Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα αυξημένα επίπεδα της NF-κΒ είναι το σήμα κατατεθέν του παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) και οι δύο οι κλασικές και εναλλακτικές οδούς ενεργοποίησης του NF-κΒ έχουν ενοχοποιηθεί.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η ενεργοποίηση της εναλλακτικής οδού είναι μια πηγή για την υψηλή βασική δράση του NF-κΒ στο PDAC κυτταρικές γραμμές. Η αυξημένη δραστικότητα του συμπλόκου ρ52 /RelB ΝΡ-κΒ προκαλείται μέσω σταθεροποίησης και ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ επαγωγής κινάση (ΝΙΚ). Προσδιορίζουμε πρωτεασώματος μειορρύθμιση του παράγοντα υποδοχέα που σχετίζεται με TNF 2 (TRAF2) ως μηχανισμός με τον οποίο τα επίπεδα του δραστικού ΝΙΚ αυξήθηκε σε κυτταρικές σειρές PDAC. Τέτοια ρύθμιση προς τα πάνω του ΝΙΚ επίπεδα έκφρασης και η δραστικότητα ρελέ για αυξημένο πολλαπλασιασμό και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, αλλά όχι τη μετανάστευση ή την επιβίωση των κυττάρων PDAC.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Η ταχεία ανάπτυξη είναι ένα χαρακτηριστικό του καρκίνου του παγκρέατος . Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η TRAF2 /ΝΙΚ /NF-κΒ2 μονοπατιού ρυθμίζει PDAC ογκογενετικότητας των κυττάρων και θα μπορούσε να είναι ένα πολύτιμο στόχο για τη θεραπεία αυτού του καρκίνου

Παράθεση:. Doppler Η Liou GY, Storz P (2013) Ελάττωση της TRAF2 Μεσολαβεί ΝΙΚ-Induced καρκίνο του παγκρέατος πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ογκογονικότητα. PLoS ONE 8 (1): e53676. doi: 10.1371 /journal.pone.0053676

Επιμέλεια: Γκύντερ Schneider, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 26, Ιουλίου, 2012? Αποδεκτές: 3 Δεκ 2012? Δημοσιεύθηκε: 3 Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Doppler et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από την AACR (08.20.25-STOR), τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας χορηγεί CA135102, CA140182 και P50CA102701 (Mayo Clinic SPORE σε καρκίνο του παγκρέατος). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι παράγοντες μεταγραφής του ΝΡ-κΒ (πυρηνικός παράγοντας κ-ελαφριάς αλυσίδας-ενισχυτής των ενεργοποιημένων Β κυττάρων) οικογένειας ρυθμίζεται αυξητικά σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους [1]. ΝΡ-κΒ έχει ρόλους σε όλες τις σφραγίδες της καρκινογένεσης ή εξέλιξης του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της προστασίας από τον κυτταρικό θάνατο, αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, κυτταρική κινητικότητα και μετάσταση, φλεγμονή και αγγειογένεση όγκου [1]. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα συχνά αποκτούν αντοχή σε αντικαρκινικά φάρμακα (χημειοαντίσταση) με προς τα πάνω ρύθμιση του NF-κΒ σηματοδότηση [2].

Οι ΝΡ-κΒ σύμπλοκα παράγοντα μεταγραφής που σχηματίζεται από ομο- ή ετεροδιμερή της ρ65 υπομονάδες (ΚεΙΑ) , RelB, c-συνδεδεμένη, P50 ή P52 [3]. ΚεΙΑ διμερή /p50 αντιπροσωπεύει την κλασική (κανονική) NF-κB1 και RelB /P52 διμερή την εναλλακτική (μη-κανονικό) NF-κΒ2 συγκρότημα [4]. Τόσο η εναλλακτική λύση και κλασικά μονοπάτια της ενεργοποίησης του NF-κΒ βασίζονται στο συγκρότημα ΙκΒ κινάσης (ΙΚΚ), που αποτελείται από ΙΚΚα, ΙΚΚβ και NEMO /IKKγ. ΙΚΚβ και NEMO /IKKγ μεσολαβούν την ενεργοποίηση της κανονικής οδού NF-κB1, στην οποία ΙΚΚα δεν έχει ουσιαστικό ρόλο. Σε αντίθεση, η ενεργοποίηση της εναλλακτικής οδού NF-κΒ2 απαιτεί ΙΚΚα, ΙΚΚβ αλλά όχι και NEMO [5]. Συνεπάγεται επίσης κινάση ΝΡ-κΒ επαγωγής (ΝΙΚ) ως άμεσο ανάντη κινάσης για ΙΚΚα [4]. Μόλις ενεργοποιηθεί από ΝΙΚ, ΙΚΚα προκαλεί την επεξεργασία του NF-κΒ2 /P100 σε P52.

Σε απουσία ενός ερεθίσματος, ΝΙΚ είναι γρήγορα υποβαθμισμένη και αυτό εξαρτάται από τη σύνδεσή της με τον παράγοντα σχετίζεται με τον υποδοχέα του TNF 3 (TRAF3) . Δέσμευση σε TRAF3 στρατολογεί ΝΙΚ στο σύμπλοκο TRAF2 /cIAP1 /cIAP2 λιγάσης [6], [7]. Cellular αναστολέας των πρωτεϊνών απόπτωσης (cIAPs) είναι ubiquitin λιγάσες που μπορούν να προωθήσουν την ουβικιτινίωση και πρωτεασώματος αποικοδόμηση του εαυτού τους, καθώς και συνεργάτες σύνδεσης TRAF2 τους και TRAF3 [8], [9]. Και οι δύο cIAPs μεσολαβούν επίσης K48-συνδέονται polyubiquitination της ΝΙΚ, με αποτέλεσμα την υποβάθμιση του πρωτεασώματος του [7]. Σε διεγερμένα κύτταρα (δηλαδή κατά την εμπλοκή του υποδοχέα CD40), σύμπλοκα TRAF2 /cIAP1 /cIAP2 /TRAF3 προσλαμβάνονται στον υποδοχέα και επάγει TRAF2 ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση του TRAF3 [10]. Δεδομένου ότι τα επίπεδα TRAF3 μειωθεί, νεοσυντιθέμενες ΝΙΚ σταθεροποιείται και ενεργό, διότι δεν μπορεί πλέον να αλληλεπιδρούν με την TRAF2 /cIAP1 /cIAP2 συγκρότημα [6].

Σε καρκίνο του παγκρέατος πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC), τα επίπεδα της NF-κΒ είναι αυξήθηκε σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, καθώς και δείγματα ασθενών και μεσολαβούν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία [11], [12], [13]. Η αυξημένη δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε PDAC οφείλεται τόσο στις οδούς κανονικά και εναλλακτικά ενεργοποίηση [14], [15]. Δεδομένου ότι μέχρι στιγμής δεν γενετικές αλλοιώσεις για TRAFs, CIAP ή ΝΙΚ περιγράφηκαν για αυτόν τον καρκίνο, οι μηχανισμοί με τους οποίους ρυθμίζεται αυξητικά η εναλλακτική οδός είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστες για PDAC.

