Αφηρημένο

Χημειοπροφύλαξη παρουσιάζει μια σημαντική στρατηγική για την ιατρική αντιμετώπιση του ορθοκολικού καρκίνου. Τα περισσότερα φάρμακα που χρησιμοποιούνται για τον ορθοκολικό καρκίνο θεραπεία προκαλεί βλάβη στο DNA-αλκυλίωση, η οποία επισκευάζεται πρωτίστως από την οδό επιδιόρθωσης βάση εκτομή (BER). Έτσι, ο αποκλεισμός της οδού BER είναι μια ελκυστική επιλογή για να αναστέλλουν την εξάπλωση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Χρησιμοποιώντας ένα

in silico

προσέγγιση, πραγματοποιήσαμε μια οθόνη δομή που βασίζεται σε docking μικρών μορίων σε β DNA πολυμεράσης (Pol-β) και εντόπισε ένα ισχυρό αντι-Pol-β ένωση, NSC-124854. Ο στόχος μας ήταν να εξετάσει κατά πόσον NSC-124854 μπορούσε να ενισχύσει την θεραπευτική αποτελεσματικότητα του παράγοντα DNA-αλκυλίωση, Temozolomide (TMZ), μπλοκάροντας ΚΑΚ. Πρώτον, προσδιορίσαμε την ειδικότητα της NSC-124854 για Pol-β εξετάζοντας

in vitro

δραστηριότητες του APE1, Fen1, DNA λιγάση Ι, και Pol-β-κατευθυνόμενη μοναδικού νουκλεοτιδίου (SN) – και μακράς-μπάλωμα (LP) -BER. Δεύτερον, μελετήσαμε την επίδραση της NSC-124854 σχετικά με την αποτελεσματικότητα της ΤΜΖ να αναστέλλουν την ανάπτυξη του αναντιστοιχία επισκευή (MMR) ελλιπή ως και MMR-ικανοί καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας τα

in vitro

κλωνογενείς δοκιμασίες. Τρίτον, διερευνήσαμε την επίδραση της NSC-124854 επί ΤΜΖ επαγόμενη

in vivo

ανάπτυξης όγκου αναστολή της MMR ανεπάρκεια και MMR-ικανοί κολονικού ξενομοσχεύματα εμφυτεύθηκαν σε θηλυκά ομόζυγα ποντίκια SCID. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η NSC-124854 έχει υψηλή εξειδίκευση για να Pol-β και μπλοκάρει Pol-β-σκηνοθεσία δραστηριότητες sn-και LP-BER στο

in vitro

ανασύσταση του συστήματος. Επιπλέον, NSC-124854 που προκαλείται αποτελεσματικά την ευαισθησία της ΤΜΖ στο MMR ανεπάρκεια και MMR-καλά παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα, τόσο

in vitro

κυτταρική καλλιέργεια και

in vivo

μοντέλα ξενομοσχεύματος. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν μια πιθανή νέα στρατηγική για την ανάπτυξη των πολύ ειδικό αναστολέα δομή που βασίζεται για την πρόληψη του παχέος εξέλιξης του όγκου

Παράθεση:. Jaiswal AS, Banerjee S, Aneja R, Sarkar FH, Ostrov DA, Narayan S (2011) DNA πολυμεράσης β ως νέος στόχος για χημειοθεραπευτική Παρέμβαση του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (2): e16691. doi: 10.1371 /journal.pone.0016691

Επιμέλεια: Ben Κω, Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 4 του Οκτωβρίου του 2010? Αποδεκτές: 3, Ιαν, 2011? Δημοσιεύθηκε: 2 Φεβρουαρίου του 2011

