Αφηρημένο

Μια σιελογόνους πλούσια σε προλίνη πεπτίδιο των 1932 Da έδειξε μια δοσοεξαρτώμενη ανταγωνιστική επίδραση στην κυτταροπλασματική Ca

2+ κινητοποίηση που προκαλείται από την προγεστερόνη σε μια γλώσσα πλακωδών κυττάρων καρκινώματος γραμμή. Μελέτες δομής-δραστικότητας έδειξαν ότι η δραστικότητα του πεπτιδίου έγκειται στο Ο-τερματική περιοχή χαρακτηρίζεται από ένα τέντωμα προλίνη πλαισιώνεται από βασικά υπολείμματα. Επιπλέον, η έλλειψη δραστικότητας του πεπτιδίου αναλόγου οπισθο-ανάστροφο πρότεινε τη συμμετοχή των στερεο αναγνώρισης. Φασματομετρία μάζας με βάση ανάλυση κυνηγετικό όπλο, σε συνδυασμό με κηλίδωση Western και δοκιμές βιοχημικά δεδομένα που λαμβάνονται με τον αναστολέα AG205 προγεστερόνης υποδοχέα μεμβράνης Συστατικό 1 (PGRMC1), έδειξε ισχυρή απόδειξη ότι p1932 εκτελεί ρυθμιστική δράση της μέσω αλληλεπίδρασης με τον PGRMC1 υποδοχέα προγεστερόνης, η οποία είναι κατά κύριο λόγο που εκφράζεται σε αυτή την κυτταρική γραμμή και, σαφώς, παίζει ένα ρόλο στην προγεστερόνη επαγόμενη Ca

2+ απόκριση. Έτσι, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν p1932 ως ρυθμιστής του μονοπατιού μεταγωγής σήματος που προκαλείται από αυτή την πρωτεΐνη και, δεδομένης μια καθιερωμένη συμμετοχή των PGRMC1 στην ογκογένεση, υπογραμμίζουν μια πιθανή θεραπευτικό δυναμικό του p1932 για τη θεραπεία του καρκίνου του στόματος.

Παράθεση: Palmerini CA, Mazzoni Μ, Radicioni G, Marzano V, Granieri L, Iavarone F, et al. (2016) ανταγωνιστική δράση ενός σιελογόνων Proline-Rich πεπτιδίου στην Κυτοσολικά Ca

2+ Κινητοποίηση Induced από προγεστερόνη στο Προφορική κύτταρα καρκίνο εκ πλακωδών. PLoS ONE 11 (1): e0147925. doi: 10.1371 /journal.pone.0147925

Επιμέλεια: Alessandro Datti, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Καναδάς

Ελήφθη: 27 του Απρίλη 2015? Αποδεκτές: 11 Γενάρη 2016? Δημοσιεύθηκε: 27, Γενάρη 2016

Copyright: © 2016 Palmerini et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι μέσα στο χαρτί. Τα αρχεία που αφορούν τα επεξεργαστεί μάζας αποτελέσματα φασματομετρία αναφέρονται στο χειρόγραφο διατηρείται σε μέσα ηχογραφήσεις μας

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από Nando Ίδρυμα Peretti, Καθολικό Πανεπιστήμιο της Ρώμης, του Πανεπιστημίου του Κάλιαρι, MIUR και Regione Sardegna, σύμφωνα με προγράμματά τους επιστημονικών διάχυσης. Το έργο υποστηρίζεται επίσης από FaReBio dQ 2012 του έργου CNR. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το σάλιο είναι ένας μεικτός ρευστό, η οποία εκκρίνεται από τα μείζονα και ελάσσονα σιελογόνων αδένων που βρίσκονται στη στοματική κοιλότητα [1], και ασκεί διάφορες προστατευτικές λειτουργίες του πεπτικού και [2]. Αυτές οι λειτουργίες που συνδέονται με το σάλιο δυναμική σύνθεση [3, 4], και για το λόγο αυτό, έχουν σημαντικές προσπάθειες έχουν αφιερωθεί στον ορισμό των σιελογόνων πρωτεώματος [5] με περισσότερα από 2500 διαφορετικές πρωτεΐνες ήδη εντοπισθεί [6]. Αυτά μπορούν να χωριστούν σε πρωτεΐνες που εκκρίνονται από τους σιελογόνους αδένες, οι οποίες περιλαμβάνουν 400-500 συνιστώσες που αντιστοιχούν σε περίπου 90% του συνολικού βάρους των σιελογόνων πρωτέωμα, και πρωτεΐνες που προέρχονται από άλλες πηγές (πάνω από 2000), τα οποία αντιστοιχούν σε λιγότερο από το 10%.

Οι πρωτεΐνες και τα πεπτίδια που προέρχονται από την έκκριση των σιελογόνων αδένων περιλαμβάνουν μουκίνες, α-αμυλάσες, histatins, σταθερίνη, πεπτίδιο ΡΒ, S-κυστατίνες, λιπάσες, λιπίδιο μεταφορέα (λιποκαλίνης), και πλούσια σε προλίνη πρωτεΐνες (PRPs), διαιρούμενο σε όξινο (aPRPs), βασικές (bPRPs) και γλυκοζυλιωμένη βασικό (gPRPs) [4]. Η απόδοση ειδικών λειτουργιών στις ποικίλες συνιστώσες και τις οικογένειες είναι απαιτητική, πιθανώς επειδή κάθε οικογένεια ασκεί πολλαπλές και ολοκληρωμένες λειτουργίες, και επειδή οι πρωτεΐνες σιελογόνων είναι τυχαία διεσπαρμένα σε διάλυμα [7-11].

bPRPs, το προϊόν έκφρασης τεσσάρων πολλαπλών αλληλόμορφων loci ονομάζεται PRB1-4, είναι μια πολύ ετερογενής οικογένεια πεπτιδίων οφείλεται σε εκτεταμένη πολυμορφισμούς, εναλλακτικό μάτισμα και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Μετά την έκκριση, bPRPs μερικώς διασπάται σε μικρότερα πεπτίδια που κυμαίνονται από 8 έως 25 υπολείμματα αμινοξέων από διάφορες εξωγενείς πρωτεάσες [12]. Αυτά τα πεπτίδια έχουν περίεργη πρωτογενείς αλληλουχίες που συχνά επικαλύπτονται μεταξύ τους δημιουργώντας ένα ευρύ σύνολο παρόμοιων μορίων, σε ορισμένες περιπτώσεις, μόνο που διαφέρουν κατά ένα υπόλειμμα.