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι σε PDAC επίπεδα πρωτεΐνης κυτταρικές σειρές TRAF2 τα μειωτικά και ότι αυτός είναι ο μηχανισμός με τον οποίο επιτυγχάνεται η σταθεροποίηση του ΝΙΚ να επάγει την ενεργοποίηση της εναλλακτικής οδού του ΝΡ-κΒ. Δείχνουμε επίσης ότι τα κέντρα δραστηριότητας ΝΙΚ σε αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη. Η ταχεία ανάπτυξη είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου του παγκρέατος και τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η TRAF2 /ΝΙΚ /NF-κΒ2 μονοπάτι μπορεί να είναι ένα πολύτιμο στόχο για τη θεραπεία αυτού του καρκίνου.

Αποτελέσματα

ΝΙΚ έκφραση και δραστηριότητα Αυξημένες σε PDAC Κυτταρικές Γραμμές

Ενεργή ΝΙΚ υπερεκφράζεται σε ανθρώπινα δείγματα από PDAC σύγκριση με τα φυσιολογικά παγκρεατικό ιστό (Εικ. 1Α). Αυτό μας προωθείται για να αναλύσει ένα πάνελ εννέα καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές PDAC, όπως επίσης και ανθρώπινα κύτταρα παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά (HPDE), που χρησίμευσε ως κανονικός έλεγχος για έκφραση και τη δραστηριότητα των ΝΙΚ. Στις περισσότερες PDAC κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν, η έκφραση ΝΙΚ αυξήθηκε σε σύγκριση με την κανονική HPDE κύτταρα (Σχ. 1 Β, άνω πλαίσιο). Αυξημένη έκφραση συσχετίζεται με αυξημένη δραστικότητα, όπως προσδιορίζεται με ένα φωσφο-ειδικό αντίσωμα (αντι-pT559-ΝΙΚ) που αναγνωρίζει φωσφορυλίωση ΝΙΚ στο βρόχο ενεργοποίησης της (σχ. 1Β, μεσαίο πλαίσιο). Από όλες τις κυτταρικές σειρές PDAC που αναλύθηκαν, μόνο δύο, Capan2 και HPAFII, δεν έδειξαν αυξημένη δραστικότητα ΝΙΚ. Χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR, έχουμε την επόμενη δοκιμαστεί εάν η αυξημένη έκφραση του mRNA ΝΙΚ θα μπορούσε να είναι ο λόγος για τις αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης. Αν και παρατηρήσαμε παραλλαγές στην έκφραση mRNA ΝΙΚ μεταξύ των διαφόρων κυτταρικών σειρών, μια προφανής συσχέτιση με την έκφραση της σε επίπεδο πρωτεΐνης δεν παρατηρήθηκε (Εικ. 1 C). Αυτό έδειξε ότι σε κυτταρικές σειρές PDAC αυξημένη έκφραση ΝΙΚ δεν επιτυγχάνεται με αυξημένη μεταγραφή, αλλά μάλλον με μηχανισμούς που σταθεροποιούν τα επίπεδα πρωτεΐνης

Α:. Δείγματα ανθρώπινου ιστού κανονικών παγκρέατος και PDAC ανοσοϊστοχημικά-χρωματίστηκαν για συνολική ΝΙΚ ( αντι-ΝΙΚ) ή ενεργό ΝΙΚ () έκφραση-pT599-ΝΙΚ αντι, ή να υποβληθούν σε H & amp? χρώση Ε. Η γραμμή δείχνει 50 μm. Β: Κυτταρολύματα από υποδεικνύεται κυτταρικές γραμμές ή τα κύτταρα PDAC HPDE ομαλοποιήθηκαν σε 0,5 mg /ml και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη και αναλύθηκαν με κηλίδα Western για έκφραση ΝΙΚ (αντι-ΝΙΚ) ή δραστικότητα ΝΙΚ (αντι-pT559-ΝΙΚ). Η χρώση για β-ακτίνη (αντι- β-ακτίνης) χρησίμευσαν ως έλεγχος φόρτωσης. C: Δείγματα του mRNA της ενδεικνυόμενης κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε ποσοτική RT-PCR που κατευθύνεται έναντι ΝΙΚ. Τα δείγματα ομαλοποιήθηκαν σε GAPDH.

Η

Έκφραση TRAF2 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε PDAC Γραμμές κυττάρων

Είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν ΝΙΚ ρυθμίζεται μετά τη μετάφραση. Εν τη απουσία ενός σήματος ενεργοποίησης, ΝΙΚ δείχθηκε να κατιούσα ρύθμιση της έκφρασης της με αλληλεπίδραση με τον TRAF2, TRAF3 και cIAP1 /2 πολύπλοκη και επακόλουθη ουβικιτινίωση [15], [16]. Αυτού του ρυθμιστικού συγκρότημα για ΝΙΚ, TRAF3 και cIAP1 /2 εκφράζεται σε αφθονία σε όλα τα PDAC κυτταρικές σειρές, καθώς και τα φυσιολογικά κύτταρα ελέγχου HPDE (Εικ. 2Α). TRAF2, ωστόσο, εκφράστηκε μόνο στα κύτταρα HPDE, αλλά όχι, ή πολύ λίγο εκφράζονται σε επτά από εννέα κυτταρικές σειρές PDAC. Σε Capan1 και HPAFII κύτταρα TRAF2 έκφραση ανιχνεύθηκε, αλλά σε μια ασυνήθιστη μοριακό βάρος περίπου 65 kDa (Σχ. 2Α, η Εικ. S1, λευκό βέλος). Η απώλεια της έκφρασης TRAF2 παρατηρήθηκε σε όλα τα PDAC κυτταρικές σειρές που παρουσίασαν αυξημένη δραστικότητα ΝΙΚ (σύγκρινε Σχ. 1Α και το Σχ. 2Α). Είναι ενδιαφέρον, TRAF2 mRNA ήταν άφθονο σε όλες τις κυτταρικές σειρές PDAC (Εικ. 2Β), υποδεικνύοντας ότι η έκφρασή του, επίσης, δεν ρυθμίζεται σε μεταγραφικό επίπεδο. Δεδομένου ότι τα επίπεδα έκφρασης TRAF2 μπορεί να ρυθμιστεί από ουβικιτινίωση, έχουμε την επόμενη δοκιμαστεί εάν η απώλεια του σε κυτταρικές σειρές PDAC οφείλεται στην ουβικιτινίωση και μετέπειτα αποικοδόμηση του πρωτεασώματος. Κατά την εκ νέου εκφράζεται σε κύτταρα PANC1, TRAF2 ήταν ουβικουιτινωμένης (Σχ. 2C), ενώ δεν ήταν ουβικιτινίωση ανιχνεύεται όταν έκτοπη TRAF2 εκφράστηκε σε κύτταρα HPDE (δεν φαίνεται). Θεραπεία κυτταρικών γραμμών PDAC με MG-132, έναν αναστολέα πρωτεασώματος, αποκαταστάθηκε ενδογενή επίπεδα TRAF2 μέσα σε 4 έως 24 ώρες, ανάλογα με την κυτταρική γραμμή (Σχ. 2D). Επιπλέον, έκτοπη επανέκφραση του TRAF2 σε PANC1 οδήγησε σε μείωση στην έκφραση ΝΙΚ, δείχνοντας περαιτέρω ότι η αυξημένη Τα επίπεδα ΝΙΚ προκαλούνται από ρύθμιση προς τα κάτω του TRAF2 σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 2Ε). Στο σύνολό τους, αυτό υποδηλώνει ότι ένας μηχανισμός για το πώς βασικής υψηλής έκφρασης και της δραστηριότητας των επιπέδων ΝΙΚ ρυθμίζονται στην πλειονότητα των κυτταρικών σειρών PDAC είναι από ουβικιτινίωση και πρωτεασώματος αποικοδόμηση του TRAF2, με αποτέλεσμα την αυξημένη σταθερότητα και δραστικότητα ΝΙΚ.

