Αφηρημένο

Ιστορικό & amp? Στόχοι

παχέος συχνότητα εμφάνισης και των θανάτων από καρκίνο μειώνονται με την ανίχνευση και την αφαίρεση του πρώιμου σταδίου, θεραπεύσιμη νεοπλασία αλλά μας λείπουν αποδειχθεί βιοδείκτες ευαίσθητη τόσο για τον καρκίνο και προ-επεμβατική αδενώματα. Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να καθοριστεί εάν αδενώματα και καρκίνους εμφανίζουν χαρακτηριστικά πρότυπα της έκφρασης βιοδεικτών και να διερευνήσει κατά πόσον ένας ιστός-ανακαλύφθηκε (και επικυρωμένα) βιολογικός δείκτης εκφράζεται διαφορικά στο πλάσμα των ασθενών με αδενώματα του παχέος εντέρου ή καρκίνο.

Μέθοδοι

βιοδείκτες RNA υποψήφιες ταυτοποιήθηκαν με ανάλυση ολιγονουκλεοτιδίων μικροσυστοιχιών του παχέος δείγματα (222 κανονική, 29 αδένωμα, 161 αδενοκαρκίνωμα και 50 κολίτιδα) και επικυρώθηκε σε προηγουμένως μη δοκιμασμένη ομάδα των 68 παχέος δείγματα χρησιμοποιώντας μια ειδικά σχεδιασμένη ολιγονουκλεοτιδίων μικροσυστοιχίας. Ένα επικυρωμένο βιοδεικτών,

KIAA1199

, αναλύθηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR σε πλάσμα εξάγεται RNA από 20 κολονοσκόπηση-επιβεβαίωσε υγιείς μάρτυρες, 20 ασθενείς με αδένωμα, και 20 με καρκίνο.

Αποτελέσματα

ανάλυση του γονιδιώματος σε επίπεδο Ανοιχτό αναπαραγώγιμη υπογραφές γονιδιακής έκφρασης και για τις δύο αδενωμάτων και καρκίνων σε σύγκριση με τους ελέγχους. 386/489 (79%) του αδενώματος και 439/529 (83%) των βιοδεικτών αδενοκαρκινώματος επικυρώθηκαν σε ανεξάρτητους ιστούς. Ταυτοποιήσαμε επίσης γονίδια διαφορικά εκφραζόμενα σε αδενώματα σε σύγκριση με τον καρκίνο.

KIAA1199

επιλέχθηκε για περαιτέρω ανάλυση με βάση συνεπή ρύθμιση προς τα πάνω σε νεοπλασία, προηγούμενες μελέτες και το ενδιαφέρον του ως μη χαρακτηρισμένο γονίδιο. Πλάσματος

KIAA1199

επίπεδα RNA ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με καρκίνο ή αδένωμα (31/40) σε σύγκριση με νεοπλασία χωρίς ελέγχους (6/20).

Συμπεράσματα

παχέος νεοπλασία εμφανίζει χαρακτηριστικά πρότυπα της γονιδιακής έκφρασης.

KIAA1199

εκφράζεται διαφορικά σε νεοπλασματικών ιστών και

KIAA1199

μεταγραφές είναι πιο άφθονη στο πλάσμα των ασθενών με είτε καρκίνο ή αδένωμα σε σύγκριση με τους μάρτυρες

Παράθεση:. LaPointe LC, Pedersen SK, Dunne R, Μπράουν GS, Pimlott L, Gaur S, et al. (2012) Ανακάλυψη και Επικύρωση μοριακοί βιοδείκτες για αδενώματα του παχέος εντέρου και του καρκίνου με την αίτηση για τη δοκιμή του αίματος. PLoS ONE 7 (1): e29059. doi: 10.1371 /journal.pone.0029059

Επιμέλεια: Libing Song, η Sun Yat-sen University Κέντρο Καρκίνου, η Κίνα

Ελήφθη: May 30, 2011? Αποδεκτές: 20 του Νοέμβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 19 του Ιαν 2012

Copyright: © 2012 LaPointe et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο συγχρηματοδοτήθηκε από το Πανεπιστήμιο Flinders της Νότιας Αυστραλίας και της Κοινοπολιτείας Επιστημονικής και Βιομηχανικής Έρευνας Οργανισμό (CSIRO) της Αυστραλίας. Δρχ. Dunne, Molloy και Brown απασχολούνται από CSIRO. Αυτές οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Η χρηματοδότηση αυτή παρέχεται επίσης από Clinical Genomics Pty Ltd, μια εταιρεία που ασχολείται με την ανακάλυψη και την εμπορευματοποίηση των βιοδεικτών για καρκίνο του παχέος εντέρου. Δρχ. LaPointe, Pedersen, Gaur, McEvoy και Thomas απασχολούνται από Clinical Γονιδιωματική Pty Ltd και καθηγητής Young είναι μια πληρωμένη σύμβουλος της Κλινικής Γονιδιωματική Pty Ltd. Κατά συνέπεια, η χρηματοδότη έπαιξαν ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση, και την προετοιμασία του χειρογράφου. Κα Pimlott και ο Δρ Wattchow δεν έχουν τίποτα να αποκαλύψει