Ένα από αυτά τα πεπτίδια (1932 Da, p1932) κατοχυρώθηκε με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας για του ισχυρή αντι-ιική δράση [ΡΟΤ /IB2012 /050415] και πρόσφατα βρέθηκε να εσωτερικοποιείται εντός του στοματικού βλεννογόνου κύτταρα [13]. Αρκετά πειράματα πραγματοποιήθηκαν με σκοπό την αξιολόγηση βιολογικές επιδράσεις του πεπτιδίου αποδεικνύεται επιρροή της στην ομοιόσταση του ασβεστίου μέσα στα κύτταρα. Η διαμόρφωση της κυτοσολικής Ca

2 + συγκέντρωση ([Ca

2 +]

γ) είναι ένα σημαντικό γεγονός που συνέβη σε ένα κύτταρο από το Ca

2+ συγκέντρωση μεσολαβεί πολλές βιολογικές εκδηλώσεις, όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό , τη διαφοροποίηση, τον μεταβολισμό, τη σύσπαση των μυών, την απόπτωση και ανοσολογική απόκριση [14], καθώς και η εξωκυττάρωση των συναπτικών κυστιδίων στην απελευθέρωση των νευροδιαβιβαστών [15].

ομοιόστασης ασβεστίου στα κύτταρα των θηλαστικών είναι ένα πολύπλοκο φαινόμενο και τα αποτελέσματα από την ισορροπία μεταξύ ενδοπλασματικό δίκτυο καταστημάτων ασβέστιο και ανταλλαγές ιόντων με το εξωκυτταρικό μέσο. Η προγεστερόνη, μέσω γονιδιωματική και μη γονιδιωματικών επιδράσεων, παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, την ανάπτυξη και τη συντήρηση των γυναικείων αναπαραγωγικών ιστών. Επιπλέον, η ορμόνη μπορεί να επηρεάσουν τη φυσιολογία του εγκεφάλου και του νευρικού συστήματος, που βασίζεται στη λειτουργία του ως νευροστεροειδούς επηρεάζουν την επιβίωση των κυττάρων και την ανάπτυξη [16, 17]. Η διαμόρφωση της ομοιόστασης ασβεστίου που προωθείται από την προγεστερόνη γενικά ρυθμίζεται μέσω μη γονιδιωματικών μηχανισμών που περιλαμβάνουν διαφορετικούς τύπους υποδοχέων της προγεστερόνης [18, 19]. Είναι ενδιαφέρον, θα πρέπει να σημειωθεί ότι η ορμόνη είναι παρούσα στο σάλιο σε ελεύθερη μορφή [20].

Εδώ, περιγράφουμε ότι p1932 έχει ανταγωνιστική δράση στην κυτοσολικό Οα

2+ κινητοποίηση που προκαλείται από την προγεστερόνη σε ένα ανθρώπινο πλακωδών κυττάρων καρκινώματος γραμμή κυττάρων γλώσσα (PE /CA-PJ15). Επιπλέον, θα παρέχει ισχυρές ενδείξεις ότι ο ρυθμιστικό ρόλο του p1932 ενεργοποιείται μέσω του υποδοχέα PGRMC1, όπως φαίνεται από συγκριτικές μελέτες έκφρασης πρωτεΐνης και βιοχημικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν με την παρουσία του AG-205, ένας ειδικός αναστολέας του PGRMC1 χρησιμοποιούνται μόνα τους και σε συνδυασμό με p1932 . Τα αποτελέσματα αυτά, αναδεικνύουν νέες προοπτικές πάνω από τις λειτουργικές επιπτώσεις των σιελογόνων πλούσια σε προλίνη πεπτίδια στα συστήματα των καρκινικών κυττάρων που εκτίθενται σε συγκεκριμένες σεξουαλικές ορμόνες.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά

Φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα Φυσιολογικός ορός (PBS) και θρυψίνη-EDTA είναι προϊόντα EuroClone (Padua, Ιταλία). Εμβρύου ορό μόσχου (FCS), αντιβιοτικά (πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη), L-γλουταμίνη, Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), Iscove τροποποιημένο Μέσο Dulbecco (IMDM), Fura 2-ΑΜ (Fura 2-ακετοξυ-μεθυλ-εστέρας), διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), KCl, MgCl

2, γλυκόζη, Hepes, NaCl, CaCl

2, EGTA (αιθυλενο glicol-δις (2-αμινο-αιθυλαιθέρα) -Ν, Ν, Ν ‘, Ν’-τετρα -οξικό οξύ), η προγεστερόνη (Ρ4), δεοξυχολικό οξύ, Nonidet Ρ-40 (ΝΡ-40), EDTA (2 – ({2 [δις (καρβοξυμεθυλ) αμινο] αιθυλ} (καρβοξυμεθυλ) αμινο) οξικό οξύ), Tween- 20 και AG-205, αγοράστηκαν από την Sigma (Μιλάνο, Ιταλία).

τα πεπτίδια σύνθεση

p1932, RI-p1932 και θραύσματα F (MER 1-8), C (MER 1- 17des Pro), Ε (MER 1-11), Β (MER 1-17) και D (MER 12-20) έχουν συναρμολογηθεί επί ενός Applied Biosystem 433Α Peptide Synthesizer (Foster City, CA, USA) σε ένα προεγκατεστημένο προλίνη-2 -chlorotrityl ρητίνη (Novabiochem, Laufelfingen, CH) μετά την Fmoc- (Να-9-φθορενυλμεθυλοξυκαρβονυλ) πρωτόκολλο για σταδιακή πεπτιδική σύνθεση στερεάς φάσης [21]. Fmoc-αμινοξέα ήταν από την Novabiochem

