Abstract

YM155, η οποία αναστέλλει την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη survivin, είναι γνωστό ότι ασκούν τη δράση κατά των όγκων σε διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του προστάτη και καρκίνο του πνεύμονα. Ωστόσο, υπάρχουν μερικές αναφορές που περιγράφουν το ανασταλτικό αποτέλεσμα επί YM155 ανθρώπινους καρκίνους του παγκρέατος που εκφράζουν υψηλά survivin. Εδώ, εξετάσαμε τις επιδράσεις της YM155 σε μια ποικιλία καρκινικών κυτταρικών σειρών, περιλαμβανομένων των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος. Βρήκαμε ότι YM155 εξασκεί ένα αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, επάγουν κυτταρικό θάνατο μέσω καταστολής του ΧΙΑΡ (αναστολέας φυλοσύνδετη απόπτωσης), καθώς και survivin χωρίς να επηρεάζει τις αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-xL ή Mcl-1. YM155 ανέστειλε επίσης την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

, μειώνοντας το μέγεθος του παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικής γραμμής MIAPaCa-2 ξενομοσχεύματα κατά 77,1% την ημέρα 31. τεχνική Western blot περαιτέρω έδειξαν ότι YM155 μειωτικά φωσφοϊνοσίτη 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) έκφραση και μείωσε τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένη (ενεργοποιημένη) εξωκυττάριο κινάσης σήματος ρυθμίζεται (ΕΚΚ) και STAT3 (μετατροπέας σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3) σε κύτταρα PANC-1. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε επίσης ότι YM155 μειωτικά τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές και προκάλεσε την φωσφορυλίωση EGFR και ουβικιτινίωση του EGFR σε κύτταρα PANC-1. YM155 επίσης συγκρατημένα προώθησε την ουμπικουιτίνωση της survivin και ΧΙΑΡ. Ως εκ τούτου, YM155 δρα μέσω της διαφοροποίησης του EGFR και την έκφραση survivin να μειώσει στη συνέχεια την επιβίωση. Προτείνουμε ότι YM155 έχει δυναμικό ως θεραπευτικός παράγοντας στην θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Na Y-S, Yang S-J, Kim S-M, Jung Κ-Α, Σελήνης J-Η, Shin J-S, et al. (2012) YM155 Προκαλεί καταστολή EGFR σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 7 (6): e38625. doi: 10.1371 /journal.pone.0038625

Επιμέλεια: Γκύντερ Schneider, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 10 Νοεμβρίου 2011? Αποδεκτές: 12 Μάη 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιουνίου του 2012

Copyright: © 2012 Na et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τον ενισχυτή 21 R & Κορέα Υγείας? D Έργου, Υπουργείο Υγείας, Πρόνοιας και Οικογενειακών Υποθέσεων, Δημοκρατία της Κορέας (A062254). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια ιδιαίτερα επιθετική κακοήθη νόσο. Παρά τις θεραπευτικές εξελίξεις, η πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος είναι εξαιρετικά φτωχή. Η κακή πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος οφείλεται στην τάση αυτού του καρκίνου να υπάρξει μικρή ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία. Αν και το ανάλογο νουκλεοσιδίου γεμσιταμπίνη είναι σήμερα το πρότυπο χημειοθεραπευτικό παράγοντα που χρησιμοποιείται για τον καρκίνο του παγκρέατος, το όφελος επιβίωσης της είναι ικανοποιητική και νέων θεραπευτικών παραγόντων χρειάζονται απεγνωσμένα [1].

Η υπερέκφραση της survivin, το μικρότερο μέλος (16,5 kDa) του αναστολέα της απόπτωσης (ΙΑΡ) οικογένεια πρωτεϊνών, έχει αναφερθεί ότι είναι σημαντική στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του παγκρέατος [2], [3]. Survivin περιέχει ένα μοναδικό βακουλοϊού ΙΑΡ επανάληψης (BIR) και αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες χρωμοσωμικές επιβατών, NES (νεστίνη), aurora κινάση Β, SMAC /DIABLO, CDK1 (εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση 1), ΡΚΑ (πρωτεϊνική κινάση Α), ΧΙΑΡ, και θερμότητα πρωτεΐνη σοκ (HSP) -90 [2], [3]. Survivin εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, τα μιτοχόνδρια και οι πυρήνες, και εκφράζεται πανταχού εις εμβρυϊκά στάδια, αλλά δεν ανιχνεύεται στο φυσιολογικό τερματικά διαχωριζόμενες ιστούς ενηλίκων [2], [3]. Παθολογικά, survivin υπερεκφράζεται σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος [2], [3]. Όπως survivin εκφράζεται έντονα σε παγκρεατικά ιστούς όγκων, αλλά όχι σε φυσιολογικά παγκρεατικούς ιστούς, είναι ένας ελκυστικός στόχος για την ανάπτυξη φαρμάκων κατά του καρκίνου του παγκρέατος. [4]

YM155, ένα μικρό μόριο αναστολέα της survivin που αναπτύχθηκε από Astellas Pharma , Inc., που επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές, καταστέλλει μετενεργοποίηση των survivin μέσω άμεσης συνδέσεως με υποκινητή του [5]. YM155 έχει εξεταστεί σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των μελανωμάτων και λεμφωμάτων, καθώς επίσης και του προστάτη, του πνεύμονα, και καρκίνων του μαστού [6]. Ξενομοσχεύματος μοντέλα έχουν επίσης δείξει την αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της YM155 σε συνδυασμό με ενώσεις πλατίνας [7] ή ντοσεταξέλη [8], καθώς και σε μονοθεραπεία [9].

Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), το οποίο υπερεκφράζεται σε διάφορους καρκίνους και έχει διερευνηθεί σε σχέση με την πρόγνωση του καρκίνου [10], [11], [12], είναι γνωστό ότι είναι ένας σημαντικός παράγοντας στην εξέλιξη του καρκίνου του παγκρέατος [13]. Η πρόσδεση ενός συνδέτη με EGFR προάγει διαμορφωτικές μεταβολές που επάγουν διμερισμό του υποδοχέα, με αποτέλεσμα την αυτοφωσφορυλίωση τυροσίνης και ενεργοποίηση του υποδοχέα. Τα ενεργοποιημένα σήματα EGFR μέσω φωσφορυλιωμένα υπολείμματα τυροσίνης για την τόνωση πολλαπλές οδούς, συμπεριλαμβανομένων ενεργοποιημένων από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ), φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) /Akt, μετατροπείς σήματος και ενεργοποιητές μεταγραφής (STAT), φωσφολιπάση C, και Src /εστιακό κινάσης προσκόλλησης (SRC /ΡΑΚ) μονοπάτια. Η ενεργοποίηση της σηματοδότησης EGFR διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην προώθηση της διάδοσης και της επιβίωσης? Αντίθετα, η διακοπή του EGFR προάγει την απόπτωση. EGFR-στοχευμένες θεραπευτικά, όπως erlotinib, έχουν αναπτυχθεί για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος.

YM155 έχει δείξει αντικαρκινική δραστικότητα σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές [14]. Επιπλέον, σε κύτταρα καρκίνου του μαστού, η έκφραση survivin έχει αναφερθεί ότι ρυθμίζεται από EGFR μέσω της οδού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, ένα άλλο σημαντικό μονοπάτι σε καρκίνους του παγκρέατος [15]. Ως εκ τούτου, φαίνεται δυνατό να έχει ως αποτέλεσμα την YM155 επί EGFR και κατάντη σηματοδότησης του σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα επειδή survivin ρυθμίζεται με EGFR.

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε τις αντικαρκινικές δράσεις της YM155 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παγκρέατος και ξενομοσχεύματα. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση της YM155 επί EGFR, ΡΙ3Κ, ERK, και έκφραση STAT3 να προσδιορίσει αν YM155 επηρεάζει τις οδούς EGFR /ΡΙ3Κ /STAT3. Ερευνήσαμε επίσης την επίδραση του YM155 στην έκφραση των άλλων μελών της οικογένειας ΙΑΡ σχετίζεται με αντι-αποπτωτικών και προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές.

Αποτελέσματα

Ο καρκίνος του παγκρέατος κύτταρα είναι ευαίσθητα σε YM155

για τη διερεύνηση της αντι-πολλαπλασιαστική ικανότητα των YM155 σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές, μετρήσαμε IC

50 τιμές για YM155 σε παγκρεατικά, γαστρικό, και του παχέος εντέρου κύτταρα (Πίνακας 1 και Πίνακας S1) . Τα IC

50 τιμές για YM155 σε παγκρεατικά, γαστρικό, και του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές ήταν 3,7 έως 30,3, 1,4 έως 140,8, και 8,7 έως 370,0 ηΜ, αντίστοιχα. Έτσι, YM155 είναι αποτελεσματική στη παγκρέατος, του στομάχου, του παχέος και καρκινικά κύτταρα.

Η

Για να προσδιοριστεί η επίδραση του αναστολέα YM155 survivin για την έκφραση της survivin και ΧΙΑΡ, ένα άλλο μέλος της οικογένειας ΙΑΡ, πραγματοποιήσαμε Western κηλίδωση σε παγκρεατικά και κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (Εικ. 1Α και η Εικ. S1). Σε υψηλές συγκεντρώσεις, YM155 μείωσε σημαντικά την έκφραση του survivin σε PANC-1, MIAPaCa-2, BxPC-3, κυτταρικές σειρές KATOIII, και ΜΚΝ45. YM155 ήταν κυρίως πιο ισχυρό σε κύτταρα PANC-1, όπου μειωμένη έκφραση survivin σε χαμηλή συγκέντρωση (10 ηΜ). YM155 επίσης ανέστειλε την έκφραση του ΧΙΑΡ σε παγκρεατικά και γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, με εξαίρεση ΜΚΝ45 κύτταρα? σε αυτά τα κύτταρα, YM155 είχε καμία ορατή επίδραση στα επίπεδα ΧΙΑΡ. Σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις [9], [16], YM155 έδειξε μικρή επίδραση στην έκφραση των ΙΑΡ, cIAP1 και cIAP2 σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (Σχ. S2).

Α, εξαρτάται από τη συγκέντρωση αποτελέσματα μιας θεραπείας 24 ωρών με YM155 στην έκφραση της survivin και ΧΙΑΡ σε PANC-1, MIAPaCa-2 και κύτταρα BxPC-3 προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western. Β, η επίδραση της YM155 στην έκφραση του ΧΙΑΡ συγκρίθηκε με εκείνη του survivin knockdown με κηλίδωση Western. κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με YM155 για 24 ώρες ή επιμολυσμένα με 40 ηΜ siRNA (siSurvivin, siXIAP, και κωδικοποιημένα siRNA) για 48 ώρες. *, Μη ειδική. C, εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση επιδράσεις της YM155 στην έκφραση των αντι-αποπτωτικών (Bcl-xL και Mcl-1) και προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών (Bid και κακή) εξετάστηκαν σε PANC-1, MIAPaCa-2 και κύτταρα BxPC-3 .