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Το έργο συγχρηματοδοτήθηκε από την Κλινική Genomics Pty Ltd, μια εταιρεία που ασχολείται με την ανακάλυψη και την εμπορευματοποίηση των βιοδεικτών για καρκίνο του παχέος εντέρου. Δρχ. LaPointe, Pedersen, Gaur, McEvoy και Thomas απασχολούνται από Clinical Genomics Pty Ltd. καθηγητής Young είναι μια πληρωμένη σύμβουλος της Κλινικής Γονιδιωματική Pty Ltd. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι θεραπεύσιμη αν εντοπίζονται και να απομακρύνονται σε πρώιμο στάδιο με το 95% των ασθενών επιβιώνουν πέραν των πέντε ετών [1]. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι η αφαίρεση προ-επεμβατική αλλοιώσεις του παχέος εντέρου, δηλ αδενώματα, με πολυποδεκτομή μειώνει τη συχνότητα εμφάνισης και η θνησιμότητα από, ορθοκολικό καρκίνο [2] – [4]. Κατά συνέπεια, η πρόληψη του ορθοκολικού καρκίνου αφαιρώντας αδενώματα οθόνης ανιχνεύεται όλο και περισσότερο τονίζεται ως σημαντικός στόχος του ορθοκολικού καρκίνου. Απλές δοκιμές διαλογής που διατίθενται σήμερα, ωστόσο, είναι υποβέλτιστες για την ανίχνευση αδενώματος, αν και κοπράνων ανοσοχημική δοκιμές για σφαιρίνης είναι πολύ βελτιωμένη σε σχέση με προηγούμενες δοκιμές [5] – [7]. προγράμματα προσυμπτωματικού ελέγχου του πληθυσμού μπορεί να βελτιωθεί εάν μια βολική εξέταση αίματος ήταν διαθέσιμες που είναι ευαίσθητη και ειδική για τις δύο πρώτες, πιο θεραπεύσιμες στάδια καρκίνου του παχέος εντέρου και επίσης ευαίσθητα για την προ-επεμβατική αδενώματα. Ένα τέτοιο τεστ θα διευκολύνει μια ορθολογική προσέγγιση διαλογής επιτρέποντάς μας να κατευθύνει κολονοσκόπηση πόρους για εκείνα τα άτομα που είναι πιθανό να πάρετε το μεγαλύτερο όφελος από την επεμβατική διαδικασία [8].

Τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης που δείχνει όλο και υπόσχεση για την αναγνώριση των υποψήφιο βιοδεικτών για καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά αυτοί οι υποψήφιοι συχνά στερούνται κατάλληλης επικύρωσης και λίγα στοιχεία είναι διαθέσιμα για βιοδείκτες που είναι επίσης ευαίσθητη για αδενώματα. Υποθετικό βιοδείκτες που προκύπτουν από την έρευνα ανακάλυψη που βασίζεται πρέπει να επικυρώνεται με αυστηρότητα, αν πρόκειται να είναι κλινικά χρήσιμη [9] – [12]. Επικύρωση, δηλαδή τον έλεγχο της υπόθεσης ότι οι υποψήφιες βιοδείκτες είναι γνήσια δείκτες του φαινοτύπου, κάνει ιδανική χρήση μιας κοόρτης του ασθενούς που είναι κλινικά ανεξάρτητη από την ομάδα ανακάλυψης. Περαιτέρω, η συσχέτιση μεταξύ των προτύπων γονιδιακής έκφρασης σε ιστό και την ανίχνευση βιοδεικτών στο αίμα δεν έχει καλά καθορισμένο.

Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να καθοριστεί εάν αδενώματα και καρκίνους εμφανίζουν χαρακτηριστικά πρότυπα της έκφρασης βιοδεικτών και να διερευνήσει κατά πόσον ένα ιστό -discovered (και επικυρωμένα) βιοδείκτης εκφράζεται διαφορικά στο πλάσμα των ασθενών με ορθοκολικό αδενώματα ή καρκίνο. Ιδιαίτερη προσοχή δίνεται στα πρότυπα έκφρασης αδενώματος ως βιοδείκτες αδένωμα έχουν σε μεγάλο βαθμό αγνοηθεί στη βιβλιογραφία.

επιδιωκόμενο σκοπό μας να αποκαλύψει ευαίσθητες βιοδείκτες για τόσο αδενώματα του παχέος εντέρου και του καρκίνου, ακολουθώντας μια στρατηγική τριών φάσεων της ανακάλυψης, την επικύρωση και κλινικές δοκιμές προσδιορισμού. Πρώτον, τα δεδομένα μικροσυστοιχιών υψηλής διαστάσεων γονιδιακής έκφρασης αναλύθηκαν για να ανακαλύψετε υποψηφίων βιοδεικτών σε δύο καρκίνους και αδενώματα από το παχέος εντέρου. Για τότε επικυρώνει υποψηφίων γονιδιακή έκφραση, ένα ειδικά σχεδιασμένο ολιγονουκλεοτίδιο μικροσυστοιχιών ( «Adenoma βιοδεικτών Gene Chip») σχεδιάστηκε και κατασκευάζεται για να περιέχει μια ευρεία επιλογή των υποθετικών δεικτών που βρέθηκαν κατά την διάρκεια της φάσης ανακάλυψης, καθώς και δείκτες επιλέγονται από την βιβλιογραφία. Υποψήφιος βιοδείκτες επικυρώθηκαν με τη χρήση αδενώματος βιοδεικτών Gene Chip σε ένα ανεξάρτητο σύνολο των νεοπλασματικών δειγμάτων. Τέλος, η πιθανή κλινική χρησιμότητα της μια πολλά υποσχόμενη ιστού επικυρωμένη παχέος νεοπλασία βιοδείκτη μετρήθηκε σε RNA που εκχυλίστηκε από το πλάσμα των ασθενών ορθοκολικού αδενώματος και καρκίνου και κολονοσκόπηση επιβεβαιωμένης υγιείς ελέγχους. Αυτή η διαδοχική διαδικασία ακολουθεί τα δύο πρώτα στάδια της αξιολόγησης πέντε σταδίων των βιοδεικτών που προτείνει Pepe et al [13].

Αποτελέσματα

Νεοπλασματική εναντίον μη-νεοπλασματικές μεταγραφικό

Από 44928 probesets αναλύθηκαν για έκφραση γονιδίου διαφορά, παρατηρήσαμε 11.183 (24.9%) probesets να εκφράζονται διαφορικά σε νεοπλαστικούς ιστούς σε σχέση με μη νεοπλασματικά ιστούς συμπεριλαμβανομένου κολιτιδικά δείγματα. Για σύγκριση, παρατηρήσαμε 2701 (6,0%) probesets παρομοίως εκφράζονται διαφορικά μεταξύ της κανονικής (n = 222) και κολίτιδα (n = 42) τα εκχυλίσματα ιστών (Πίνακας 1). Αυτά τα στοιχεία έκφρασης αναλύθηκαν επίσης με την πλήρη γονιδίωμα επιπέδου χρησιμοποιώντας ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) (Σχήμα 1). Η μεγαλύτερη πηγή της αλλαγής έκφραση που παρατηρείται σε αυτές τις 454 μικροσυστοιχίες (όπως αποδεικνύεται τόσο από μέση μεταβολή της έκφρασης και του οικοπέδου PCA) συσχετίζεται με την παρουσία ή την απουσία της νεοπλασίας. Αυτή η φαινοτυπική επίδραση ήταν ανεξάρτητη από το αν τα μη νεοπλασματικά ιστούς παρουσίασαν κολίτιδα και επίσης ανεξάρτητα από το αν τα νεοπλασματικών ιστοί ήταν αδενωματωδών ή καρκινικές

(Α) Discovery μικροσυστοιχιών σύνολο δεδομένων:. 222 κανονικό, μαύρο? 42 κολίτιδα /IBD, πράσινο? 29 αδενώματα, μπλε? και 161 αδενοκαρκινώματα, κόκκινο. (Β) Επικύρωση μικροσυστοιχιών σύνολο δεδομένων: 30 κανονικό, μαύρο? 19 αδενώματα, μπλε? και 19 αδενοκαρκινώματα, κόκκινο.