Όλες οι ζεύξεις πραγματοποιήθηκαν με 5-πλάσια περίσσεια του ενεργοποιημένου αμινοξέος με την παρουσία 10 ισοδυνάμων Ν-αιθυλδιϊσοπροπυλ αμίνη, χρησιμοποιώντας Ν -. [(Διμεθυλαμινο) -1-Η- 1, 2, 3-τριαζολο- [4, 5-β] πυριδινο-1-υλομεθυλενο] -Ν-μεθυλομεθαναμινίου εξαφθοροφωσφορικό Ν-οξείδιο (HATU, ΡΕ Biosystems, Inc., Warrington, UK) ως παράγοντα ενεργοποιήσεως για την καρβοξυ ομάδα. Στο τέλος της διάταξης πεπτιδικής αλυσίδας, το πεπτίδιο διασπάστηκε από τη ρητίνη με κατεργασία με ένα μίγμα από 80% τριφθοροοξικό οξύ, 5% νερό, 5% φαινόλη, 5% θειοανισόλη, 2,5% αιθανοδιθειόλη και 2,5% τριισοπροπυλοσιλάνιο για 3 ώρες (αίθουσα θερμοκρασία), με ταυτόχρονη αποπροστασία πλευρικής αλυσίδας. Μετά από διήθηση της ρητίνης, το πεπτίδιο καταβυθίστηκε σε ψυχρό τριτ.-βουτυλομεθυλαιθέρα. Μετά από φυγοκέντρηση και πλύση με tert-βουτυλομεθυλαιθέρα το πεπτίδιο αιωρήθηκε σε 5% υδατικό οξικό οξύ και λυοφιλοποιήθηκε. Αναλυτική και ημιπαρασκευαστική αντίστροφης φάσης υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία (RP-HPLC) διεξήχθη σε ένα σύστημα Tri Rotar-VI HPLC εφοδιασμένο με ανιχνευτή πολυκαναλικό MD-910 για αναλυτικούς σκοπούς ή με ένα μεταβλητό ανιχνευτή υπεριώδους Uvidec-100-VI για παρασκευαστική σκοπό (όλα από την JASCO, Tokyo, Japan). Αναλυτική RP-HPLC εκτελέστηκε σε μία Jupiter 5 μm C18, 300 Α στήλη (150 χ 4,6 mm, Phenomenex, Torrance CA, USA). Ημιπαρασκευαστική RP-HPLC πραγματοποιήθηκε ένα Jupiter 10 μm C18 300 Α (250 χ 21,2 mm, που Phenomenex, Torrance CA, USA). Γραμμικές κλίσεις ακετονιτριλίου σε υδατικό 0,1% TFA (ο /ο) χρησιμοποιήθηκαν για την έκλουση δεσμευμένου πεπτιδίου. MALDI-TOF ανάλυση φασματομετρίας μάζας πραγματοποιήθηκαν σε ένα σταθμό εργασίας Autoflex (Bruker Daltonics, της Βρέμης, DE) επιβεβαιώνοντας τη θεωρητική μάζα του πεπτιδίου.

Ανθρώπινο PE /CA-PJ15 κυτταρική σειρά

PE /κύτταρα CA-PJ15 (ECACC, 96121230, Porton Down, UK) [22] καλλιεργήθηκαν (37 ° C, 5% CO

2) σε μέσο ΙΜϋΜ, που περιέχει 2 mM γλουταμίνη και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (100 U /mL το καθένα ), συμπληρωμένο με 10% απενεργοποιημένο FCS. Τα κύτταρα υποκαλλιεργήθηκαν κάθε τέσσερα ημέρα πριν καταστεί πλήρως συρρέοντα.

Προσδιορισμός της κυτοσολικής συγκέντρωσης Ca

2+

FURA-2 ΑΜ (2 μΙ ενός 2 mM διάλυμα σε DMSO) προστέθηκε σε 1 mL ΡΕ /CA-PJ15 αιωρήματα (περίπου 10 χ 10

6 κύτταρα) που ελήφθη μετά την επεξεργασία με θρυψίνη 0,05% και επωάζονται επί 60 λεπτά στους 37 ° C, στο σκοτάδι. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 800 GX 10 λεπτά και τελικά εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό HBSS ρΗ 7,4 (140 mM NaCl, 5,3 mM ΚΟΙ, 1 mM MgCl

2, 1 mM ΟαΟ

2, 5 mM γλυκόζη, 25 mM Hepes, ρυθμισμένο σε ρΗ 7.4) σε τελική συγκέντρωση κυττάρων 1 χ 10

6 mL

ένα κλάσμα αυτού του εναιωρήματος (1 mL) στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 800g χ 5 λεπτά, μετά την οποία τα κύτταρα /. συλλέχθηκαν και εναιωρήθηκαν σε 3 κ.εκ. χωρίς ασβέστιο HBSS ρΗ 7,4 (140 mM NaCl, 5 mM ΚΟΙ, 1 mM MgCl

2, 5 mM γλυκόζη, 25 mM HEPES, 0,1 mM EGTA) πριν από την φθορισμομετρική μετρήσεις. Ο φθορισμός μετρήθηκε με ένα Perkin-Elmer LS φασματοφωτομέτρου φθορισμού 50 B εξοπλισμένο με ένα διπλό σύστημα διέγερσης (ex. 360 και 380 nm, em. 510 nm). Σχισμής πλάτη καθορίστηκαν σε 1,5 nm για διέγερση και 3 nm για εκπομπή. Οι συγκεντρώσεις το κυτοσολικό ασβέστιο ([Ca

2+] c υπολογίστηκαν όπως αναφέρθηκε [23].

πρωτεομική ανάλυση των υποδοχέων προγεστίνης σε κύτταρα PJ15

εκχυλίσματα πρωτεΐνης ελήφθησαν με κυτταρική λύση με 50 mM Tris-HCl ρΗ 8, 150 mM NaCl, 0.5% δεοξυχολικό οξύ, 0.1% SDS, 1% ΝΡ-40, 1 mM EDTA ρΗ 8 συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης (ρυθμιστικό RIPA). οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε SDS-πολυακρυλαμιδίου και, μετά κολλοειδές Coomassie brilliant blue χρώση, συγκροτήματα γέλη ενδιαφέροντος αποκόπηκαν, αποχρωματίζονται με 25 mM ΝΗ