Copyright: © 2011 Jaiswal et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA (R01 CA-097 031 και CA-100 247). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ο τρίτος συχνότερος καρκίνος και η δεύτερη πιο κοινή αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους παγκοσμίως [1]. Κατά το έτος 2010, εκτιμάται ότι περίπου 102.900 νέες περιπτώσεις ορθοκολικού θα διαγνωστούν και 51.370 θάνατοι θα συμβεί μόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες. Παρά το γεγονός ότι τις τελευταίες δύο δεκαετίες μία σημαντική πρόοδος έχει σημειωθεί στις επιλογές θεραπείας, το ποσοστό θνησιμότητας από την ασθένεια αυτή δεν είναι πολύ βελτιωμένη. Ως εκ τούτου, οι νέες θεραπείες που απαιτούνται για να βελτιώσει την πρόγνωση της ασθένειας αυτής. Για πολλά χρόνια, η πρώτη επιλογή του χημειοθεραπευτικού φαρμάκου για τον ορθοκολικό καρκίνο έχει 5-φθοριοουρακίλη (5-FU). Χρησιμοποιείται κυρίως ως εισαγωγική θεραπεία με ακτινοβολία και σε συνδυασμό με διάφορα άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα, όπως μιτομυκίνη, σισπλατίνη, οξαλιπλατίνη, Camptosar, οξαλιπλατίνη, Avastin, Erbitux, και Vectibix για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου που γίνεται μετάσταση [2]. Αυτά τα φάρμακα δίνουν καλύτερα αποτελέσματα σε υψηλότερες δόσεις, αλλά να προκαλέσει σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες, συμπεριλαμβανομένης της θανάτωσης των υγιών κυττάρων του βλεννογόνου του στόματος, η επένδυση της γαστρεντερικής οδού, οι θύλακες των τριχών, ο μυελός των οστών και να προκαλέσουν ηπατική βλάβη και υπέρταση [3].

Μεταλλάξεις στο

αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC)

γονίδιο είναι ένα πρώιμο συμβάν στην οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση (FAP), ένα σύνδρομο στο οποίο υπάρχει μια κληρονομική προδιάθεση για καρκίνο του παχέος εντέρου [4], [5]. Οι περισσότερες μεταλλάξεις του

APC

γονίδιο συμβαίνουν στην περιοχή σύμπλεγμα μετάλλαξη (MCR) και έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή μιας κολοβωμένης πρωτεΐνης. Αυτή η περικοπή θέτει σε κίνδυνο διάφορες λειτουργίες του APC, η οποία εμπλέκεται στην χρωμοσωμική αστάθεια και ανώμαλη λειτουργία του μονοπατιού Wnt σηματοδότησης, ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, η σταθεροποίηση του κυτταροσκελετού των μικροσωληνίσκων, οι αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου και rep DNA y [6] – [14]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η πυρηνική APC, μέσα από μια περιοχή (αμινοξέα 1441-2077) που έχει περικοπεί στην πλειονότητα των όγκων παχέος εντέρου, συνεργάζεται με την πρόσληψη DNAPKcs στο κατεστραμμένο χρωματίνης DNA και ενισχύει την πρώιμη απόκριση σε διπλό σκέλος διαλείμματα (ΟΕΔ ) επιδιόρθωση του DNA [15]. APC αλληλεπιδρά επίσης άμεσα με γονιδιωματικό DNA, κατά προτίμηση με αλληλουχίες πλούσιες σε Α /Τ [16], υποδηλώνοντας έναν ρόλο για APC στην αντιγραφή του DNA [17]. Έχει προταθεί ότι η APC μέσω βαθμίδας C-άκρο αυτού (αμινοξέα 2140-2421) αλληλεπιδρά με το DNA και ρυθμίζει αρνητικά την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου μέσω της αναστολής της αντιγραφής του DNA με άμεση αλληλεπίδραση με το DNA [17]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η θεραπεία με παράγοντες αλκυλίωσης DNA-ενισχύει το επίπεδο της APC σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα [14]. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι APC αλληλεπιδρά με β DNA πολυμεράση (Pol-β) και πτερύγιο-ενδονουκλεάση 1 (Fen1) και μπλοκ Pol-β-κατευθυνόμενη μονού νουκλεοτιδίου (SN) – και μακράς επίθεμα (LP) -base επισκευή εκτομή (BER) δραστηριότητες που επηρεάζουν την κυτταρική ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία [14], [18]. Με βάση αυτές τις μελέτες, φαίνεται ότι η αλληλεπίδραση του APC με Pol-β και άλλες πρωτεΐνες BER μπορεί να είναι ένας κατάλληλος στόχος για χημειοθεραπευτικές παρέμβαση του παχέος ανάπτυξη καρκίνου.