η

για να προσδιορίσετε αν YM155 που προκαλείται προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ΧΙΑΡ οφείλεται σε μειωμένη έκφραση της survivin, εμείς γκρέμισε survivin σε PANC-1 με siRNA (siSurvivin) και αξιολογείται η έκφραση ΧΙΑΡ με κηλίδωση Western (Εικ . 1Β). Το επίπεδο της πρωτεΐνης ΧΙΑΡ μειώθηκε σε μεγαλύτερο βαθμό μετά από έκθεση σε 10 ηΜ YM155 ό, τι σε κύτταρα επιμολυσμένα με siSurvivin, υποδηλώνοντας ότι η YM155 προκαλούμενη μείωση στα επίπεδα ΧΙΑΡ δεν συμβαίνει μέσω μειορρύθμιση της survivin. Σουρβιβίνη έχει αναφερθεί ότι έχουν θέσεις δέσμευσης για ΧΙΑΡ [2]. Για να εξεταστεί η επίδραση της YM155 στις αλληλεπιδράσεις survivin-ΧΙΑΡ, ανοσοκαταβυθίσαμε survivin και έπειτα ανιχνεύθηκαν ανοσοϊζήματα με κηλίδωση Western με ένα αντίσωμα κατά του ΧΙΑΡ (Εικ. S3). Θεραπεία της PANC-1 κύτταρα με 100 ηΜ YM155 για 6 ώρες δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα της survivin ή ΧΙΑΡ, αλλά είχε ελαφρώς αναστέλλουν την αλληλεπίδραση του survivin με ΧΙΑΡ, γεγονός που υποδηλώνει ότι YM155 επηρεάζει την συναρμολόγηση του συμπλόκου survivin-ΧΙΑΡ σε κάποιο βαθμό .

Ερευνήσαμε επίσης τα αποτελέσματα της YM155 στην έκφραση των αντι-αποπτωτικών και προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (εικ. 1 C). Δεν υπήρξε καμία αλλαγή στην Bcl-xL ή επίπεδα Mcl-1 μετά από θεραπεία με YM155. YM155 προκάλεσε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση μείωση στην Bid, ρ-Bad, και Bad επίπεδα στα περισσότερα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές? Η εξαίρεση ήταν προσφορά, η οποία δεν επηρεάστηκε σε BxPC-3 κύτταρα.

YM155 προκαλεί ρύθμιση προς τα κάτω της PI3K, π-ΕΚΚ, και π-STAT3

Επειδή YM155 κατασταλεί η έκφραση ΧΙΑΡ, εξετάσαμε αν YM155 επηρέασε την έκφραση των άλλων συστατικών σηματοδότησης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Θεραπεία της HER2-υπερεκφράζουν κύτταρα MCF7 με τον αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 ή ERK1 /2 U0126 αναστολέας έχει αναφερθεί να ρυθμίζουν προς τα κάτω της survivin [17]. Ένας αναστολέας STAT3 έχει επίσης αναφερθεί για την καταστολή της έκφρασης της survivin [18]. Με βάση τις εκθέσεις αυτές, ερευνήσαμε την επίδραση του YM155 επί ΡΙ3Κ, ERK, και STAT3 σε PANC-1 κύτταρα (Σχ. 2), το οποίο είχαμε βρει ότι είναι η πιο YM155 ευαίσθητη των παγκρεατικών κυτταρικών σειρών που δοκιμάστηκαν. Η κατεργασία αυτών των κυττάρων με YM155 σε συγκεντρώσεις 10 ηΜ και παραπάνω μειώθηκε ΡΙ3Κ (Εικ. 2Α), ρ-ΕΚΚ (Εικ. 2Β), και ρ-STAT3 (Σχ. 2C) επίπεδα σε σύγκριση με εκείνα siSurvivin-επεξεργασμένα κύτταρα. Ο αναστολέας ΡΙ3Κ LY294002 και ΜΕΚ1 /2 αναστολέα AZD6244 χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες για την ανάλυση των επιπέδων της ΡΙ3Κ, φωσφορυλιωμένης ERK και survivin. Εξετάσαμε επίσης τα αποτελέσματα της YM155 στην έκφραση της ΡΙ3Κ μελών της οικογένειας ρ110α, ρ110β, κατηγορίας III, ρ85, και ρ-ρ85 σε PANC-1, MIAPaCa-2 και κύτταρα BxPC-3, και βρήκαν ότι όλα μειώθηκαν κατά 100 ηΜ YM155 σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές (Εικ. S4). Επιπλέον, η φωσφορυλίωση της Akt, η οποία είναι μια καθοδικός τελεστής του ΡΙ3Κ, επίσης μειώθηκε κατά YM155 (100 ηΜ) σε αυτές τις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Akt είναι γνωστό ότι προάγει την κυτταρική επιβίωση μέσω της φωσφορυλίωσης του Bad [19], [20]. Ως εκ τούτου, η μείωση του φωσφορυλιωμένη μορφή της Akt προκαλεί μια μείωση στην ρ-Bad, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 C, με αποτέλεσμα το θάνατο του κυττάρου.

Α, Επίπεδα ΡΙ3Κ και survivin αναλύθηκαν με κηλίδωση Western μετά την αγωγή με YM155 ή 30 μΜ LY294002 (έλεγχος) επί 24 ώρες, και 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με 40 ηΜ siRNA. Β, Επίπεδα φωσφορυλιωμένου ERK και έκφραση survivin προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western μετά την θεραπεία για 24 ώρες με YM155 ή 500 ng του AZD6244, και 48 ώρες μετά την επιμόλυνση 40 ηΜ siRNA. C, τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου STAT3 και έκφραση survivin αναλύθηκαν με κηλίδωση Western μετά από μια θεραπεία 24 ώρες με YM155 και 48 ώρες μετά την επιμόλυνση 40 ηΜ siRNA.