4HCO

3 /ΑΟΝ 1: 1 (ν /ν), αφυδατωμένο με 100% ACN, ανάγεται με 10 mM ϋΤΤ σε 25 mM ΝΗ

4HCO

3 και αλκυλιώνονται με 55 mM ΙΑΑ σε 25 mM ΝΗ

4HCO

3. Μετά την πλήρη αφυδάτωση, ένα διάλυμα από 0,02 μg /μL θρυψίνη σε 25 mM ΝΗ

4HCO

3 προστέθηκε, και οι πρωτεΐνες υπέστησαν πέψη στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Η αντίδραση διακόπηκε με την προσθήκη ΤΡΑ σε τελική συγκέντρωση 0,1%. Τα υπερκείμενα που περιέχουν θρυπτικά πεπτίδια συνελέγησαν μαζί με θραύσματα πεπτίδιο εκχυλίζεται από τη γέλη με 100% ACN /0.1% TFA σε νερό 3: 2 (ν /ν). Τρυπτικά πεπτίδια αναλύθηκαν με υγρή χρωματογραφία-ιονισμού ηλεκτροψεκασμού-διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC-ESI-MS /MS) σε ένα Ultimate 3000 συσκευή Micro HPLC (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) εφοδιασμένο με μία μονάδα διαχειριστής FLM-3000-Flow άμεσα συνδέεται με ένα LTQ Orbitrap XL υβρίδιο φασματόμετρο μάζας FT (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, USA). Η χρωματογραφία αντίστροφης φάσης πραγματοποιήθηκε σε ένα Jupiter C18, 5 μm, 300 Α, 150 χ 1.0 mm στήλη (Phenomenex, Torrance, CA, USA) και μια 95 min τρέξιμο (κλίση 1,6 σε 44% ακετονιτρίλιο σε νερό με 0.1% μυρμηκικό οξύ πάνω από 60 min) σε ρυθμό ροής 80 μL /min. Μαζικές φασματομετρικές μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν με τον τρόπο θετικού ιόντος με θερμοκρασία τριχοειδή 250 ° C, ροή αερίου θήκη 40 αυθαίρετες ενοτήτων, μια πηγή τάσης 3,6 kV και τριχοειδή τάση 48 V. Τα φάσματα μάζας συνελέγησαν σε FT-IT δεδομένα λειτουργίας εξαρτάται σάρωσης (MS σάρωση σε 60000 του ψηφίσματος στο Orbitrap και MS /MS σαρώσει στις τρεις πιο έντονες κορυφές στην παγίδα ιόντων). ταυτοποιήσεις πρωτεΐνης ελήφθησαν με το ενσωματωμένο λογιστικό ιόντων αλγόριθμο (Sequest ΗΤ) του λογισμικού Proteome Discoverer (έκδοση 1.4, Θέρμο) και ψάχνοντας μια ανθρώπινη βάση δεδομένων (UniProtKB /Swiss-Prot πρωτεΐνης Γνωσιακή, αφήστε 2013_09 18-Sep-13 που περιέχει 540.958 ακολουθία εγγραφές? περιορισμούς ταξινόμησης: Homo sapiens, 20.271 καταχωρήσεις ακολουθία). Οι παράμετροι αναζήτησης ήταν 10 ανοχή ppm για πρόδρομα ιόντα και 0,8 Da για ιόντα του προϊόντος, 1 χαμένο διάσπαση, carbamydomethylation της κυστεΐνης ως πάγια τροποποίηση, την οξείδωση της μεθειονίνης ως μεταβλητή τροποποίηση και ψευδώς θετικό ποσοστό κάτω του 5% που υπολογίζεται σε μια αναζήτηση της βάσης δεδομένων δολωμάτων.

υποδοχέα προγεστίνης κηλίδωση Western

η συγκέντρωση πρωτεΐνης του προϊόντος λύσης κυττάρου προσδιορίστηκε με την Protein Bio-Rad Δοκιμασία (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). μεμβράνες πλάσματος παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24] με μικρές τροποποιήσεις. Τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης (50 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 0,1 Μ NaCl, 1 mM EDTA) που περιέχει 1% κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma-Aldrich) με Dounce ομογενοποιητή (30 κινήσεις). Το ομογενοποίημα φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στα 2000 g και 4 ° C, που ακολουθείται από φυγοκέντρηση του υπερκειμένου στα 100.000 g για 1 ώρα στους 4 ° C για να σφαιροποιηθούν μεμβράνες του πλάσματος, η οποία επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris-HCl ρΗ 8,0 , 1 mM EDTA, 1% SDS, 1 mM DTT, και αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ). Η ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης 2-D Quant Kit (GE Healthcare, Uppsala, Σουηδία). Οι πρωτεΐνες φορτώθηκαν και διαχωρίστηκαν σε πηκτές SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι κηλίδες μπλοκαρίστηκαν σε ένα διάλυμα μπλοκαρίσματος (PBS, 0,1% Tween-20, 5% (w /v) σκόνη άπαχου γάλατος) και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα μονοκλωνικά πρωτογενή αντισώματα εξής ποντικού: αντι-PGRMC1 (κλώνος C-3 , Santa Cruz, CA, USA), αντι-nPR (κλώνος 2C11F11, Santa Cruz), αντι-mPRα (κλώνος H-76, Santa Cruz) και αντι-β-ακτίνης (κλώνος AC-15, Sigma). Οι μεμβράνες πλύθηκαν εκτεταμένα και μετά την επώαση με ραφανιδική υπεροξειδάση (HRP), γίδινη αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού αντίσωμα (Santa Cruz) που αναπτύχθηκε με το σύστημα ECL συν χημειοφωταύγειας ανίχνευση (GE Healthcare, UK).

Στατιστική αναλύει

Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM (n) και σημαντικά επίπεδα μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν με ANOVA και-hoc μετά τη δοκιμή Scheffé. Οι τιμές Ρ κάτω από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Ανταγωνιστική δράση του πεπτιδίου p1932 για P4 επίδραση

Η πατενταρισμένη p1932 πεπτίδιο (ΝΗ

2

1GPPPQGGNK

10PQGPPPPGKPQ-PCT /IB2012 /050415) είναι ένα θραύσμα που προκύπτει από την πρωτεολυτική επεξεργασία της πλούσια σε προλίνη πρωτεΐνες PRB1-L (UniProt /Swiss-Prot, P0428), PRB-2 (P02812), PRB1- M (Q86YA1) και PRB2 (Q7M4Q5) [4]. Η αλληλουχία του p1932 επαναλαμβάνεται τέσσερις φορές σε PRP1-L και PRB2, και τρεις φορές σε PRB1-M, φέρνοντας μέση συγκέντρωση της στο ανθρώπινο σάλιο περίπου 5-10 μΜ. Παρ ‘όλα αυτά, όπως και για πολλούς άλλους σιελογόνων πεπτίδια, ο ακριβής ρόλος του p1932 σε προφορική φυσιολογία και την παθολογία είναι προς το παρόν άγνωστη. Σε μια πρόσφατη εργασία που έχουμε αποκαλύψει την ικανότητα του p1932 να εσωτερικοποιηθεί μέσα στα κύτταρα του βλεννογόνου του στόματος σε μια εποχή πάροδο λίγων λεπτών, εξάλλου έχουμε αποδείξει την έλλειψη κυτταροτοξικότητας ακόμη και σε συγκεντρώσεις πολύ υψηλότερες από αυτές που βρέθηκαν στο σάλιο για αυτό το πεπτίδιο [13] .

