται με Proteasome αναστολέα Ixazomib Δραστηριότητα σε προκλινικές

In Vivo

Μοντέλα παχέος εντέρου και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα: πιθανός ρόλος των όγκων του μεταβολισμού. PLoS ONE 10 (12): e0144825. doi: 10.1371 /journal.pone.0144825

Επιμέλεια: Mariola J. Edelmann, Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 23 Ιουλίου 2015? Αποδεκτές: 23 Νοεμβρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 28 Δεκ 2015

Copyright: © 2015 Chattopadhyay et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από την Takeda Pharmaceuticals International Co. Επιπλέον, η Takeda Pharmaceuticals παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς (NC, AJB, EK, BB, JG, HB, PH, AML, ΥΥ, JD, KJ, ST, BS, CX, GK, ΜΜ, και ΒΑ). Metabolon Inc. παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για συγγραφέα NR, αλλά δεν έχει καμία επιπλέον ρόλο στην απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από την Takeda Pharmaceuticals International Co . Συγγραφείς NC, AJB, EK, BB, JG, ΗΒ, PH, AML, ΥΥ, JD, KJ, ST, BS, CX, GK, ΜΜ, και ΒΑ απασχολούνται από την Takeda Pharmaceuticals. NR απασχολείται από πληροφορίες Ευρεσιτεχνίας Metabolon Inc.: Μια αίτηση για δίπλωμα ευρεσιτεχνίας για τα τμήματα του έργου αυτού έχει κατατεθεί (WO2013071142 Α1) υπό τον τίτλο «Οι βιοδείκτες της απάντηση σε αναστολείς πρωτεασώματος» από την Millennium Pharmaceuticals Inc., μια θυγατρική της Takeda Pharmaceutical Company Περιωρισμένος. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Το σύστημα ουμπικιτίνης πρωτεασώματος επεξεργάζεται την πλειονότητα των κυτταρικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη, ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης [1,2,3]. VELCADE (bortezomib) είναι το πρώτο στην κατηγορία αναστολέα πρωτεασώματος (PI), έχουν εγκριθεί για τη θεραπεία ασθενών με πολλαπλό μυέλωμα (ΜΜ) [4] και μανδύα λεμφώματος κυττάρου [1,5,6]. Ixazomib είναι ένα ερευνητικό προφορική PI, επί του παρόντος σε κλινικές μελέτες φάσης ΙΙΙ σε ασθενείς με ΜΜ και αμυλοείδωση ελαφριάς αλυσίδας. PIs έχουν καταδείξει ένα ευρύ φάσμα επιδράσεων σε κύτταρα ΠΜ και μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών τους. Αυτό περιλαμβάνει αποτελέσματα επί του κυτταρικού κύκλου, η αναστολή του NF-kB, και αποπτωτικών ρυθμιστών, καθώς και επαγωγή της ολοκληρωμένης απόκρισης στρες, η αναστολή της παραγωγής IL-6 και σηματοδότηση, και πολλοί άλλοι [7,8]. Ως άκρως εκκριτικά κύτταρα που παράγουν αντισώματα, τα κύτταρα του ΠΜ έχουν μια αυξημένη ανάγκη για τον έλεγχο της ποιότητας πρωτεΐνης και μπορεί να έχει μεγαλύτερη εξάρτηση από την λειτουργία του πρωτεασώματος για την επιβίωση σε σύγκριση με άλλους τύπους κυττάρων [9].

Αν και PI έχουν δοκιμαστεί σε διάφορες κλινικές δοκιμές στερεού όγκου, δεν ΡΙ σήμερα εγκριθεί για τη θεραπεία των συμπαγών όγκων. Τα προκλινικά δραστηριότητα ixazomib και άλλων αναστολέων πρωτεάσης έχει αποδειχθεί σε περιορισμένο αριθμό μοντέλων στερεών ξενομοσχεύματος όγκου [10,11,12], αλλά προκλινικές προσδιορισμό της γενετικής και φαινοτυπική καθοριστικούς παράγοντες των στερεών ευαισθησία του όγκου σε αναστολείς της πρωτεάσης έχει λείπει.

στην παρούσα μελέτη αναφέρουμε μια εντυπωσιακή συσχέτιση μεταξύ

KRAS

γονότυπο και ixazomib ευαισθησία σε μια ομάδα μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και τα μοντέλα ξενομοσχεύματος του παχέος εντέρου. Ixazomib έδειξαν σημαντικά καλύτερη αντικαρκινική δράση σε άγριου τύπου ξενομοσχεύματα (WT) KRAS σε σχέση με ξενομοσχεύματα με την ενεργοποίηση του KRAS μεταλλάξεις. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η συσχέτιση αυτή δεν παρατηρήθηκε

in vitro

. Περίπου 25-30% των ανθρώπινων όγκων εκτιμάται ότι φιλοξενούν ενεργοποίηση μεταλλάξεων RAS [13]. Από τις τρεις ισομορφές RAS (KRAS, ΕΡΑ και HRAS),

KRAS

είναι πιο συχνά μεταλλάσσεται σε κακοήθειες.