Η

Με τη θέσπιση μιας απαίτησης για δύο φορές την αλλαγή στην ένταση του σήματος μεταξύ νεοπλασματικών και μη νεοπλασματικών ιστών, ο αριθμός των διαφορικά εκφρασμένων probesets μειώθηκε από 11.183 σε 446 (Τραπέζι 1). Έτσι μόνο 4,0% των διαφορικά εκφρασμένων probesets (1,0% του συνολικού probesets) έδειξε μεταβολή τουλάχιστον δύο φορές έκφρασης. Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ ο αριθμός των probesets εμφανίζουν διαφορική απόκριση οποιουδήποτε μεγέθους ήταν περίπου εξίσου χωρίζονται μεταξύ probesets με αυξημένη έκφραση σε νεοπλαστικούς ιστούς (6227? 55%) και probesets με μειωμένη έκφραση (4956? 44%), μετά την εφαρμογή του διττό κριτήριο τον αριθμό των υπο-εκφράζονται probesets με μειωμένη ένταση σε νεοπλαστικούς ιστούς ήταν πολύ μεγαλύτερος από τον αριθμό των probesets με αυξημένη ένταση, 338 (76%) έναντι 108 (24%) αντίστοιχα. Η τάση παρατηρήθηκε τόσο σε μη νεοπλασματικά έναντι αδένωμα και μη νεοπλαστικά έναντι συγκρίσεις καρκίνου. Από την άλλη πλευρά, η σύγκριση μεταξύ της κανονικής και της κολίτιδας δείγματα έδειξαν περίπου ίσους αριθμούς γονιδίων με υψηλότερο (60) και χαμηλότερα επίπεδα (73) έκφραση μεταξύ φαινοτύπους. Μεταξύ αδενώματος και καρκίνου, ωστόσο, υπήρχαν σημαντικά περισσότερα γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω (145) στον καρκίνο έναντι κάτω ρυθμιζόμενη (43). Μια περίληψη των διαφορικών αλλαγής έκφρασης από φαινότυπος φαίνεται στον Πίνακα 1 και τον κατάλογο των επικυρωμένων γονιδίων πάνω και κάτω-ρυθμίζονται σε καρκίνους σε σύγκριση με αδενώματα παρουσιάζονται στους Πίνακες S1 και S2, αντίστοιχα.

Probesets που αποκάλυψε απόκλιση έκφραση μεταξύ νεοπλασματικών (αδενώματα και καρκίνους) και μη-νεοπλασματικών ιστών (κανονικό και κολίτιδα) χαρτογραφήθηκαν σε σύμβολα υποτιθέμενο γονίδιο χρησιμοποιώντας τις πιο πρόσφατες αρχεία μικροσυστοιχιών σχολιασμού. 108 probesets αυξημένα σε νεοπλασματικών ιστών από τουλάχιστον δύο φορές χαρτογραφήθηκαν σε 97 χαρακτήρες γονιδίου και 338 μειώθηκε probesets χαρτογραφήθηκαν σε 264 χαρακτήρες γονίδιο (Πίνακας S3).

φαινότυπου-ειδικών γονιδίων

Η σύνολα των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων αναλύθηκαν περαιτέρω χρησιμοποιώντας μια νέα μέθοδο ανάλυσης που αναπτύχθηκε από εμάς να προβλέψουμε μεταγραφές που μπορούν να εκφραστούν σε ένα φαινότυπο (π.χ. νεοπλασία), αλλά όχι σε άλλο (π.χ. υγιείς μάρτυρες). Με την εφαρμογή αυτής της μεθοδολογίας, 23 στόχοι probeset ταυτοποιήθηκαν ως πιθανές υποψήφιες για έκφραση γονιδίου νεοπλασματικές-ειδική, δηλαδή υποθετικά αναμμένων σε νεοπλαστικούς ιστούς αλλά σβηστό σε μη νεοπλασματικά ελέγχους. Επιπλέον, 35 γονίδια ταυτοποιήθηκαν ως υποψήφιοι για την έκφραση σε μόνο μη νεοπλασματικά ιστούς, δηλ αναμμένων σε μη νεοπλασματικά ιστούς αλλά σβηστό σε νεοπλαστικούς ιστούς. Ένα παράδειγμα ενός probeset παρουσιάζει ένα πρωτότυπο πρότυπο νεοπλασματικής-ειδική απόκριση δείχνεται στο Σχήμα 2Α, και ο πλήρης κατάλογος των probesets που αντιστοιχούν σε υποθετικά αναμμένων και σβηστό γονιδίων δείχνεται στους Πίνακες S4 και S5, αντίστοιχα.

(Α) σύνολο δεδομένων Discovery, 222 κανονικό, μαύρο? 42 IBDs, πράσινο? 29 αδενώματα, μπλε? 161 αδενοκαρκινώματα, κόκκινο. (Β) σύνολο δεδομένων Επικύρωση: 30 κανονικό, μαύρο? 19 αδενώματα, μπλε? 19 αδενοκαρκινώματα, κόκκινο. Υ-άξονας:. Κανονικοποιημένη ένταση probeset (log2)

Η

Custom «Adenoma βιοδεικτών» γονίδιο τσιπ

Το οικόπεδο PCA των δεδομένων εντοπισμού (Σχήμα 1Α) δείχνει ένα ισχυρό εναντίον νεοπλασία μη-νεοπλασία διαχωρισμού που περιλαμβάνουν τα πρώτα δύο κύριους άξονες συστατικό, με τα αδενώματα και τον καρκίνο ομαδοποιούνται. Για τα δεδομένα επικύρωσης (Σχήμα 1Β), η πρώτη κύρια συνιστώσα επιβεβαιώνει ότι η μεγαλύτερη πηγή της διακύμανσης σε αυτές probesets είναι η παρουσία ή η απουσία νεοπλασίας. Το δεύτερο συστατικό κύριο, ωστόσο, δείχνει ότι τα αδενώματα ομαδοποιούνται χωριστά από τα δείγματα καρκίνου.