στην εργασία αυτή δείχνουμε για πρώτη φορά η δοσο-εξαρτώμενη επίδραση του p1932 για τη διαμόρφωση της κυτοσολικής απελευθέρωση ασβεστίου που προωθείται από την προγεστερόνη στην κυτταρική σειρά ΡΕ /CA-PJ15.

Αυτά κύτταρα, τα οποία μπορεί να θεωρηθεί ένα μοντέλο κυττάρων ανθρώπινου στοματικό καρκίνωμα [25], ήταν σκόπιμα επιλεγεί για να διερευνήσει τις πιθανές επιπτώσεις της p1932 με την παρουσία των υποδοχέων προγεστερόνης στο παρελθόν σχετίζεται με προγνωστική σημασία πάνω από το κεφάλι-και του τραχήλου [26].

Η επίδραση της Ρ4 επί των κυττάρων ΡΕ /CA-PJ15 μελετήθηκε με τη χρήση της ορμόνης με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις (5 και 10 μΜ) προκειμένου να διερευνηθούν πιθανές επιδράσεις δοσοεξαρτώμενες. Η προγεστερόνη (Ρ4) επεξεργασία των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με την απουσία εξωκυτταρικού ασβεστίου η οποία είχε προηγουμένως αφαιρεθεί με 0,1 mM EGTA 0,1 mM. Μετά από λίγα δευτερόλεπτα μετά την επεξεργασία Ρ4, μία αύξηση της [Ca

2 +]

γ μπορεί να παρατηρηθεί και στις δύο συγκεντρώσεις (Σχήμα 1). Μια τέτοια ταχεία αύξηση υποδεικνύει μια ταχεία μη γενωμική δράση της P4 [27], που μπορεί να προκαλείται από διάφορες κατηγορίες υποδοχέων προγεστερόνης, όπως την κλασική υποδοχέα πυρηνικής προγεστερόνης (NPR) σε μονομερή της μορφή (NPR-Α), η Προγεστερόνη υποδοχέα μεμβράνης Components 1 (PGRMC1), και η μεμβράνη υποδοχέα προγεστερόνης MPR [28].

το σχήμα απεικονίζει το αποτέλεσμα ενός τυπικού πειράματος. Τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό HBSS χωρίς ασβέστιο. Μετά από 250 δευτερόλεπτα για ασβέστιο προστέθηκε για να φτάσει μια συγκεντρώσεις 1 mM. Το πείραμα επαναλήφθηκε 10 φορές και μια παρόμοια συμπεριφορά παρατηρείται πάντοτε. Ένθετο: μέγιστη αύξηση του [Ca

2+] c, αναφέρονται ως Δ [Ca

2+] c, μετά την προσθήκη αυξανόμενων ποσοτήτων προγεστερόνης. Τα αποτελέσματα που δείχνονται αντιστοιχούν στα μέσα ± SEM 10 πειραμάτων. ANOVA. Επιδράσεις λόγω προγεστερόνη εν απουσία ασβεστίου: p & lt? 0,0001, και υπό την παρουσία 1 mM ασβεστίου: όχι σημαντική (δεν φαίνεται στο ένθετο). Post-hoc: τεστ του Scheffe σ επίπεδο 0,05. Οι αστερίσκοι φαίνονται στατιστική σημαντικότητα.

Η

Η [Ca

2 +]

αύξηση γ εξαρτάται από τη συγκέντρωση της προγεστερόνης, και στο ένθετο του σχήματος 1, οι επιπτώσεις της Ρ4 σε [Ca

2 +]

γ αναφέρονται ως Δ [Ca

2 +]

γ (nM). Στατιστική ανάλυση επιβεβαίωσε την επίδραση της αύξησης δόσεων προγεστερόνης στο [Ca

2 +]

C σε συνθήκες χωρίς ασβέστιο (ρ & lt? 0,0001). Όταν 1 mM Ca

2+ προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας, μια περαιτέρω αύξηση του [Ca

2 +]

C παρατηρήθηκε (Σχήμα 1), και οι δύο με την απουσία και παρουσία της προγεστερόνης, προς 42 ± 3 ηΜ (μέση τιμή 10 ± προσδιορισμών SEM). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι [Ca

2 +]

γ αλλαγές κατά P4 ερέθισμα εξαρτώνται κυρίως από την απελευθέρωση του Ca

2 + από ενδοκυτταρικά αποθέματα, σε συμφωνία με τα προηγούμενα ευρήματα [29]. Σε αυτό το πλαίσιο, η γραμμική σχέση παρατηρείται μεταξύ [Ca

2 +]

αύξηση c και δόση P4, είναι πιθανό ενδεικτικό της έχουν άμεσο αντίκτυπο, αποκλείοντας έτσι μη ειδικά αποτελέσματα P4 στις κυτταρικές μεμβράνες που, τελικά, θα οδηγούν σε ενδοκυτταρική αυξήσεις ασβέστιο [30]. Στα ακόλουθα πειράματα p1932 πεπτίδιο χρησιμοποιήθηκε σε μια χαμηλότερη συγκέντρωση (1.700 ηΜ) σε σχέση με αυτή που βρίσκεται στο σάλιο (5-10 μΜ), λαμβάνοντας υπόψη ότι σε φυσιολογικές συνθήκες, δεν είναι όλα τα κλάσμα σιελογόνους πεπτιδίου p1932 είναι σε επαφή με βλεννογόνου κελιά ταυτόχρονα.