Η

YM155 ρυθμίζει αρνητικά έκφραση EGFR

Επειδή YM155 ρυθμίζει προς τα κάτω ΡΙ3Κ, ρ-ΕΚΚ, και ρ-STAT3, τα οποία είναι κατάντη μεσολαβητές της EGFR σηματοδότησης [21], [22], [23], αναλύσαμε εάν YM155 επηρεάζει την έκφραση του EGFR (Εικ. 3). Όπως ήταν αναμενόμενο, η θεραπεία με EGF αυξημένη φωσφορυλίωση του EGFR. Είναι ενδιαφέρον, ωστόσο, τα επίπεδα του ρ-EGFR καθώς και της συνολικής EGFR σε κύτταρα PANC-1 μειώθηκαν σημαντικά μετά από έκθεση σε YM155 παρουσία EGF (Σχ. 3Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι YM155 μειωμένα επίπεδα ρ-EGFR μέσω μιας μείωσης στα επίπεδα EGFR. Το cetuximab, χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος, μειώθηκε επίσης ρ-EGFR με την παρουσία του EGF. Μια περαιτέρω ανάλυση των αποτελεσμάτων της YM155 επί της έκφρασης EGFR σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές έδειξαν ότι YM155 προκάλεσε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση μείωση στα επίπεδα EGFR σε παγκρεατικά (PANC-1, MIAPaCa-2 και BxPC-3), του παχέος (HCT116), προστάτη (PC3) και του πνεύμονα (Η460) κυτταρικές σειρές καρκίνου? Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε KATOIII γαστρικό καρκίνο κύτταρα αλλά όχι σε ΜΚΝ45 γαστρικά καρκινικά κύτταρα (Σχ. 3Β και Σχ. S5).

Α, κύτταρα PANC-1 διεγέρθηκαν με 100 ng /ml EGF επί 10 λεπτά πριν επώαση με ή χωρίς YM155 για 6 ώρες. Cetuximab (CTX? 100 ng /ml επί 1 ώρα) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Επίπεδα φωσφορυλιωμένου (Y1068) EGFR και EGFR σύνολο αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Β, YM155 μείωσε την έκφραση του EGFR σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο με τον PANC-1, MIAPaCa-2 (περικοπεί κηλίδες? Οι κηλίδες πλήρους μήκους που παρουσιάζονται στο Σχήμα S5A.), Και τα κύτταρα BxPC-3. Η αναλογία της έκφρασης EGFR:actin σύγκριση με τον έλεγχο παρουσιάζεται για κάθε λωρίδα (χρησιμοποιώντας λογισμικό v2.3 Multi-Gauge). C, Survivin και έκφραση EGFR ανιχνεύτηκαν σε υποκυτταρικά κλάσματα των κυττάρων PANC-1 με κηλίδωση Western. Cytoplasmic (κυτταρο) και πυρηνική (ηυ) κλάσματα απομονώθηκαν μετά από έκθεση σε YM155 για 24 ώρες. Αλδολάση (κυτταροπλασματική) και Η3 (πυρηνική) χρησίμευσε ως δείκτες για την καθαρότητα του υποκυτταρικά κλάσματα. Σύνολο προϊόντων λύσης (σύνολο) αναλύθηκαν ταυτόχρονα. D, YM155 (10 ηΜ) προκάλεσε τη συσσώρευση πυρηνικών EGFR. κύτταρα PANC-1 υπέστησαν χρώση με αντι-ΕΟΡΚ, αντι-Alexa Fluor 488, και ϋΑΡΙ μετά τη θεραπεία YM155. Ράβδοι κλίμακας:. 10 μm

Η

εξέτασαν τις επιδράσεις της YM155 για survivin και τον εντοπισμό του EGFR με την εξέταση υποκυτταρικών επίπεδα κλάσμα (Σχ. 3C)? YM155 μειωμένα επίπεδα survivin σε τόσο κυτταροπλασματική και πυρηνική κλάσματα των κυττάρων PANC-1. επίπεδα EGFR μειώθηκαν στην κυτταροπλασματική κλάσμα, αλλά EGFR συσσωρεύεται στο πυρηνικό κλάσμα. Η συσσώρευση των πυρηνικών EGFR που προκαλείται από 10 ηΜ YM155 επιβεβαιώθηκε με ομοεστιακό μικροσκόπιο (Εικ. 3D). Επειδή YM155 (10 ηΜ) δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα EGFR συνολικά κυτταρολύματα, αυτή η κατάσταση μπορεί να αντανακλά πυρηνικής μετατόπισης του EGFR. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι YM155 μειώνει τα επίπεδα της κυτταροπλασματικής και πυρηνικής survivin, και υποδηλώνουν ότι YM155 προωθεί EGFR πυρηνικής μετατόπισης.

YM155, η οποία αναστέλλει δραστικότητα προαγωγού survivin, επάγει αποικοδόμηση του EGFR, ΧΙΑΡ, και survivin

για να προσδιορίσετε αν EGFR είναι ο στόχος της δράσης YM155, εξετάσαμε την επίδραση της YM155 στη βιωσιμότητα των κυττάρων PANC-1 μετά από siRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν του EGFR (Εικ. S6a). Κηλίδωση Western αποκάλυψε ότι siSurvivin και siEGFR χτυπηθεί αποτελεσματικά κάτω survivin και EGFR, αντίστοιχα, όπως φαίνεται με κηλίδωση Western, και τα ποσοστά των βιώσιμων κυττάρων ήταν περίπου 66% και 75%, αντίστοιχα. Η προσθήκη YM155 μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα σε survivin- ή EGFR-knockdown κυττάρων σε ένα βαθμό παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε σε κύτταρα μάρτυρες επιμολυσμένα με περιπλεγμένο siRNA. YM155 δρα ως αναστολέας της μεταγραφής του survivin, μειώνοντας δραστηριότητα υποκινητή survivin σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο σε κύτταρα PANC-1 (Εικ. S6B). Λόγω αυτής της αναστολής της μεταγραφής survivin, δράση YM155 μπορεί να επηρεάζεται ελάχιστα από knockdown του survivin. Κατ ‘επέκταση, οι παρόμοιες μειώσεις στην βιωσιμότητα των κυττάρων από YM155 παρατηρείται σε EGFR-νοκ ντάουν και ελέγχου (ομελέτα siRNA) κύτταρα μπορεί να οφείλεται σε μείωση του επιπέδου survivin από YM155.