KRAS

μετάλλαξη είναι ιδιαίτερα κυρίαρχο στο παχύ έντερο (40-45%), NSCLC (16-40%) και το καρκίνωμα παγκρεατικού πόρου (69-95%) [14]. Οι πρωτεΐνες RAS είναι GTPases που ρυθμίζουν διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού, την επιβίωση, την ανάπτυξη, τη μετανάστευση, τη διαφοροποίηση και τον μεταβολισμό. Μεταλλάξεις στο

KRAS

ογκογονίδιο είναι γνωστό ότι διαμορφώνουν μια σειρά σημαντικών μεταβολικών οδών, συμπεριλαμβανομένου γλυκόλυση, τρικαρβοξυλικού οξέος κύκλου (TCA), πεντόζη φωσφορικό μονοπάτι (ΣΔΙΤ), βιογένεση μεμβράνης καθώς και μεταφορά γλυκόζης [15,16 , 17]. Για να χαρακτηρίσουμε το μηχανισμό του KRAS που σχετίζονται με

in vivo

αντίσταση στην ixazomib, συγκρίναμε το μεταβολικό προφίλ κατά την έναρξη και μετά από ixazomib θεραπεία σε ισογονιδιακές KRAS WT και μεταλλαγμένα ξενομοσχευμάτων SW48. Εντοπίσαμε πολλά βασικά μεταβολικές οδούς που είναι διαφορικά επηρεάζονται από την κατάσταση KRAS, ixazomib θεραπεία, ή και τα δύο. Τα στοιχεία δείχνουν ότι αυτές οι μεταβολικές οδούς θα μπορούσαν να παίξουν ρόλο στον καθορισμό της ευαισθησίας σε αναστολέα πρωτεασώματος σε συμπαγείς όγκους.

Μέθοδοι και Υλικά |

Οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

SW48 και SW48- KRAS-G13D και SW48-KRAS-G12V κύτταρα ελήφθησαν από το Horizon Discovery Ltd. Κέιμπριτζ, Ηνωμένο Βασίλειο και διατηρήθηκαν σε μέσα McCoy 5Α συμπληρωμένο με 10% ορό.

Οι 8 άλλες κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται ως ξενομοσχεύματα ελήφθησαν από την ATCC , Manassas, VA.

για

in vitro

χρήση, ixazomib διαμορφώθηκε σε DMSO και αραιώνεται σε μέσα μαζικής ενημέρωσης για την επιθυμητή συγκέντρωση.

αντισώματα

αντισώματα κουνελιού κατά της ανθρώπινης GLUT1, GLUT 4, GCN2, pGCN2 (T899) και eIF2α ελήφθησαν από Abcam, Cambridge, ΜΑ. FASN, ΡΑΟΟ (S79), ACC, CPT-1 αντισώματα ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ και το αντίσωμα ποντικού κατά της ανθρώπινης peIF2α (S52) ελήφθη από την Invitrogen, Grand Island, ΝΥ. Όλα τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε 1:. Αραίωση 1000

Μελέτες in vivo σε ποντίκια που έφεραν ξένου μοσχεύματος

Όλα τα ζώα έρευνα και την κτηνιατρική φροντίδα που έγιναν σε Takeda Βοστώνη, διεξήχθη στο πλαίσιο εγκεκριμένου Takeda Βοστώνη Θεσμική φροντίδα των ζώων και τη χρήση της ουσίας (IACUC) πρωτόκολλο σε μια Ένωση για την Αξιολόγηση και διαπίστευση του Εργαστηρίου ζώων Care International (AAALAC) διαπιστευμένους εγκατάσταση. Ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς στεγάστηκαν σε ελεγχόμενο περιβάλλον και έλαβαν τροφή και νερό κατά βούληση. Οι λεπτομέρειες των μοντέλων ξενομοσχεύματος, συμπεριλαμβανομένων ενδεικτικά, τον αριθμό των κυττάρων που εμφυτεύονται και στέλεχος υποδοχής που καθορίζονται στον πίνακα S1.

Οι μελέτες σε ζώα που πραγματοποιήθηκαν σε Oncotest, GmbH διεξήχθη σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του νόμου Πρόνοιας της Γερμανίας Ζώων (Tierschutzgesetz ).

Για ξενομοσχεύματα κυτταρικής σειράς, έναν καθορισμένο αριθμό κυττάρων (με ή χωρίς Matrigel, BD Biosciences, Bedford, ΜΑ) υποδορίως εμβολιάσθηκαν στο δεξιό πλευρό των ποντικών και η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με μέτρηση με παχύμετρο. Μόλις η μέση όγκος φτάσει σε ένα ορισμένο όγκο (μεταξύ 120-250mm

3, ανάλογα με το μοντέλο), τα ζώα τυχαιοποιήθηκαν σε διαφορετικές ομάδες θεραπείας των 8-10 ζώων ανά ομάδα. Πρωτοβάθμια μοντέλα ξενομοσχεύματος ανθρώπινου όγκου σχολιασμένο με PhTX αναπτύχθηκαν στην Takeda. Τα δείγματα ασθενών ελήφθησαν είτε από την Εθνική Νοσημάτων Έρευνας Interchange, Philadelphia, PA ή ο Συνεταιρισμός Ανθρώπινο Δίκτυο ιστών, NCI. Αφαιρεθεί χειρουργικά δείγματα ασθενών υποδορίως εμφυτευμένων σε ποντικούς και διαβιβάσθηκαν επανειλημμένα (όχι περισσότερο από 10) πριν από τη χρήση σε μελέτες αποτελεσματικότητας. Πρωτοπαθείς όγκους σχολιασμένο με LX αναπτύχθηκαν και δοκιμάστηκαν σε Oncotest GmbH, Γερμανία.

Ixazomib για

in vivo

χρήση διαμορφώθηκε σε 10% το HP-β-CD (υδροξυπροπυλ β-κυκλοδεξτρίνη) και σε δόση μέγιστη ανεκτή δόση της (MTD) για το συγκεκριμένο στέλεχος ποντικού και μοντέλο (μεταξύ 11 έως 14mg /kg, IV, BIW για 3-4 εβδομάδες).

δραστηριότητα

Αντικαρκινική προσδιορίστηκε με υπολογισμό της θεραπείας για τον έλεγχο (Τ /C) κατ ‘όγκο αναλογία του όγκου στο τέλος της μελέτης.