σιελογόνων p1932 πεπτίδιο μόνο (1700 nM) δεν είχε επιπτώσεις στην [Ca

2 +]

γ στα κύτταρα ΡΕ /CA-PJ15, είτε σε περίπτωση απουσίας ή με την παρουσία του Ca

2+ στο μέσο. Ωστόσο, όταν προστίθεται 2 λεπτά πριν από τη θεραπεία Ρ4 σε συνθήκες χωρίς ασβέστιο, p1932 σβήστηκε εντελώς την επίδραση των αποτελεσμάτων της προγεστερόνης (τόσο στα 5 και 10 μΜ συγκεντρώσεις) (Σχήμα 2, ένθετο). Επιπλέον, παρατηρήσαμε μια δοσο-εξαρτώμενο αποτέλεσμα όταν το πεπτίδιο p1932 σιελογόνων δοκιμάστηκε σε διάφορες συγκεντρώσεις στην περιοχή 17 έως 1700 ηΜ (Σχήμα 3). Ειδικότερα, η κατά ανασταλτικά αποτελέσματα προγεστερόνης μεσολάβηση (5-10 μΜ) ήταν ουσιαστικά γραμμική μέχρι την υψηλότερη συγκέντρωση (1700 ηΜ) του πεπτιδίου που χρησιμοποιείται.

Το σχήμα απεικονίζει το αποτέλεσμα ενός τυπικού πειράματος. Τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό HBSS χωρίς ασβέστιο. Το πεπτίδιο (1,700 ηΜ) προστέθηκαν δύο λεπτό πριν προγεστερόνη (10 μΜ). Μετά 250 s ασβεστίου προστέθηκε για να φτάσει μια συγκεντρώσεις 1 mM. Ένθετο: μέγιστη αύξηση του [Ca

2 +]

γ, αναφέρονται ως Δ [Ca

2 +]

c, μετά την προσθήκη αυξανόμενων ποσοτήτων προγεστερόνης. Τα αποτελέσματα που δείχνονται αντιστοιχούν στα μέσα ± SEM 10 πειραμάτων ANOVA. Επιδράσεις λόγω προγεστερόνη εν απουσία ασβεστίου: p & lt? 0,0001 και υπό την παρουσία 1 mM ασβεστίου: όχι σημαντική (δεν φαίνεται στο ένθετο).

Η post-hoc

: δοκιμή Scheffe κατά σ επίπεδο 0,05. Οι αστερίσκοι φαίνονται στατιστική σημαντικότητα.

Η

Μετά από 120 δευτερόλεπτα μετά από του την προσθήκη του πεπτιδίου (17 έως 1.700 ηΜ), η προγεστερόνη (10 μΜ [μαύρα τετράγωνα] ή 5 μΜ [λευκά τετράγωνα]) επίσης διανεμήθηκε . Δεδομένων (αναφέρονται ως Δ [Ca

2 +] γ) αναφέρουν τα μέσα ± SEM 10 πειραμάτων ANOVA. Επιδράσεις της προγεστερόνης: p & lt? 0.001 και της συγκέντρωσης του πεπτιδίου: ρ. & Lt? 0.001

Η

Για να καθοριστούν οι ελάχιστες διαρθρωτικές απαιτήσεις για να εκφράσει την ανταγωνιστική δράση, συνθέσαμε διαφορετικά τμήματα του p1932, και εκτελούνται πειράματα σε 1700 ηΜ να διερευνηθεί η σχέση μεταξύ των αλληλουχιών θραύσματος και βιολογική δραστικότητα. Τα θραύσματα C (MER 1-17 des Pro), Ε (MER 1-11), και F (MER 1-8) έδειξε μία σημαντική χαμηλότερη ανταγωνιστική δράση σε σύγκριση με το άθικτο πεπτίδιο (Σχήμα 4). Αντιστρόφως, θραύσμα Β (MER 1-17), και θραύσμα D (MER 12-20), είχε ως αποτέλεσμα τόσο ενεργή όσο πεπτιδίου p1932. Είναι ενδιαφέρον ότι η MER 1-17 des Pro θραύσμα, το οποίο δεν έχει ένα υπόλειμμα προλίνης, δεν είχε καμία ανασταλτική επίδραση υποδεικνύοντας υψηλό βαθμό εξειδίκευσης με την πιθανολογούμενη μοριακό στόχο του p1932 [31]. Τέλος, η μορφή οπισθοανάστροφο (R.I.) του p1932 όταν δοκιμάζονται επί της ηΜ περιοχή συγκεντρώσεων 17-1700, δεν έδειξε ανταγωνιστική δράση (τα δεδομένα δεν φαίνονται), γεγονός που υποδηλώνει την εμπλοκή ενός στερεοφωνικού μηχανισμό αναγνώρισης. Αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν τη σύνδεση της Ο-τερματικό τμήμα του πεπτιδίου, που περιέχει την 12-GPPPPGKPQ-20 πλούσια σε προλίνη αλληλουχία, με πλήρη ανασταλτικό αποτέλεσμα επί της [Ca

2 +]

αύξηση γ.

Μετά την προσθήκη είτε πεπτιδίου ή θραυσμάτων αυτής σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (17 – 1.700 ηΜ), 5 μΜ προγεστερόνη προστέθηκε επίσης στο μέσο καλλιέργειας ιστού χωρίς ασβέστιο. Δεδομένων (αναφέρονται ως Δ [Ca

2 +] γ), αναφέρουν τα μέσα ± SEM 10 πειραμάτων. ANOVA: Επιδράσεις του πεπτιδίου: p & lt? 0.001 και συγκέντρωσης: p & lt? 0.001. Post-hoc: (scheffée p = 0.05). Ομογενή υποσύνολα πεπτίδιο: 1. Α (p1932), Β (MER 1-17) και D (MER 12-20)? 2. C (MER 1-17 des Pro), Ε (MER 1-11) και F (MER 1-8).

Η

Ανάλυση των υποδοχέων προγεστερόνης

πρωτεομική ανάλυση των κύτταρα PJ15 έγινε προκειμένου να αποδειχθεί η παρουσία των τριών τάξεων των θεωρούμενων υποδοχέων προγεστερόνης που περιγράφονται στην βιβλιογραφία: nPR, PGRMC1 και mPRα. Μετά τη λύση των κυττάρων, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, μετά την οποία και οι πρωτεΐνες με μάζες στις περιοχές 21, 40 και 100 kDa αναλύθηκαν με LC-ESI-MS /MS. Υπό αυτές τις συνθήκες, εντοπίσαμε μόνο PGRMC1 (Πίνακας 1) (21 kDa) εις διπλούν πειράματα. PGRMC1, mPRα και έκφραση nPR επίσης εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western ανάλυση, η οποία επιβεβαίωσε ότι PGRMC1 είναι ο κύριος υποδοχέας προγεστερόνης που εκφράζεται σε PJ15 κύτταρα ΡΕ /CA. Western blots απεκάλυψε επίσης mPRα, αν και σε έναν μικρότερο βαθμό σε σύγκριση με PGRMC1 (Σχήμα 5), επιβεβαιώνοντας έτσι προηγούμενες αξιολογήσεις συνανοσοκαθίζηση γεγονός που υποδηλώνει ότι, πιθανόν, PGRMC1 και mPRα συνδέονται λειτουργικά [32]. Αντίθετα, ο υποδοχέας nPR δεν είχε εντοπιστεί, σε συμφωνία με τα δεδομένα της Lukits και Coll. λαμβάνονται με την ίδια κυτταρική γραμμή (Πίνακας 1 και Σχήμα 5) [26]