Α : κυτταρολύματα από κύτταρα έδειξε κανονικοποιήθηκαν προς 0,5 mg /ml και στη συνέχεια 20 μg υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη και αναλύθηκαν με κηλίδα Western για έκφραση του TRAF2 (αντι-TRAF2), TRAF3 (αντι-TRAF3), cIAP1 (αντι-cIAP1), cIAP2 (αντι-cIAP2) ή β-ακτίνης (αντι-β-ακτίνης ? φόρτωση ελέγχου). TRAF2 υπερεκφράζεται σε ΗΕΚ293 κύτταρα χρησίμευσαν ως πρόσθετος έλεγχος του μοριακού βάρους. Β: Δείγματα του mRNA της ενδεικνυόμενης κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε ποσοτική RT-PCR που κατευθύνεται έναντι TRAF2. Τα δείγματα κανονικοποιήθηκαν για GAPDH. κύτταρα PANC1 (5 × 10

5 κύτταρα, 6 πιάτα cm) συν-επιμολύνθηκαν με TRAF2 και φορέα αναφοράς ή ΗΑ-ubiquitin: C. Μετά από 24 ώρες τα κύτταρα λύθηκαν, TRAF2 ανοσοκαταβυθίστηκε (αντι-TRAF2) και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση για ουβικουϊτινίωση του TRAF2 (αντι-ΗΑ). Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν εκ νέου για TRAF2 (αντι-TRAF2). D: Ενδείκνυται κυτταρικές γραμμές υπέστησαν κατεργασία με MG-132 (20 μΜ) για 0, 4, 8, 16 ή 24 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν και αναλύθηκαν για έκφραση του ενδογενούς TRAF2 (αντι-TRAF2) ή β-ακτίνης (αντι-β-ακτίνης? Φόρτωση έλεγχος TRAF2 υπερεκφράζεται σε ΗΕΚ293 κύτταρα χρησίμευσαν ως θετικός έλεγχος Ε:.. Τα κύτταρα PANC1 (5 × 10

5 κύτταρα, 6 cm δίσκους) διαμολύνθηκαν με φορέα ελέγχου ή TRAF2 όπως υποδεικνύεται. Μετά από κυτταρολύματα 24 ώρες πραγματοποιήθηκαν αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για έκφραση ΝΙΚ (αντι-ΝΙΚ), υπερεκφράζεται TRAF2 (αντι-TRAF2) ή β-ακτίνης (anti -β-ακτίνη) ως έλεγχος φόρτωσης.

η

ΝΙΚ Παρεμβαίνει βασικοκυτταρικό NF-κΒ Δραστηριότητα στο PDAC τηλέφωνα Γραμμές

Μόλις ενεργοποιηθεί ΝΙΚ μπορεί να προκαλέσει την μη κανονική πορεία ενεργοποίησης του NF-κΒ, επάγοντας την επεξεργασία του ΝΡ-κΒ2 /ρ100 προς ρ52. Συνολικά κυτταρολύματα κυτταρικών γραμμών PDAC, αυξημένα επίπεδα ρ52 συσχετίζεται με αυξημένη έκφραση και δραστικότητα ΝΙΚ υποδεικνύοντας ότι η ενεργός ΝΙΚ είναι επίσης λειτουργική (σύγκρινε Σχ. 3Α και Εικ. 1Β) . Παρατηρήσαμε επίσης αυξημένη έκφραση του RelB, ένα

καλόπιστους

συνεργάτη σύνδεσης για ρ52 σε εναλλακτικής οδού NF-κΒ, υποδεικνύοντας ότι η αυξημένη δραστηριότητα ΝΙΚ οδηγεί στο σχηματισμό RelB /P52 NF-κΒ συγκροτήματα. Πράγματι, τα δύο συστατικά αυτού του συμπλέγματος ανιχνεύθηκαν σε πυρήνες κυτταρικών γραμμών PDAC (Σχ. 3Β) και ανάλυση EMSA υπερμετατόπισης έδειξε ότι και οι δύο έχουν το DNA δραστικότητα δέσμευσης (Σχ. 3C). Αξίζει να σημειωθεί ότι, πυρηνικά εκχυλίσματα που περιέχονται, επίσης, p65 και p50 (Εικ. S2). Χρησιμοποιώντας λουσιφεράσης δοκιμασίες γονιδίου ανταποκριτή Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν ΝΙΚ-μεσολαβούμενη επαγωγή του ΝΡ-κΒ2 ρελέ σε αυξημένα βασικά επίπεδα του ΝΡ-κΒ. Όταν τα κύτταρα PANC1 είχαν lentivirally μολύνθηκαν με έλεγχο shRNA ή δύο ειδικές αλληλουχίες ΝΙΚ-shRNA (ΝΙΚ-shRNA1 και ΝΙΚ-shRNA2) και στη συνέχεια επιμολύνονται με το γονίδιο ΝΡ-κΒ-λουσιφεράσης ανταποκριτής, παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ όταν ΝΙΚ ήταν προς τα κάτω σε έκφραση του (Σχ. 3D). Σε αντίθεση, όταν τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα ενεργό αλληλόμορφο του ΝΙΚ (NIK.T559D) βασικά επίπεδα ΝΡ-κΒ αυξήθηκαν (Εικόνα 3Ε).