Για να προσδιορίσετε αν το μειωμένο επίπεδο του EGFR μετά θεραπεία YM155 οφειλόταν σε μειωμένη παραγωγή ή αυξημένη αποικοδόμηση, αναλύσαμε τα επίπεδα μεταγραφής χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR (Εικ. 4Α) και αξιολόγησε την επίδραση της YM155 επί αποικοδόμησης πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας τη κυκλοεξαμίδιο αναστολέα σύνθεσης πρωτεΐνης (Εικ. 4Β) σε PANC- 1 κύτταρα. Όπως αναμενόταν με βάση την ανασταλτική δράση της επί του υποκινητή survivin, YM155 μειωμένα επίπεδα μεταγραφής survivin. Ωστόσο, τα επίπεδα μεταγραφής αυξήθηκαν ΧΙΑΡ, ένα αποτέλεσμα που μπορεί να είναι μια αντισταθμιστική απόκριση στη μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης ΧΙΑΡ. Δηλαδή, για να προστατευθούν από την απόπτωση, τα κύτταρα θα μπορούσαν να ρυθμίζει αυξητικά ΧΙΑΡ, μία άλλη πρωτεΐνη ΙΑΡ, όταν survivin έκφραση μειώνεται, αλλά η αποικοδόμηση ΧΙΑΡ πρωτεΐνης με YM155 μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη μεταγραφή ΧΙΑΡ ως αντισταθμιστικό μηχανισμό. επίπεδα μεταγραφής EGFR αυξήθηκαν κατά 10 nM YM155 αλλά μειώθηκαν από 100 nM YM155. Από την ανάλυση των μεταβολών στα επίπεδα πρωτεΐνης συναρτήσει του χρόνου με την απουσία της πρωτεϊνοσύνθεσης (δηλαδή, με την παρουσία κυκλοεξιμίδιο) έδειξε ότι survivin, EGFR, και ΧΙΑΡ αποικοδομήθηκαν ταχύτερα σε PANC-1 κύτταρα κατεργασμένα με YM155 από τον έλεγχο (cyclohexamide- μόνο) κύτταρα. Οι επιδράσεις των 100 ηΜ YM155 στην έκφραση της survivin, EGFR, και ΧΙΑΡ στα κύτταρα PANC-1 συναρτήσει του χρόνου ερευνήθηκαν (Εικ. S7). Η θεραπεία 8 ώρες μείωσε σημαντικά τα επίπεδα survivin. Ως εκ τούτου, survivin θα μπορούσε να αποτελέσει έναυσμα για την μετέπειτα απόπτωση. Συλλογικά, αυτές οι αναλύσεις δείχνουν ότι YM155 μείωσε την παραγωγή της survivin και EGFR (υψηλή δόση, 100 ηΜ) και ενίσχυσε την υποβάθμιση των survivin, ΧΙΑΡ, και EGFR.

Α, μετά από επεξεργασία των PANC-1 κύτταρα με YM155 για 24 ώρες, survivin, τα επίπεδα EGFR, και ΧΙΑΡ mRNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR. Β, Survivin, EGFR, και ΧΙΑΡ επίπεδα σε κύτταρα PANC-1 μετά από αγωγή με 50 μg /ml κυκλοεξιμιδίου (ΟΗΧ) απουσία ή παρουσία 100 ηΜ YM155 για τις υποδεικνυόμενες περιόδους εξετάστηκαν με κηλίδωση Western. Η αναλογία του survivin, EGFR, ή έκφραση XIAP:actin σύγκριση με τον έλεγχο εμφανίζεται για κάθε λωρίδα. *, Μη ειδική.

Η

YM155 επάγει φωσφορυλίωση του EGFR, και ουμπικουιτίνωση του EGFR

Για να προσδιορίσετε αν YM155 επιπτώσεις στην EGFR, ΧΙΑΡ, και η υποβάθμιση survivin ήταν proteasome-, lysosome-, ή κασπάσης εξαρτώμενης, εκτελέσαμε κηλίδωση Western σε PANC-1 κύτταρα μετά τη θεραπεία με το MG132 αναστολέα πρωτεασώματος, η χλωροκίνη αναστολέα λυσόσωμα, ή τον αναστολέα κασπάσης Ζ-VAD-fmk (Εικ. 5Α). Η προσθήκη χλωροκίνη να YM155-επεξεργασμένα κύτταρα PANC-1 αμβλύνθηκε τη μείωση της EGFR, ΧΙΑΡ, και τα επίπεδα survivin, ενώ MG132 και Ζ-VAD-fmk ήταν αναποτελεσματική, γεγονός που υποδηλώνει ότι το βραχύτερο χρόνο ημιζωής αυτών των πρωτεϊνών υπό την παρουσία YM155 ήταν σχετίζονται με την αυξημένη λυσοσωμική αποικοδόμηση. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε MIAPaCa-2 κύτταρα (Σχ. S8). Στην συνέχεια προσδιορίσαμε αν YM155 επαγόμενη, λυσόσωμα εξαρτώμενη αποδόμηση συνδέθηκε με ουβικουϊτινίωση του EGFR, ΧΙΑΡ, και survivin (Εικ. 5Β). Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης αποκάλυψε μια σαφή αύξηση των ουβικουιτινωμένης EGFR μετά από αγωγή με YM155 (100 ηΜ) για 6 ώρες, και μία μέτρια αύξηση στη σουρβιβίνη και ΧΙΑΡ ουβικιτινίωση. Ως εκ τούτου, YM155 επάγει ουβικουϊτινίωση του EGFR, survivin, και ΧΙΑΡ.