Εισηγμένες είναι οι ακόλουθες παραμέτρους πρωτεΐνης:. αλφαριθμητικό μοναδικό αναγνωριστικό αλληλουχίας της πρωτεΐνης (Προσχώρηση), χαρακτήρες αναγνωριστικό πρωτεΐνη με μια σύμβαση ονομασίας (ονομασία Έναρξη) , το όνομα Gene και το όνομα της πρωτεΐνης (Περιγραφή) που παρέχονται από UniProtKB πρωτεΐνη γνώσεων? Το υπολογισμένο μοριακό βάρος της πρωτεΐνης σε μονάδες kilo-Dalton (MW), η θεωρητικώς υπολογισθείσα ισοηλεκτρικό σημείο (ρΐ cal.) και ο αριθμός πρωτεΐνη των αμινοξέων (# AAS)? Σκορ SEQUEST HT αναγνώρισης πρωτεΐνης? ποσοστό της αλληλουχίας της πρωτεΐνης που καλύπτονται από προσδιορίζονται πεπτίδια (Cov)? αριθμός πεπτιδίων μοναδική για την πρωτεΐνη (# μοναδικά πεπτίδια)? αριθμός των ταυτοποιημένων πεπτιδίων που ταιριάζουν με την πρωτεΐνη (# πεπτίδια)? συνολικός αριθμός των ταυτοποιημένων αλληλουχιών πεπτιδίου (φάσμα πεπτίδιο αγώνες) (# PSMs) που λαμβάνεται από δύο διαφορετικά πειράματα (Exp 1 και Exp 2). Στον πίνακα παρατίθενται τα πεπτίδια PGRMC1 ακόλουθες παραμέτρους: το εντοπίστηκαν αμινο όξινο πεπτιδική αλληλουχία? Φορτίστε κατάσταση του προδρόμου ιόντος? η θεωρητική μάζα πρωτονιωμένη πεπτίδιο μονοϊσοτοπική, σε daltons (ΜΗ +)? μάζα προς φορτίο αναλογία (m /z) του προδρόμου ιόντος, σε daltons? η διαφορά μεταξύ της θεωρητικής μάζας του πεπτιδίου και της πειραματικής μάζα του προδρόμου ιόντος σε μέρη ανά εκατομμύριο (ΔM)? χρόνος κατακράτησης του προδρόμου ιόντος, σε λεπτά (R.T.)? η βαθμολογία αλληλοσυσχέτιση SEQUEST ΗΤ για όλες τις υποψήφιες πεπτίδια ερωτηθούν από τη βάση δεδομένων (Xcorr)? αριθμός αποτυχίας αποκοπής.

Η

PGRMC1, nPR και mPRα επίπεδα πρωτεϊνών αποκαλύφθηκαν με ειδικά αντισώματα σε PE /CA PJ15 κυτταρικά εκχυλίσματα που λαμβάνονται λύση κυττάρων με ρυθμιστικό ΚΙΡΑ. Blot αντι mPRα διεξήχθη επίσης στην προετοιμασία της μεμβράνης. Πρωτεΐνες εκχυλίσματα από κύτταρα HepG2 και MCF7 αναλύθηκαν ως θετικοί έλεγχοι (PGRMC1: 21.67 kDa, https://www.uniprot.org/uniprot/O00264? NPR: 82,29 kDa ισομορφή Α, 98,98 kDa ισομορφή Β, http: //www. uniprot.org/uniprot/P06401? mPRα: 39.72 kDa, https://www.uniprot.org/uniprot/Q86WK9). Ίση φόρτωση πρωτεΐνης (50 μg) επιβεβαιώθηκε από την έκφραση της β-ακτίνης.

Η

Λόγω της υψηλής έκφρασης PGRMC1 σε PJ15 κύτταρα ΡΕ /CA, θελήσαμε να εξακριβωθεί ο ρόλος της στην [Ca

2+] c αυξηθεί μετά προγεστερόνης ερέθισμα με τη χρήση μόνο του και σε συνδυασμό με p1932 τον συγκεκριμένο αναστολέα AG-205. AG-205 είναι γνωστό ότι συνδέεται με τη θέση σύνδεσης της αίμης της πρωτεΐνης αυτής τροποποιώντας έτσι φασματοσκοπικές ιδιότητες και τις λειτουργίες [33] της. Ο αναστολέας PGRMC1 AG 205 (0,01-1,0 μΜ) ή πεπτίδιο p1932 (0,01-1,0 μΜ), εισήχθησαν στο μέσο επώασης 50 δευτερόλεπτα πριν προγεστερόνης (5 ή 10 μΜ). Με την παρουσία του AG-205 ή p1932 πεπτιδικά την επίδραση της Ρ4 (5-10 μΜ) επί Δ [Ca

2+] c ήταν στατιστικά ανέστειλε κατά τρόπο εξαρτώμενο από τη δόση, μιμούμενες έτσι την δράση της p1932 (Εικ 6α) . Στη συνέχεια, AG-205 (0,01-1,0 μΜ) και το πεπτίδιο p1932 (0,01-1,0 μΜ) προστέθηκαν ταυτόχρονα στις μέσον 50 δευτερόλεπτα πριν την προγεστερόνη. Ο συνδυασμός των δύο παραγόντων στις ίδιες δόσεις, οδήγησε σε μια ανασταλτική δράση υψηλότερη στη δραστηριότητα της προγεστερόνης, από εκείνη που παρατηρήθηκε για το άτομο AG-205 ή p1932 πεπτίδιο μόνο, υποδεικνύοντας μιας πρόσθετης δράσης των δύο μορίων (Σχήμα 6β).