Η χρήση του DNA-αλκυλιωτικούς παράγοντες όπως χημειοθεραπευτικά φάρμακα είναι με βάση την ικανότητά τους να ενεργοποιούν μια απόκριση κυτταρικού θανάτου [19], και η θεραπευτική αποτελεσματικότητα τους προσδιορίζεται από την ισορροπία μεταξύ της βλάβης του DNA και την επισκευή. Οι DNA-αλκυλίωση βλάβη που προκαλείται από βλάβες επισκευαστεί από τον ΚΑΚ, O

6-μεθυλγουανίνη DNA-μεθυλοτρανσφεράση (MGMT) και επισκευή ασυμφωνία (MMR) μονοπάτια. Πολλοί όγκοι του παχέος εντέρου γίνει ανθεκτικός σε DNA-αλκυλιωτικούς παράγοντες λόγω υπερέκφραση MGMT ή MMR-ανεπάρκειας [20]. Τα κύτταρα ανεπαρκή σε MGMT δεν είναι σε θέση να επεξεργάζονται το O

6MeG κατά τη σύνθεση του DNA, και αν δεν επισκευαστεί, ένα G: C προς G: T μετάβαση μετάλλαξη επέρχεται [21]. Σε προηγούμενες μελέτες, ο ρόλος του BER οδού έχει επίσης εμπλακεί στην κυτταρική αντίσταση σε ΤΜΖ [22], [23], η οποία εξαρτάται από τη συγκεκριμένη γονιδιακή έκφραση ΚΑΚ και δραστηριότητα [24]. Κατά τα τελευταία χρόνια, οι αντικαρκινικά φάρμακα που έχουν αναπτυχθεί κυρίως στοχεύουν το MGMT και MMR οδών [25], [26]. Από MMR με ανεπάρκεια του παχέος εντέρου αποτελεί μεγαλύτερο κίνδυνο αντίστασης στα φάρμακα DNA-αλκυλίωση λόγω της υπερέκφρασης του MGMT ή MMR-ανεπάρκειας [27] – [29], είναι κρίσιμο να ανακαλύψουν ένα χημειοθεραπευτικό στρατηγική που μπορεί να είναι χρήσιμες για τη θεραπεία του τόσο MMR ανεπάρκεια και MMR-καλά όγκους του παχέος εντέρου. Είναι ενδιαφέρον, αν και BER είναι υπεύθυνη για την επισκευή του 70%, 5% και 9% του Ν

7-μεθυλγουανίνη (MEG), Ν

3-MeG και Ν

3-μεθυλαδενίνη (ΜΕΑ) βλάβες , αντίστοιχα, που επάγεται από το DNA-αλκυλίωση φάρμακο τεμοζολομίδη (ΤΜΖ? NSC-362856) [23], [30], [31], η δυνητική χρησιμότητα του αποκλεισμού οδού BER δεν έχει διερευνηθεί διεξοδικά. Έτσι, με το συνδυασμό των παραγόντων αποκλεισμού BER και θεραπεία ΤΜΖ, η κλινική έκβαση των χημειοθεραπευτικών αποτελεσματικότητα της ΤΜΖ μπορεί να ενισχυθεί. Προηγούμενες μελέτες υποστηρίζουν επίσης ότι το DNA αλκυλίωση που προκαλείται από βλάβη επιδιορθώνεται κυρίως από το μονοπάτι ΚΑΚ [26], [27]. Στο παρελθόν, η BER μονοπάτι έχει χρησιμοποιηθεί ως στόχος για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων, αλλά η κλινική επίπτωση αυτών των φαρμάκων είναι ακόμη υπό έρευνα [31] – [36].