είτε στο τέλος της κάθε μελέτης, της αν κάποιο ζώο φτάσει μια ανθρώπινη παράμετρο, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 που ακολουθείται από εξάρθρωση του αυχένα ή μια άλλη δευτερεύουσα μέθοδος της ευθανασίας έχουν εγκριθεί από το πρωτόκολλο IACUC.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε αντίστοιχα μέσα ανάπτυξή τους, συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και σπείρονται επί 384 φρεατίων πολυ- D-λυσίνη (PDL) -επικαλυμμένα μαύρο, διαυγούς πυθμένα πλάκες (BD Biocoat

™) και επωάστηκαν 24 ώρες στους 37 ° C, 6% CO

2. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με ixazomib σε διάφορες συγκεντρώσεις για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα εκτιμήθηκε με CellTiter-Glo

® αντιδραστήριο Βιωσιμότητας Κυττάρων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega, Madison, WI).

δοκιμασία σχηματισμού Αποικίας 2D

5000 κύτταρα ανά φρεάτιο του άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο KRAS (G12V ή G13D) SW48 γραμμές σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων (BD Falcon, Βϋ Biosciences, San Jose, CA) και επωάζονται όλη τη νύκτα. Κυττάρων μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0-500 ηΜ ixazomib για 11 ημέρες και μονιμοποιήθηκαν σε 4% PFA, πριν από χρώση με 0,5% κρυσταλλικό ιώδες σε 25% μεθανόλη. Περιοχή των αποικιών μετρήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό Metamorph και IC

50 προσδιορίστηκε με υπολογισμό της συγκέντρωσης κατά την οποία το ποσοστό μέση έκταση αποικία έφθασε το 50% σε σχέση με τον έλεγχο του οχήματος.

δοκιμασία σχηματισμού αποικίας 3D για 20 πρωτογενείς ασθενή προέρχεται όγκους NSCLC περιγράφεται στο [18].

Ανάλυση φαρμακοκινητικής του όγκου (PK) και 20S πρωτεασώματος

όγκων PK και αναλύσεις 20S περιγράφονται προηγουμένως [10]. Εν συντομία, τα δείγματα όγκων συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά οχήματος ή τη χορήγηση του φαρμάκου και ομογενοποιείται σε πλάσμα ποντικού για ΡΚ ανάλυση στοιχείων. Συγκέντρωση των ixazomib στους όγκους προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας LC /μεθόδους MS /MS.

20S πρωτεασώματος β5 ενζυματική δραστικότητα μετρήθηκε μετά από ομογενοποίηση δειγμάτων όγκου σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει HEPES και DTT χρησιμοποιώντας μια συσκευή υπερήχων Covaris.

Μεταλλακτική ανάλυση

DNA από όγκους ξενομοσχεύματος ενισχύθηκε και αναλύθηκε με δοκιμασία Sequenom, όπως περιγράφεται στο [19]. Ο πίνακας γονίδιο που περιλαμβάνονται στο OncoCarta

™ V1 και προσαρμοσμένες πάνελ παρέχεται σε S2 πίνακα. Για το

KRAS

γονιδίων, οι μεταλλάξεις που εξετάστηκαν είναι G12 A /C /D /F /R /S /V, G13 A /C /D /R /S /V, L19F, Q22K, T58I, A59T /V, G60D, Q61 E /H /K /L /P /R και A146T.

Μεταβολικό προφίλ

δείγματα όγκων συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά από ενδοφλέβια χορήγηση μιας μόνο δόσης ixazomib. Για τον έλεγχο του οχήματος, αξιολογήθηκαν δύο χρονικά σημεία (1 ώρα και 8 ώρες). Η λύση του όγκου και σφαιρική ανάλυση μεταβολικό προφίλ έγιναν σε Metabolon Inc. Εν συντομία, τα δείγματα εκχυλίζονται σε μεθανόλη και διαιρείται σε ίσα μέρη για ανάλυση στο /MS και LC /MS /MS πλατφόρμες GC. Ιδιόκτητο λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για να ταιριάζει με τα ιόντα σε μια βιβλιοθήκη στο σπίτι των προτύπων για την ταυτοποίηση μεταβολιτών και για το μεταβολίτη ποσοτικοποίηση του εμβαδού της κορυφής. Του Welch δύο δειγμάτων t-tests και αμφίδρομη ΑΝΟνΑ χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση των μέσων δύο πληθυσμών. τιμές ρ ≤0.05 θεωρήθηκαν πολύ σημαντική και ρ τιμές μεταξύ 0,05 και 0,1 θεωρήθηκαν λιγότερο σημαντικές.

Western ανάλυση κηλίδος

δείγματα όγκου ομογενοποιούνται σε ρυθμιστικό MPER περιέχει αναστολείς πρωτεάσης [10]. 10-20 μγραμ των πρωτεϊνών φορτώθηκαν σε 4% έως 12% πηκτώματα Bis-Tris, ή πηκτώματα 3-8% οξικό τρις ​​για υψηλότερες πρωτεΐνες μοριακού βάρους (Invitrogen). Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF-FL (Millipore), μπλοκάρει και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα ακολουθούμενη από Alexa Fluor 680 επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα (Molecular Probes). Ζώνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας Odyssey σύστημα υπέρυθρης απεικόνισης (LI-COR Βιοεπιστημών, Lincon, ΝΕ).