Επικύρωση των υποψηφίων βιοδεικτών για τον ορθοκολικό νεοπλασία

Από τις 108 probesets των οποίων οι στόχοι υπέθεσε να είναι υπερ- εκφράζονται από τουλάχιστον δύο φορές σε νεοπλαστικούς ιστούς ανακάλυψη, 103 probesets (95%) ήταν αυξημένα στις νεοπλαστικούς ιστούς επικύρωσης (

P

≤0.05, MHT), και εξ αυτών 92 (85%) ήταν αυξημένα κατά τουλάχιστον 2 φορές. Παρομοίως, 297 από τους 338 στόχους probeset (87%) υποτίθεται ότι είναι υπο-εκφράζεται σε νεοπλαστικούς ιστούς ήταν επίσης κάτω από-εκφράζεται στα πειράματα επικύρωσης (

P

≤0.05, MHT)? σε νεοπλασματικά δείγματα, 247 (73%) αυτών των γονιδίων εμφάνισε το ήμισυ ή λιγότερο της έκφρασης παρατηρήθηκαν σε φυσιολογικούς ιστούς ελέγχου. Τα αποτελέσματα επικύρωσης Αντίθετα φαινότυπο παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Ένας κατάλογος των επικυρωμένων πάνω και κάτω-ρυθμίζονται probesets παρουσιάζεται στους Πίνακες S6 και S7, αντίστοιχα.

Η

δοκιμασία Ποσοτική PCR για την μέτρηση των επιπέδων βιοδείκτη RNA στο ιστό ή το πλάσμα

ένα από τα πιο διαφορικά πάνω ρυθμισμένα probesets τόσο στην ανακάλυψη (Σχήμα 3Α) και την επικύρωση (Σχήμα 3Β) ανιχνεύθηκαν μεταγραφές από

KIAA1199

, ένα γονίδιο άγνωστης λειτουργίας. Στο σύνολο δεδομένων επικύρωσης, probeset 1008852-HuGene_st (

KIAA1199

) εκφράστηκε περισσότερο από 25-φορές υψηλότερη σε ορθοκολικό νεοπλασία σε σχέση με μη νεοπλασματικά μάρτυρες (Πίνακας S6). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν προηγούμενες εκθέσεις, η οποία διαπίστωσε ότι

KIAA1199

mRNA μπορεί να είναι ένας υποψήφιος βιοδείκτης για ορθοκολικού αδενώματος [14]. Με βάση την επαναλαμβανόμενη παρατήρηση μας διαφορικής έκφρασης σε νεοπλαστικούς ιστούς, η προηγούμενη απόδειξη της επάνω ρυθμισμένη έκφραση σε αμφότερες αδενωμάτων και καρκίνων και το ενδιαφέρον γεγονός που

KIAA1199

δεν έχει προηγουμένως χαρακτηριζόμενη από την άποψη της δομής ή λειτουργίας, εμείς επέλεξε

KIAA1199

να δοκιμάσει την ιδέα ότι τα πρότυπα έκφρασης ιστού μπορεί να αντανακλάται στο αίμα. Για να διερευνήσουν περαιτέρω το δυναμικό βιοδείκτη του

KIAA1199

σχεδιάσαμε μια δοκιμασία PCR σε πραγματικό χρόνο για την ανίχνευση των μεταγραφών RNA που προέρχεται από αυτό το τόπο.

(Α)

μετριέται KIAA1199

έκφρασης μέσω probeset 212942_s_at στην ανακάλυψη σύνολο δεδομένων από 454 παχέος δείγματα ιστών (x-άξονα αναπροσαρμόζονται από φαινότυπο)? Norm: 222 φυσιολογικά δείγματα, μαύρο? IBD: 42 δείγματα «κολίτιδα», πράσινο? ADE: 29 αδενώματα, μπλε? CA: 161 δείγματα καρκίνου, κόκκινο. Υ-άξονας: κανονικοποιημένη ένταση probeset (log2). (Β)

KIAA1199

έκφραση μετράται με probeset 1008852-HuGene_st στο σύνολο δεδομένων επικύρωσης σε 68 δείγματα ορθοκολικού ιστού. Χ-άξονας? Norm: 30 δείγματα φυσιολογικού ιστού του παχέος εντέρου, μαύρο? ADE: 19 αδενώματα, μπλε? CA: 19 παχέος δείγματα καρκίνου, κόκκινο. Υ-άξονας: κανονικοποιημένη ένταση probeset (log2). (Γ) ποσοτική σε πραγματικό χρόνο SYBR πράσινο

KIAA1199

δοκιμασία PCR εφαρμόζεται σε εκχυλίσματα RNA που χρησιμοποιείται για την επικύρωση των δεδομένων μικροσυστοιχιών: 30 κανονικό, μαύρο? 21 αδενώματα, μπλε? 20 ορθοκολικό καρκίνο, κόκκινο δείγματα. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές δειγμάτων εις διπλούν, κανονικοποιημένη έναντι HPRT1 και απεικονίζονται ως τιμές δέλτα-δέλτα-Ct. Σημειώστε ότι τρεις επιπλέον νεοπλασματικά δείγματα ήταν διαθέσιμα για τις PCR πειράματα που δεν έχουν δοκιμαστεί από τη συνήθεια των μικροσυστοιχιών.

Η

Κατ ‘αρχάς, ένα SYBR-πράσινο βασίζεται σε πραγματικό χρόνο PCR για

χρησιμοποιήθηκε KIAA1199

για να επιβεβαιώσει τα στοιχεία του ιστού επικύρωση μικροσυστοιχιών? τα αποτελέσματα ήταν σε καλή συμφωνία με τα δεδομένα μικροσυστοιχίας για αυτό το γονίδιο (Σχήμα 3C). Στη συνέχεια,

KIAA1199

(και

GAPDH

έλεγχος) επίπεδα μεταγραφής μετρήθηκαν σε RNA που εξάγεται από το κλάσμα των 40 ασθενών με ορθοκολικό νεοπλασία (αδένωμα ή αδενοκαρκίνωμα) και 20 υγιείς μάρτυρες του πλάσματος (όλες οι κατηγορίες που έχουν επιβεβαιώθηκε από κλινικές παθολογικά ευρήματα) χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμες δοκιμασίες TaqMan qPCR.