ΤΜΖ έχει επιτυχώς χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του μεταστατικού μελανώματος και πολύμορφο γλοιοβλάστωμα, τον τελευταίο σε συνδυασμό με ακτινοθεραπεία [37], [38], αλλά έχει αποδειχθεί ότι είναι λιγότερο αποτελεσματική στη θεραπεία άλλων κακοηθειών. Μια Φάσης ΙΙ κλινική μελέτη της ΤΜΖ σε προεπιλεγμένους προχωρημένους καρκίνους αναπνευστικής οδού, συμπεριλαμβανομένων του παχέος νεοπλασία, έχει πρόσφατα ολοκληρωθεί από την Schering-Plough, Kenilworth, NJ, δείχνοντας μόνο μια μερική ανταπόκριση στη θεραπεία (https://clinicaltrials.gov/CT2 /show /NCT00423150). Σε μια προηγούμενη κλινική μελέτη Φάσης Ι της ΤΜΖ, μερική απόκριση του φαρμάκου επί μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο παρατηρήθηκε επίσης, υποδηλώνοντας σημαντική αντίσταση όγκου προς αγωγή [39]. Για να ξεπεραστεί η αντίσταση της ΤΜΖ, μια κλινική μελέτη Φάσης ΙΙ διεξήχθη στην οποία lomeguatrib συνδυάστηκε με ΤΜΖ, αλλά τα αποτελέσματα δεν ήταν πολύ σημαντικά [40]. Επομένως, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για την ανάπτυξη μιας νέας στρατηγικής με την οποία η αποτελεσματικότητα της ΤΜΖ μπορεί να αυξηθεί για την θεραπεία του ορθοκολικού καρκίνου.

Δεδομένου ότι τα περισσότερα χημειοθεραπευτικά φάρμακα προκαλούν βλάβη του DNA και την αντίσταση που οφείλεται σε ενεργοποίηση του ο επιδιόρθωσης του DNA μονοπάτι (s), που στοχεύουν πρωτεΐνες αυτών οδού (ες) για να εμποδίσει τη δράση τους μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων με υψηλότερη αποτελεσματικότητα και για τις δύο χημειο-ανθεκτικά και ευαίσθητα όγκους. Τα τελευταία χρόνια, η δομή που βασίζεται σε εικονικό σχεδιασμό και η τρισδιάστατη δομή μιας αλληλεπίδρασης φαρμάκου-στόχου με αναστολείς μικρού μοριακού βάρους έχει χρησιμοποιηθεί για να καθοδηγήσει λογική ανακάλυψη φαρμάκων [41]. Το computer-aided design φάρμακο θα μπορούσε να βρει νέες ενώσεις μολύβδου και με τη βοήθεια της βελτιστοποίησης δομής για βιολογικές και φαρμακολογικές δοκιμές [42] – [44]. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήσαμε δομή που βασίζεται σε μοριακή βάση σύνδεσης του Pol-β στη θέση όπου αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC) αλληλεπιδρά και δεσμεύει Pol-β-κατευθυνόμενη ΚΑΚ [14], [45], [46]. Η μοριακή δομή σύνδεσης με βάση θεωρείται κατάλληλη προσέγγιση για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων, δεδομένου ότι αυτή η προσέγγιση έχει ως στόχο συγκεκριμένες πρωτεΐνες και συγκεκριμένη οδό [47]. Με βάση in silico προσπάθειες, έχουμε ταυτοποιήσει έναν πολύ ισχυρό αναστολέα μικρού μοριακού βάρους, NSC-124854 {[5- (4-αμινο-6-ιωδο-2-οξο-5,6-διυδροπυριμιδιν-1-υλο) -3- υδροξυ-οξολαν-2-υλ] methoxyphosphonic οξύ}, το οποίο αλληλεπιδρά ειδικά με Pol-β και μπλοκ Pol-β-κατευθυνόμενη μονού νουκλεοτιδίου (SN) – και μακράς επίθεμα (LP) -BER. Εδώ παρουσιάζουμε τα δεδομένα που περιγράφουν ότι η NSC-124854 μπορεί να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα της TMZ σε MMR ανεπάρκεια και καλά καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα

in vitro

και

in vivo

μοντέλα. Προτείνουμε ότι οι προ-κλινικά ευρήματα θα δημιουργήσει ένα νέο πρότυπο για την κλινική διαχείριση του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Αποτελέσματα

Προβολή των μικρών μορίων να αναστέλλουν Pol-β-σκηνοθεσία μετάθεσης κλώνου δραστηριότητα

