Αφηρημένο

LC3s (map1-LC3A, Β και Γ) είναι δομικές πρωτεΐνες των μεμβρανών autophagosomal, που χρησιμοποιείται ευρέως ως βιοδείκτες της αυτοφαγία. Είτε αυτές οι τρεις πρωτεΐνες LC3 έχουν ένα παρόμοιο βιολογικό ρόλο στην αυτοφαγία παραμένει ασαφής. Εξετάζουμε παράλληλα οι υποκυτταρική πρότυπα έκφρασης των τριών πρωτεϊνών LC3 σε μια ομάδα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών, καθώς επίσης και σε κανονικούς ινοβλάστες MRC5 και HUVEC, χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία και ανάλυση κηλίδας Western των κλασμάτων κυττάρων. Στο κυτταρόπλασμα, υπήρχε μια ελάχιστη συν-εντοπισμό μεταξύ LC3A, Β και Γ χρώση, υποδηλώνοντας ότι οι σχετικές αυτοφαγοσώματα σχηματίζονται από ένα μόνο από τα τρία πρωτεΐνες LC3. LC3A έδειξε περιπυρηνική και πυρηνικού εντοπισμού, ενώ LC3B ήταν ισομερώς κατανεμημένα σε όλο το κυτταρόπλασμα και εντοπίζονται στις πυρηνισκικός περιοχές. LC3C βρισκόταν στο κυτταρόπλασμα και έντονα στους πυρήνες (εξαιρουμένων των πυρηνίσκους), όπου σε μεγάλο βαθμό συν-εντοπίζεται με την LC3A και την Beclin-1 αυτοφαγία έναρξη πρωτεΐνη. Beclin 1 είναι γνωστό ότι περιέχει ένα σήμα διακίνηση πυρηνικών υλικών. Αποκλεισμός λειτουργία πυρηνική εξαγωγή από Leptomycin Β οδηγεί σε πυρηνική συσσώρευση όλων LC3 και πρωτεΐνες Beclin-1, ενώ Ivermectin που μπλοκάρει πυρηνική εισαγωγή έδειξαν μείωση της συσσώρευσης, αλλά όχι σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Δεδομένου ότι οι ενδογενείς πρωτεΐνες LC3 χρησιμοποιούνται ως μείζων δείκτες αυτοφαγία σε κλινικές μελέτες και κυτταρικές σειρές, είναι απαραίτητο να ελέγχεται η εξειδίκευση των αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται, καθώς η κινητική αυτών των μορίων δεν είναι ταυτόσημες και μπορούν να έχουν ξεχωριστές βιολογικές ρόλους. Οι διακριτές υποκυτταρικές πρότυπα έκφρασης των LC3s παρέχει μια βάση για περαιτέρω μελέτες

Παράθεση:. Κουκουράκης MI, Καλαμίδα D, Γιατρομανωλάκη Α, Ζώης CE, Σιβρίδης Ε, Pouliliou S, et al. (2015) Autophagosome Πρωτεΐνες LC3A, LC3B και LC3C έχουν διακριτά υποκυτταρικά Κινητική κατανομή και έκφραση στις γραμμές καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 10 (9): e0137675. doi: 10.1371 /journal.pone.0137675

Επιμέλεια: Srinivasa Μ Srinivasula, IISER-TVM, ΙΝΔΙΑ

Ελήφθη: 4 του Ιουλίου 2015? Αποδεκτές: 20 του Αυγούστου 2015? Δημοσιεύθηκε: 17 Σεπτεμβρίου του 2015

Copyright: © 2015 Κουκουράκης et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το «ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗ ΚΑΙ ΔΙΑ ΒΙΟΥ ΜΑΘΗΣΗ – αριστεία» του έργου, ο κωδικός δεν 520, ΕΣΠΑ 2007-2013, ΓΓΕΤ αριθμό απόφασης 12605 /09.26.2012 (URL: https://www.espa.gr/el/pages/proclamationsfs.aspx?item=1736). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Autophagy είναι μια σημαντική ενδοκυτταρική διαδρομή για την αποικοδόμηση και την ανακύκλωση των μακρόβιων πρωτεϊνών και όλη την οργανίδια [1,2]. LC3s (map1-LC3s) είναι δομικές πρωτεΐνες των μεμβρανών autophagosomal. Η οικογένεια γονιδίων LC3 άνθρωπος έχει τρία μέλη, LC3A, LC3B και LC3C, ενώ οι δύο παραλλαγές της πρωτεΐνης LC3A έχουν εντοπιστεί [3,4]. Η οικογένεια γονιδίων LC3 άνθρωπος έχει τρία μέλη η LC3A, LC3B και LC3C ενώ σε ένα πρόσφατο έγγραφο έχει αναφερθεί πέντε μέλη, LC3A (παραλλαγή-1, παραλλαγή-2), LC3B, LC3B2 και LC3C [4]. Η μορφή LC3-ΙΙ είναι ένα από τα κύρια συστατικά της μεμβράνης autophagosome (LC3A-ΙΙ και LC3B-ΙΙ, επίσης LC3C-ΙΙ αλλά δεν μελετήθηκε εδώ) που βρίσκεται τόσο στο εσωτερικό και εξωτερικό χώρο της μεμβράνης. Η LC3-ΙΙ προέρχεται από μία πρωτεΐνη proLC3 ~ 30kDa μετά από διάσπαση με autophagin Atg4 να παράξει το δραστικό κυτοσολική μορφή LC3-Ι. Αυτό με τη σειρά του ενεργοποιείται από ATG7, και στη συνέχεια μεταφέρονται σε Atg3, ένα δεύτερο Ε2 ένζυμο που μοιάζει, να γίνει μια μορφή δεσμευμένη σε μεμβράνη, LC3-II [5]. Μετά το σχηματισμό autophagosome, το LC3-ΙΙ που βρίσκεται στην εξωτερική τοποθεσία απελευθερώνεται στο κυτοσόλιο και η LC3-ΙΙ που βρίσκεται στο εσωτερικό χώρο αποικοδομείται από υδρολάσες [6]. Σε αυτή την τελευταία μορφή, LC3-II εντοπίζεται στα σφαιρικά autophagosomal και autolysosomal μεμβρανών, σχηματίζοντας ένα κατάλληλο δείκτη της αυτοφαγικά δραστηριότητας [6,7].