Αποτελέσματα

μεταλλάξεις KRAS συσχετίζονται με μειωμένη ευαισθησία στην ixazomib

Για να κατανοήσουμε τη μοριακή παράγοντες που καθορίζουν την ευαισθησία στην ixazomib

in vivo

, ερευνήσαμε κατά του όγκου δραστικότητα σε ένα πάνελ του παχέος εντέρου και NSCLC μοντέλα ξενομοσχεύματος πρωτογενή ανθρώπινα ξενομοσχεύματα και αλλομοσχεύματα γραμμή που προέρχεται από κύτταρο. Η αντικαρκινική δραστικότητα του φαρμάκου εκφράστηκε ως αναλογία Τ /Ο? με T /C από το 0 υποδεικνύει την πλήρη εξάλειψη του όγκου, και T /C του 1 υποδεικνύει καμία επίδραση. (Σχήμα 1Α)

(Α) Η αντικαρκινική δράση του ixazomib σε 14 μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και 6 μοντέλα ξενομοσχεύματος κόλον. Ο πίνακας που περιλαμβάνεται τόσο κυτταρική γραμμή που προέρχεται και πρωτογενών ανθρώπινων ξενομοσχευμάτων φιλοξενούν είτε WT ή μεταλλαγμένο KRAS. ζώα που φέρουν όγκο (η = 8-10 ανά ομάδα) υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με όχημα ή ΜΤϋ δόση ixazomib (μεταξύ 11 και 14 mg /kg, IV, BIW) για περίπου τρεις εβδομάδες. T /C υπολογίστηκε διαιρώντας μέσο όγκο του όγκου των ζώων που έλαβαν το φάρμακο από ότι των ζώων που έλαβαν φορέα κατά την ημέρα 19-21. συγκέντρωση του όγκου των ixazomib (Β) και 20S αναστολή πρωτεασώματος (περιοχή β5) (C) σε διάφορα NSCLC και ξενομοσχευμάτων του παχέος εντέρου σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά από μία μόνο ενδοφλέβια χορήγηση MTD δόσης ixazomib. % 20S β5-αναστολής υπολογίστηκε με την εξέταση της μέσης (n = 3 για την ομάδα θεραπείας ή 4 για όχημα ομάδα) όγκου 20S δραστικότητα των ζώων που έλαβαν φορέα ως 100%. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τη μέση συγκέντρωση του ixazomib ή αναστολής 20S στη όγκου από 3-4 διαφορετικά ζώα +/- SD.

Η

Μεταλλάξεις σε ένα πάνελ των ογκογονιδίων και καταστολείς όγκων (S2 Πίνακα) εξετάστηκαν σε οι ξενομοσχεύματα όγκου κατά μάζα ανάλυση φασματομετρίας που βασίζονται Sequenom. Συνεπής με την υψηλή επικράτηση του

KRAS

μεταλλάξεις στο ανθρώπινο παχύ έντερο και όγκους NSCLC, 12 από τα μοντέλα 20 αξιολογήθηκαν είχαν

KRAS

μεταλλάξεις στα κωδικόνια G12, G13, G61 ή A146T, ενώ δεν

NRAS

ή

HRAS

μεταλλάξεις εντοπίστηκαν. Λιγότεροι δείγματα είχαν μεταλλάξεις σε

PI3KCA

, ή άλλα γνωστά ογκογονίδια (S3 πίνακα). KRAS όγκους μεταλλαγμένου έδειξαν μικρότερη ευαισθησία στην ixazomib (av. Τ /C = 0,82) σε σύγκριση με KRAS WT όγκους (av. Τ /C = 0,4) (p = 0.002 καθορίζεται από t-test) (Σχήμα 1Α).

Εμείς αξιολογούνται διάφορες πιθανές εξηγήσεις για τις διαφορές στο ixazomib ευαισθησία μεταξύ των όγκων ξενομοσχεύματος, ξεκινώντας με φαρμακοκινητική (ΡΚ) και φαρμακοδυναμικές (PD) επιπτώσεις της ixazomib

in vivo

μετά από μία μόνο δόση MTD σε 5 μοντέλα ξένου μοσχεύματος. Οι συγκεντρώσεις Ixazomib σε όγκους μεταλλαγμένου KRAS ήταν είτε παρόμοια ή υψηλότερα από εκείνα KRAS WT όγκους (Σχήμα 1Β), και τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος όγκου β5 επιτόπου ανεστάλη σε παρόμοιο βαθμό και στις δύο KRAS άγριου τύπου και των μεταλλαγμένων όγκων (Σχήμα 1C). Πρόσθετη απόδειξη της αναστολής πρωτεασώματος και κατάντη των συνεπειών της δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό IHC για ATF3, η οποία ρυθμίζεται προς τα πάνω, στο πλαίσιο της ολοκληρωμένης απάντησης στο στρες μετά από πρωτεασώματος αναστολή [10]. ATF3 ρύθμιση προς τα άνω ανιχνεύθηκε σε όλα τα μοντέλα, ανεξάρτητα από τους

KRAS

κατάσταση μετάλλαξη ή ευαισθησία στο ixazomib (S1 Σχήμα). Έτσι, η έλλειψη ευαισθησίας των μεταλλαγμένων όγκων KRAS να ixazomib δεν εξηγείται από την χαμηλότερη έκθεση του όγκου ή μικρότερη αναστολή στόχου.

Είναι ενδιαφέρον, KRAS μεταλλάξεις δεν έχουν προσδιοριστεί ως προγνωστικός παράγοντας της αντίστασης PI σε αναλύσεις βιωσιμότητας μονοστρωματική καλλιέργεια ιστών. Για να προσδιορίσετε αν θα μπορούσε να παρατηρηθεί η συσχέτιση μεταξύ της κατάστασης KRAS και ixazomib ευαισθησία χρησιμοποιώντας ένα

in vitro

τρισδιάστατο μοντέλο, ένα πάνελ 20 μοσχευμάτων ξένου μοσχεύματος, συμπεριλαμβανομένων WT KRAS και μεταλλαγμένου KRAS δοκιμάστηκαν σε μια δοκιμασία σε μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας. Τα μοσχεύματα που περιλαμβάνονται 17 πρωτογενών ανθρώπινων όγκων ξενομοσχεύματος και 3 κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται όγκους ξενομοσχεύματος, και 8 από τα 20 έχουν επίσης δοκιμαστεί για την απόκριση ixazomib

in vivo

. Η διαφορά στην ευαισθησία δει

in vivo

δεν ανιχνεύτηκε

in vitro

. Το μεσαίο IC

50 στη δοκιμασία σχηματισμού αποικιών ήταν 99 nM (εύρος 34-272 nM) για τα μοντέλα WT KRAS, και 73 nM (εύρος 38-17 5ηΜ) για KRAS μεταλλαγμένο μοντέλα (S4 Πίνακας). (Ρ = 0,4). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι μεταλλαγμένο KRAS παρέχει ένα πλεονέκτημα επιβίωσης

in vivo

οποία δεν μιμήθηκε στο μαλακό μορφή άγαρ δοκιμασία.