Για να προσδιορίσει ένα ισχυρό αντι-Pol-β ένωση, χρησιμοποιήσαμε ένα

in silico

προσέγγιση μοριακή βάση για τη δομή που βασίζεται σε υψηλής απόδοσης και διαλογή περίπου 140.000 μικρές ενώσεις μόριο (το μοριακό βάρος & lt? 500 daltons) για την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με την θέση πρόσδεσης APC του Pol-β (Σχ. 1

A

) [48]. Τα 22 υψηλότερη βαθμολογία μικρές μοριακές ενώσεις που ζητούνται από την Αναπτυξιακή Therapeutics Program (DTP) του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου (NCI) για τη λειτουργική αξιολόγηση. Πραγματοποιήσαμε την αρχική διαλογή των ενώσεων για τον προσδιορισμό της ικανότητάς τους να αναστέλλουν την Pol-β-κατευθυνόμενη σύνθεση κλώνου-μετατόπισης. Χρησιμοποιήσαμε ένα

in vitro

reconsitiuted σύστημα προσδιορισμού σε αυτές τις μελέτες. Θα προβληθεί 22 κορυφαίες ενώσεις βαθμολόγησης και τα δεδομένα των 12 ενώσεων που παρουσιάζεται εδώ (Σχήμα 2

A

-.

C

). Μεταξύ των 22 μικρών μορίων, NSC-21371 και NSC-91855 ανέστειλε Pol-β-σκηνοθεσία μετάθεσης κλώνου σύνθεση σε 125 μΜ συγκέντρωση (Σχήμα 2

Β

?. Συγκρίνουν λωρίδα 3 με λωρίδες 9-13 και 19-23 , αντίστοιχα). Αυτές οι μικρές μοριακές ενώσεις δεν επηρέασε δραστηριότητα ενσωμάτωση 1-nt (προϊόν 24-μερές) του Πολ-β σε οποιαδήποτε εξεταζόμενη συγκέντρωση. Ωστόσο, NSC-124854 ανέστειλε Pol-β-κατευθυνόμενη δραστικότητα μετάθεσης κλώνου στο 5 μΜ συγκέντρωση, ενώ υψηλότερες συγκεντρώσεις NSC-124854 κατήργησε εντελώς το σχηματισμό κλώνου εκτόπισης προϊόντων (σχήμα 2

A

?. Σύγκριση του λωρίδα 3 με λωρίδες 4-8 αντίστοιχα). Όταν η συγκέντρωση του NSC-124854 αυξήθηκε περαιτέρω σε 50 μm ή περισσότερο, η ενσωμάτωση 1-nt (24-μερές προϊόν) δραστηριότητα του Pol-β ήταν εντελώς αποκλεισμένη, όπως φαίνεται από την συσσώρευση του προϊόντος τομή 23-μερές και η έλλειψη 1 ΝΤ προϊόν ενσωμάτωσης, αντανακλώντας μια πλήρη απώλεια της δραστηριότητας Pol-β (Σχ. 2

μια

, συγκρίνετε λωρίδα 3 με 4-8, αντίστοιχα). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι NSC-124854 είναι ένας πολύ ισχυρός αναστολέας της δραστικότητας Pol-β μεταξύ όλων των ενώσεων που δοκιμάστηκαν.

Πίνακας

A

δείχνει την προβλεπόμενη αλληλεπίδραση του NSC-124854 με βάση την κρυσταλλική δομή του Πολ-β. Pol-β φαίνεται στο χρυσό και πλευρικές αλυσίδες προβλέπεται να σχηματίζει επαφές με NSC-124854, Asp17 και Arg89, απεικονίζονται με χρυσό για άνθρακα, μπλε για το άζωτο και κόκκινο για το οξυγόνο. Τα APC υπολείμματα θύλακα δέσμευσης, Thr79, Lys81, Arg83 του Πολ-β παρουσιάζεται ως σφαίρες γκρι χρώμα για τον άνθρακα, το μπλε για το άζωτο και το κόκκινο για το οξυγόνο. Οι πολικές επαφές απεικονίζονται ως κίτρινο διακεκομμένες γραμμές μεταξύ του NSC-124854 και Pol-β κατάλοιπα Lys81 και Arg89. Η εικόνα έγινε με PyMol. Πίνακας