Είτε αυτές οι τρεις πρωτεΐνες LC3 έχουν ένα παρόμοιο βιολογικό ρόλο στην αυτοφαγία ή άλλες μονοπάτια παραμένει ασαφής. Στη βιβλιογραφία, οι περισσότερες μελέτες επικεντρώνονται σε μια γενική έκφραση LC3, χωρίς την υποβολή εκθέσεων σχετικά με την ειδικότητα των αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται, με βάση την αυθαίρετη παραδοχή ότι οι μορφές Α και Β είναι ισοδύναμες. Στην παρούσα μελέτη εξετάζουμε, μετά εκτενώς επικύρωση ειδικότητα αντισώματος, την έκφραση παράλληλα των τριών LC3A, πρωτεΐνες Β και C σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές, που δείχνει διαφορετικά πρότυπα του υπο-κυτταρικό εντοπισμό, υποδηλώνοντας μια ξεχωριστή βιολογικό ρόλο αυτών των πρωτεϊνών αδελφή .

Αποτελέσματα

Ταυτοποίηση LC3A και ειδικών αντισωμάτων Β

Η εξειδίκευση των αντισωμάτων δοκιμάστηκαν ενάντια στα εμπορικά διαθέσιμα ανθρώπινων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών LC3A και LC3B δείχνεται στο Σχήμα 1Α. Τα αντισώματα αντι-LC3A (ap1805a και ab62720) είναι ειδικά για την πρωτεΐνη LC3A και τα αντισώματα αντι-LC3B (5F10 και NB100-2220) είναι ειδικά για την πρωτεΐνη LC3B. Η L8918, NB600-1384 και L7543 μπορεί να συνδεθεί είτε με την LC3A ή LC3B, αλλά με διαφορετική ευαισθησία, ενώ η ab52628 απέτυχε να ανιχνεύσει οποιαδήποτε από τις δύο ισομορφές κάτω από τις ίδιες συνθήκες.

(Α) Εξειδίκευση των διαφόρων αντισώματα αντι-LC3 δοκιμάστηκαν έναντι ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών LC3A και LC3B. (Β) Η LC3A και LC3B επεξεργασία μετά από 24 ώρες από βαφιλομυκίνη (100 nm) θεραπεία σε γλοιώματος και του καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές, χρησιμοποιώντας το ειδικό ab62720 LC3A και του LC3B ειδικών 5F10 αντισώματα (C) Διπλή ανοσοφθορισμός στην Α549 κυτταρική γραμμή με τη χρήση της ab62720 αναγνωρίζοντας αποκλειστικά η πρωτεΐνη LC3A και το αντίσωμα 5F10 που αντιδρά αποκλειστικά με LC3B. Σημειώνεται μια σαφώς διακριτή έκφραση LC3A στο πράσινο κενοτόπια με περιπυρηνικών /πυρηνικό εντοπισμό και LC3B κόκκινο κενοτόπια που έχουν μια διάχυτη, σε όλο το κυτταρόπλασμα, τον εντοπισμό. Δεν υπάρχουν αυτοφαγοσώματα αποτελείται από δύο πρωτεΐνες LC3A και LC3B (C1, C2), ενώ LC3A και LAMP2a δείχνουν εκτεταμένη colocalization (C3, C4). Η διακριτή ταυτότητα του LC3A και LC3B αυτοφαγοσώματα Επιβεβαιώθηκε επίσης υπό όξινες συνθήκες (C5) και μετά από έκθεση σε βαφιλομυκίνης (C6). (Δ) Διπλό ανοσοφθορισμός στην κυτταρική σειρά Α549 χρησιμοποιώντας το ab62720 αναγνωρίζει αποκλειστικά την πρωτεΐνη LC3A και το NB600-1384 που αντιδρά με τις δύο πρωτεΐνες LC3A και LC3B. Σημειώνεται ότι η πλειοψηφία των περιπυρηνικών /πυρηνικό LC3A (πράσινο) κενοτόπια δείχνουν διπλό ανοσοφθορισμό (κίτρινο), ένα αποτέλεσμα της διπλής αντιδραστικότητας LC3A /LC3B που παράγει το αντίσωμα NB600-1384. (Ε) LC3A και LC3B siRNAs μπλοκάρουν ειδικά την έκφραση των πρωτεϊνών LC3A και LC3B, αντίστοιχα, σε Α549 κυτταρική γραμμή (E1,2,3). Στην Ε4 η αντιδραστικότητα των LC3A (ab62720 Ab) και του LC3B (5F10 αντίσωμα) δείχνεται, μετά αποσιώπηση του LC3A ή των γονιδίων LC3B, στο Α549 κυτταρική γραμμή.

Η

επικεντρώθηκε τόσο LC3A και πρωτεΐνες LC3B να αναλύσει απόκριση αυτοφαγικά να βαφιλομυκίνη σε κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας τις δύο αντισώματα τα οποία αναγνωρίζουν επιλεκτικά αυτές τις ισομορφές. Οι δύο ισομορφές έδειξαν διαφορετική γραμμή βάσης και έκφραση προφίλ απόκρισης (Σχήμα 1Β) Υπό βαφιλομυκίνης στρες υπήρχε συσσώρευση της LC3A-ΙΙ και LC3B-ΙΙ σε όλες τις κυτταρικές σειρές, γεγονός που υποδηλώνει ότι αμφότερες οι πρωτεΐνες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την αξιολόγηση αυτοφαγικά ροής (Σχήμα 1Β) . Οι κυτταρικές γραμμές T98G και ΒΤ474 έχουν υψηλότερη ροή αυτοφαγικά (όπως εκτιμάται είτε με LC3A ή LC3B ανοσοστύπωση) σε σύγκριση με την U87MG και MDA-MB-231, αντίστοιχα (Σχήμα 1Β).