Α, YM155 επαγόμενη λυσοσωμική αποικοδόμηση του EGFR, ΧΙΑΡ, και survivin σε κύτταρα PANC-1. κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 100 ηΜ YM155 (ΥΜ), 10 μΜ MG-132 (MG), 50 μΜ χλωροκίνη (CQ), ή 30 μΜ Ζ-VAD-fmk (Ζ-VAD), χωρίς ή με YM155 για 24 ώρες . Οι αναλογίες έκφραση του EGFR, ΧΙΑΡ, ή survivin να ακτίνης σε σύγκριση με τον έλεγχο παρουσιάζονται για κάθε λωρίδα. ctrl, τον έλεγχο? Μ + Υ, MG-132 + YM155? C + Y, χλωροκίνη + YM155? Ζ + Y, Z-VAD-fmk + YM155. Β, PANC-1 κύτταρα κατεργασμένα με 100 ηΜ YM155 για 6 ώρες ανοσοκαταβυθίστηκαν (ΙΡ) με αντισώματα έναντι EGFR, survivin ή ΧΙΑΡ, και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για ουβικιτίνη. C, Η χρονική πορεία της φωσφορυλίωσης του EGFR σε Y1045 σε PANC-1 κύτταρα μετά τη θεραπεία με YM155 (100 ηΜ) δείχνεται.

Η

Ο Y1045-φωσφορυλιωμένη μορφή του EGFR είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρά με το Ε3 ουβικιτίνης-πρωτεΐνης λιγάση c-Cbl, η οποία στοχεύει EGFR στο λυσόσωμα για επακόλουθη αποδόμηση [24]. Επειδή YM155 επαγόμενη ουβικιτινίωση EGFR, εξετάσαμε τη φωσφορυλίωση του EGFR, ως συνάρτηση του χρόνου μετά τη θεραπεία με YM155 με διερεύνηση για pY1045-EGFR με κηλίδωση Western (Εικ. 5C). Αυτά τα πειράματα έδειξαν μία σαφή μείωση στην pY1045-EGFR μετά από έκθεση σε YM155 για 105 λεπτά ή περισσότερο. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι YM155 ρυθμίζει Y1045-φωσφορυλίωση του EGFR.

YM155 παρουσίασαν αντινεοπλασματική δράση κατά του καρκίνου του παγκρέατος

in vivo

Η

Για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα αντι-όγκου των YM155 για τον καρκίνο του παγκρέατος

in vivo

, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου MIAPaCa-2 παγκρεατικού κυτταρική γραμμή, η μέτρηση του όγκου του όγκου και το σωματικό βάρος (σχ. 6Α και 6Β). Σε MIAPaCa-2 ξενομοσχεύματα, ανάπτυξη όγκου αναστάλθηκε κατά 77,1% την ημέρα 31 μετά την αγωγή με συνεχή έγχυση YM155 (ρ & lt? 0.001, YM155 έναντι του οχήματος). Το σωματικό βάρος δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ ανεπεξέργαστων και YM155 αγωγή ομάδες. ομάδα YM155 αγωγή κατά την ημέρα 31 είχε μικρότερα βάρη των όγκων από τα ζώα υπό αγωγή με όχημα (Εικ. 6C). YM155 προκάλεσε την μειορύθμιση του EGFR, survivin, και εκφράσεις ΧΙΑΡ σε όγκους ξενομοσχεύματος (Σχ. 6D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι YM155 ασκεί μία σημαντική δράση κατά του όγκου έναντι του καρκίνου του παγκρέατος

in vivo

.

Επιδράσεις της YM155 στην αύξηση του όγκου (Α) και το σωματικό βάρος (Β)

in vivo

αξιολογήθηκαν σε MIAPaCa-2 ξενομοσχεύματα (όχημα, η = 6? YM155, n = 8). Ο όγκος του όγκου προσδιορίστηκε στους υποδεικνυόμενους χρόνους μετά την έναρξη της θεραπείας. YM155 χορηγήθηκε σε δόση των 50 mg /kg. Η

in vivo

πειραματικό πρόγραμμα των YM155 αναγράφεται στο κάτω μέρος της κάθε γράφημα. Ημέρα 0 δείχνει την ώρα κατά την οποία υποδόριων όγκων έφθασε μεγέθους 100 mm

3 και διαχείριση των YM155 ξεκίνησε. Οι στατιστικές αναλύσεις των αποτελεσμάτων της YM155 επί του μεγέθους όγκου εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας Mann-Whitney τεστ (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001, YM155 έναντι του οχήματος). C, οι μέσες μεγέθη όγκων απεικονίζεται για κάθε ομάδα την ημέρα 31. D, ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις σε όγκους ξενομοσχεύματος την ημέρα 31 μετά την επεξεργασία YM155 διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι EGFR, survivin, και ΧΙΑΡ και χρωματίστηκαν με Η &?. Ε