GAPDH

μεταγραφές RNA ήταν ανιχνεύσιμα σε όλα τα 60 δείγματα πλάσματος δοκιμάστηκαν (Σχήμα 4Α) και ελαφρά υψηλότερο

GAPDH

επίπεδα RNA παρατηρήθηκαν σε δείγματα πλάσματος από ασθενείς διαγνώστηκαν με αδενώματα του παχέος εντέρου ή καρκίνο σε σύγκριση με υγιείς δότες (δεν είναι σημαντική, οι τιμές ρ & gt? 0,05). Υψηλότερες συγκεντρώσεις

KIAA1199

μεταγραφές RNA ανιχνεύθηκαν στο πλάσμα από ασθενείς με ορθοκολικό νεοπλασία σε σχέση με το πλάσμα από υγιείς ελέγχους (Σχήμα 4Β).

KIAA1199

RNA ανιχνεύθηκε στο πλάσμα από 31 από τα 40 (77,5%) ασθενείς με ορθοκολικό νεοπλασία και σε 6 από τις 20 (30%) ασθενείς με νεοπλασία-free.

(Α )

GAPDH

και (Β)

KIAA1199

επίπεδα RNA στο πλάσμα από 20 υγιείς εθελοντές (μαύρο) και από 20 ασθενείς με αδενώματα του παχέος εντέρου (μπλε) και 20 ασθενείς CRC (κόκκινο). Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές Ct (τριπλότυπα) κανονικοποιημένη για τις διαφορές απόδοση εκχύλισης και απεικονίζεται ως διαφορές πολλαπλάσια μεταβολή σε σχέση προς το μέσο έκφρασης που μετρήθηκε στα 20 φυσιολογικά άτομα. Οι τιμές Ρ υπολογίστηκαν με τη χρησιμοποίηση δύο ουρών Mann-Whitney t-test.

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη επιβεβαιώνει ότι ορθοκολικό μεταγραφών mRNA εκφράζονται διαφορικά σε αμφότερες τις αδενώματος και καρκίνου του ιστούς σχέση με τους ελέγχους , με κάποια μετάγραφα είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε νεοπλασία, ενώ άλλοι είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω. Επιβεβαιώσαμε ότι 103 από 108 (95%) probesets ανακαλυφθεί να είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε νεοπλασία ομοίως εκφράζονται διαφορικά κατά τη δοκιμή επικύρωσης. 87% (297/338) των κάτω-ρυθμίζονται probesets επιβεβαιώθηκαν και κατά τη διάρκεια δοκιμών επικύρωσης. Γονιδίωμα-ευρύ μοτίβα συνδιακύμανσης έδειξε ότι η παρουσία ή απουσία νεοπλασίας συσχετίζεται με τη μεγαλύτερη πηγή μεταβλητότητας σε όλες probesests και όλων των συστοιχιών στα δεδομένα έκφρασης (Εικ 1Α). Περίπου το 25% των 44.928 στόχων ανακάλυψη probeset εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ νεοπλαστικό ιστό και μη νεοπλασματικών ελέγχους. Όλες οι άλλες αντιθέσεις φαινότυπο ως αποτέλεσμα λιγότερες probesets δείχνει μια διαφορική απόκριση. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι νεοπλασματική κατάσταση έχει μεγαλύτερη επίδραση στην γονιδιακή έκφραση από, για παράδειγμα, κολίτιδα ή ακόμη και τη διαφορά μεταξύ των προ-επεμβατική ιστού αδενώματος και κακοήθη καρκίνο.

Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν με ένα κοινά παρατηρείται τάση καρκίνο του παχέος εντέρου γονίδιο έρευνα έκφραση που δείχνει μια αύξηση του αριθμού των γονιδίων τα κάτω-ρυθμίζονται σε αδενώματος και καρκίνου του ιστούς σε σύγκριση με μη νεοπλαστικά ελέγχους [15]. Αυτό το πρότυπο έκφρασης μπορεί αντανακλά την αύξηση των επιπέδων της υπερμεθυλίωσης σχετίζεται με ογκογένεση [16].

Από την άλλη πλευρά, αυτή η μελέτη αποκαλύπτει ότι περισσότερα γονίδια εμφανίζονται να είναι επάνω-ρυθμίζονται κατά τη μετάβαση από αδένωμα προς αδενοκαρκίνωμα (Πίνακας S1) . Αυτή η παρατήρηση θα μπορούσε να αντανακλά την αυξημένη υποκείμενη ιστολογική πολυπλοκότητα του καρκίνου σε σύγκριση με αδένωμα ιστού ή, πιο ενδιαφέροντα τρόπο, μπορεί να καταδείξει μια σχέση μεταξύ αυξημένων αριθμών εκφρασμένων γονιδίων και της εξέλιξης σε μια επεμβατική φαινότυπο και μετάσταση. Η μεγαλύτερη ομάδα (14%) των γονιδίων up-ρυθμίζονται σε καρκίνο σε σύγκριση με αδενώματα είναι από την οικογένεια του κολλαγόνου αλλά ο κατάλογος περιλαμβάνει επίσης τέσσερα διαφορετικά είδη metaloproteinases μήτρας υποδηλώνει αυξημένη δραστηριότητα των γονιδίων με δυναμικό εισβολής (Πίνακας S1).

Επιπλέον, αυτή η μελέτη περιελάμβανε τη σχεδίαση μιας προσαρμοσμένης μικροσυστοιχιών που περιείχε ένα σύνολο γονιδίων που δείχνουν ότι αδενώματα μπορούν να διαχωριστούν από τα δείγματα του καρκίνου με βάση πρότυπα γονιδιακής έκφρασης (Σχήμα 1Β). Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την ιδέα ότι δεν είναι μόνο η νεοπλασματική υπογραφή γονιδιακής έκφρασης διατηρούνται μεταξύ της ανακάλυψης και επικύρωση των δεδομένων, αλλά και το αδένωμα εναντίον υπογραφή έκφραση καρκίνος παρομοίως διατηρηθεί. Εμείς δεν γνωρίζουν καμία προηγούμενη μελέτη γονιδιακής έκφρασης που έχει αποδείξει την ικανότητα να διακρίνουν μεταξύ μη νεοπλασία, προ-επεμβατική νεοπλασία και επεμβατικές φαινοτύπους. Η επιλογή των γονιδίων ανοίγει το δρόμο για την ταυτοποίηση βιοδεικτών χρήση στην ευαίσθητη και ειδική ανίχνευση των αδενωμάτων.