Τα πειράματα διεξήχθησαν σε ΡΕ /CA PJ15 σημασμένο με fura-2 ΑΜ. Μετά από 50 δευτερόλεπτα στο μέσο επώασης, Ρ4 (5 μΜ, Σχήμα 6Α? 10 μΜ, Σχήμα 6Β) προστέθηκε και η αύξηση του κυτοσολικού ασβεστίου ως Δ [Ca

2+] c μετρηθεί. Ο αναστολέας PGRMC1 AG 205 (0,01-1,0 μΜ) και /ή πεπτιδίου p1932 (0,01-1,0 μΜ), προστέθηκε στους μέσον 50 δευτερόλεπτα πριν από την 5 ή 10 μΜ προγεστερόνη. Με την παρουσία του AG205 ή πεπτιδίου p1932, την επίδραση της Ρ4 (5-10 μΜ) επί Δ [Ca

2+] c ήταν στατιστικά ανέστειλε κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Όταν AG 205 (0,01-1,0 μΜ) και το πεπτίδιο p1932 (0,01-1,0 μΜ) προστέθηκαν σε συνδυασμό, η παρατηρούμενη ανασταλτική δράση ήταν υψηλότερη από ό, τι στα δείγματα που έλαβαν θεραπεία με τον κάθε παράγοντα ξεχωριστά. Κάθε δεδομένα αντιστοιχεί στον μέσο ± SEM από έξι ανεξάρτητες μετρήσεις.

Η

Ο υποδοχέας PGRMC1 περιέχει ένα Ν-τερματικό διαμεμβράνης πεδίο (72-135 αα) και έναν τομέα cyt-B5 ή αίμης /στεροειδών πρόσδεσης [ ,,,0],34]? Τα παρόμοια χαρακτηριστικά από κοινού με ομόλογο PGRMC2 της. Και οι δύο πρωτεΐνες που εκφράζονται σε διάφορους ανθρώπινους ιστούς, συμπεριλαμβανομένων καρδιά, το ήπαρ και πλακούντα [35], και υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκινικών κυττάρων [36-38]. PGRMC1 δεσμεύει P4 με μέτρια συγγένεια και μεσολαβεί P4 αντι-μιτωτική και αντι-αποπτωτική δράση. Είναι εντοπισμένη στην μεμβράνη του πλάσματος, κυτταρόπλασμα και πυρηνικές μεμβράνες, εξηγώντας έτσι το δυναμικό συμμετοχή της στην ταχεία σήματα μη-γονιδιωματικό προγεστερόνης. Πρόσφατα, PGRMC1 βρέθηκε να συσχετίζεται αυστηρά Sigma-2 υποδοχέων [39], παρά την ύπαρξη ορισμένων αμφιλεγόμενα αποτελέσματα [40].

Η ΕΑ (MW 40 kDa) ήταν πρώτον απομονώθηκαν σε seatrout [41] και αντιπροσωπεύονται από τουλάχιστον πέντε υποτύπους, δηλαδή α, β, γ, δ, και ε αυστηρά με προγεστίνη και αδιπονεκτίνη-Q-υποδοχέα (PAQR) της οικογένειας [42]. αποτελεσματική την παρουσία τους και τη φύση ως υποδοχείς προγεστερόνης έχουν δημιουργηθεί μετά από χρόνια συζήτησης [43]. Οι υποδοχείς αυτοί έχουν υψηλή συγγένεια για Ρ4 (Kd 5 ηΜ) και μπορεί να μεσολαβεί ταχείες αποκρίσεις ως άμεσα συνδεδεμένο με πρωτεΐνες G [32, 44]. Και οι δύο PGRMC1 και mPRα υποδοχείς είναι σε θέση να ανταποκριθεί γρήγορα σε ένα ερέθισμα P4, και, κατά συνέπεια, καθορίζουν την αύξηση του [Ca

2 +]

c από το ενδοπλασματικό καταστήματα [45, 46]. Λαμβάνοντας υπόψη πόσο αλληλεπιδράσουν οι πρωτεΐνες αυτές [30], είναι πιθανό ότι αντιπροσωπεύουν τις μοριακούς στόχους του p1932.

Τα διαρθρωτικά χαρακτηριστικά του p1932 υποδεικνύουν έντονα αυτό το πεπτίδιο ως ένα δυναμικό αλληλεπίδρασης του Proline-Rich Αναγνώριση Domains (PRDS) , και ιδίως των τομέων SH3 [46, 47]. Για να επιτευχθεί η δέσμευση μεταξύ ενός πλούσια σε προλίνη αλληλουχία και έναν τομέα SH3, μια -PxxP- πυρήνας πρέπει να είναι παρούσα στην αλληλουχία συνδετήρα. Επιπλέον, ένα βασικό υπόλειμμα που πλευρίζει την -PxxP- πυρήνα είναι σημαντική για τον καθορισμό της ειδικότητας αλληλεπίδρασης καθορισμό δύο τύπων κανονικών συναινετικές αλληλουχίες: ο Κατηγορίας Ι -PxxPxx (R /K) και η κατηγορία II – (R /K) xPxxP- [48 ]. Η παρουσία των τριών -PxxP- συναίνεσης πυρήνες, εκτός από την παρουσία ενός μοτίβου Class-II στην C-τερματική περιοχή του p1932 (ΝΗ

2-

1GPPPQGGNKP

10QGPPPPGKPQ), στο οποίο διαμένει ο ανασταλτική δράση, υποστηρίζουν σθεναρά την υπόθεση μας ότι p1932 μπορούν να στοχεύουν περιοχές SH3. Η nPR είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρά με τον τομέα SH3 c-SRC κινάσης μέσω πλούσια σε προλίνη περιοχή του [49], αλλά η έλλειψη αυτού του υποδοχέα στα κύτταρα PJ15, όπως προκύπτει από την πρωτεομική και τη δυτική-blot αναλύσεις, οι κανόνες-out το μηχανισμό αυτό. υποδοχέα PGRMC1 αντίθετα εντόνως εκφρασμένο σε αυτή την κυτταρική σειρά, που υποδεικνύει ότι είναι η πραγματική υποδοχέας ανταποκρίνεται σε Ρ4 ερεθίσματα σε κύτταρα PJ15. Η διαμεμβρανική περιοχή της PGRMC1 διαθέτει μια υποθετική συναινετικές αλληλουχίες στόχου SH3 για CRK /Grb2 /Abl και Src κινασών ενώ η περιοχή πρόσδεσης της αίμης περιέχει συναινετική αλληλουχία για κινάσες τυροσίνης τύπου Lck /Abl-P και για ERK1 [47], όπως προβλέπεται επίσης από την ΤΗΕ