Α:. Κυτταρολύματα των κυττάρων έδειξε κανονικοποιήθηκαν έως 0,5 mg /ml και στη συνέχεια 20 μg υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη και αναλύθηκαν με κηλίδα Western για έκφραση RelB (αντι-RelB), ρ52 (αντι-P52) ή β-ακτίνης (αντι-β-ακτίνης? Έλεγχος φόρτωσης). Β: Πυρηνικά εκχυλίσματα και κυτοσολικά κλάσματα υποδεικνύονται κυτταρικές σειρές αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για RelB και ρ52 και επιπροσθέτως για ρ65 και ρ50 (βλέπε Σχήμα Συμπληρωματικό S2). Ανοσοχρώση για νουκλεολίνη υπηρέτησε ως δείκτης για πυρηνικά εκχυλίσματα. Silver χρώση των προϊόντων λύσης χρησίμευσαν ως έλεγχος φόρτωσης. C: Πυρηνικά εκχυλίσματα των κυττάρων PANC1 επωάστηκαν με αντι-RelB ή αντισώματα αντι-ρ52 όπως υποδεικνύεται και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση DNA δεσμευτική δραστικότητα χρησιμοποιώντας EMSA. 100x μη επισημασμένα ολιγονουκλεοτίδιο χρησίμευσε ως έλεγχος ειδικότητας. D: PANC1 κύτταρα που εκφράζουν τον έλεγχο (κωδικοποιημένο) shRNA ή ΝΙΚ-shRNA (δύο διαφορετικές ακολουθίες, ΝΙΚ-shRNA1 ή ΝΙΚ-shRNA2) έχουν επιπλέον επιμολυσμένα με NF-κΒ-λουσιφεράσης και λουσιφεράσης Renilla δημοσιογράφους. 16 ώρες μετά την δοκιμασίες λουσιφεράσης γονίδιο μορφομετατροπή ανταποκριτού διεξήχθησαν. Knockdown του ΝΙΚ ελέγχθηκε με ανάλυση RT-PCR. RT-PCR για mRNA β-ακτίνης χρησίμευσε ως έλεγχος. Οι αστερίσκοι δεικνύουν τη στατιστική σημαντικότητα. Ε: κύτταρα PANC1 επιμολύνθηκαν με ΝΡ-κΒ-λουσιφεράση και ρεπόρτερ λουσιφεράσης Renilla, καθώς και τον έλεγχο των φορέων ή ένα μεταλλαγμένο NIK.T599D, όπως υποδεικνύεται. 16 ώρες μετά την δοκιμασίες λουσιφεράσης γονίδιο μορφομετατροπή ανταποκριτού διεξήχθησαν. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν για εκφράζεται δραστική ΝΙΚ χρησιμοποιώντας Western blot και αντισώματα που κατευθύνονται έναντι FLAG-tagged NIK.T559D (αντι-FLAG) ή β-ακτίνης (αντι-β-ακτίνης) ως έλεγχος φόρτωσης. Ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα.

Η

ΝΙΚ είναι ένα κρίσιμο ρυθμιστή του μεταμορφωμένη ανάπτυξης στην PDAC κύτταρα

Στη συνέχεια αξιολόγησε την απαίτηση της ΝΙΚ σε μεταμορφωμένα ανάπτυξη PDAC κυττάρων. Ως εκ τούτου, καθιερώθηκε για πρώτη φορά κυτταρικές σειρές PANC1 και MIAPaCa2 που εκφράζουν σταθερά είτε ΝΙΚ-shRNA ή τον έλεγχο ομελέτα shRNA. Στη συνέχεια χρησιμοποιούνται αυτές οι κυτταρικές σειρές για να προσδιοριστεί αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη σε προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας softagar. Η knockdown του ΝΙΚ στα κύτταρα PANC1 και MIAPaCa2 μειώθηκαν σημαντικά ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και αυτό συσχετίζεται με τα επίπεδα ΝΙΚ έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα (Σχ. 4Α). Η έκτοπη έκφραση μιας συστατικώς δραστικής ΝΙΚ αλληλόμορφο αυξημένη αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη και αποικία σχηματισμό σε κύτταρα PANC1 (Εικ. 4Β). Παρόμοια αποτελέσματα επί της ανάπτυξης κυττάρου ελήφθησαν με παραπάνω αντίστροφης γενετικής (Σχ. 4C, επάνω σειρά) ή έκτοπη υπερέκφραση (Εικ. 4C, κάτω σειρά) προσεγγίσεις, όταν τα κύτταρα PANC1 αναπτύχθηκαν σε 3-διαστάσεων (3D) καλλιέργεια κυττάρων σε Matrigel αντί του softagar. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ΝΙΚ είναι αναγκαία και επαρκής για να μεσολαβήσει ογκογόνο ανάπτυξη κυτταρικών σειρών PDAC

Α:. PANC1 ή κύτταρα MIAPaCa2 (5 × 10

5 κύτταρα, 6 πιάτα cm) που εκφράζει σταθερά τον έλεγχο (ομελέτα) shRNA ή ΝΙΚ-shRNA (δύο διαφορετικές αλληλουχίες, ΝΙΚ-shRNA1 ή ΝΙΚ-shRNA2) υποβλήθηκαν σε προσδιορισμούς μαλακού άγαρ σχηματισμού αποικίας. Ένα κλάσμα των επιμολυσμένων κυττάρων συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για έκφραση ΝΙΚ χρησιμοποιώντας ανάλυση Western blot και αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον ΝΙΚ (αντι-ΝΙΚ) ή β-ακτίνης (αντι-β-ακτίνης) ως έλεγχος φόρτωσης. Οι αστερίσκοι δεικνύουν τη στατιστική σημαντικότητα. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 1 mm. κύτταρα PANC1 (5 × 10

5 κυττάρων, 6 cm δίσκους) έχουν lentivirally μολύνθηκαν με τον ιό ελέγχου ή του ιού για την έκφραση μόνιμα ενεργών ΝΙΚ (NIK.T559D μεταλλαγμένο) και υποβλήθηκε σε προσδιορισμούς μαλακού άγαρ σχηματισμού αποικίας: Β. Πριν την σπορά ένα κλάσμα των κυττάρων λύθηκαν και αναλύθηκαν για εκφράζεται δραστική ΝΙΚ χρησιμοποιώντας Western blot και αντισώματα που κατευθύνονται έναντι FLAG-tagged NIK.T559D (αντι-FLAG) ή β-ακτίνης (αντι-β-ακτίνης) ως έλεγχος φόρτωσης. Ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 1 mm. κύτταρα PANC1 (5 × 10

5 κύτταρα, 6 πιάτα cm) που εκφράζει σταθερά τον έλεγχο (ομελέτα) shRNA, ΝΙΚ-shRNA1 ή ΝΙΚ-shRNA2 (επάνω σειρά), ή κύτταρα lentivirally έχουν μολυνθεί με τον ιό ελέγχου ή NIK.T559D μεταλλαγμένο: C (κάτω σειρά) σπάρθηκαν σε πολιτισμό 3D Matrigel. Τις ημέρες 10 (κύτταρα shRNA) ή 14 (τα κύτταρα που εκφράζουν NIK.T559D) μετά τη σπορά ανάπτυξης αποικίας αναλύθηκε με ImagePro. Η γραμμή αντιπροσωπεύει 500 μm.