Ο δεύτερος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει κατά πόσον επιλεγέντα υποψήφιο βιοδείκτες που ανακαλύφθηκε στον ιστό ήταν ανιχνεύσιμες και διαφορικά εκφρασμένων στο πλάσμα των ασθενών με αδενώματα ή του παχέος εντέρου σε σύγκριση με μη νεοπλαστικά πλάσμα ελέγχου. Αυτό το βήμα είναι ζωτικής σημασίας για τη μετάφραση των ευρημάτων ιστού σε κλινικά χρήσιμη τελικά σημεία. Σε αντίθετη περίπτωση, η ανακάλυψη δείκτης πρέπει να ξεκινήσει σε διαγνωστικά κλινικά δείγματα (π.χ. αίμα) που θέτουν μεγαλύτερες προκλήσεις από ό, αρχίζοντας με σχετικά RNA-πλούσια σε φρέσκο ​​κατεψυγμένο ιστό. Η παρούσα έκθεση περιγράφει ένα πλάσμα που βασίζεται qPCR δοκιμασία απόδειξη της ιδέας ότι τα μέτρα μεταγραφές mRNA της

KIAA1199

, ένα γονίδιο άγνωστης λειτουργίας που επιβεβαιώνουν να εκφράζονται διαφορικά σε τόσο ιστό και το πλάσμα του καρκίνου και αδένωμα ασθενείς.

βιοδείκτες για τον ορθοκολικό νεοπλασία

υπάρχει μια μεγάλη και αυξανόμενη βιβλιογραφία των πειραμάτων έκφρασης που σχετίζονται με ορθοκολικό γονίδιο [17], [18]. Η μελέτη που παρουσιάζεται εδώ επεκτείνει και βελτιώνει την εν λόγω φορέα του έργου. Μια συγκριτικά μεγάλη μετα-ανάλυση των Chan et al. μελετών ανακάλυψη έκφραση 25 γονιδίων που σχετίζονται με καρκίνο του παχέος εντέρου εντοπίζονται πέντε γονίδια να είναι up-ρυθμίζονται σε επτά ή περισσότερες ανεξάρτητες αναλύσεις, συμπεριλαμβανομένων των

TGFBI

,

IFITM1

,

MYC

,

SPARC

,

GDF15

[17]. Και οι πέντε από αυτά τα γονίδια αυτά επιβεβαιώθηκαν να ρυθμίζεται προς τα πάνω στη μελέτη μας.

Λίγες μελέτες αντιμετώπιση διαφορές έκφρασης μεταξύ ορθοκολικού αδενώματος και φυσιολογικό ορθοκολικό ιστό. Galamb et al. μεταχειρισμένα μικροσυστοιχίες για να προσδιορίσει ένα σύνολο τριών γονιδίων (

KIAA1199

,

FOXQ1

, και

CA7

) που εκφράζονται διαφορικά σε αδενώματα σε σχέση με φυσιολογικούς μάρτυρες, καθώς και ένα σύνολο πέντε γονίδια (

VWF

,

IL8

,

CHI3L1

,

S100A8

, και

GREM1

), η οποία θα μπορούσε να διακρίνουν τον καρκίνο ιστούς από φυσιολογικούς ελέγχους [19]. Από αυτά τα γονίδια, η μελέτη μας διαπίστωσε ότι

KIAA1199

,

FOXQ1

και

IL8

εκφράστηκαν διαφορικά σε αδενώματα (και σε καρκίνους) σε σχέση με φυσιολογικούς μάρτυρες.

KIAA1199

Η παρούσα μελέτη επιβεβαιώνει προηγούμενες εκθέσεις που em

KIAA1199

παρουσιάζει ένα αυξημένο επίπεδο έκφρασης mRNA σε προκαρκινικές αδενώματα, μια ρύθμιση προς τα πάνω που εξακολουθεί να υφίσταται σε καρκινικούς ιστούς [14]. Αυτό το γονίδιο ήταν επίσης ένα από τα κορυφαία δεικτών που προσδιορίζονται από εργαστήριο Marra ως προηγουμένως άγνωστο στόχο Wnt-επαγόμενης έκφρασης και μια πιθανή νέα βιοδείκτη για ορθοκολικό νεοπλασία. Sabatés-Bellver et al. έδειξαν ότι το

KIAA1199

έκφραση σε φυσιολογικό βλεννογόνο περιοριζόταν σε κύτταρα στο κατώτερο τμήμα του εντερικού κρυπτών, ενώ αυξημένα

KIAA1199

έκφραση παρατηρήθηκε σε όλα τα αδενώματα που μελετήθηκαν.

ο ρόλος του

KIAA1199

δεν είναι γνωστή, αλλά η απόδειξη της Wnt-επαγωγιμότητας υποδηλώνει αυτό το γονίδιο μπορεί να είναι μέρος του κατάντη του καταρράκτη Tcf /LEF μεταγραφικά ενεργοποιημένου γονίδια τα οποία συνήθως διαταράσσονται σε γαστρεντερικές νεοπλασίες [14] . Γαστρική αδενοκαρκινώματα εκφράζουν υψηλά επίπεδα του

KIAA1199

συσχετίζονται με χειρότερη πενταετούς επιβίωσης αποτελέσματα σε σχέση με τους ασθενείς με χαμηλή

KIAA1199

έκφρασης [20]. Καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα κατεργασμένα με εκλεκτικούς αναστολείς κυκλοοξυγενάσης-2 δείξουν μειωμένα

KIAA1199

έκφραση [21], ενώ τα υψηλά επίπεδα του

KIAA1199

mRNA συσχετίζονται θετικά με τη θνησιμότητα των κυττάρων σε ανθρώπινους ινοβλάστες [22].