Εισαγωγή μετάλλαξη KRAS αντιστρέφει in vivo ixazomib ευαισθησία του KRAS WT ξενομοσχεύματος

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ

KRAS

γονότυπο και ixazomib ευαισθησία

in vivo

, χρησιμοποιήσαμε ένα σύνολο από κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου, που διαφέρουν ως προς την κατάσταση KRAS, αλλά κατά τα άλλα γενετικά ταιριάζουν. Σταθερά παράγωγα της κυτταρικής σειράς SW48 προέκυψαν με την εισαγωγή ενός KRAS-G13D ή σημειακή μετάλλαξη KRAS-G12V μέσω της τεχνολογίας επεξεργασίας γονίδιο rrAV. Η παρουσία των μεταλλάξεων και η διατήρηση της συνολικής γονιδιωματικού προφίλ των κατασκευασμένων κυττάρων επιβεβαιώθηκαν με ανίχνευση μετάλλαξης και ανάλυσης SNP (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η ενεργοποίηση του KRAS σηματοδότησης στα κύτταρα KRAS-G13D και KRAS-G12V σε σύγκριση με το WT ομόλογό τους είχε προηγουμένως επιβεβαιωθεί. [20]

Όλα τα 3 κυτταρικές σειρές ήταν εξίσου ευαίσθητα στην ixazomib στο

στο

vitro δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας (Σχ 2Α). KRAS WT και τα κύτταρα KRAS-G13D ήταν εξίσου ευαίσθητα στην δοκιμασία σχηματισμού 2D αποικίας, ενώ τα κύτταρα KRAS-G12V ήταν περίπου 2 φορές πιο ευαίσθητοι σε αυτή τη δοκιμασία CFA (Σχήμα 2Α). Αντίθετα, υπήρξε μια σαφής διαφορά στο

in vivo

ευαισθησία σε ixazomib στο SW48, SW48-G13D και SW48-G12V ξενομοσχεύματος όγκους. SW48 ξενομοσχευμάτων με KRAS άγριου τύπου ανταποκρίθηκαν στην ixazomib θεραπεία με Τ /Κ 0,42 (Σχήμα 2Β). Σε αντίθεση, ούτε η SW48-G13D ούτε μοντέλο ξενομοσχεύματος SW48-G12V ήταν ευαίσθητη σε ixazomib (T /C = 1,05 και 0,99), γεγονός που υποδηλώνει ότι η εισαγωγή ενός

KRAS

μετάλλαξη είναι αρκετή για να οδηγήσει αντίσταση στην PI σε όγκο ξενομόσχευμα μοντέλα

in vivo

. Τα 3 μοντέλα ξενομοσχεύματος έδειξε παρόμοια κινητική ανάπτυξη στις ομάδες του οχήματος (Σχήμα 2Β), υποδηλώνοντας ότι οι διαφορές στην απόκριση ixazomib δεν οφείλονται σε διαφορές στα ποσοστά ανάπτυξης του όγκου. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μιας μελέτης PK /PD διεξήχθη στους όγκους ξενομοσχεύματος SW48 και SW48-G13D δείχνουν συγκρίσιμα επίπεδα ixazomib έκθεσης στα ξενομοσχεύματα (Σχήμα 2C), όπως επίσης και παρόμοια επίπεδα αναστολής πρωτεασώματος όγκου (Σχήμα 2D), σε συνέπεια με τα αποτελέσματα στην ευρύτερη πάνελ ξενομοσχευμάτων που περιγράφονται στο Σχήμα 1. Έτσι, η επίδραση της μετάλλαξης του KRAS δεν είναι στο επίπεδο της έκθεσης στο φάρμακο ή την αναστολή του στόχου.

(Α) Συνοπτικός πίνακας της ΕΚ

50, IC

50 και Τ /Κ τιμές για τα κύτταρα και αλλομοσχεύματα από

in vitro

βιωσιμότητα των κυττάρων,

in vitro

σχηματισμού αποικιών και

in vivo SW48, SW48-G13D και SW48-G12V

δοκιμασίες αντικαρκινική δράση. ΕΚ

50 αντιπροσωπεύει τη μέση συγκέντρωση του ixazomib (+/- SD) που απαιτείται για 50% θανάτωση κυττάρου σε τρία διαφορετικά πειράματα σε δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας. Στην δοκιμασία σχηματισμού αποικίας (CFA) η μέση συγκέντρωση του φαρμάκου για να αναστείλει τον σχηματισμό αποικίας κατά 50% υπολογίστηκε σε τρία διαφορετικά πειράματα και ο αριθμός είναι μέσος όρος +/- SD. 13 mg /kg, IV, BIW δόση χρησιμοποιήθηκε σε ξενομοσχεύματος μελέτες και Τ /Κ υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως. (Β) Η αντικαρκινική δράση των ixazomib στο SW48, SW48-G13D και SW48-G12V ξενομοσχευμάτων. Η ανάπτυξη του όγκου πάροδο του χρόνου παρουσιάζεται για το όχημα και ixazomib θεραπεία ζώα που φέρουν SW48, SW48-G13D και ξενομοσχευμάτων SW48-G12V. Η θεραπεία άρχισε όταν ο μέσος όγκος του όγκου έφθασε περίπου 200 χιλιοστά