Η

TRAF2 /ΝΙΚ Σηματοδοσίας Ρυθμίζει PDAC Πολλαπλασιασμός Κυττάρων

Είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν ΝΙΚ επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό, κινητικότητα και χημειοαντίσταση των κυττάρων PDAC. Ως εκ τούτου χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές γραμμές μας PANC1 και MIAPaCa2 εκφράζουν ΝΙΚ-shRNA ή ελέγχου κωδικοποιημένο shRNA και εκτελούνται δοκιμασίες πολλαπλασιασμού σε πραγματικό χρόνο σε χρονική περίοδο 30 ωρών. Σε κύτταρα PANC1, knockdown του ΝΙΚ με δύο διαφορετικές ακολουθίες shRNA μειώθηκαν σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε 62 – /+ 1,1 τοις εκατό για αλληλουχία 1 και 51 – /+ 1 τοις εκατό για αλληλουχία 2 σε σχέση με το μάρτυρα (100%) στο τελικό σημείο της ανάλυσης. Σε κύτταρα MIAPaCa2, knockdown του ΝΙΚ μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε 49 – /+ 0,7 τοις εκατό για αλληλουχία 1 και 63 – /+ 1,7 τοις εκατό για αλληλουχία 2 στο τελικό σημείο της ανάλυσης (Σχήμα 5Α).. Επιπλέον, κυτταρικές σειρές PANC1 και MIAPaCa2 εκφράζουν τον ιδιοσυστατικά ενεργό μεταλλαγμένο NIK.T559D έδειξαν αυξημένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε 138 – /+ 3,7 τοις εκατό (PANC1) και 166 – /+ 2,7 τοις εκατό (MIAPaCa2) σε σχέση με το μάρτυρα (100%) σε το τελικό σημείο της ανάλυσης (Σχ. 5Β). Δεν παρατηρήσαμε αυξημένη ευαισθησία σε κυτταρικό θάνατο όταν τα κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με ΝΙΚ-shRNA (δεν φαίνεται). Επιπλέον, η knockdown του ΝΙΚ δεν ευαισθητοποιεί κυτταρικές σειρές PDAC να χημειοθεραπευτικά-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Για να ελεγχθεί αυτό συγκρίναμε κυτταρικές γραμμές για ανταπόκριση τους σε Gemcitabine- και 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) (Εικ. S3). Ωστόσο, σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα, οι knockdown κυτταρικές γραμμές έδειξε ένα μειωμένο σήμα σε ΜΤΤ, λόγω μειωμένης δυνατότητά τους να πολλαπλασιάζονται. Τέλος, ελέγξαμε εάν το ενδεχόμενο να μεταναστεύσουν ή να εισβάλουν μεταβάλλεται με έκφραση ΝΙΚ, αλλά δεν βρήκαν καμία σημαντική διαφορά στην κυτταρική μετανάστευση ή την εισβολή στα κύτταρα εξαντλούνται από την ΝΙΚ ή κύτταρα που υπερεκφράζουν ενεργό ΝΙΚ (Εικ. S4). Αυτό δείχνει ότι η βασική δραστηριότητα της ΝΙΚ στα κύτταρα PDAC επηρεάζει αποκλειστικά και μόνο τον πολλαπλασιασμό

Α:. PANC1 ή κύτταρα MIAPaCa2 (5 × 10

5 κύτταρα, 6 εκατοστά πιάτο) που εκφράζει σταθερά τον έλεγχο (κωδικοποιημένο) shRNA ή ΝΙΚ-shRNA (δύο διαφορετικές ακολουθίες, ΝΙΚ-shRNA1 ή ΝΙΚ-shRNA2) σπάρθηκαν σε E-πλάκες και μετά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσκόλλησης ήταν υπό συνεχή παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο για έδειξε φορές χρησιμοποιώντας ένα όργανο xCELLigence RTCA DP. γραμμές σφάλματος (γκρι) αντιπροσωπεύουν τρία πειράματα. ανάλυση Έλεγχος knockdown του ΝΙΚ και για τις δύο κυτταρικές γραμμές φαίνεται στο Σχήμα 4Α. Β: PANC1 ή κύτταρα MIAPaCa2 (5 × 10

5 κύτταρα, 6 εκατοστά πιάτα) έχουν lentivirally μολυνθεί με τον ιό ελέγχου ή του ιού για την έκφραση μόνιμα ενεργών ΝΙΚ (NIK.T559D μεταλλαγμένα). Την επόμενη μέρα μέσα αλλάζονταν και μετά από 48 ώρες τα κύτταρα σπάρθηκαν σε E-πλάκες και μετά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσκόλληση παρακολουθήθηκε συνεχώς σε πραγματικό χρόνο για υποδεικνυόμενους χρόνους χρησιμοποιώντας ένα όργανο xCELLigence RTCA DP. γραμμές σφάλματος (γκρι) αντιπροσωπεύουν τρία πειράματα. Ένα κλάσμα των επιμολυσμένων κυττάρων λύθηκαν και αναλύθηκαν για εκφράζεται δραστική ΝΙΚ χρησιμοποιώντας Western blot και αντισώματα που κατευθύνονται έναντι FLAG-tagged NIK.T559D (αντι-FLAG) ή β-ακτίνης (αντι-β-ακτίνης) ως έλεγχος φόρτωσης (που δείχνεται για MIAPaCa2). Οι κηλίδες ελέγχου για την κυτταρική γραμμή Panc-1 που φαίνεται στο Σχ. 4Β.