LC3A και LC3B εκφράζουν αυτοφαγοσώματα

συνεστιακή μικροσκοπία ανοσοφθορισμού με διπλό LC3A /Β, χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα LC3 τύπου αποκάλυψε ότι LC3A και LC3B αυτοφαγοσώματα είναι διακριτές και ότι δεν υπάρχουν αυτοφαγοσώματα εκφράζουν αμφότερες τις πρωτεΐνες (σχ 1C1 και 1C2). Αυτό το εύρημα ήταν καθολική σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν. ανάλυση colocalization αποκάλυψε ένα ποσοστό & lt? 1%, ενώ LC3A /LAMP2A colocalization στα κύτταρα ελέγχου ήταν υψηλότερο από το 20% (Σχήμα 1C3 και 1C4)

Η διακριτή ταυτότητα LC3A έναντι LC3B αυτοφαγοσώματα επιβεβαιώθηκε επίσης μετά την εντατικοποίηση της αυτοφαγία. υπό όξινες συνθήκες (Σχήμα 1C5) και μετά από autophagy φραγή ροής μετά από έκθεση σε βαφιλομυκίνη (Σχήμα 1C6). Αντίθετα, οι μη-ειδικά αντισώματα παρουσίασαν ένα ευρύ υπέρθεση έκφρασης, ένα αποτέλεσμα της διπλής αναγνώρισης των LC3A και LC3B από το αντίσωμα (Σχ 1D1 και 1D2).

Η χρήση siRNA για LC3A και LC3B, αυτά μπλοκάρει συγκεκριμένα τη συσσώρευση της LC3A ή αυτοφαγοσώματα LC3B, αντίστοιχα (Σχήμα 1E1, 1E2 και 1E3). Φίμωση LC3A ή LC3B επιβεβαίωσε την απώλεια της ταυτότητας των αντίστοιχων πρωτεϊνών στη Δυτική κηλίδες (Εικ 1E4).

Η κυτταροπλασματική LC3A και μοτίβα εντοπισμού LC3B

Η κατανομή των LC3A και LC3B στο κυτταρόπλασμα ήταν πολύ διαφορετικές. LC3A συσσωρεύθηκε κυρίως στην περιπυρηνική περιοχή, ενώ LC3B ήταν ομοιόμορφα κατανεμημένα σε όλο το κυτταρόπλασμα. Αυτό το φαινόμενο ήταν εμφανής σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν και, όπως φαίνεται από κυτταροπλασματική ανάλυση ένταση έκφρασης, περιπυρηνική LC3A φτάσει έως και 90% (εύρος 60-90%) της κυτταροπλασματικής περιεκτικότητα ολικής πρωτεΐνης (Εικ 2A1-2A7). Περιστασιακά, μικρά LC3A + αυτοφαγοσώματα περιλαμβάνονται στο LC3B + αυτοφαγοσώματα ήταν εμφανής στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 2Α1 και 2Α2).

(Α) Ομοεστιακή διπλού ανοσοφθορισμού για LC3A (πράσινο) και LC3B (κόκκινο) σε διάφορες κυτταρικές σειρές. Σημείωσε τη συσσώρευση LC3A στην περιπυρηνική περιοχή, ενώ LC3B διανέμεται σε όλο το κυτταρόπλασμα (A1-7). αδρανών υλικών LC3, υποδηλώνουν μικρές LC3A + αυτοφαγοσώματα περιλαμβάνονται στο LC3B + αυτοφαγοσώματα, είναι περιστασιακά παρόντες (κουτιά σε a1,2). Western blots επιβεβαιώνουν την πυρηνική παρουσία LC3A στους πυρήνες, κυρίως με τη μορφή LC3A-ΙΙ (Α8). (Β) πυρήνιο βάφονται με την MIB1 /πράσινο (Β1), το LC3B /κόκκινο (Β2), αλλά όχι το LC3A /βιολετί αντίσωμα (Β3)? LC3A συγκεκριμένες ap1805a και του LC3B χρησιμοποιήθηκαν ειδικά 5F10 αντισώματα. Αυτό επιβεβαιώνεται σε διπλή ανοσοχρώση για LC3A /MIB1 (Β4), LC3B /MIB1 (Β5) και LC3A /LC3B (Β6). Σημειώνεται ότι LC3B χρωματίζει τις εσωτερικές πυρηνισκικός περιοχές, ενώ MIB1 η περιφερειακή. (C) ακτινομυκίνη D ζημιές πυρηνίσκοι και διαταράσσει την nucleaolar LC3B και MIB1 εντοπισμού (C1). Όξινες συνθήκες (ρΗ = 6,5? C2) ή υπερθερμία (40 ° C? C3) δεν καταργεί τη διανομή LC3B στην πυρηνίσκους ούτε LC3A στους πυρήνες. Lamin χρησιμοποιείται επίσης ως έλεγχος για την επιβεβαίωση της παρουσίας των πυρήνων μόνο στον πυρηνικό κλάσμα.

Η

Πυρηνική LC3A και LC3B εντοπισμό πρότυπα

LC3A σαφώς εντοπισμένη στους πυρήνες όλων των καρκίνων κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, συμπεριλαμβανομένου του η γραμμή του ανθρώπου MRC5 ινοβλαστών (Εικ 2A1-2A7) HUVEC s και. Ανάλυση κηλίδας Western μετά την τριπλή κλασματοποίησης (πυρηνικά pellet-υπερκείμενο) έδειξε σαφώς την παρουσία των πρωτεϊνών LC3A στους πυρήνες, περισσότερο εμφανής ως μορφή LC3A-ΙΙ, που ήταν πιο εμφανή στα κύτταρα γλοιοβλαστώματος (Εικ 2A8).

LC3B ήταν κακώς εκφράζεται σε πυρήνες αλλά εξέφρασε έντονα στις πυρηνισκικός περιοχές, μια περιοχή που ήταν αρνητικό για LC3A. Πυρηνικός ισχυρή χρώση είναι εμφανής σε 60-95% του κυτταρικού ανάλογα με την κυτταρική γραμμή. Για παράδειγμα, το Α549 πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου εμφανίζει αυτό το μοτίβο χρώσης στο 60% των καλλιεργημένων κυττάρων, ενώ αυτό είναι τόσο υψηλό όπως 95% στην Η1299 κυτταρική γραμμή καρκίνου του πνεύμονα. Σχ 2B1-2B6 δείχνουν ένα τυπικό μοτίβο έκφρασης σε 4-χρώμα συνεστιακή μικροσκόπηση. Κί67 λεκέδες πυρηνίσκοι και συνεντοπίζεται με LC3B, αλλά όχι LC3A. Η θεραπεία των κυττάρων με ακτινομυκίνη D (Σχήμα 2C1) που ζημιές πυρηνίσκοι οδήγησε σε έλλειψη LC3B και Κί67 εντοπισμό στους πυρήνες. Σε αντίθεση, η έκθεση των κυττάρων σε όξινες συνθήκες (ρΗ = 6,5) ή υπερθερμία (40 ° C) για 24 ώρες δεν καταργεί τη διανομή LC3B στην πυρηνίσκους ή LC3A στους πυρήνες (Εικ 2C2 και 2C3). Η ανάλυση στυπώματος Western στο πυρηνικό κλάσμα επιβεβαίωσε την παρουσία του LC3B πρωτεΐνης (Σχήμα 3).

(Α, Β, C) επώαση 24h με Leptomycin Β σε 10 ng /ml, τα αποτελέσματα στην πυρηνική συσσώρευση του LC3A, LC3C και Beclin-1 στον πνεύμονα Α549, Η1299 και glioblastom U87, κυτταρικές γραμμές Τ98. (D) επώαση 24h με Ivermectin σε 100 μg /ml, μείωσε την πυρηνική έκφραση του LC3A /Beclin-1 σε Α549 και κυτταρικές γραμμές Η1299 και αύξησε την περιπυρηνική συσσώρευση LC3A στην κυτταρική σειρά Η1299. (Ε) Western blots της συσσώρευσης επιβεβαιώνουν πυρηνικό κλάσμα κυττάρων του LC3s και Beclin-1 στον πνεύμονα και κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος μετά από επώαση με Leptomycin B. Η μείωση των πρωτεϊνών μετά την επώαση με Ivermectin δεν ήταν συνεπής σε όλες τις κυτταρικές σειρές.

η έκφραση της LC3C

LC3C εκφράστηκε ξεκάθαρα στο κυτταρόπλασμα και πιο εντατικά στους πυρήνες των κυττάρων (Εικόνα 4Α). ανάλυση κηλίδας Western έδειξε μία σαφή παρουσία LC3C στο πυρηνικό κλάσμα (Εικ 4Ε). Δεν υπήρχε εμφανής εντοπισμό των πυρηνισκικός περιοχές και σε διπλό ανοσοφθορισμό με LC3B υπάρχει έλλειψη σαφώς collocalizaton στην πυρηνίσκους και στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 4Β). Σε διπλή ανοσοφθορισμού, LC3C εκτενώς συν-εντοπίζεται με την LC3A στον πυρηνικό τομέα (Σχήμα 4C και 4D), ενώ colocalization τους ήταν ελάχιστη στο κυτταρόπλασμα. Η εξέχουσα έκφραση των LC3C στους πυρήνες επιβεβαιώθηκε επίσης σε ανάλυση κηλίδος western (Σχήμα 4Ε). Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν. Ο Πίνακας 1 συνοψίζει τα διακριτά μοτίβα έκφρασης για LC3A, LC3B και LC3C.

(Α) Κυτταροπλασματικά και πυρηνική χρώση των LC3C (κόκκινο) στην κυτταρική σειρά U87. (Β) Διπλό LC3C (κόκκινο) και LC3B (πράσινο) ανοσοχρώση σε κύτταρα U87 δείχνει έλλειψη συν-εντοπισμό μεταξύ των δύο πρωτεϊνών, τόσο στο κυτταρόπλασμα και τα πυρηνικά πυρηνισκικός περιοχές /. (C, D) Διπλή LC3C (κόκκινο) και LC3A (πράσινο) ανοσοχρώση που δείχνει συν-εντοπισμό μεταξύ των δύο πρωτεϊνών, κυρίως στον πυρηνικό τομέα (U87 και Τ98 κυτταρικές γραμμές). (Ε) κηλίδα Western για LC3C στον πυρηνικό (Ν), Pellet (Ρ) και Διαλυτό (S) κλάσμα U87 και Τ98 κύτταρα. «Μ» είναι ο δείκτης και Lamin χρησιμοποιείται ως έλεγχος για την επιβεβαίωση της παρουσίας των πυρήνων μόνο στον πυρηνικό κλάσμα.

Η

LC3 πυρηνο-κυτοσολικού εμπορίας

Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με Leptomycin Β, ειδικώς και ισχυρός αναστολέας της CRM1 /exportin 1 μονοπάτι πυρηνικής εξαγωγής. Στα 10 ng /ml για επώαση 24h, η συσσώρευση LC3A στους πυρήνες αυξήθηκε, γεγονός που υποδηλώνει μια απόφραξη της κινητικής εξώθηση LC3A από τους πυρήνες (σχήμα 3Α). Ενδιαφέρον, LC3A πυρηνική συσσώρευση έδειξε μια έντονη συν-εντοπισμό με την αυτοφαγία σηματοδότησης πρωτεΐνης Beclin-1, και παρόμοια κινητική υπό έκθεση Leptomycin Β (Σχήμα 3Β). Παρόμοια κινητική και τα πρότυπα colocalization με Beclin-1 επιβεβαιώθηκε για την πρωτεΐνη LC3C (Σχήμα 3C).

Ivermectin, από την άλλη πλευρά, είναι ένας ισχυρός αναστολέας της importin

α

/

β

(Imp

α

/

β

1) πυρηνικής εισαγωγής εξαρτάται από τις μεταφορές. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με Ivermectin σε διάφορες συγκεντρώσεις. Μετά από επώαση 24 ώρες σε 100 μg /ml, η συσσώρευση LC3s και του Beclin-1 στους πυρήνες μειώθηκε, ενώ κυτταροπλασματική χρώση ήταν αυξημένη (Σχήμα 3D και 3Ε). Τα ευρήματα, ωστόσο, ποικίλη μεταξύ κυτταρικές σειρές, όπως η έκφραση μείωση αυτή δεν επιβεβαιώθηκε για όλες τις πρωτεΐνες σε όλες τις κυτταρικές σειρές.

Συζήτηση

Στους ανθρώπους η οικογένεια γονιδίων LC3 έχει πέντε μέλη, η LC3Av1 ( παραλλαγή 1? NM_032514), LC3Av2 (παραλλαγή 2? NM_81509), LC3B (NM_022818), LC3B2 (NM_001085481) και η LC3C (NM_001004343). Η geneloc για LC3A είναι 20.q11.22 ενώ για το MAP1LC3B είναι 16q24.2 και MAP1LC3C είναι 1q43. Τόσο LC3A και LC3B εκφράζονται διαφορικά σε φυσιολογικούς ιστούς [3,4,7,8]. Περαιτέρω, η LC3C (η τρίτη ισομορφή της οικογένειας LC3) πιστεύεται ότι είναι ελάχιστα ή δεν εκφράζονται στους περισσότερους φυσιολογικούς ιστούς [3,4,7]. Ωστόσο, μόνο η LC3A (παραλλαγή 1), LC3B και LC3C υπήρξε δείχνουν να έχουν μετά την τροποποίηση μετάφραση και τη δημιουργία της μορφής II [4]. Περαιτέρω, πηγαίνοντας πίσω στην βιβλιογραφία [3,7,8] στην ιστοσελίδα της μετάφρασης μετά την MAP1LC3B μόνο δεν διατηρείται. Για παράδειγμα, He et al. 2003 [3] ανέφερε ότι απαραίτητη θέση για την ξεχωριστή τροποποίηση μετά την μετάφραση του MAP1LC3B είναι Lys-122 αντί για το συντηρημένο Gly-120, που αναφέρονται για την MAP1LC3A και MAP1LC3C. Από την άλλη πλευρά Tanida et al. 2005 [8] ανέφεραν ότι το καρβοξυλ άκρο του MAP1LC3B διασπάται για να εκθέσει Gly (120) για περαιτέρω αντιδράσεις ubiquitylation-όπως. Σε αυτές τις δύο εκδόσεις ραφές ότι το MAP1LC3B παράγει το LC3B-II, ενώ η μετα-μεταφραστική τροποποίηση ιστοσελίδα δεν διατηρείται.

Στη βιβλιογραφία η καλύτερα μελετημένα ενδογενούς αυτοφαγικά δείκτης είναι LC3B. Τονίζεται, ωστόσο, ότι η πλειοψηφία των μελετών που έχουν διεξαχθεί αντισώματα αντι-LC3 χρήση θεωρείται ότι είναι αντι-LC3B και όχι αντι-LC3A, χωρίς να έχει επικυρωθεί η εξειδίκευση τους [9,10,11]. Υπάρχει μια υψηλή ταυτότητα μεταξύ του LC3A και LC3B ισομορφή, υποδεικνύοντας ότι οι επίτοποι που χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη ειδικών αντισωμάτων είναι καθοριστικής σημασίας. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα μας μερικά αντισώματα δεν είναι ειδικά, αναγνωρίζοντας τα δύο ισόμορφα με διαφορετικό ευαισθησία, ενώ άλλοι είναι σε θέση να ανιχνεύσει τις συγκεκριμένες ισομορφές LC3A και LC3B. Σε κάθε περίπτωση, προσδιορίζοντας την LC3 τύπου μελετηθεί θα ήταν περιττή, εάν πράγματι οι διαφορετικές πρωτεΐνες LC3 είχαν το ίδιο πρότυπο έκφρασης και της βιολογίας σε φυσιολογικούς και καρκινικούς ιστούς. Ωστόσο, αυτό δεν είναι η περίπτωση, όπως φαίνεται στην παρούσα μελέτη.

Σε προηγούμενη μελέτη μας [12], που εξετάζει την αυτοφαγικά ροή σε ιστούς ποντικών μετά από διάφορες καταπονήσεις, ανοσοαποτύπωση εργασία έδειξε ότι η πρωτεΐνη LC3A εξής διακριτά μοτίβα του LC3A-Ι και-ΙΙ LC3A αλλαγές στο ήπαρ, πνεύμονα, νεφρού και καρδιάς ιστούς των ποντικών. Αυτό τόνισε ότι LC3A είναι επίσης τονίσει επαγόμενων και έχει συγκεκριμένες μορφές έκφρασης των διαλυτών και autophagosome δεσμευμένη μορφή του. Εδώ, σε ομοεστιακό μικροσκόπιο με τη χρήση επικυρωμένων ειδικά αντισώματα αντι-LC3 επιβεβαιώσαμε ότι LC3A και LC3B αυτοφαγοσώματα είναι διακριτές, ποτέ αποτελείται από τις δύο πρωτεΐνες και έχουν διακριτές υποκυτταρική κατανομή. Η LC3A επικρατούσα περιπυρηνική έκφραση έρχεται σε αντίθεση με τη μάλλον ομοιογενή κατανομή του LC3B σε όλο το κυτταρόπλασμα, γεγονός που υποδηλώνει ένα ξεχωριστό βιολογικό ρόλο μεταξύ των δύο autophagosome τύπους. Ενδιαφέροντος, σε ένα έγγραφο από Bai et al. 2012 [4]. LC3A και LC3B συχνά συν-εντοπισμένη στην ίδια puncta σε συνθήκες λιμοκτονίας (67%), ενώ σε βασικές συνθήκες ο συν-εντοπισμό ήταν κατά 13% σε κύτταρα Saos-2. Σημειώσαμε επίσης, σε συνεστιακή μικροσκοπία, ένα σποραδικές συνεντόπισης της LC3A και LC3B, δίνοντας την εντύπωση ενός μεγάλου LC3B + autophagosome εύπεπτος ένα LC3A + ένα.

Η κυτταροπλασματική βιολογία μεσολάβηση LC3 αυτοφαγία είναι καλά μελετημένη. Ο ρόλος των LC3s στους πυρήνες παραμένει ασαφής. Karim κ.ά. ανιχνεύεται πρώτα την μορφή πρωτεΐνης LC3-ΙΙ στους πυρήνες των ηπατοκυττάρων αρουραίου [13], η οποία είναι σύμφωνη με αδημοσίευτες εμπειρία μας με ηπατοκύτταρα BALB /c ποντικό. Drake et al ανέφεραν ότι αν και LC3A και Β μοιράζονται καμία γνωστή σήμα πυρηνικού εντοπισμού, ένα πυρηνικό σήμα εξαγωγής μπορεί να υπάρχουν, που βρίσκεται στα υπολείμματα 63 έως 73 της ανθρώπινης LC3 [14]. EGFP-LC3 πρωτεΐνη ήταν σαφώς εντοπισμένη στους πυρήνες των κυττάρων COS-7. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιώντας ένα ευρύ φάσμα καρκινικών κυτταρικών γραμμών, καθώς και φυσιολογική ανθρώπινη ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα, επιβεβαιώσαμε την πυρηνική παρουσία και των τριών πρωτεϊνών LC3. Υπήρχε, ωστόσο, μια εντυπωσιακή διαφορά εντοπισμός της πρωτεΐνης LC3B που κατά προτίμηση εντοπίζεται στις πυρηνισκικός περιοχές, ενώ οι μορφές Α και Γ ήταν εντοπισμένες στο εξω-πυρηνισκικός πυρηνικό τομέα. Ο ρόλος αυτής της LC3B πυρηνισκικός έκφρασης παραμένει ένα μυστήριο, όπως ακριβώς και το ρόλο της LC3A και LC3C στον υπόλοιπο πυρήνα. Αυτός et al πρότεινε ότι η πυρηνική LC3 μπορεί να εμπλέκεται στον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε προμυελοκυτταρική λευχαιμία [15].

Ερευνήσαμε κατά πόσο είναι γνωστά μονοπάτια της πυρηνικής μεταφοράς που συμμετέχουν στην πυρηνο-κυτοσολικής διακίνησης LC3s. Η εισαγωγή και εξαγωγή μονοπάτι πυρηνική πρωτεΐνη που προκαλούνται από συγκροτήματα πυρηνικού πόρου (NPC) μελετήθηκε, χρησιμοποιώντας τον παράγοντα Leptomycin Β, ένα αντιμυκητιασικό αντιβιοτικό, ότι ειδικά και ισχυρά αναστέλλει τη CRM1 /exportin 1 μονοπάτι πυρηνικής εξαγωγής από απευθείας δέσμευση της πρωτεΐνης CRM1 [16 , 17]. Μετά την επώαση 24h του πνεύμονα και κυττάρων γλοιοβλαστώματος γραμμές, μια σημαντική συσσώρευση LC3A, LC3C και πρωτεϊνών Beclin-1 ήταν εμφανής με συνεστιακή μικροσκοπία, η οποία επιβεβαιώθηκε και σε ανάλυση κηλίδος Western. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με το εύρημα με Drake et al [14], όπου μια σύντομη επώαση 3h του COS-7 και HeLa κυττάρων με Leptomycin δεν οδήγησε σε πυρηνική συσσώρευση EGFP-LC3. Beclin-1 περιέχει ένα σήμα πλούσιες σε λευκίνη πυρηνικής εξαγωγής και η διατάραξη των CRM1 αποτελέσματα λειτουργίας στην πυρηνική συσσώρευση Beclin-1 [18]. Ενδιαφέροντος, Beclin-1 συν-εντοπίζεται στους πυρήνες με LC3A και LC3C, ενώ δεν εξέχοντα συν-εντοπισμό σημειώθηκε στο κυτταρόπλασμα. Είτε Beclin-1 πρόσδεση σε LC3 απαιτείται για την πυρηνική είσοδο ενός σύνθετες απαιτήσεις περαιτέρω έρευνα.

Ivermectin, από την άλλη πλευρά, είναι ένας ισχυρός αναστολέας της importin

α

/

β

(Imp

α

/

β

1) πυρηνική εισαγωγή εξαρτώνται από τις μεταφορές, με καμία επίδραση επί των πρωτεϊνών που περιέχουν το σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NLSs) αναγνωρίζεται από εναλλακτικές οδούς πυρηνικής εισαγωγής [19] η επώαση των καρκινικές κυτταρικές γραμμές με Ιβερμεκτίνη οδήγησε σε μειωμένη έκφραση του LC3s και Beclin-1 στους πυρήνες, ένα αποτέλεσμα, ωστόσο, ότι ποικίλη μεταξύ των κυτταρικών σειρών και των πρωτεϊνών που εξετάστηκαν.

από ενδογενείς πρωτεΐνες LC3 είναι σημαντικοί δείκτες της αυτοφαγία, είναι απαραίτητο για να ελέγξετε την ειδικότητα των αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται κατά την εκτέλεση πειραμάτων για LC3A ή μεταποίηση LC3B σε απάντηση σε διαφορετικό τύπο στρεσογόνους παράγοντες. Αυτά τα μόρια δεν είναι ταυτόσημες και μπορούν να έχουν διαφορετικές βιολογικές ρόλους, δεν είναι καλά διευκρινιστεί ακόμη. Η πυρηνισκικό εντοπισμό LC3B και η πυρηνική LC3A, LC3C και Beclin-1 συσσώρευσης που βρέθηκαν στην παρούσα μελέτη παρέχει μια βάση για περαιτέρω μελέτες σχετικά με την ξεχωριστή βιολογικός ρόλος αυτών των πρωτεϊνών μπορεί να έχει σε κανονικές και καρκινικούς ιστούς.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειες γραμμή κυττάρων

Ο καρκίνος του πνεύμονα κυτταρικών γραμμών Α549 (πνεύμονας ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα, CLS GmbH, Germany), και Η1299 (ανθρώπινα μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα, ATCC), κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος U87MG ( ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος-αστροκύτωμα, CLS GmbH, Germany) και T98G (ανθρώπινη πολύμορφο γλοιοβλάστωμα, ATCC), ο καρκίνος του μαστού κυτταρικές γραμμές (HER2 + ΒΤ474, αρνητικός HER MDA-MB-231, DA3? ATCC), όπως επίσης και τα εμβρυϊκά MRC5 ινοβλάστες κυτταρικές γραμμές ( CLS κυττάρων Γραμμή Εξυπηρέτησης, Γερμανία) καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας ϋΜΕΜ βασικό μέσο (31885-023, Gibco). κύτταρα HUVEC (CLS κυττάρων Γραμμή Εξυπηρέτησης, Γερμανία) καλλιεργούνται σε συγκεκριμένο μέσο (ΕΒΜ ™ -2 Βασικό Μεσαίο με ΕΓΣ ™ -2 SingleQuots ™ Παράγοντες Ανάπτυξης? Lonza) μελετήθηκαν επίσης. Το βασικό μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% FBS (FB-1000/500, Biosera), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (15140-122, Gibco) και 2 mM L-γλουταμίνη (25030, Gibco). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε πρότυπες συνθήκες, 37 ° C, 5% CO2 σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα και χρησιμοποιήθηκαν φτάνοντας 70-90% συρροή.

Χημεία

Οι κυτταρικές καλλιέργειες υπέστησαν κατεργασία χωριστά, όπως ορίζεται για χρόνο επώασης 24 ώρες με Leptomycin Β (L2913, Sigma-Aldrich) σε τελική συγκέντρωση 20 ng /ml και ιβερμεκτίνη (I8898, Sigma-Aldrich) σε τελική συγκέντρωση 100 μg /ml.

Ταυτοποίηση LC3A, Β και Γ ειδικά αντισώματα

για να ελέγξετε την εξειδίκευση των διαθέσιμων στο εμπόριο αντισωμάτων σχετικά με την ειδικότητά τους για LC3A ή LC3B τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν κατά την εμπορική διάθεση ανθρώπινων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών LC3A (H00084557-P01, Abnova) και LC3B ( H00081631-P01, Abnova):

Το πολυκλωνικό κουνελιού LC3A (1: 30.000, ab62720, Abcam, ένα συνθετικό πεπτίδιο PSDRPFKQRRSFADR συζευγμένο σε KLH δια ένα υπόλειμμα κυστεϊνης συνδετήρα, που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 2-15 του Ανθρώπου MAP1LC3A)

το πολυκλωνικό κουνελιού LC3A (1: 2500, 1805a, Abgent, ένα συνθετικό μεταξύ 97 ~ 120 αμινοξέα από το Ο-τερματική θέση διάσπασης χρήση ανθρώπινης διασπάται-LC3A ως ένα επιτόπιο)

Η μονοκλωνικά κουνέλι να LC3A (1: 1000, ab52628, Abcam)

το κουνέλι πολυκλωνικό να LC3B (1: 5.000, NB600-1384, Novus, ένα συνθετικό πεπτίδιο πραγματοποιηθεί προς τη Ν-τερματική περιοχή του ανθρώπινου LC3, ισομορφή πρωτεΐνη Β),

Το πολυκλωνικό κουνελιού LC3B (1: 5.000, L7543 Sigma-Aldrich, ένα συνθετικό πεπτίδιο που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 2-15 της ανθρώπινης LC3B, συζευγμένο με KLH)

το πολυκλωνικό κουνελιού LC3B (1: 5000, NB100-2220, Novus, ένα συνθετικό πεπτίδιο που γίνονται σε ένα τμήμα Ν-τερματική της αλληλουχίας ανθρώπινης πρωτεΐνης LC3B μεταξύ των υπολειμμάτων 1-100)

ο κουνελιού πολυκλωνικό να LC3 ( 1: 5.000, L8918, Sigma-Aldrich, ένα συνθετικό πεπτίδιο που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 36-49 της ανθρώπινης ισομορφής LC3A ένα, συζευγμένο με KLH μέσω C-τελικό κατάλοιπο κυστεΐνης)

το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι στην. LC3B. (1: 5000, 5F10, Nanotools, ένα συνθετικό πεπτίδιο που γίνονται σε ένα τμήμα Ν-τερματικό της ανθρώπινης πρωτεΐνης LC3B)

η

Όσον αφορά την αντι-anibody LC3C, χρησιμοποιήσαμε το κουνέλι πολυκλωνικά (18726 – 1-AP, Proteintech Ευρώπη) αντισώματος. Η ειδικότητα του αντισώματος αντι-LC3C χρησιμοποιείται έχει προηγουμένως αναφερθεί (https://www.ptglab.com/Products/Search.aspx?key=LC3C).

Η έκθεση σε βαφιλομυκίνη

LC3A και LC3B αναλύθηκαν σε κυτταρικές σειρές κάτω από την έκθεση στον αυτοφαγία διατάραξη παράγοντα βαφιλομυκίνης A [8]. Βαφιλομυκίνη Α είναι ένας ειδικός αναστολέας του τύπου vacuolar Η (+) – ΑΤΡάσης (V-ΑΤΡάση) σε κύτταρα, αναστέλλει την αύξηση της οξύτητας των οργανιδίων που περιέχουν αυτό το ένζυμο (όπως λυσοσώματα και ενδοσώματα) και, επιπλέον, αναστέλλει την σύντηξη autophagososomes με το λυσοσώματα [8]. Αξιολόγηση διεξήχθη 24 ώρες μετά την επώαση των κυττάρων με 100 ηΜ βαφιλομυκίνης.

SDS-PAGE και ανοσοκηλίδωση

Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS δύο φορές και υποβλήθηκαν σε λύση σε ένα που βασίζεται σε σακχαρόζη ρυθμιστικού λύσης (0.25 Μ σακχαρόζη , 25 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (πλήρης μίνι κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης, Roche Diagnostics GmbH) και αναστολείς φωσφατάσης (φωσφατάση κοκτέιλ αναστολέα, Cell Signaling Technology). Μία διαφορική φυγοκέντρηση των πλήρων κυττάρων προϊόντα λύσης οδήγησε σε πυρηνικά, υπερκείμενο (κυτταροπλασματική-υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες) και σφαιρίδιο (μεμβράνη πρωτεΐνες) κλάσματα. Πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την Pierce ™ Kit BCA Protein Assay (# 23225, Θέρμο Scientific).

Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε ασυνεχή πηκτώματα SDS με τη χρήση 10% διαχωριστική γέλη επί Beclin-1 ενώ για LC3A, LC3B και χρησιμοποιήθηκε LC3C 12,5% πηκτή διαχωρισμού. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε 5% πηκτή στοιβασίας. Σαράντα νανογραμμάρια των δειγμάτων που αναλύονται στη γέλη. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη χρησιμοποιώντας μεμβράνες PVDF-PSQ (Millipore Corp.). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε 150 mM NaCl, 10 mM Tris, ρΗ 7,5 (TBS) και 0,1% (ν /ν) Tween-20 σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες και ακολούθησε η υβριδοποίηση όλη τη νύχτα σε 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα. Οι μεμβράνες κατόπιν υβριδοποιήθηκαν επί 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με το δευτερεύον αντίσωμα, κατσίκα πολυκλωνικό να κουνελιού IgG-HRP (1: 3.000, Biorad, 1,706,515, USA) ή κατσίκα πολυκλωνικό να ποντικού IgG-HRP (1: 3.000, Biorad, 1706516, ΗΠΑ). Συγκροτήματα αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας Chemidoc MP Σύστημα Απεικόνισης (Biorad, USA)

Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: ι.) Κουνελιού πολυκλωνικό να LC3A (1: 1.000, ab62720, Abcam, ένα συνθετικό πεπτίδιο PSDRPFKQRRSFADR συζευγμένο σε KLH δια ένα υπόλειμμα κυστεϊνης συνδετήρα, που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 2-15 του Ανθρώπου MAP1LC3A), ii) μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού προς LC3B (1: 1.000? LC3B 5F10 Nanotools), iii) πολύκλωνα αντισώματα κουνελιού προς MAP1LC3C (1: 1.000, ProteinTechLab) και iv) κουνέλι πολυκλωνικό αντίσωμα προς Beclin-1 (1: 2.000, A303-673A, Bethyl Laboratories, Inc., USA)

Κάθε μια από αυτές κηλίδες στη συνέχεια απογυμνώνεται, ξηραίνεται όλη τη νύκτα, εκ νέου υβριδοποιήθηκε με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού προς ακτίνη β. (1: 5000, NB600-501, Novus Biologicals)

siRNA

siRNAs LC3A συνενώθηκαν ως (5′-GCGAGUUGGUCAAGAUCAUTT-3 ‘), (5′-GCUUCCUCUAUAUGGUCUATT-3′ ), (5’-CCUGCUGUGUGGUUCAUCUTT- 3 ‘), (5′-GCUGUAAGGAGGUACAGCATT-3′), και LC3B siRNA αντιστοίχως ομαδοποιήθηκαν ως (5’-GCCCUCUACUGAUUGUUAATT-3 ‘), (5′-CUCCCUAAGAGGAU CUUUATT-3′), (5’- GCCUGUGUUGUUACGGAAATT- 3 ‘). Αυτά συντέθηκαν κατά παραγγελία από τη Σαγκάη GenePharma Co., Ltd (Κίνα). Αυτά χρησιμοποιήθηκαν σε 20-50 ηΜ για την επιμόλυνση κυττάρων χρησιμοποιώντας HiPerfect (QIAGEN) για 24 ώρες, ενώ η αποδοτικότητα φίμωση siRNAs επιβεβαιώθηκε τόσο με συνεστιακή μικροσκοπία και στύπωμα western μετά από 24 ώρες.

συνεστιακή ανοσοφθορισμού και ανάλυση εικόνας

για τη χρώση ανοσοφθορισμού, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν επί 1,5 Νο γυάλινες καλυπτρίδες, μονιμοποιήθηκαν σε 3.7% παραφορμαλδεΰδη /PBS ρΗ 7.4 για 20 λεπτά στους 37 ° C και στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά σε PBS /0.1% ν /ν Triton Χ- 100 ρΗ 7.4 για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Επιπλέον, τα κύτταρα μπλοκαρίστηκαν σε PBS /5% w /v BSA ρΗ 7,4 για 20 λεπτά και χρωματίστηκαν με διάφορα πρωτογενή αντισώματα: αντι-Κί67 (MIB1) μονοκλωνικό ποντικού (1: 150? ΫΑΚΟ), αντι-LC3A πολυκλωνικό κουνελιού (1 : 500? Abcam), αντι-LC3C κουνελιού πολυκλωνικό (1: 200? Proteintech Ευρώπη), αντι-LC3B μονοκλωνικό ποντικού (1: 200? Nanotools) και αντι-Beclin-1 πολυκλωνικό κουνελιού (1: 100, ab62557, Abcam) για . 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου

τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS ρΗ 7,4, επωάστηκαν με τα κατάλληλα CF 488 και 564 δευτερογενή αντισώματα σε RT και το DNA αντίθετα με Hoechst 33342 (1 μg /ml? Sigma-Aldrich). Μετά την τελική πλύσεις καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν στο σπιτικό μέσο στερέωσης Mowiol. Απεικόνιση διεξήχθη σε μια προσαρμοσμένη Andor Επανάσταση Spinning Disk System Ομοεστιακή χτισμένο γύρω από ένα περίπτερο (IX81? Όλυμπος) με φακό 60x και μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (Andor ixon + 885) (CIBIT διευκόλυνση, MBG-ΔΠΘ). απόκτησης εικόνας έγινε σε Andor λογισμικό IQ 2. Οπτική τομές καταγράφονται κάθε 0,3 μm. Όλες οι εικόνες συνεστιακής μικροσκοπίας που παρουσιάζονται σε αυτή την εργασία είναι 2D μέγιστη ένταση προβολές εικόνων z-stack, και ανάλυση εικόνας για τα ληφθέντα σύνολα δεδομένων έχει εκτελεστεί χρησιμοποιώντας 1.47v ImageJ (Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, USA). Συν-εντοπισμός εικόνες ανάλυσης και υπολογισμού του συντελεστή του Pearson για τις ανέλυσε εικόνες πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός συνδυασμού της Κοινός εντοπισμός Finder και τα plugins COLOC 2 ImageJ.

Ηθική

Η μελέτη έχει εγκριθεί από το Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης Επιτροπή Ερευνών Δεοντολογίας.

Ευχαριστίες

Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το «ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗ ΚΑΙ ΔΙΑ ΒΙΟΥ ΜΑΘΗΣΗ-αριστεία» του έργου, ο κωδικός δεν 520, ΕΣΠΑ 2007-2013, ΓΓΕΤ αριθμός απόφασης 12605 /09.26.2012