3 και υπήρχαν n = 10 ζώα ανά βραχίονα. Ο Τ /Κ υπολογίστηκε κατά την ημέρα 19-21. Γ και Δ: συγκέντρωση όγκου του ixazomib (C) και 20S πρωτεασώματος αναστολή (D) σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά από οξεία ενδοφλέβια χορήγηση ixazomib σε 13mg δόσεως /kg σε SW48 και όγκους SW48-G13D. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει όγκους από τρία διαφορετικά ζώα +/- SD

Η

Η αυξημένη έκφραση των υποδοχέων GLUT4 σε όγκους μεταλλαγμένου KRAS

Οι διαφορές στη δραστηριότητα ixazomib

in vitro

και

in vivo

προτείνουν παράγοντες στο περιβάλλον του όγκου

in vivo

, όπως τα επίπεδα θρεπτικών συστατικών, των μεταβολιτών ή άλλους παράγοντες, θα μπορούσε να διαδραματίσει κάποιο ρόλο στον καθορισμό της ευαισθησίας σε ixazomib. έχουν ογκογονικές KRAS πρωτεΐνες έχουν αναφερθεί ότι επάγουν κυτταρική επιφάνεια έκφραση των υποδοχέων γλυκόζης (GLUTs), και με τον τρόπο αυτό διευκολύνει την κυτταρική μεταφορά γλυκόζης [4,15,21,22]. Επομένως, εξετάσαμε την βασική έκφραση του GLUT1 και GLUT4 σε έναν αριθμό KRAS WT και μεταλλαγμένων όγκων με στύπωμα Western (Σχήμα 3). Εμείς περιλαμβάνονται λύματα από KRAS WT και ξενομοσχευμάτων γραμμή που προέρχεται από μεταλλαγμένο κύτταρο (NCI-H1650 και Α549 και το ισογονιδιακές ζευγάρι SW48 και SW48-G13D) και πρωτοβάθμια ξενομοσχεύματα (PHTX132Lu και PHTX192Lu). Αν και η έκφραση των υποδοχέων GLUT1 δεν σχετίζεται με την κατάσταση KRAS, τα μεταλλαγμένα ξενομοσχεύματα KRAS παρουσίασαν πολύ υψηλότερα επίπεδα έκφρασης των υποδοχέων GLUT4 σε σύγκριση με όγκους με WT KRAS. Αυξημένη GLUT4 θα επιτρέψει αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης, η οποία θα είναι επωφελής σε περιβάλλοντα θρεπτικό περιοριστικά βρίσκονται συχνά σε όγκους. Η αυξημένη έκφραση GLUT4 σε όγκους μεταλλαγμένου KRAS υποδηλώνει ότι αλλαγμένη πρόσληψης γλυκόζης και μεταβολισμού μπορεί να παίζουν κάποιο ρόλο στον καθορισμό της ευαισθησίας σε ixazomib.

Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από μη επεξεργασμένο όγκους και πρωτεΐνη 10 μg φορτώθηκε σε κάθε λωρίδα. Επίπεδα των πρωτεϊνών GLUT1 και GLUT4 προσδιορίστηκαν με κηλίδα western και τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. n = 3 για κάθε όγκο.

Η

Παγκόσμια ανάλυση μεταβολικό προφίλ στο SW48 ισογονιδιακές όγκους

Για να κατανοήσουμε περισσότερο τις μεταβολικές διαφορές μεταξύ KRAS WT και KRAS όγκους μεταλλαγμένου και την αντίδρασή τους σε ixazomib, εμείς διεξάγεται μεταβολικό προφίλ στο SW48 και SW48-G13D όγκους ξενομοσχεύματος που συλλέγονται σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά από μία εφάπαξ ενδοφλέβια δόση των οχημάτων ή ixazomib. Μεταβολίτη επίπεδα μετρήθηκαν με μεθόδους μαζικής φασματομετρίας με βάση και αναφέρεται ως ένα πτυσσόμενο αλλαγή σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου ορίζεται. Υπήρχαν ορισμένες μεταβολικές διαφορές παρατηρήθηκαν στη βασική γραμμή (δείγματα υπό αγωγή με όχημα) μεταξύ SW48 και όγκων SW48-G13D, ιδιαίτερα σχετικές σε γλουταθειόνη και το μεταβολισμό του γλυκογόνου και σύνθεση λιπαρών οξέων (Σχήμα 4). Τόσο οξειδωμένη και ανηγμένη γλουταθειόνη (GSSG και GSH) ανιχνεύθηκαν σε υψηλότερα επίπεδα σε όγκους μεταλλαγμένου KRAS σε σύγκριση με KRAS WT όγκους (Σχήμα 4Α). Αντιστρόφως, βιοσυνθετική πρόδρομοι της γλουταθειόνης, όπως γλουταμινικό, κυστεΐνη, γλυκίνη, γ-γλουταμυλ αμινοξέα, και 5-οξυπρολίνη ανιχνεύθηκαν σε χαμηλότερα επίπεδα σε KRAS όγκους μεταλλαγμένου ξενομοσχεύματος (Σχ 4Α). Το αυξημένο επίπεδο της σύνθεσης της γλουταθειόνης σε όγκους μεταλλαγμένου KRAS μπορεί να προάγει την αυξημένη επιβίωση και την αντίσταση των ναρκωτικών μέσω της ενίσχυσης της ικανότητας των όγκων να ασχοληθεί με οξειδοαναγωγικό στρες [23]