Η

Από τα προηγούμενα στοιχεία μας δείχνουν ότι η σταθερότητα ΝΙΚ και δραστηριότητα σε κυτταρικές σειρές PDAC επιτυγχάνονται μέσω του πρωτεασώματος ρύθμιση προς τα κάτω των TRAF2, είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν η επανέκφραση του TRAF2 μπορεί να μειώσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Η έκτοπη έκφραση του TRAF2 μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων των κυττάρων PANC1, MIAPaCa2 και BxPC3. Ανάλογα με την κυτταρική γραμμή, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μειώθηκε στα 68 – /+ 1 τοις εκατό (PANC1), 82 – /+ 1 τοις εκατό (MIAPaCa2), ή 48 – /+ 0,5 τοις εκατό (BxPC3) στο τελικό σημείο της ανάλυσης (30 ώρες) . Τελικά, ελέγξαμε εάν η ενεργοποίηση της εναλλακτικής οδού NF-κΒ2 μπορούν να μεσολαβήσουν κυτταρικό πολλαπλασιασμό των φυσιολογικών κυττάρων παγκρεατικού πόρου. Ως εκ τούτου, μολυσμένα κανονική HPDE κυττάρων με NF-κΒ2 /P100 και αναλύθηκαν πολλαπλασιασμού από μέτρηση σε πραγματικό χρόνο. Μετά την έκφραση του NF-κΒ2 /P100, ανιχνεύσαμε ενεργή ρ52 προϊόν της στα κύτταρα HPDE, συσχετίζοντας με ελαφρώς αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε 107 – /+ 1,2 τοις εκατό σε σχέση με το μάρτυρα (100%) στο τελικό σημείο της ανάλυσης (Εικ. 6D) .

Α-Γ: Ενδείκνυται κυτταρικές σειρές (5 × 10

5 κύτταρα, 6 πιάτα cm) μολύνθηκαν με τον έλεγχο ή TRAF2 αδενοϊό. Μετά από 48 ώρες τα κύτταρα σπάρθηκαν σε E-Πλάκες και μετά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσκόλλησης ήταν υπό συνεχή παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο για 30 ώρες χρησιμοποιώντας ένα όργανο xCELLigence RTCA DP. γραμμές σφάλματος (γκρι) αντιπροσωπεύουν τρία πειράματα. Ένα κλάσμα των επιμολυσμένων κυττάρων λύθηκαν και αναλύθηκαν με στύπωμα Western για TRAF2 ή β-ακτίνης (έλεγχος φόρτωσης). κύτταρα HPDE (5 × 10

5 κύτταρα, 6 εκατοστά πιάτα) μολύνθηκαν με τον έλεγχο ή NF-κΒ2 /P100 αδενοϊό: D. Μετά από 48 ώρες τα κύτταρα σπάρθηκαν σε E-Πλάκες και μετά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσκόλλησης ήταν υπό συνεχή παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο για 20 ώρες χρησιμοποιώντας ένα όργανο xCELLigence RTCA DP. γραμμές σφάλματος (γκρι) αντιπροσωπεύουν τρία πειράματα. Ένα κλάσμα των επιμολυσμένων κυττάρων λύθηκαν και αναλύθηκαν με στύπωμα Western για επεξεργασία, ενεργός ΝΡ-κΒ2 χρησιμοποιώντας αντισώματα που κατευθύνονται έναντι ρ52 (αντι-P52) ή β-ακτίνης (αντι-β-ακτίνης) ως έλεγχος φόρτωσης.

συσχέτιση του

in vitro

δεδομένων με Κλινικά δεδομένα

στη συνέχεια θα καθοριστεί αν μια παρόμοια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης ΝΙΚ και της δραστηριότητας και TRAF2 αρνητική ρύθμιση συμβαίνει σε ανθρώπινα δείγματα του παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα. Από 55 ανθρώπινα δείγματα PDAC αναλύθηκαν, 69% έδειξε μειωμένη έκφραση TRAF2 συσχετίζεται με αυξημένα επίπεδα ΝΙΚ και αυξημένη δραστηριότητα ΝΙΚ (Εικ. 7Α, δείγματα # 58, # 27 και # 44 στο κόκκινο πλαίσιο και Σχ. 7Β κορυφή πίτα γράφημα κόκκινη περιοχή) . Ωστόσο, το 18% των δειγμάτων έδειξε αυξητική ρύθμιση των επιπέδων TRAF2 και ΝΙΚ, αλλά καθόλου ή πολύ μικρή δραστηριότητα ΝΙΚ (Σχ. 7Α, δείγμα # 30 και το Σχ. 7Β πίτα γράφημα πράσινη περιοχή). Πρόσθετες 13% όλων των δειγμάτων έδειξε αυξητική ρύθμιση και των τριών μορίων (Σχ. 7Α, δείγμα # 35 και το Σχ. 7Β πίτα γράφημα μπλε περιοχή). Αριθ συσχέτιση του TRAF2 /επιπέδων ΝΙΚ είτε με την ηλικία, το φύλο, το στάδιο του όγκου ή ΤΝΜ κατάσταση παρατηρήθηκαν Ωστόσο, υπήρχε ένας συσχετισμός μεταξύ του βαθμού του όγκου και TRAF2 /επιπέδων ΝΙΚ. Καλά διαφοροποιημένο όγκους βαθμού 1 παρουσίασαν είτε υψηλή TRAF 2 και επίπεδα ΝΙΚ και χαμηλή pT559-ΝΙΚ, ή είχαν και τα τρία ρυθμίζεται προς τα πάνω. Οι όγκοι αυτού του βαθμού φαίνονται φυσιολογικά και δεν αυξάνεται με ταχείς ρυθμούς. Σε αντίθεση περισσότερο από το 70% του βαθμού 2 όγκων (μετρίως διαφοροποιημένες) και περισσότερο από το 80% του βαθμού 3 όγκων (πτωχά διαφοροποιημένο) έδειξε προς τα κάτω ρύθμιση του TRAF2 συσχετισμού με αυξημένα επίπεδα ΝΙΚ και δραστηριότητα. Καρκινικά κύτταρα αυτών των βαθμών εμφανίζονται ανώμαλα και έχουν την τάση να αναπτύσσονται και να εξαπλωθεί πιο επιθετικά, συσχετίζοντας με μας

in vitro

δεδομένα που δείχνουν ότι η ανωτέρω περιγραφείσα TRAF2 /ΝΙΚ μηχανισμός σηματοδότησης μπορούν να μεσολαβήσουν πολλαπλασιασμό των παγκρεατικών κυττάρων του όγκου.

Α: μικροσυστοιχίες Tissue (TMAs) συμπεριλαμβανομένων 10 δείγματα φυσιολογικού παγκρεατικό ιστό και 55 παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος πόρου ήταν η &? Ε χρώση ή αναλύονται για την έκφραση του TRAF2 (αντι-TRAF2), ΝΙΚ (αντι-ΝΙΚ) ή ενεργός ΝΙΚ (αντι-pT559- ΝΙΚ). Αντιπροσωπευτικά εικόνες των καρκινικών ιστών που απεικονίζονται. Οι αριθμοί δείχνουν τη θέση του ιστού στο TMA. Η γραμμή δείχνει 50 μm. Β: Ανάλυση του συσχετισμού των TRAF2, ΝΙΚ, και pT559-ΝΙΚ σε n = 55 ανθρώπινα δείγματα για παγκρέατος addnocarcinoma. Επάνω γράφημα πίτας δείχνει το ποσοστό των κυττάρων με χαμηλή έκφραση TRAF2 και υψηλή έκφραση του ΝΙΚ και pT559-ΝΙΚ σε κόκκινο, το ποσοστό των κυττάρων με υψηλή TRAF2 και έκφραση ΝΙΚ και χαμηλή έκφραση του pT559-ΝΙΚ σε πράσινο, και το ποσοστό των κυττάρων με υψηλή TRAF2, έκφραση ΝΙΚ και pT559-ΝΙΚ σε μπλε χρώμα. Κάτω ιστογράμματα δείχνουν ποσοστό αυτών των ομάδων στην βαθμός1, βαθμού 2, και βαθμού 3 όγκων.