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τις επιπτώσεις της YM155 αναστολέα survivin σε survivin, ΧΙΑΡ, και της έκφρασης EGFR σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι YM155 επηρεάζει την έκφραση των δύο survivin και EGFR και κατά συνέπεια μειώνει την επιβίωση. Αν και προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι YM155 ειδικά μπλοκ survivin έκφρασης σε κύτταρα καρκίνου προστάτη και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων (NSCLC), χωρίς να επηρεάζεται άλλες πρωτεΐνες [9], [16], τα δεδομένα μας από παγκρεατικό και γαστρικό καρκίνο κύτταρα εκτός των κυττάρων ΜΚΝ45 υποδηλώνουν αλλιώς. Ωστόσο, όπως και τα αποτελέσματά της στον καρκίνο του προστάτη ή κύτταρα NSCLC, σχεδόν δεν ανιχνεύθηκαν επιδράσεις YM155 επί της έκφρασης ΧΙΑΡ σε κύτταρα ΜΚΝ45. Τέτοια διαφορικής έκφρασης κυτταρικό τύπο ορισμένων πρωτεϊνών μπορεί να αντικατοπτρίζει κυτταρική γραμμή ειδικές αποκρίσεις των παγκρεατικών ή γαστρικών καρκινικών κυττάρων να YM155. Σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις, βρήκαμε ότι τα κύτταρα PANC-1 ήταν τα πλέον ευαίσθητα στη YM155 μεταξύ των παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές [6]. Τα κύτταρα PANC-1 είναι γνωστό ότι εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα mRNA της survivin από τις άλλες δύο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές [25]. Buck et al. ανέφεραν ότι το επίπεδο έκφρασης του EGFR είναι υψηλότερη σε κύτταρα PANC-1 από ό, τι σε MiaPaCa-2 κύτταρα [25]. τα κύτταρα PANC-1 που εκφράζουν υψηλά επίπεδα ολικής και ενεργοποιημένων ΑΚΤ έχουν αναφερθεί ότι εμφανίζουν σημαντική αναστολή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, όταν ΡΙ3Κ /ΑΚΤ αναστέλλεται, σε σύγκριση με τις άλλες δύο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές [26], [27]. PI3K /AKT ρυθμίζεται από EGFR [28]. Ως εκ τούτου, η επίδραση της YM155 επί EGFR σε κύτταρα PANC-1 μπορεί να συνδέεται με ΑΚΤ. Επιπλέον, η υψηλή έκφραση της survivin και EGFR μπορεί να είναι κυτταροπροστατευτικά και συσχετίζονται με ευαισθησία YM155. Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω μελέτη είναι απαραίτητη για να διερευνήσει κατά πόσον επιδεκτικότητα των κυττάρων σε YM155 σχετίζεται με κυτταρική σειρά ειδικών αλλοιώσεων σε γονίδια όπως EGFR ή survivin. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι YM155 αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου σε MIAPaCa-2 ξενομοσχεύματα Ως εκ τούτου, ο συνδυασμός της YM155 με γεμσιταβίνη είναι επίσης άξια έρευνας καρκίνου του παγκρέατος.

YM155 σήμερα υποβάλλεται σε κλινικές δοκιμές [29]. Δοκιμές Φάσης II του YM155 πρότεινε την δραστικότητα και την ανεκτικότητα σε ασθενείς με μελάνωμα και προχωρημένο πυρίμαχα μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [30], [31]. Οι δόσεις YM155 δοκιμάζονται σε προκλινικά στάδια μέσω του καθορισμού της μέγιστης ανεκτής δόσης (MTD) ή μελέτες φαρμακοκινητικής ισχύουν για τις κλινικές ρυθμίσεις. Μια κλινική δοκιμή μπορεί να σχεδιαστεί με βάση την

in vitro

και

in vivo

αποτελεσματικότητα του YM155. Βάσει των προκλινικών δεδομένων μας, YM155 είναι αξίζει να διερευνηθεί περαιτέρω σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος.

Στη μελέτη μας, YM155 δεν άλλαξε Bcl-xL ή επίπεδα Mcl-1. Τα αποτελέσματα για Bcl-xL ήταν σύμφωνα με προηγούμενες παρατηρήσεις [9], ενώ εκείνες για Mcl-1 ήταν σε αντίθεση με εκείνους της προηγούμενης έκθεσης [32]. Tang et al. ανέφεραν ότι ρυθμίζει προς τα κάτω YM155 Mcl-1 σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων, αλλά όχι σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Αυτό μπορεί να αντανακλά την κυτταρική σειρά-ειδικές αποκρίσεις των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων να YM155. Ενώ YM155 προκάλεσε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση μείωση στην Bid, ρ-Bad, και Bad επίπεδα στα περισσότερα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, Bid ήταν ανεπηρέαστη σε BxPC-3 κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι YM155 επηρεάζει αποπτωτικών επίπεδα πρωτεϊνών, ένα αποτέλεσμα που έρχεται σε αντίθεση με προηγούμενες αναφορές [9].

Προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η φωσφορυλίωση του EGFR προκλήθηκε από ιονίζουσα ακτινοβολία σε ένα συνδετήρα-ανεξάρτητο τρόπο και η ιονίζουσα ακτινοβολία ή σισπλατίνη χωρίς EGF μεταφοράς που επάγεται EGFR στον πυρήνα [33]. Έδειξαν ότι ο μηχανισμός για προκαλούμενη από ακτινοβολία EGFR εισαγωγή μέσα στον πυρήνα συνδέθηκε με μια karyopherin α. Ωστόσο, δεν γνωρίζουμε τον ακριβή μηχανισμό της πυρηνικής μετατόπισης του EGFR από YM155 χωρίς EGF ακόμα. Έτσι, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να ανακαλύψει το μηχανισμό με τον YM155 στην πυρηνική μετατόπιση του EGFR. Liccardi et al. ανέφεραν ότι πυρηνική μετατόπιση του EGFR είναι σημαντική στη ρύθμιση της επισκευής της βλάβης του DNA μετά από χημειοθεραπεία [34]. Σε αυτή τη μελέτη, 10 ηΜ YM155 επαγόμενη πυρηνική μετατόπιση του EGFR και αυξημένα επίπεδα EGFR μεταγραφής. EGFR μετατοπίζεται στον πυρήνα, όπου EGFR θα μπορούσε να ενεργοποιήσει τα γονίδια που σχετίζονται με την επισκευή ως παράγοντας μεταγραφής [35]. Ωστόσο, υψηλότερες συγκεντρώσεις YM155 (100 ηΜ) μειωμένα επίπεδα μεταγραφής EGFR και αυξημένη αποικοδόμηση EGFR. Ως εκ τούτου, αυξημένη μεταγραφή και μετάθεση του EGFR σε χαμηλές συγκεντρώσεις (10 ηΜ) YM155 μπορεί να προστατεύσει τα κύτταρα από την απόπτωση, ενώ οι υψηλές συγκεντρώσεις (100 ηΜ) μειώνουν την κυτταρική επιβίωση μέσω της μείωσης της μεταγραφής EGFR και την αύξηση της υποβάθμισης EGFR.