Β

απεικονίζει Pol-β-συνδέτη αλληλεπιδράσεις προέβλεψε με βάση το θέτει προσανατολισμό μοριακή βάση σύνδεσης του NSC-124854. Οι αλληλεπιδράσεις που προκαλούνται από δεσμούς υδρογόνου (πράσινο) και με υδρόφοβα (γκρι) επαφών. Τα NSC-124854 και Pol-β φαίνεται στο μαύρο για τον άνθρακα, το μπλε για το άζωτο και το κόκκινο για το οξυγόνο. Τα Inter-ατομικό ομόλογα του NSC-124854 φαίνεται στο ματζέντα. Τα Inter-ατομικό ομόλογα του Pol-β φαίνεται στο χρυσό. Οι δεσμοί υδρογόνου υποδεικνύονται με διακεκομμένες γραμμές μεταξύ των ατόμων που εμπλέκονται, ενώ οι υδρόφοβες επαφές αντιπροσωπεύονται από ένα τόξο με ακτίνες ακτινοβολεί προς τα άτομα NSC-124854 έρχονται σε επαφή. Τα επαφή άτομα Pol-β εμφανίζεται με ακτίνες ακτινοβολεί πίσω. Η εικόνα έγινε με HBPLUS και LigPlot.

Η

Για να προσδιοριστεί η επίδραση των ενώσεων για την παρεμπόδιση του Πολ-β-δραστηριότητα, μαζευτήκαμε

in vitro

σκέλος εκτόπισμα δοκιμασία σύνθεσης με καθαρισμένο APE1 precut

32Ρ-σημασμένο 63-μερές F-DNA και Pol-β. Πίνακας

Μια

(NSC-124854, NSC-143995, NSC-160172 και NSC-263659),

Β

(NSC-10730, NSC-21371, NSC-43656 και NSC-91855) και

C

(NSC-274937, NSC-351093, NSC-668472 και NSC-674711) δείχνουν την επίδραση των μικρών μορίων για τη σύνθεση Pol-β-σκηνοθεσία μετατόπισης κλώνου. Σε κάθε πάνελ, λωρίδα 1 δείχνει 63-mer

32Ρ-επισημασμένο F-DNA, λωρίδα 2 δείχνει το προϊόν 23-μερές μετά APE1 τομή, λωρίδα 3 δείχνει την ενσωμάτωση 1-nt (24-mer) και κλώνου-μετατόπισης προϊόντα. Λωρίδες 4-8, 9-13, 14-18 και 19-23 δείχνουν το σκέλος μετατόπισης δραστικότητα του Pol-β επωάσθηκαν με 0, 5, 10, 25, 50 και 125 μΜ, αντιστοίχως, των υποδεικνυόμενων ενώσεων. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο πειραμάτων.

Η

αναστολέας μικρό μόριο, NSC-124854, ειδικά μπλοκ δραστηριότητα Pol-β

Είμαστε αποφασισμένοι περαιτέρω αν NSC-124854 είναι ένας ειδικός αναστολέας της πολι- β δραστικότητα ή μπορεί επίσης να εμποδίσει τη δραστηριότητα των άλλων ενζύμων BER. Έχουμε καθορίζεται για πρώτη φορά το IC

50 του NSC-124854 για την Pol-β-σκηνοθεσία μετάθεσης κλώνου σύνθεσης. Αυτό το πείραμα ήταν η ίδια όπως περιγράφεται στο πείραμα διαλογής, εκτός επιλέξαμε χαμηλότερες συγκεντρώσεις για να προσδιοριστεί η IC

50 του NSC-124854. Εμείς ποσοτικοποιείται ο κλώνος μετατόπισης προϊόντα σύνθεσης (Σχ. 3

A

, λωρίδες 3-10, αντίστοιχα) και παρίσταται ως ποσοστό μεταβολής της NSC-124854 μεσολάβηση μπλοκάρισμα της δραστηριότητας Pol-β (Σχ. 3

Β

). Η θεραπεία με NSC-124854 έδειξε μια εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στην δραστηριότητα της σύνθεσης κλώνου εκτόπισης με IC

50 5,3 μΜ (Σχ. 3

B

). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι NSC-124854 έχει μια ισχυρή ανασταλτική επίδραση στην Pol-β-κατευθυνόμενη κλώνου εκτόπισης σύνθεσης.