Η

Συζήτηση

Η αυξημένη βασική δράση του NF-κΒ εντοπίστηκε σε ανθρώπινα δείγματα καρκίνου του παγκρέατος, όπως καθώς και κυτταρικές γραμμές PDAC [11]. ΝΙΚ έχει αναγνωριστεί ως βασικός ρυθμιστής της NF-κΒ σε πολλούς καρκίνους [17]. Στην παρούσα εργασία δείχνουμε ότι η ενεργός ΝΙΚ εκφράζεται σε ιστό ασθενούς για καρκίνο του παγκρέατος και κυτταρικές σειρές PDAC (Εικ. 1). Προσδιορίζουμε ρύθμιση προς τα κάτω του TRAF2 μέσω ουβικουϊτινίωσης ως μηχανισμός με τον οποίο επιτυγχάνεται αυτό (Εικ. 2). Σε PDAC κύτταρα αυξημένη σταθερότητα και δραστικότητα του ΝΙΚ ρελέ για αυξημένη ενεργοποίηση της εναλλακτικής οδού ΝΡ-κΒ (NF-κΒ2? P52 /RelB). Αυτό προκαλεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη (Σχ. 4, 5, 6), όλα τα χαρακτηριστικά του καρκίνου του παγκρέατος. Τα δεδομένα μας υποστηρίζονται από προηγούμενες εργασίες της Schneider et al., δείχνοντας ότι η P52 /RelB NF-κΒ συγκρότημα μπορεί να ρυθμίσει G1-μέχρι την εξέλιξη της S-φάσης σε κυτταρικές σειρές PDAC [18].

Σε πολλούς καρκίνους NF -κB ενεργοποίηση σε κακοήθη κύτταρα λαμβάνει χώρα σε απόκριση προς φλεγμονώδεις κυτοκίνες [19]. Για παράδειγμα, επαγόμενη από τον ΤΝΡα ενεργοποίηση του κανονικού μονοπατιού ΝΡ-κΒ έχει ενοχοποιηθεί ως πιθανή αιτία για την αύξηση της χημειοαντίσταση [2]. Ωστόσο, υπάρχουν παραδείγματα καρκίνων όπου σταθεροποίηση του ΝΙΚ και η προκύπτουσα ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ επιτυγχάνεται με εγγενή μεταλλάξεις. Σε περίπου 20% των πολλαπλών περιπτώσεων μυέλωμα απώλειας λειτουργίας μεταλλάξεων για TRAF2, TRAF3 και cIAP1 /2 έχουν ταυτοποιηθεί σε ασθενείς, οδηγώντας σε ΝΙΚ-επαγόμενη ενεργοποίηση τόσο των κανονικών και των εναλλακτικών οδών NF-κΒ στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης και επιβίωσης [20], [21].

στην εναλλακτική οδό ενεργοποίησης του NF-κΒ, στην απουσία ενός ερεθίσματος, ΝΙΚ συνδέεται με το συγκρότημα TRAF3 /TRAF2 /cIAP1 /cIAP2 που στοχεύει για την αποικοδόμηση. Κατά τη διέγερση του υποδοχέα ο /TRAF3 /cIAP1 /συγκρότημα cIAP2 TRAF2 είναι συγκεντρωμένα στον υποδοχέα και ενεργοποίηση TRAF2 οδηγεί σε cIAP1 /2 και /ή την αποικοδόμηση TRAF3 [6]. Αυτό σταθεροποιεί του κυτταροπλάσματος ΝΙΚ και επιτρέπει κατάντη σηματοδότησης για να ενεργοποιήσετε ΙΚΚα και NF-κΒ2 /P100 [6], [10]. Αλλά ΝΙΚ επίσης μπορούν να σταθεροποιηθούν με άλλους μηχανισμούς. Για παράδειγμα, το τσίμπημα, ένας γνωστός επαγωγέας της εναλλακτικής οδού του ΝΡ-κΒ πυροδοτεί την αποικοδόμηση της cIAP1 /2 και αυτό έχει ως αποτέλεσμα ΝΙΚ σταθεροποίηση και NF-κΒ2 /P100 επεξεργασία [7]. Εδώ περιγράφουμε ένα πρόσθετο και διαφορετικό μηχανισμό ενεργοποίησης που εμφανίζεται σε κυτταρικές σειρές PDAC. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν μόνιμη ρύθμιση προς τα κάτω της πρωτεΐνης TRAF2 σε κυτταρικές γραμμές PDAC υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης, οδηγώντας σε σταθεροποίηση της έκφρασης ΝΙΚ και ενεργοποίηση της εναλλακτικής οδού του ΝΡ-κΒ.

Εκτός εννέα PDAC κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, οι επτά ήταν αρνητικά για έκφραση πρωτεΐνης TRAF2 και δύο εκφράζονται TRAF2 σε μια ασυνήθιστη μοριακό βάρος περίπου 65 kDa αντί του 53 kDa (Σχ. 2Α). Είναι πιθανό ότι αυτή η μεγαλύτερη πρωτεΐνη TRAF2 αντιπροσωπεύει μια μορφή ματίσματος ή μια πρωτεΐνη σύντηξης. Ωστόσο, η αύξηση του μεγέθους δεν φαίνεται να έχει επίδραση λειτουργία TRAF2 προς ΝΙΚ δεδομένου ότι σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, παρόμοια με HPDE κύτταρα ελέγχου, η έκφραση της πρωτεΐνης ΝΙΚ ήταν χαμηλή (Εικ. 1Β). Η φύση και η λειτουργία αυτού του TRAF2 ισομορφή θα χρειαστεί περισσότερο σε βάθος έρευνα στις μελλοντικές εργασίες. Θα είναι επίσης ενδιαφέρον να καθοριστεί εάν υπάρχουν TRAF2 πρωτεΐνη αυξημένου μοριακού βάρους σε ασθενείς.