Levkowitz et al. ανέφερε ότι η δέσμευση του EGF στον EGFR προκαλεί υποβάθμιση του EGFR μέσω της σύνδεσης με c-Cbl στο pY1045-EGFR [36]. Ahsan et al. ανέφεραν φωσφορυλίωση EGFR, ουβικιτινίωση και της υποβάθμισης στις σισπλατίνη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα [37]. Pangbum et al ανέφεραν ότι η σουλινδάκη μεταβολίτης επάγει επίσης την ουβικουϊτινίωση του EGFR [38]. Ομοίως, βρήκαμε ότι η φωσφορυλίωση του EGFR, και ουβικιτινίωση EGFR και αποικοδόμηση μετά από θεραπεία με YM155 προκλήθηκαν. Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να διερευνηθεί Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης να YM155.

ΧΙΑΡ έχει αναφερθεί να επάγει την καθοδική ρύθμιση της survivin μέσω XAF1 (ΧΙΑΡ σχετίζονται παράγοντα 1) [39]. ΧΙΑΡ έχει επίσης ταυτοποιηθεί ως συμπαράγοντας της survivin στην αναστολή της απόπτωσης [40]. Survivin απελευθερώνεται από μιτοχόνδρια σε απόκριση αποπτωτικών ερεθίσματα αλληλεπιδρά με ΧΙΑΡ μέσω θέση ΧΙΑΡ πρόσδεσης που αντιστοιχούν σε Lys15-Met38, με αποτέλεσμα την αυξημένη σταθερότητα ΧΙΑΡ κατά ουβικιτινίωση /υποβάθμισης του πρωτεασώματος και η αναστολή της απόπτωσης [41], [42]. Η φωσφορυλίωση του survivin στο κυτταρόπλασμα αναστέλλει την συναρμολόγηση του συμπλόκου survivin-ΧΙΑΡ, καταργώντας αντι-αποπτωτική λειτουργία του [41]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η επίδραση της YM155 επί της έκφρασης ΧΙΑΡ διέφεραν στο πλαίσιο της survivin knockdown. YM155 προκάλεσε αύξηση στα επίπεδα της μεταγραφής ΧΙΑΡ και προαχθεί η υποβάθμιση της πρωτεΐνης ΧΙΑΡ. YM155 μείωσε την αλληλεπίδραση του survivin με ΧΙΑΡ, ελαφρώς ενισχυμένη ουβικουϊτινίωση του ΧΙΑΡ, και επαγόμενη λυσοσωμική αποικοδόμηση του ΧΙΑΡ. Ως εκ τούτου, YM155 επηρεάζει την αποδόμηση του ΧΙΑΡ καθώς survivin, και παρεμβαίνει με τη συναρμολόγηση του συμπλόκου survivin-ΧΙΑΡ. Η YM155 προκαλούμενη μείωση στα επίπεδα ΧΙΑΡ είναι απίθανη λόγω της μείωσης των επιπέδων της survivin. Σε αυτή τη μελέτη, δεν είχαμε εξετάσει φωσφορυλίωση της survivin από YM155 ή διερεύνηση άλλων παραγόντων που μπορεί να επηρεάσουν το συγκρότημα survivin-ΧΙΑΡ. Κατά συνέπεια, θα πρέπει να γίνεται επιπλέον σε βάθος μηχανιστικές μελέτες για YM155 διαμόρφωση των ΧΙΑΡ.

Εν κατακλείδι, διαπιστώσαμε ότι YM155, γνωστό ως αναστολέας survivin, προωθεί ρύθμιση προς τα κάτω της PI3K, π-ΕΚΚ, και π-STAT3 μέσω αποδόμησης του EGFR σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι YM155 έχει θεραπευτικές δυνατότητες σε καρκίνο του παγκρέατος και παρέχει υποστήριξη για τις κλινικές δοκιμές των YM155 σε αυτό το πλαίσιο.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές, οι ενώσεις, πλασμίδιο, και αντισώματα

Οι ανθρώπινες παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές PANC-1, MIAPaCa-2 και BxPC-3 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USAA). YM155 λήφθηκε από Hanmi Pharmaceuticals (Σεούλ, Κορέα). Άλλα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται περιλαμβάνουν LY294002 (Calbiochem, Darmstadt, Γερμανία), AZD6244 (Chemizon Κορέα), MG132 (Calbiochem), χλωροκίνη (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ), Z-VAD-fmk (R &? D Systems, ΜΝ, USA ), κυκλοεξιμίδιο (Sigma-Aldrich), του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF? Daewoong Pharmaceuticals, Κορέα), και cetuximab (Merck Κορέα). Πρωτογενή αντισώματα κατά των ακόλουθων πρωτεΐνες χρησιμοποιήθηκαν για αναλύσεις κηλίδος Western: survivin (Abcam, Cambridge, MA, USA)? ΧΙΑΡ (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)? ουβικιτίνης και β-ακτίνη (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)? EGFR, φωσφο (σ) -EGFR (Y1068, Y1045), Bcl-XL, Mcl-1, Bid, π-Bad (S112), Bad, PI3K, ERK, π-ΕΚΚ (T202 /Y204), STAT3, ρ- STAT3 (Y705), αλδολάση, και Η3 (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ, USA). Ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας είδη κατάλληλο συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας δευτερογενή αντισώματα. Μερικά υλικά περιγράφονται στο Υλικά και Μέθοδοι S1.

δοκιμασίας Κυτταρική βιωσιμότητα και siRNA διαμόλυνση

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο Μετρώντας Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τρία ανεξάρτητα πειράματα εις διπλούν. ανασταλτικές συγκεντρώσεις πενήντα τοις εκατό (IC

50s) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego).