Αφηρημένο

Ιστορικό

εισβολή Τ λεμφώματος και μετάσταση 1 (Tiam1) είναι ένας πιθανός τροποποιητής της ανάπτυξης και εξέλιξης του όγκου. προηγούμενη μελέτη μας in vitro και σε γυμνούς ποντικούς πρότεινε ένα ρόλο προαγωγής της Tiam1 για εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC). Στην παρούσα μελέτη, που παράγεται Tiam1 /C1199-CopGFP διαγονιδιακά ποντίκια για να διερευνήσει την tumorigenetic, επεμβατικές και μεταστατικές αλλοιώσεις στο κόλον και το ορθό του άγριου τύπου και διαγονιδιακών ποντικών Tiam1 υπό 1,2-διμεθυλυδραζίνη (DMH) θεραπεία.

Μέθοδοι

τα διαγονιδιακά ποντίκια που παράγεται με τη μέθοδο της προπυρηνικό microinlectlon. Ολόκληρο το σώμα απεικόνισης φθορισμού (Lighttools, Edmonton, Alberta, Canada), PCR, και ανοσοϊστοχημικές τεχνικές (IHC) εφαρμόστηκαν διαδοχικά για τον προσδιορισμό των διαγονιδιακών ποντικών. Το καρκινογόνο DMH (20 mg /kg) χρησιμοποιήθηκε για την επαγωγή όγκων παχέος εντέρου αν και ενδοπεριτοναϊκή (ΙΡ) ενέσεις μία φορά την εβδομάδα για 24 εβδομάδες από την ηλικία των 4 εβδομάδων Tiam1 διαγονιδιακά ή μη διαγονιδιακά ποντίκια.

Αποτελέσματα

παράγεται επιτυχώς Tiam1 /C1199-CopGFP διαγονιδιακά ποντίκια και επάγεται πρωτογενείς όγκους στο έντερο τόσο του φυσικού τύπου και διαγονιδιακών ποντικών Tiam1 με κατεργασία DMH. Επιπλέον, Tiam1 διαγονιδιακά ποντίκια ανέπτυξαν μεγαλύτερη και πιο επιθετική νεόπλασμα από τα ποντίκια άγριου τύπου. Επιπλέον, ανοσοϊστοχημική χρώση αποκάλυψε ότι προς τα πάνω ρύθμιση του Tiam1 συσχετίστηκε με αυξημένη έκφραση του β-κατενίνης και βιμεντίνης, και προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης σε αυτά τα ποντίκια.

Συμπεράσματα

Η μελέτη μας έχει παράσχει in vivo στοιχεία που να υποστηρίζουν ότι Tiam1 προωθεί την εισβολή και τη μετάσταση του CRC, πιθανότατα μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης, σε ένα διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού Tiam1

Παράθεση:. Yu LN, Zhang QL, Λι Χ, Hua X , Cui ΥΜ, Zhang NJ, et al. (2013) Tiam1 διαγονιδιακά ποντίκια εμφανίζουν αυξημένη όγκων επεμβατική και μεταστατικό δυναμικό του καρκίνου του παχέος εντέρου μετά από 1,2-διμεθυλυδραζίνη θεραπεία. PLoS ONE 8 (9): e73077. doi: 10.1371 /journal.pone.0073077

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 21 του Ιούνη 2013? Αποδεκτές: 14, Ιούλ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 12 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Yu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (nos: 81001111, 81071735, 30901791) και το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Guangdong (S2011040003696) .Τα χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία της το χειρόγραφο

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) συμβάλλει η τρίτη πιο τύπος καρκίνου στο δυτικό κόσμο. . Υποτροπής και μετάσταση είναι οι κύριες αιτίες θανάτου του CRC. Περίπου το 50 τοις εκατό των ασθενών με CRC θα πεθάνουν εξαιτίας της επιπλοκή της μετάστασης. Παρά το γεγονός ότι έρευνες έχουν εντοπίσει πολλαπλά γονίδια που είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη του CRC, μοριακά γεγονότα που εμπλέκονται στις πολύπλοκες διαδικασίες CRC μετάστασης παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.

T λέμφωμα εισβολή και μετάσταση 1 (Tiam1), ένα νουκλεοτίδιο γουανίνης παράγοντας ανταλλαγής που ενεργοποιεί επιλεκτικά την Rho-σαν ΟΤΡάσης Rac, ταυτοποιήθηκε αρχικά ως μια εισβολή επαγωγής και το γονίδιο της μετάστασης επαγωγής σε Τ κύτταρα λεμφώματος [1]. Tiam1 είναι ένας πιθανός τροποποιητής της έναρξης και εξέλιξης του όγκου. Αποδείχθηκε ότι εμπλέκονται σε Ρακ-ρύθμιση του ακτίνης πολυμερισμού, κυτταρική προσκόλληση και κινητικότητα, η επιβίωση των κυττάρων και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [2], [3]. Ωστόσο, οι έρευνες έχουν δείξει ότι Tiam1 έχει αντίθετα αποτελέσματα επί διαφορετικών καρκίνων. Μερικές μελέτες έδειξαν ότι προς τα πάνω ρύθμιση του Tiam1 συσχετίζεται με την επιθετική συμπεριφορά του ανθρώπινου καρκίνου και την κακή κλινική έκβαση των ασθενών σε διάφορους τύπους κακοήθων όγκων, όπως ο καρκίνος του μαστού, ο καρκίνος του παχέος εντέρου, καρκίνο του προστάτη, καρκίνο του ήπατος, καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα, καθώς και του οισοφάγου πλακώδους καρκίνωμα (ESCC) [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Ενώ, αντίθετα, Tiam1 ενισχύει ομοτυπική προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου και αναστέλλει την εισβολή σε κύτταρα νεφρικού καρκινώματος [10]. Επιπλέον, Tiam1 διαδραματίζει εισβολή-καταστολέα ρόλο σε κύτταρα Madin-Darby νεφρού σκύλου (MDCK) [11]. Μια Tiam1 ποντίκι knock-out είναι σχετικά ανθεκτική σε χημική επαγωγή όγκων του δέρματος [12]. Σε μηχανικής ιστών ανθρώπινο δέρμα, εξάντληση Tiam1 σε δερματικές ινοβλάστες οδήγησε σε αυξημένη διεισδυτικότητα των επιδερμικών κερατινοκυττάρων με προκαρκινικές χαρακτηριστικά [13].

προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι Tiam1 ρυθμίζεται αυξητικά σε ιστούς CRC και υψηλό επίπεδο έκφρασης του Tiam1 είχε συνδέεται στενά με την επιθετική και μεταστατικό δυναμικό σε CRC. Αποσιώπηση του Tiam1 σε κυτταρικές γραμμές CRC οδήγησε σε αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης και της εισβολής in vitro, και μετάσταση σε γυμνούς ποντικούς [9]. Για να κατανοήσουμε καλύτερα τον ρόλο και μηχανισμό Tiam1 στην πρόοδο του CRC, δημιουργήσαμε pCDFl-Tiaml-copGFP διαγονιδιακά ποντίκια και διερεύνησαν την επίδραση της Tiaml στην ανάπτυξη καρκινωμάτων στο παχύ έντερο και το ορθό που επάγεται από τη χημική καρκινογόνο (DMH ), σε συνδυασμό με την ιστολογική παρατήρηση των τοπικών εισβολής και μακρινή μετάσταση.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις του Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Νότιας (Αριθμός Άδειας: scxK2007 – 0005). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγινε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Δημιουργία Tiam1 /C1199-CopGFP διαγονιδιακά ποντίκια

Το cDNA πλήρους μήκους του Tiam1 από C1199 κλωνοποιήθηκε στη φορέας λεντοϊού pCDF1-CopGFP. Τα διαγονιδιακά ποντίκια που παράγεται με τη μέθοδο της προπυρηνικό microinlectlon. Ένα σύνολο από 60 υπερ-ωορρηξία και 33 ψευδο-εγκύων ποντικών ICR χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα. Lentivirus περιέχει γονίδιο TIAM1 /EGFP έγινε μικροένεση σε προπυρήνα κάθε εμβρύου. Τα έμβρυα καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες σε μέσο και μορίδιο σταδίου έμβρυα FHM μεταφέρθηκαν στις σάλπιγγες 0-5 ημέρες μετά τη συνουσία ψευδοκυοφορόν. Τα ποντίκια ήταν έγκυες και τα νεογνά είχαν παραδοθεί σε 20-21 ημέρες.

Αναγνώριση Tiam1 /EGFP διαγονιδιακά ποντίκια

Κανονική ποντίκια ICR χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Ολόκληρο το σώμα απεικόνισης φθορισμού (Lighttools, Edmonton, Alberta, Canada), PCR, και ανοσοϊστοχημικές τεχνικές (IHC) εφαρμόστηκαν διαδοχικά για τον προσδιορισμό των διαγονιδιακών ποντικών. Τα διαγονιδιακά ποντίκια και μη διαγονιδιακά ζώα της ίδιας γέννας τους γονότυπος με PCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εναρκτήρες για Tiam1: 5 ‘AAGACGTACTCAGGCCATGTCC 3’ και 5 ‘GACCCAAATGTCGCAGTCAG 3’. Γονιδιακό DNA παρασκευάστηκε από βιοψίες ποντικού-ουρά. Το προφίλ θερμοκρασίας της PCR ήταν 94 ° C για 45 s, 58 ° C για 45 s, και 72 ° C για 45 s με επέκταση του τελευταίου κύκλου για 10 λεπτά στους 72 ° C. Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης με βρωμιούχο αιθίδιο υπό υπεριώδες φως. Το ΡΟΚ-ανάλυση αποκάλυψε ότι 60 από τα 124 ζώα ήταν διαγονιδιακά. IHC διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [9]. Κουνελιού πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι Tiam1 (Santa Cruz, CA, USA, αραίωση 1: 200), ποντικού αντι-β-κατενίνης (BD, ΜΟ, 1: 500), ποντικού αντι-Ε-καδερίνης (BD, ΜΟ, 1: 500) , ποντικού αντι-βιμεντίνης (Cell Signaling Technology, ΡΟ, 1: 200) χρησιμοποιήθηκαν

εκχύλιση RNA και αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (RT-PCR)

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ. (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι RNAwas προεπεξεργασία με DNase και χρησιμοποιήθηκαν για cDNAsynthesis με τυχαία εξαμερή. Το mRNA του Tiam1 ενισχύθηκε με PCR από δείγματα cDNA διαγονιδιακών ποντικών και μη-διαγονιδιακών ζώων. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του Tiam1: εναρκτήρας με νόημα, 5-AAGACGrACTCAGGCCATGTCC-3? αντιπληροφοριακό εκκινητή, 5-GACCCAAATGTCGCAGTCA-3. αφυδρογονάση αφυδρογονάση 3-φωσφορικής ενισχύθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος χρησιμοποιώντας νοηματικό εκκινητή, 5-AATCCCATCACCATCTTCCA-3, και αντινόημα εναρκτήρα, 5-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3. Το κατάλληλο μέγεθος των προϊόντων PCR επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης.

Η θεραπεία με ΩΜΗ

Για να διερευνηθεί η επίδραση της Tiam1 στις παχέος ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου, Tiam1 διαγονιδιακά και μη διαγονιδιακά ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες, αντίστοιχα, αγωγή είτε με DMH (ομάδες δοκιμής) ή όχι (ομάδες ελέγχου). Οι ομάδες ελέγχου 1 και 2 δόθηκαν 0.1 ml PBS ί.ρ. μία φορά την εβδομάδα για 10 εβδομάδες. ομάδες δοκιμής είχαν την καρκινογόνο DMH (20 mg /kg) μέσω της ενδοπεριτοναϊκής (ε.π.) ενέσεις μία φορά την εβδομάδα για 24 εβδομάδες από την ηλικία των 4 εβδομάδων Tiam1 διαγονιδιακά ή μη διαγονιδιακά ποντίκια. Όλα τα ποντίκια είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε νερό της βρύσης και ένα πρότυπο διατροφής. Όλα τα ζώα παρατηρήθηκαν καθημερινά για κλινικά σημεία ασθένειας.

Αποτελέσματα

Παραγωγή και προσδιορισμός των Tiam1 /EGFP διαγονιδιακά ποντίκια

Ένα σύνολο 823 αυγά ελήφθησαν από 60 υπερ-ωορρηξία ποντίκια. Η Tiam1-EGFP ανασυνδυάζονται lentivirus μικροενέθηκε μέσα στο χώρο του περιβιτελλινικό 628 αυγά, τα οποία στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε 33 ICR ψευδο-εγκύων ποντικών. 21 από τους 33 ψευδοκυοφορόν ποντίκια εμποτισμένα. 67 πιθανούς Tiam1 /EGFP διαγονιδιακά ποντίκια γεννήθηκαν. Πέντε θετικά Tiam1-EGFP διαγονιδιακά ποντίκια, τα οποία προσδιορίζονται ως F0-17 (♂), F0-36 (♀), F0-48 (♂), F0-52 (♀) και F0-61 (♀), δημιουργήθηκαν από το pro -Πυρηνική τεχνική μικροέγχυσης. Ένα σύνολο των 44 θετικών F1 (Σχήμα S1) και 146 θετικές διαγονιδιακά ποντίκια F2 Tiam1 δημιουργήθηκαν από F0-36 (♀) και F0-48 (♂). Όλα τα θετικά αλληλουχιών PCR γονίδιο Tiam1 αντιστοιχήθηκαν με την αλληλουχία του γονιδίου Tiam1 το οποίο είναι διαθέσιμο από το NCBI (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η απεικόνιση φθορισμού ολόκληρου του σώματος έδειξε ισχυρό σήμα GFP στα όργανα του ομόζυγου Tiam1 F1 /EGFP διαγονιδιακά ποντίκια, συμπεριλαμβανομένων του παχέος εντέρου, του στομάχου, του πνεύμονα, των νεφρών και TESIS (Σχήμα 1Α). Κατεψυγμένα τμήμα αυτών των οργάνων από EGFP διαγονιδιακά ποντίκια εμφανίζουν επίσης ισχυρή Signa GFP (Σχήμα 1Β). Ωστόσο, δεν υπάρχει σήμα ή μόνο ασθενές σήμα παρατηρήθηκε στα ποντίκια άγριου τύπου (Σχήμα 1Α και 1Β). Ανοσοϊστοχημική ανάλυση χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπινο αντίσωμα κουνελιού Tiam1 επιβεβαίωσε ότι η ανθρώπινη πρωτεΐνη Tiam1 έντονα εκφράζεται στο παχύ έντερο του Tiam1 διαγονιδιακών ποντικών, ενώ ήταν μόνο ασθενώς ανιχνεύθηκε στα ποντίκια άγριου τύπου (Σχήμα 1 C).

( Α και Β) Παρατήρηση της έκφρασης EGFP και Tiam1 σε differente όργανα (Α) και τα αντίστοιχα κατεψυγμένα τμήματα (Β) από το διαγονιδιακό pCDFl-Tiaml-copGFP (TG) ποντικών και άγριου τύπου (WT) ποντίκια από ένα σύστημα απεικόνισης φθορισμού ολόκληρου του σώματος . (C) Ανίχνευση Tiaml πρωτεΐνης στο κόλον των διαγονιδιακών ποντικών pCDFl-Tiaml-copGFP και ποντικούς άγριου τύπου μέσω χρώσης ανοσοϊστοχημεία. (Δ) Ανίχνευση Tiaml mRNA στο κόλον 10 pCDFl-Tiaml-copGFP διαγονιδιακών ποντικών και 1 ποντικούς άγριου τύπου μέσω RT-PCR.

Η

Η έκφραση της ανθρώπινης mRNA Tiam1 στο κόλον αναλύθηκε με RT-PCR και θα μπορούσε να ανιχνευθεί μόνο σε Tiam1 διαγονιδιακά ποντίκια με β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος έκφρασης (Σχήμα 1 D). Η θεραπεία με DMH δεν επάγουν την έκφραση του ενδογενούς Tiam1 στο mRNA επίπεδο, ούτε σε διαγονιδιακά ζώα, ούτε σε μη διαγονιδιακά νεογνά τους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Επίδραση της pCDFl-Tiaml-copGFP επί ΩΜΗ επαγόμενη ογκογένεση

παρατηρήθηκαν Οκτώ εβδομάδες μετά DMH-θεραπεία, υπερπλασία του λεμφικού ιστού στο μεσεντέριο και εντερικού τοιχώματος στις δύο pCDFl-Tiaml-copGFP (3/5) και μη διαγονιδιακά νεογνά (2/5). Hyperrugosity στον ορθοκολικό βλεννογόνων και πάχυνση του εντερικού επιθηλίου εμφανίστηκαν σε δύο διαγονιδιακά (4/5) και τα ποντίκια της ομάδας άγριου τύπου (3/5) στις 12 εβδομάδες μετά DMH-θεραπεία. 16 εβδομάδες αργότερα, ορθοκολικού αδενώματος παρατηρήθηκε τόσο σε διαγονιδιακούς (2/5) και τα ποντίκια της ομάδας άγριου τύπου (1/5). 20 εβδομάδες αργότερα, ορθοκολικού όγκου συνέβη σε δύο διαγονιδιακά (1/6) και τα ποντίκια της ομάδας άγριου τύπου (1/6), το οποίο ιστολογικά διαγνώστηκε ως ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα (Πίνακας 1). Μετά DMH-θεραπεία, 21/21 (100%) Tiam1 διαγονιδιακά ποντίκια και 18/21 (85,7%) μη διαγονιδιακά νεογνά ανέπτυξαν όγκους εντός 32 εβδομάδων (Πίνακας 1). Σχήμα 2Α και 2Γ έδειξε το αντιπροσωπευτικό μακρο-αλλοιώσεις και αλλαγές ιστολογία (από την H & amp? Ε χρώση) εμφανίστηκε σε ποντίκια παχέος εντέρου σε αντίστοιχη χρονικά σημεία. Πρωκτική πρόπτωση παρατηρήθηκε στο 52,4% (11/21) των Tiam1 διαγονιδιακών ποντικών (Σχήμα 2Β).

(Α) Αντιπροσωπευτική όγκοι προκαλούνται υπό θεραπεία DMH στο κόλον και το ορθό του άγριου τύπου (WT) (ανώτερο πίνακας) και Tiaml διαγονιδιακών (TG) ζώο (κάτω πίνακας) σε διαφορετικά χρονικά σημεία. (Β) Η πρωκτική πρόπτωση (βέλος) σε ένα διαγονιδιακό Tiaml (TG) ποντικών. (C) HE χρώση των αντιπροσωπευτικών βλαβών όγκου του παχέος εντέρου και του ορθού του άγριου τύπου (WT) (άνω πάνελ) σε διαφορετικά χρονικά σημεία.

Η

Η συντριπτική πλειοψηφία των όγκων που βρέθηκαν σε το παχύ έντερο βρίσκονταν σε 1 έως 8 cm από τον πρωκτό (Σχήμα 3Α). Και στις δύο γονότυπους, δεν παρατηρήθηκαν όγκοι βρέθηκαν στο λεπτό έντερο. Η συχνότητα εμφάνισης του όγκου και ο αριθμός των όγκων ανά ζώο δεν επηρεάστηκαν από Tiam1, όπως αναλύθηκαν στις 20 εβδομάδες, 24 εβδομάδες και 32 εβδομάδες μετά τη θεραπεία DMH (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, όταν τους μέσους όγκους των όγκων αναλύθηκαν σε 29 όγκους που επιλέγονται τυχαία από κάθε μία από τις δύο ομάδες, μια σημαντικά αυξημένο μέγεθος του όγκου παρατηρήθηκε σε Tiam1 διαγονιδιακά ποντίκια (Σχήμα 3Β και Πίνακας 2) με ένα μέσο μέγεθος όγκων (23,260 ± 2,119 mm

3) 4,7 φορές υψηλότερη (Ρ & lt?. 0.001) σε σχέση με ποντικούς άγριου-τύπου (4,929 ± 0,580 mm

3)

(Α) Κατανομή των ορθοκολικών όγκων σε ποντικούς μετά τη θεραπεία DMH. (Β) Σύγκριση του όγκου του παχέος όγκου σε διαγονιδιακά ποντίκια και ποντίκια άγριου τύπου.

Η

Επίδραση της pCDFl-Tiaml-copGFP για επεμβατική και μεταστατική ικανότητα του ΩΜΗ επάγεται CRC

Για να προσδιοριστεί η φύση των παχέος μαζών, εξετάσαμε τους όγκους χρησιμοποιώντας ιστολογικές μεθόδους. Με μικροσκοπική ανάλυση, στα μη διαγονιδιακά ποντίκια, οι περισσότεροι από τους όγκους που αναπτύσσονται στο πλαίσιο της θεραπείας DMH εμφανίζονται αλλοιώσεις με περιορισμένη μόνο βάθος των νεοπλασματικών εισβολής. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α-Β, η νεοπλασματική κολονικό επιθήλιο σχηματίζεται μια πλάκα μάζα που μοιάζει με το οποίο ήταν διαφορετικό από το γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνο. Οι νεοπλασματικές αδένες επεκταθεί εντός και διαμέσου του submucosa, αλλά δεν εφάπτεται στο τοίχωμα των μυών.

(Α-Β) Οι όγκοι που αναπτύσσονται στο πλαίσιο της θεραπείας DMH εμφανίζονται αλλοιώσεις με περιορισμένη μόνο βάθος των νεοπλασματικών εισβολής. Οι νεοπλασματικές αδένες επεκταθεί εντός και διαμέσου του submucosa, αλλά δεν εφάπτεται στο τοίχωμα των μυών. (C-F) Tiaml διαγονιδιακά ποντίκια περιείχαν περισσότερο επιθετικούς όγκους και εμφανίζονται βαθύτερη διείσδυση των νεοπλασματικών κυττάρων στον μυ στρώμα, καθώς και στους λεμφαδένες εντός τοιχώματος του εντέρου (G-Η).

Η

Σύμφωνα με την μεγαλύτερο όγκο του όγκου που αναπτύσσονται στο πλαίσιο της θεραπείας DMH, η Tiaml διαγονιδιακά ποντίκια περιείχαν επίσης πιο επιθετικούς όγκους και εμφανίζονται βαθύτερη διείσδυση των νεοπλασματικών κυττάρων στο στρώμα μυ (Σχήμα 4C-F), καθώς και στους λεμφαδένες εντός τοιχώματος του εντέρου (Σχήμα 4G-η) , όπου σχηματίζονται διακριτές αδένες, σε σύγκριση με μη διαγονιδιακά νεογνά. Αυτές επιθετικούς όγκους εισέβαλαν ελεύθερα μέσω όλων των στρωμάτων του εντέρου σχηματίζοντας μεγάλα βλεννίνη γεμάτο αδένες.

Εκτός από την τοπική εισβολή και τη συμμετοχή κόμβος ιστού της λέμφου, Tiaml διαγονιδιακά ποντίκια που δημιουργείται επίσης όγκοι εξαπλωθεί σε απομακρυσμένες θέσεις, συμπεριλαμβανομένων των περιτόναιο, του ήπατος και των πνευμόνων (Σχήμα 5). Όπως συνοψίζεται στον Πίνακα 1, το 52,4% (11/21) Tiaml διαγονιδιακά ποντίκια που παράγεται μακρινή μετάσταση 32 εβδομάδες μετά τη θεραπεία ΩΜΗ. Ωστόσο, δεν μακρινή μετάσταση ή μικρο-μεταστατικές αλλοιώσεις βρέθηκαν σε όλα τα μη διαγονιδιακά ποντίκια 21 στο ίδιο χρονικό σημείο (Πίνακας 1). Ακόμη περισσότερο, διείσδυση κυττάρων όγκου σε μικρά αγγεία παρατηρήθηκαν επίσης σε Tiaml διαγονιδιακά ποντίκια, ενώ δεν είναι σε μη διαγονιδιακά ποντίκια (Εικόνα 5).

Η

Η ενεργοποίηση της οδού β-κατενίνης συνδέθηκε με pCDFl -Tiaml-copGFP διαγονιδιακά ζώα

Εξετάσαμε επόμενο την έκφραση της β-κατενίνης, επιθηλιακά δείκτη Ε-καδερίνης, και μεσεγχυματικών δείκτη βιμεντίνης στους όγκους που αναπτύχθηκε σε ποντικούς άγριου τύπου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, ανοσοϊστοχημική ανάλυση εμφανίζεται ότι οι όγκοι που σχηματίζεται στο Tiaml-διαγονιδιακά ομάδα εμφάνισε υψηλότερη έκφραση της συνολικής και της πυρηνικής β-κατενίνης, και υψηλότερες ασθενέστερη χρώση Ε-καδερίνης, ενώ ισχυρότερη χρώση των βιμεντίνης, σε σύγκριση με τον άγριο ομάδα τύπου .

η

Συζήτηση

Tiam1 προτείνεται να διαδραματίσει έναν ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των ανθρώπινων καρκίνων. Σε μοριακή βάση, σε μελέτες in vitro που παρέχονται γνώσεις σχετικά με την επίδραση της Tiam1 καρκινογένεση και την εισβολή του όγκου. Επιπλέον, in vivo μελέτες έδειξαν ότι Tiam1 που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση σε άτριχα ποντίκια.

προηγούμενη μελέτη μας απέδειξε ότι Tiam1 στενά συσχετίζεται με μεταστατικό δυναμικό του καρκίνου του παχέος εντέρου, και η εξάντληση του μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου και ικανότητα μετάστασης των κυττάρων CRC [9]. Για να κατανοήσουμε καλύτερα το ρόλο και το μηχανισμό της Tiam1 στο CRC μετάσταση in vivo, σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αναπτύξει pCDFl-Tiaml-copGFP-διαγονιδιακών ποντικών και προκαλείται από ορθοκολικό σχηματισμό όγκων μέσω της επεξεργασίας των ΩΜΗ. Μέσω ιστολογική ανάλυση, βρήκαμε ότι παρόλο που η συχνότητα εμφάνισης όγκου και ο αριθμός των όγκων ανά ζώο δεν επηρεάστηκαν από Tiam1, οι μέσες όγκοι του όγκου ήταν σημαντικά αυξημένα σε Tiam1-διαγονιδιακά ομάδα από εκείνη σε ποντικούς άγριου τύπου. Επιπλέον, βρήκαμε ότι Tiam1-διαγονιδιακά ποντίκια που σχηματίζεται περισσότερο επιθετικούς όγκους, συμπεριλαμβανομένων των τοπικών εισβολή και την εμπλοκή των ιστών λεμφαδένα, σε σύγκριση με ποντικούς άγριου τύπου. Το πιο σημαντικό, Tiaml διαγονιδιακά ποντίκια που δημιουργείται επίσης όγκων που εξαπλώθηκε σε απομακρυσμένες θέσεις, συμπεριλαμβανομένων των περιτόναιο, ήπατος και των πνευμόνων, καθώς και διείσδυση των καρκινικών κυττάρων σε μικρά αγγεία. Ενώ δεν μακρινή μετάσταση ή μικρομεταστατικά αλλοιώσεις βρέθηκαν σε άγρια ​​ομάδα τύπου.

Δύο αντίθετες λειτουργίες της Tiam1 στην κυτταρική μετανάστευση, την εισβολή και την προσκόλληση υποστηρίζεται από προηγούμενες μελέτες σε διαφορετικά κυτταρικά περιβάλλοντα. Από τη μία πλευρά, έχει αναφερθεί ότι η παρουσία του Tiam1 έτειναν να συνδέονται με καλή πρόγνωση σε γαστρικό καρκίνο [14]. Σε Ras-μετασχηματισμένα κύτταρα Madin-Darby νεφρού σκύλου (MDCK) και κύτταρα ΝΙΗ3Τ3, Tiam1 επάγει μια μεσεγχυματικά-Επιθηλιακά μετάβασης (ΜΕΤ) και αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση μέσω της ενίσχυσης καντερίνη μεσολάβηση προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου [11], [15], [16 ]. Στην ανθρώπινη νεφρική κυτταρικές σειρές καρκινώματος, Tiam1 αναστέλλει την εισβολή μέσω Ρακ-επαγόμενη προς τα πάνω ρύθμιση του αναστολέα μεταλλοπρωτεϊνασών ιστού-1 (ΤΙΜΡ-1) και ΤΙΜΡ-2 [10]. Έχει τεκμηριωθεί ότι η σηματοδότηση Rac θα μπορούσε να ανταγωνισθεί δραστηριότητα Rho άμεσα στο επίπεδο ΟΤΡάσης, καθώς και την αμοιβαία ισορροπία μεταξύ Rac και τη δραστηριότητα Rho καθορίζει κυτταρική μορφολογία, μεταναστευτικών και επεμβατική ικανότητα [17]. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα αναστολής της Tiam1 για τη μετανάστευση και εισβολή σε διαφορετικά πλαίσια θα μπορούσε να προκληθεί από Ρακ-μεσολαβούμενη καταστολή της δραστηριότητας Rho.

Από την άλλη πλευρά, υπάρχουν επίσης πολυάριθμες αναφορές που στήριζε το ρόλο της στην προώθηση της Tiam1 κακοήθους μετασχηματισμού, τον πολλαπλασιασμό όγκου, εισβολή, και μετάσταση [9], [18], [19], [20], [21]. Tiam1 έχει εμπλακεί στην ογκογόνο μετασχηματισμό κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 [22]. Επιπλέον, Tiam1 αυξάνει εισβολή και τη μετάσταση σε αρκετές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου συμπεριλαμβανομένου του μελανώματος και του καρκίνου του μαστού [18], [23]. Επιπλέον, η προηγούμενη μελέτη μας υποδεικνύει επίσης έναν σημαντικό ρόλο της Tiam1 στη μετανάστευση και τη μετάσταση των κυττάρων CRC [9]. παρούσα μελέτη μας παρέχει στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η εισαγωγή του ανθρώπινου γονιδίου Tiam1 στο μικρόβιο-γραμμή ενίσχυσε σημαντικά την εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου, ενώ μόνο διακριτικά προωθεί την ανάπτυξη των όγκων παχέος εντέρου που προκαλείται από υπό θεραπεία ΩΜΗ. Έτσι, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν κυρίως την επεμβατική και μεταστατικό λειτουργία προώθηση της Tiam1 στο CRC. Σε ακόμη μια άλλη μελέτη, συγκρίνοντας όγκου βιολογικών συμπεριφορές σε APC μεταλλαγμένη Min (πολλαπλή εντερική νεοπλασία) ποντίκια που εκφράζουν ή στερούνται Tiam1, οι συγγραφείς βρήκαν ότι η εξάντληση Tiam1 προκαλείται αυξημένη εισβολή των κακοήθων εντερικών όγκων, αν και το σχηματισμό και την ανάπτυξη των πολυπόδων in vivo ήταν σημαντικά μειωμένη [24]. Η προφανής διαφορά μεταξύ των σημερινών αποτελεσμάτων μας και την παραπάνω μελέτη θα μπορούσε ενδεχομένως να οφείλεται στην μετάλλαξη φόντο APC και θεραπεία ΩΜΗ. Έτσι, οι διαφορετικές επιδράσεις του Tiam1 για τη μετανάστευση και την εισβολή είναι πιθανόν εξαρτώνται από διαφορετικά περιβάλλοντα, όπως ο τύπος κυττάρου, υπόστρωμα, την κατάσταση μετασχηματισμού, και την κατάσταση ενεργοποίησης των μικρών πρωτεϊνών G σε διάφορα είδη κυττάρων. Για να φανεί καλύτερα το ρόλο Tiam1 στην εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση, η περαιτέρω μελέτη είναι επιτακτική ανάγκη να βελτιωθεί η κατανόηση των ανάντη ρύθμιση Tiam1 του.

Wnt /β-κατενίνης σηματοδότησης κριτικά ρυθμίζει την ανάπτυξη και την εξέλιξη της CRC [25]. Πυρηνικός εντοπισμός της β-κατενίνης είναι κρίσιμη για κανονική ενεργοποίηση σηματοδότηση Wnt. Μέλη της οικογένειας των μικρών Rho GTPases, συμπεριλαμβανομένων RhoA, Rac1 και Cdc42, έχει αποδειχθεί ότι συμμετέχουν σε δραστικότητα προαγωγής της Wnt σηματοδότησης και ελέγχου επίπεδες πολικότητα των κυττάρων σε Drosophila [26]. ενεργοποίηση Rac1 επάγει πυρηνική μετατόπιση του β-κατενίνης [27]. Ως παράγοντας ανταλλαγή Rac1-ειδική, Tiam1 προωθεί την αλληλεπίδραση του Rac1 και β-κατενίνη, και είναι απαραίτητη για Rac1 διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της κανονικής οδού Wnt [28]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η εισαγωγή του Tiam1 στην βλαστικής σειράς προκάλεσε σημαντική αύξηση της πυρηνικής συσσώρευσης β-κατενίνης, μειώνοντας μεμβράνης Ε-καδερίνης, και τον εμπλουτισμό των βιμεντίνης στις παχέος όγκους με πιο επεμβατική ικανότητα. Έτσι, το παρόν η μελέτη μας παρέχει την απόδειξη ότι Tiam1 προάγει εισβολή και τη μετάσταση των CRC, και εμπλέκει ότι Wnt /β-κατενίνης οδού θα μπορούσε να περιλαμβάνει στην επίδραση της Tiam1 επί CRC εισβολή και μετάσταση in vivo.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας έχει παράσχει in vivo στοιχεία που να υποστηρίζουν ότι Tiam1 προωθεί την εισβολή και τη μετάσταση του CRC, πιθανότατα μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού σηματοδότησης Wntβ-κατενίνης. Ωστόσο, Wnt /β-κατενίνης οδού σηματοδότησης δεν θα μπορούσε να είναι ο μόνος μηχανισμός μέσω του οποίου θα μπορούσε να προωθήσει Tiam1 πρόοδο της CRC. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για τη δημιουργία του κανονιστικού δικτύου της Tiam1 στην εξέλιξη του καρκίνου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

Ταυτοποίηση Tiam1 /EGFP διαγονιδιακά ποντίκια με PCR. Τα διαγονιδιακά ποντίκια και μη διαγονιδιακά ζώα της ίδιας γέννας τους γονότυπος με PCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εναρκτήρες για Tiam1: 5 ‘AAGACGTACTCAGGCCATGTCC 3’ και 5 ‘GACCCAAATGTCGCAGTCAG 3’. Γενωμικό DNA παρασκευάστηκε από το ποντίκι-ουρά βιοψίες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0073077.s001

(ΔΕΘ)