Βρήκαμε ότι η απώλεια της έκφρασης TRAF2 προκαλείται μέσω ουβικουϊτινίωση της πρωτεΐνης (Σχ. 2C, 2D). Δεν ανιχνεύτηκαν σημαντικές αλλαγές στην έκφραση του cIAP1 /2 ή TRAF3 (Εικ. 2Α). Αποδείχθηκε πριν ότι οι λιγάσες ουβικιτίνης cIAP1 και cIAP2 προωθήσει την υποβάθμιση του πρωτεασώματος των εταίρων δέσμευσης TRAF2 και TRAF3 τους [8], [9]. Έτσι παρατηρούμενη απώλεια έκφρασης TRAF2 μπορεί να οφείλεται στην παρουσία του cIAP1 /2. Σε αυτό το σημείο δεν είναι σαφές γιατί, προκειμένου να ενεργοποιήσει την εναλλακτική οδό ΝΡ-κΒ σε PDAC, ρύθμιση προς τα κάτω του TRAF2 προτιμάται η ρύθμιση προς τα κάτω του TRAF3 ή cIAPs αντ ‘αυτού. Μια εξήγηση για μια τέτοια ρύθμιση μπορεί να είναι ότι cIAPs προηγουμένως αποδείχθηκαν ότι είναι σημαντικά για την επιβίωση των κυττάρων του όγκου [22]. Προς τα κάτω ρύθμιση του TRAF2 μπορεί να αποτρέψει ερέθισμα εξαρτώμενη αποδόμηση του cIAP1 /2 [6], ως εκ τούτου επιτρέποντας ιδιοσυστατική σηματοδότηση επιβίωσης μέσω ΙΑΡ. Επιπλέον, TRAF2 είναι ένας σημαντικός σύνδεσμος μεταξύ σκαλωσιές cIAPs και ΝΙΚ και απώλεια του TRAF2 στην πλειονότητα των κυτταρικών γραμμών PDAC δοκιμαστεί, μπορεί να αποσυνδέσει cIAP1 /2 με τη μεσολάβηση σηματοδότηση επιβίωσης από τη λειτουργία τους να καταστρέφουν τα κύτταρα από ΝΙΚ. Έτσι, με αυτόν τον μηχανισμό κύτταρα PDAC μπορούν να διατηρούν τόσο υψηλή ικανότητα για να επιβιώσουν, καθώς επίσης και υψηλά ποσοστά πολλαπλασιασμού (Εικ. 8).

προτεινόμενος μηχανισμός πώς δραστηριότητας ΝΙΚ διατηρείται σε κυτταρικές σειρές PDAC. Σε φυσιολογικά κύτταρα παγκρεατικού πόρου TRAF2 εκφράζεται και σχηματίζει ένα σύμπλοκο αποικοδόμησης για ΝΙΚ με TRAF3, cIAP1 /2. Αυτό οδηγεί σε ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση του ΝΙΚ. Σε PDAC κύτταρα, TRAF2 αποικοδομείται από ουβικουϊτινίωση. Αυτό αποτρέπει το σχηματισμό ενός συμπλόκου υποβάθμισης ΝΙΚ και ΝΙΚ παραμένει εκφράζεται. ΝΙΚ σηματοδοτεί στο σύμπλοκο μη κανονικά ΙΚΚ και ΙΚΚα διαμεσολαβεί ενεργοποίηση του NF-κΒ2 και σχηματισμός RelB διμερή /P52. Καθαρό αποτέλεσμα αυτών των σημάτων είναι μια αύξηση του πολλαπλασιασμού των παγκρεατικών κυττάρων καρκίνου.

Η

Για να ενισχύσουμε μας μηχανιστική

in vitro

ανάλυση, αναλύσαμε 55 ανθρώπινα δείγματα PDAC (βαθμοί 1-3) και βρήκαν ότι περίπου το 69% έδειξε μειωμένη έκφραση του TRAF2 και των αυξημένων επιπέδων ΝΙΚ και pT559-ΝΙΚ (Εικ. 7) παρόμοια όπως είχαμε παρατηρήθηκαν σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (Σχ. 1 και 2). Ωστόσο, περίπου το 31% των δειγμάτων που αναλύθηκαν έδειξαν υψηλή έκφραση TRAF2 παρόμοια όπως περιγράφηκε προηγουμένως από Trauzold

et al.

[23]. Είναι σημαντικό ότι, σε όλα αυτά τα δείγματα, η έκφραση ΝΙΚ επίσης ρυθμίζεται αυξητικά. Είναι πιθανό ότι αυτό το υποσύνολο των δειγμάτων ασθενών εκφράζουν την υψηλότερη παραλλαγή μοριακό βάρος του TRAF2 που είχαμε παρατηρήθηκαν εμφανίζονται σε μερικές κυτταρικές σειρές PDAC (δηλ HPAFII). Αυτό θα χρειαστεί περαιτέρω επεξεργασία σε μελλοντικές μελέτες. Όταν το διαχωρισμό των όγκων κατά βαθμό, βρήκαμε ότι όγκους με υψηλά TRAF 2 επίπεδα ήταν καλά διαφοροποιημένα καρκινώματα του βαθμού 1. Οι όγκοι αυτού του βαθμού δεν αυξάνεται με ταχείς ρυθμούς, ενώ οι όγκοι των βαθμών 2 και 3 είναι μέτρια ή κακώς διαφοροποιημένο, αντίστοιχα, και έχουν την τάση να αναπτυχθούν και να εξαπλωθούν περισσότερο επιθετικά. Αυτή η αύξηση στην επιθετική ανάπτυξη και μειωμένη έκφραση TRAF2 σε βαθμό 2 και 3 όγκων συσχετίζεται με μας

in vitro

δεδομένα που δείχνουν ότι η ανωτέρω περιγραφείσα TRAF2 /ΝΙΚ μηχανισμός σηματοδότησης μπορούν να μεσολαβήσουν πολλαπλασιασμό των παγκρεατικών κυττάρων του όγκου.

συνοπτικά, τα αποτελέσματα μας εντοπισμό του πρωτεασώματος μειορρύθμιση του TRAF2 ως μηχανισμός για το πώς σταθερότητας ΝΙΚ μπορεί να ρυθμιστεί σε PDAC. Στόχευση αυτό το μονοπάτι για να μειώσετε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων μπορεί να αντιπροσωπεύει μια νέα στρατηγική για την θεραπεία σε PDAC. Για παράδειγμα, η εναλλακτική πορεία ενεργοποίησης ΝΡ-κΒ είναι ευαίσθητη στην bortezomib αναστολέα πρωτεασώματος [20], [21]. Ως εκ τούτου, μία πιθανή προσέγγιση συνδυαστική θεραπεία θα ήταν να συνδυάσει βορτεζομίμπη με αναστολείς CIAP και /ή φάρμακα που επάγουν απόπτωση, όπως Γεμσιταβίνη.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

TMAs