AC:. Γλουταθειόνης μονοπάτια μεταβολισμό (Α), ο μεταβολισμός του γλυκογόνου ( Β) και η σχετική έκφραση των μεταβολιτών οδού στο KRAS WT vs όγκους μεταλλαγμένου KRAS που έλαβαν θεραπεία με όχημα για 1 και 8 ώρες. Οι αριθμοί δείχνουν την πολλαπλή μεταβολή του κάθε μεταβολίτη σε όγκους μεταλλαγμένου KRAS σε σύγκριση με τους όγκους KRAS WT και είναι ο μέσος όρος των επιπέδων των μεταβολιτών από 5 διαφορετικούς όγκους. C: Σχετική έκφραση των ελεύθερων λιπαρών οξέων μακράς αλύσου, ακετύλιο coA, ακετυλοκαρνιτίνη και κιτρικού στο KRAS μεταλλαγμένο vs όγκων KRAS WT. Πράσινα κουτιά υποδηλώνει μια αναλογία & lt? 1, με σκούρο πράσινο κουτιά ως ιδιαίτερα σημαντική (p ≤0.05) και το πράσινο φως κουτιά ως λιγότερο σημαντική (0,05 & lt? P & lt? 0,1). Κόκκινα κουτιά προκύπτει λόγος & gt? 1, με σκούρα κόκκινα κουτιά ως ιδιαίτερα σημαντική (p ≤0.05) και ελαφριά κόκκινα κουτιά ως λιγότερο σημαντική (0,05 & lt? P & lt? 0,1). Λευκά κουτιά αντιπροσωπεύουν καμία αλλαγή στην έκφραση.

Η

Μειωμένα επίπεδα των ενδιάμεσων γλυκογόνου, όπως μαλτοτριόζη, η μαλτόζη και η γλυκόζη παρατηρήθηκαν σε όγκους μεταλλαγμένου KRAS σε σύγκριση με KRAS WT όγκους (Σχήμα 4Β), γεγονός που υποδηλώνει μια ταχεία γλυκογόνου κατανομή σε όγκους μεταλλαγμένου KRAS για την παροχή γλυκόζης. Το σχετικά χαμηλό επίπεδο της γλυκόζης κατά την έναρξη σε όγκους μεταλλαγμένου KRAS αποτελεί ένδειξη ότι η γλυκόζη είναι ταχέως καταναλώνεται στην προώθηση συνεχή ανάπτυξη και την επιβίωση.

Τα υψηλότερα επίπεδα των ελεύθερων λιπαρών οξέων σε όγκους SW48-G13D σε σύγκριση με SW48 (Εικ 4C) ανιχνεύθηκαν. Άλλες διαφορές σε συστατικά του λιπαρού οξέος οδοί του μεταβολισμού παρατηρήθηκαν επίσης? σε όγκους SW48-G13D, τα επίπεδα του κιτρικού είναι υψηλότερα και τα επίπεδα του ακετυλο-καρνιτίνης είναι χαμηλότερα σε σύγκριση με τους όγκους SW48 WT. Στο σύνολό τους αυτές οι διαφορές οδηγούν σε αυξημένη

de novo

σύνθεση λιπαρών οξέων σε όγκους μεταλλαγμένου KRAS, τα οποία θα μπορούσαν να συμβάλουν στην αύξηση της βιοσύνθεσης μεμβράνη που απαιτούνται για τη συνεχή ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των όγκων ογκογονίδιο-οδηγείται.

αμινοξέος εξάντληση μετά από ixazomib θεραπεία

Υπήρξαν μια σειρά από μεταβολικές αλλοιώσεις παρατηρήθηκαν μετά ixazomib θεραπεία τόσο SW48 και όγκους SW48-G13D. Μία από τις σημαντικές μετατροπές ήταν η οξεία πτώση των επιπέδων των πολλών μεμονωμένων αμινοξέων εξής ixazomib αγωγή (Σχήμα 5). Το σχήμα 5Α δείχνει τη ρύθμιση των 20 αμινοξέων σε 1 και 8 ώρες μετά την αγωγή της ixazomib KRAS WT και όγκους μεταλλαγμένου SW48. Μια σειρά από απαραίτητα και μη απαραίτητα αμινοξέα μειώθηκε 1 ώρα μετά τη θεραπεία ixazomib τόσο KRAS WT και των μεταλλαγμένων όγκων. Τα επίπεδα αμινοξέος επέστρεψε κοντά στην αρχική τους κατάσταση από 8 ώρες, γεγονός που υποδηλώνει την εξάντληση οξεία αμινοξέων μετά από ixazomib θεραπεία. αποικοδόμηση του πρωτεασώματος των πρωτεϊνών δημιουργεί βραχέα πεπτίδια τα οποία μπορεί να είναι ενζυμικά μετατραπούν σε ελεύθερες αμινοξέα? μπλοκάροντας τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος με ixazomib πρέπει, επομένως, να οδηγήσει σε μειωμένη πισίνα πεπτιδίων και ελεύθερων αμινοξέων.

(Α) Σχετικό επίπεδο των αμινοξέων σε 1 ώρα και 8 ώρες μετά από ixazomib θεραπεία SW48 KRAS WT και G13D μεταλλαγμένων όγκων. Οι αριθμοί εκφράζονται ως σχετικό επίπεδο κάθε αμινοξύ εξής ixazomib θεραπεία σε σύγκριση με την αγωγή όχημα εκείνη τη χρονική στιγμή. Κάθε σημείο δεδομένων είναι ο μέσος όρος των όγκων από πέντε διαφορετικά ζώα. κωδικοποίηση χρώματος είναι παρόμοια με αυτή που περιγράφεται στο Σχήμα 4. (Β) Έκφραση pGCN2 (T899), GCN2, peIF2α (Ser52) και eIF2α σε όγκους από όχημα ή ixazomib θεραπεία. Τα δείγματα όχημα συλλέχθηκαν σε 4 ώρες μετά τη χορήγηση, και τα δείγματα αντιμετωπίζονται ixazomib συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία (όπως φαίνεται στην εικόνα) μετά την επεξεργασία φαρμάκου. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Σημείωση: για pGCN2 /GCN2 κηλίδα western, μόνο 2 δείγματα αξιολογήθηκαν σε 24ωρη χρονική στιγμή και 3 δείγματα αξιολογήθηκαν για όλους τους άλλους δείκτες και τα χρονικά σημεία σε αυτό το σχήμα (14 δείγματα που χρησιμοποιούνται στο GCN2 /κηλίδες pGCN2 και 15 δείγματα στις άλλες κηλίδες).