Μια εξέταση αίματος απόδειξη της ιδέας για αδενώματα

Παρά τη ραγδαία αυξανόμενη βάση δεδομένων των θεωρούμενων βιοδεικτών του καρκίνου, μερικά ελπιδοφόρα υποψήφιοι κατά την αρχική έρευνα ανακάλυψη επιβιώσουν τα επόμενα δοκιμές επικύρωσης με ανεξάρτητους ιστούς. Ένα ακόμα μικρότερο κλάσμα των υποψηφίων εξακολουθούν να δείχνουν υπόσχεση όταν τα εν λόγω γονίδια επιλέγονται για ανάπτυξη δοκιμασία και κλινικές δοκιμές. Έχουμε εντοπίσει εκατοντάδες βιοδεικτών για τον ορθοκολικό νεοπλασία που έχουν επιζήσει επικύρωσης σε ανεξάρτητη κλινικά δείγματα. Για ένα συναρπαστικό νεοπλαστικό βιοδείκτη ιστού,

KIAA1199

, έχουμε επίσης δοκιμαστεί μια qPCR δοκιμασία μονού γονιδίου που δείχνει υπόσχεση σε διάκριση μεταξύ των δειγμάτων πλάσματος από με ασθενείς με ορθοκολικό νεοπλασία και από υγιή άτομα. Αυτό το γονίδιο, το οποίο ήταν ένα από τα πολλά γονίδια «επικυρωμένη», επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη με βάση την απόδοση βιοδεικτών που αναφέρονται εδώ, οι προηγούμενες αναφορές που έδειξε

KIAA1199

να είναι αυξημένα σε ορθοκολικό νεοπλασία και επειδή η βιολογική λειτουργία αυτού του γονίδιο είναι άγνωστη. Πλάσματος

KIAA1199

επίπεδα ήταν αυξημένα σε ασθενείς οι οποίοι είχαν κολονοσκόπηση επιβεβαιωμένα αδενώματα ή καρκίνους σε σχέση με τον έλεγχο του πλάσματος από νεοπλασία-ελεύθερα άτομα, αν και η εμφανής ευαισθησία αυτού του ενιαίου δείκτη ήταν υψηλότερη για τον καρκίνο από ό, τι για τα αδενώματα.

Ως βιοδείκτη με το δυναμικό για τη διάγνωση σε δείγματα μη επεμβατική ασθενή,

KIAA1199

θα πρέπει τώρα να εξεταστεί για ενσωμάτωση σε mRNA (και πιθανώς πρωτεΐνη) δοκιμασίες και διερευνηθεί σε μεγαλύτερες κλινικές μελέτες και διαλογή. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον θα είναι η σχέση του

KIAA1199

έκφραση στα διάφορα γενετικά μονοπάτια ορθοκολικού ογκογένεσης, όπως την οδό

Wnt

σηματοδότησης, τα οποία συνήθως διαταράσσονται σε ορθοκολικούς καρκίνους και αδενωμάτων.

παχέος νεοπλασία παρουσιάζει χαρακτηριστικά πρότυπα γονιδιακής έκφρασης.

KIAA1199

εκφράζεται διαφορικά σε νεοπλαστικούς ιστούς και

KIAA1199

μεταγραφήματα είναι πιο άφθονη στο πλάσμα των ασθενών με είτε καρκίνο ή αδένωμα σύγκριση με τους ελέγχους.

KIAA1199

και άλλα επικυρωμένοι βιοδείκτες που περιγράφονται εδώ απαιτούν περαιτέρω αξιολόγηση όπως δοκιμασίες διαλογής με βάση το αίμα για τον ορθοκολικό νεοπλασία. Μια βασική πρόκληση για αυτήν την περαιτέρω αξιολόγηση θα είναι να ασχοληθεί επίσης με σχετική ευαισθησία ενός τεστ για αδενώματα και καρκίνους με δεδομένη την πολύ υψηλότερη επικράτηση της καλοήθους νεοπλασματικών αδενώματα του παχέος εντέρου σε σύγκριση με κακοήθεις νεοπλασματικές ορθοκολικού καρκινώματος.

Υλικά και Μέθοδοι

Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη τεκμηριώθηκε σύμφωνα με τα πρότυπα MIAME για πειράματα μικροσυστοιχιών.

δεδομένα Discovery

παχέος δείγματα ιστών που χρησιμοποιούνται για την ανακάλυψη βιοδεικτών συλλέχθηκαν από Genelogic Inc (Gaithersburg, MD, USA) από τους ασθενείς οι οποίοι έδωσαν γραπτή συγκατάθεση σύμφωνα με τα πρότυπα ηθικής ορίζονται από ανεξάρτητη επιτροπή δεοντολογίας που αποτελείται από επιστήμονες και βιοηθικής που δεν ήταν υπάλληλοι του Gene Logic. Κάθε όργανο που παρέχονται δείγματα ιστού για να GeneLogic λαμβάνονται εν επιγνώσει συναίνεση από κάθε δότη ή, κατά περίπτωση, του εξουσιοδοτημένου αντιπροσώπου τους, και πληρούν τις απαιτήσεις της σχετικής Διοικητικού Institutional Review και όλους τους ισχύοντες νόμους, γονιδιακή έκφραση προφίλ δεδομένων μετριέται σε 548 παχέος δείγματα ιστού χρησιμοποιώντας Affymetrix HGU133A & amp? chips HGU133B γονίδιο (44.928 probesets συνδυασμένη) (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) και τα συνοδευτικά κλινικά δεδομένα αγοράστηκε από GeneLogic Inc. Πειραματικές και κλινικές περιγραφείς δόθηκαν για όλα τα αρχεία δεδομένων τσιπ εκτός από αρχειοθετημένα ψηφιακά εικόνες μικροσκοπίας των ιστολογικών παρασκευασμάτων. Πριν από τη διεξαγωγή της έρευνας ανακάλυψη χρήση αυτών των δεδομένων, αυστηρές δοκιμές ποιοτικού ελέγχου εφαρμόστηκε σε αυτά τα δεδομένα. Ένα σύνολο 454 μικροσυστοιχίες πληρούνται οι απαιτήσεις ποιοτικού ελέγχου και κρίθηκαν κατάλληλα για την έρευνα αυτή ανακάλυψη. Περαιτέρω λεπτομέρειες σχετικά με τις διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου που εφαρμόζονται σε αυτά τα δεδομένα εκ νέου παρέχονται σε Στήριξη Πληροφορίες S1 Ανάλυση Ποιοτικού Ελέγχου. Περιγραφή των φαινοτύπων ιστού για αυτά τα δεδομένα ανακάλυψη παρουσιάζεται στον Πίνακα 3 με ανάλυση φαινότυπο καρκίνου στον Πίνακα 4.