η

εξάντληση αμινοξέων προκαλεί μια περίσσεια ελεύθερου tRNA που μπορεί να δεσμευτεί σε GCN2 και να οδηγήσει σε αυτοφωσφορυλίωση και την ενεργοποίηση [24] της. Όταν ενεργοποιηθεί, GCN2 φωσφορυλιώνει eIF2αat Σερίνη 52 η οποία αναστέλλει eIF2α και με αυτόν τον τρόπο καταστέλλει πρωτεΐνη μετάφραση [25,26]. Για να παρακολουθήσετε τις συνέπειες της καταστροφής του αμινοξέος, αξιολογήσαμε την GCN2 /άξονα φωσφο-eIF2α με κηλίδα western σε SW48 WT και SW48-G13D όγκους ξενομοσχεύματος μετά από ixazomib θεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, ixazomib αγωγή έχει ως αποτέλεσμα φωσφορυλίωση του GCN2 στο T899 τόσο KRAS WT και μεταλλαγμένα όγκων σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο, με ελαφρώς υψηλότερα επίπεδα pGCN2 ανιχνεύονται μετά τη θεραπεία σε SW48 WT όγκους σε σύγκριση με τους KRAS μεταλλαγμένο ομολόγους. Τα επίπεδα της ολικής GCN2 ήταν παρόμοια και στις δύο SW48 και όγκους SW48-G13D. Συνεπής με τη φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση των GCN2, παρατηρήσαμε μια αύξηση στην φωσφο-eIF2α (Ser 52) στο ίδιο χρονικό πλαίσιο και στις δύο όγκους SW48 και SW48-G13D, αν και το επίπεδο αναφοράς της ρ-eIF2α ήταν υψηλότερη σε όγκους SW48-G13D σε σύγκριση με τους όγκους SW48. Επιπλέον, το συνολικό επίπεδο των eIF2α ήταν ελαφρώς υψηλότερη σε όγκους SW48-G13D σε σύγκριση με όγκους SW48, αλλά δεν άλλαξε σε οποιαδήποτε όγκου μετά ixazomib θεραπεία. Μαζί, η μεταβολική προφίλ και τα δεδομένα υποδεικνύουν κηλίδας western ixazomib αγωγή έχει ως αποτέλεσμα μία οξεία πτώση στην ελεύθερη πισίνες αμινοξύ, το οποίο ενεργοποιεί GCN2 και επομένως έχει ως αποτέλεσμα την φωσφορυλίωση και απενεργοποίηση του eIF2α, η οποία θα μπορούσε να οδηγήσει σε μειωμένη παγκόσμια μετάφραση πρωτεΐνης. Επειδή αυτές οι αλλαγές συμβαίνουν σε τόσο KRAS WT και των μεταλλαγμένων όγκων, δεν εξηγούν τη διαφορά στο ixazomib ευαισθησίας μεταξύ KRAS WT και των μεταλλαγμένων όγκων.

Αύξηση της οξείδωσης λιπαρών οξέων βήτα σε όγκους KRAS WT παρακάτω ixazomib θεραπεία

Αξιοποίηση των λιπαρών οξέων ως μια εναλλακτική πηγή ενέργειας λαμβάνει χώρα όταν οι άλλες καταβολικές οδούς όπως ο μεταβολισμός αμινοξέων παραβιαστεί [27]. Τα ελεύθερα λιπαρά οξέα μπορούν να υποστούν β-οξείδωση για να παράγει ακετυλ-ΟοΑ και κετόνη φορείς, όπως περιγράφεται στο Σχ 6Α. Σε όγκους SW48 WT, ανιχνεύσαμε αυξημένα επίπεδα ελεύθερων λιπαρών οξέων, ακετυλο-CoA, και το σώμα κετόνης 3-υδροξυβουτυρικό (3-BHBA) σε 1 ώρα μετά τη θεραπεία ixazomib (Σχήμα 6Β και 6C). Το επίπεδο αυτών των μεταβολιτών επέστρεψε κοντά στα αρχικά επίπεδα από 8 ώρες της θεραπείας από τα ναρκωτικά. Η αύξηση αυτών των βιοχημικών σε όγκους KRAS WT είναι αντανακλαστική του μια γρήγορη μετάβαση σε β-οξείδωση των λιπαρών οξέων μετά από ixazomib θεραπεία. Σε αντίθεση, KRAS όγκους μεταλλαγμένου δεν έδειξε σημάδια αυξημένης β-οξείδωσης μετά τη θεραπεία PI, με τα περισσότερα ελεύθερα λιπαρά οξέα, ακετυλ-ΟοΑ και 3-ΗΒΑ επίπεδα παραμένουν αμετάβλητες μετά την επεξεργασία ixazomib.

μεταβολίτες που εμπλέκονται στην λιπαρό οξύ β μονοπάτι οξείδωσης. (Α) Πίνακας που συνοψίζει τα ελεύθερα λιπαρά οξέα σε δείγματα όγκων. Οι αριθμοί δείχνουν την αλλαγή φορές σε όγκους που πήραν φάρμακο επί όγκων αντιμετωπίζεται οχήματος σε 1 και 8 ώρες χρονικά σημεία. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει μέσο όρο των όγκων από πέντε διαφορετικά ζώα. Ο πίνακας που συνοψίζει τα επίπεδα της ακετυλο Co-A και 3 υδροξυ βουτυρικού σε 1 ώρα μετά την ixazomib θεραπεία. Οι αριθμοί υποδεικνύουν φορές αλλαγή στους όγκους αγωγή ixazomib πάνω όγκους αγωγή με φορέα, η = 5 ανά σημείο δεδομένων. Αλλαγές στο επίπεδο της πρωτεΐνης CPT-1 μετά ixazomib θεραπεία σε SW48 και SW48-G13D όγκους.