Η

πρότυπα έκφρασης φαινοτύπου-ειδικών

Εκτός από την τυπική απόκλιση ανάλυση της έκφρασης, παρουσιάσαμε μια αναλυτική τεχνική σχεδιαστεί για να φιλτράρουν διαφορικά εκφρασμένων υποψήφιοι probeset για μεταγραφές που υποθέσαμε ήταν ποιοτικά «γύρισε-on» στην τάξη ένα φαινότυπο και ποιοτικά «γύρισε-off» σε ένα φαινότυπο σύγκρισης. Για αυτή τη μέθοδο, η ταυτοποίηση των γονιδίων «off» βασίσθηκε στην σχετικά απλή υπόθεση ότι τα περισσότερα γονίδια σε έναν δεδομένο ιστό ήταν

δεν

εκφράζουν συντακτικά ανωτέρω ονομαστικό σχετικά χαμηλό επίπεδο υποβάθρου. Κατά συνέπεια, μια μικροσυστοιχία έχουν σχεδιαστεί να υβριδοποιούνται με το πλήρες ανθρώπινο μεταγραφικό ως εκ τούτου δεν θα πρέπει να παρουσιάζουν μεταγραφής ειδικής δέσμευσης για τις περισσότερες probesets σε ένα δεδομένο πείραμα. Αντίθετα, η ένταση φθορισμού των probesets που υβριδοποιήθηκε με το υπόλοιπο του μη εξέφρασε μεταγραφές θα πρέπει να αντικατοπτρίζει «μη ειδικό» υβριδοποίηση probeset-απομαγνητοφώνηση. Η υπόθεση ότι ένα μεγάλο κλάσμα των probesets για οποιοδήποτε δεδομένο πείραμα δεν ήταν μεταγραφής-ειδικά σήματα που παρέχονται μέσα για να εκτιμηθεί μια θεωρητική on /off όριο για τα γονίδια σε πειράματα πλήρους γονιδιώματος, όπως χρησιμοποιείται εδώ για την ανακάλυψη. Το μέσο επίπεδο έκφρασης για όλους τους 44.928 probesets στα 454 μικροσυστοιχίες ανακάλυψη ήταν κατετάγη και η αξία probeset που αντιστοιχεί στο 30

ου αξία εκατοστημόριο σε όλη τη δεδομένων επιλέχθηκε ως όριο για τη μεταγραφική σιωπή. Το όριο αυτό αντιπροσωπεύει μια συντηρητική ανώτατα όρια εκτίμηση των μη ειδικών ή φόντο έκφραση

Εκκαθάριση δεδομένων:. Δείγματα ιστών

Για όλους τους (δηλαδή έλεγχος υποθέσεων) πειράματα επικύρωσης, ανεξάρτητα συλλέγονται δείγματα νωπού κατεψυγμένου ιστού ελήφθησαν από ένα τριτοβάθμιο νοσοκομείο παραπομπής τράπεζα ιστών (Flinders Medical Centre, Αδελαΐδα, SA Αυστραλία). Μια περιγραφή των περιπτώσεων που χρησιμοποιούνται για τις δοκιμές επικύρωσης παρουσιάζεται στον Πίνακα 3. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Επιτροπή Έρευνας και Δεοντολογίας του επαναπατρισμού Γενικού Νοσοκομείου και στην επιτροπή δεοντολογίας του Flinders Medical Centre. Γραπτή συγκατάθεση του ασθενούς ελήφθη για κάθε ιστό που μελετήθηκαν. Χειρουργικά δείγματα συλλέχθηκαν και επεξεργάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]

Εκκαθάριση δεδομένων:. Προσαρμοσμένη σχεδιασμός μικροσυστοιχιών

Για να ελέγξετε τις πολλές υποθετικές βιοδείκτες γονίδιο που προσδιορίζονται από την ανακάλυψη των αναλύσεων, ειδικά σχεδιασμένα μικροσυστοιχιών, η «Adenoma βιοδεικτών Gene Chip», κατασκευάστηκε (Affymetrix). Η συστοιχία Adenoma βιοδεικτών Gene Chip συμπεριλάβει όλες τις probesets HGU133-Α /Β που προσδιορίζονται κατά τη διάρκεια της ανακάλυψης, καθώς και probesets εξόνιο επιπέδου που δεν ήταν διαθέσιμα κατά το χρόνο της αρχικής άσκησης ανακάλυψη. Κάθε probeset HGU133 ανακάλυψη σχετικά με το αδένωμα βιοδεικτών Gene Chip ήταν σχολιασμένη σε ένα ή περισσότερα σύμβολα ανθρώπινο γονίδιο με βάση την NCBI εργαλεία σχολιασμού (NCBI36 /hg18) και αυτά τα σύμβολα γονιδίου στη συνέχεια ανάστροφα πίσω στο εξώνιο επίπεδο probesets σχεδιάστηκε από Affymetrix για την HuGene ST 1.0 GeneChip. Το έθιμο των μικροσυστοιχιών περιλαμβάνονται «τέλεια-match» probesets μόνο

Εκκαθάριση δεδομένων:. RNA Extraction

Μια φαινοτυπική ανάλυση των ιστών που χρησιμοποιούνται για τις δοκιμές επικύρωσης παρουσιάζεται στον Πίνακα 3. Το RNA που εξάγεται από κατεψυγμένο ιστό δείγματα χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen, San Diego USA), όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. Εν συντομία, κατεψυγμένα ιστοί ομογενοποιήθηκαν σε 300 μL του αντιδραστηρίου ΤπζοΙ χρήση ενός τροποποιημένου τρυπάνι Dremel και αποστειρωμένα γουδοχέρια μιας χρήσης. 200 μL του αντιδραστηρίου ΤπζοΙ προστέθηκαν στο ομογενοποίημα και τα δείγματα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου (RT: 25C) για 10 λεπτά. 100 μL (% ν /ν) προστέθηκε στην συνέχεια χλωροφόρμιο, τα δείγματα ανακινήθηκαν για 15 δευτερόλεπτα, και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 3 λεπτά.