Για να προσδιοριστεί η συγγένεια της NSC-124854 για την απόφραξη του Pol-β-κατευθυνόμενη κλώνου εκτόπισης δραστηριότητα , προσδιορίσαμε του IC

50 σε ένα ανασυσταθέν σύστημα προσδιορισμού όπως στο περιγράφεται στο Σχήμα 2. Πίνακας

A

δείχνει το αυτοραδιογράφημα της δραστηριότητας κλώνου-μετατόπισης. Γραμμή 1 δείχνει

32Ρ-σημασμένο 63-μερές F-DNA, λωρίδα 2 δείχνει το προϊόν 23-μερές μετά APE1 τομή, και η λωρίδα 3 δείχνει κλώνους μετατόπιση δραστικότητα του Pol-β. Λωρίδες 4-10 δείχνει επίδραση των 0,5-20 μΜ NSC-124854 για τη δραστηριότητα Pol-β. Πίνακας

Β

δείχνει το IC

50 δεδομένων. NSC-124854 ανέστειλε Pol-β-κατευθυνόμενη κλώνου εκτόπισης δραστηριότητα με δοσοεξαρτώμενο τρόπο με μία IC

50 5,3 μΜ. Τα δεδομένα είναι ο εκπρόσωπος του δύο ανεξάρτητων εκτιμήσεων.

Η

Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε αν NSC-124854 μπορεί να αναστείλει τη δραστηριότητα των άλλων ενζύμων BER οδού όπως απουρινική /apymidinic ενδονουκλεάσης 1 (APE1), Fen1 και της DNA λιγάσης I. τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η NSC-124854 δεν inihibit τις δραστηριότητες αυτών των ενζύμων (Σχήμα 4

A

-.

C

, αντίστοιχα). Από αυτά τα αποτελέσματα, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η ανασταλτική επίδραση του NSC-124854 ήταν ιδιαίτερα ειδική για Pol-β και δεν επηρέασε τη δραστικότητα άλλων ενζύμων BER.

Πίνακας

A

δείχνει την επίδραση της NSC-124854 σχετικά με τη δραστηριότητα APE1. APE1 (10 ηΜ) επωάστηκε με διαφορετικές συγκεντρώσεις του NSC-124854 (0,5-20 μΜ, λωρίδες 3-9, αντιστοίχως) και

32Ρ-σημασμένο 63-μερές F-DNA. Οι διαδρομές 1 και 2 δείχνουν άκοπα

32Ρ-σημασμένο 63-μερές F-DNA και το προϊόν τομή 23-μερές, αντίστοιχα. Πίνακας

Β

δείχνει το αποτέλεσμα του NSC-124854 σχετικά με τη δραστηριότητα Fen1. Fen1 (10 ηΜ) επωάστηκε με διαφορετικές συγκεντρώσεις του NSC-124854 (0,5-20 μΜ, λωρίδες 3-9, αντιστοίχως) και

32Ρ-σημασμένο 51-μερές flapped-DNA. Γραμμή 1 δείχνει τη θέση των 51-μερές σημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο και η λωρίδα 2 δείχνει 11-μερές διασπάται προϊόν πτερύγιο. Πίνακας

C

δείχνει την επίδραση της NSC-124854 στη δραστικότητα DNA λιγάση Ι. DNA λιγάση Ι (5 ηΜ) επωάστηκε με διαφορετικές συγκεντρώσεις του NSC-124854 (0,5-20 μΜ, λωρίδες 3-9, αντιστοίχως) που ακολουθείται από προσθήκη 2.5 ηΜ

32Ρ-σημασμένο 63-μερές nicked DNA. Η λωρίδα 1 δείχνει 23-μερές σημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο (nicked προϊόντος) και η λωρίδα 2 δείχνει 63-μερές συνδεδεμένο προϊόν. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων

Η

Μικρές μόριο αναστολέα NSC-124854 μπλοκ μονού νουκλεοτιδίου (SN) -. Και μακράς επίθεμα (LP) δραστηριότητες -BER σε ένα ανασυσταθέν

in vitro

δοκιμασία

με βάση την ανάλυση μοριακής σύνδεσης, NSC-124854 προβλέπεται να σχηματίζει πολική (H-ομόλογα) αλληλεπιδράσεις με τα υπολείμματα αμινοξέων Lys81 και Arg89 και ένα μη πολικό (van der Waals) αλληλεπίδραση με το υπόλειμμα αμινοξέος Asp17 στην επιφάνεια του Pol-β [48], [49]. Αυτά τα υπολείμματα βρίσκονται σε στενή γειτνίαση με την APC θύλακα σύνδεσης (υπολείμματα αμινοξέων Thr79, Lys81 και Arg83) (Εικ. 1

B

). Αυτά τα προβλεπόμενα επαφές δείχνουν μια πολλαπλή απευθείας επαφές μεταξύ NSC-124854 και Pol-β, η οποία μπορεί ενδεχομένως να μιμηθεί την αλληλεπίδραση της APC με Pol-β. Από τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η NSC-124854 σε συνδυασμό με ΤΜΖ ως πιθανή στρατηγική χημειοθεραπευτική αγωγή για καρκίνο του παχέος εντέρου, αναλάβαμε μια μελέτη για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα και οι περιορισμοί αυτής της στρατηγικής.

Αν και προσδιορίσαμε την ιδιαιτερότητα του NSC- 124.854 για δραστικότητα Pol-β όπως φαίνεται στο Σχ. 3 και 4, ήταν αναγκαίο να εξετάσει την επίδραση αυτής της ένωσης όταν το πλήρες σύστημα BER της sn-και LP-BER συναρμολογείται. Αυτά τα πειράματα θα παράσχουν βιοχημικές ενδείξεις για την ισχύ της NSC-124854. Χρησιμοποιήσαμε 63-mer

32Ρ-σημασμένο U-DNA ως υπόστρωμα (Εικ. 5

A

) για SN-BER. Από Fen1 απαιτείται για δραστικότητα LP-BER και μπορεί να διεγείρει Pol-β δραστικότητα για μετάθεσης κλώνου σύνθεση [50], [51], υιοθετήσαμε ίδια στρατηγική για τον προσδιορισμό της επίδρασης του NSC-124854 επί LP-BER (Σχ. 5

Β

). Μετά APE1 τομή, ένα αναμενόμενο προϊόν 23-μερές παρήχθη (Σχήμα 5

C

?. Συγκρίνουν λωρίδα 1 με 2). Τα αποτελέσματα έδειξαν αποτελεσματική ενσωμάτωση 1-nt (24-μερές προϊόν) με Pol-β η οποία συνδέθηκε με DNA λιγάση Ι για τη δημιουργία 63-μερές επισκευασμένο προϊόν (Σχ. 5

C

, λωρίδα 5). Η προσθήκη Fen1 διεγείρεται Pol-β δραστικότητα για μετάθεσης κλώνου σύνθεσης (Σχ. 5

C

, λωρίδα 4), η οποία επίσης συνδέεται με DNA λιγάση Ι για τη δημιουργία 63-μερές επισκευασμένο προϊόν (Σχ. 5

C

, λωρίδα 6). Η προσθήκη του NSC-124854 αποκλεισμένη Pol-β-κατευθυνόμενη 1-nt (προϊόν 24-μερές με την απουσία του Fen1) προσθήκη (Εικ. 5

C

, συγκρίνετε λωρίδα 3 με 7), καθώς και strand- σύνθεση μετατοπίσεως με την παρουσία Fen1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 5

C

, συγκρίνετε λωρίδα 4 με λωρίδες 8-11, αντίστοιχα). Περαιτέρω, η πλήρης επισκευή με sn-και LP-BER υπο-μονοπάτια μετά την προσθήκη του DNA λιγάση Ι επίσης αποκλειστεί από NSC-124854 σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 5

C

, συγκρίνετε λωρίδες 12 -15 και 16-19, αντίστοιχα).

Πίνακες

Α και Β

αντιπροσωπεύουν τα πρωτόκολλα του sn-και LP-BER, αντίστοιχα. Πίνακας

C

δείχνει το αυτοραδιογράφημα που περιγράφουν την επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων του NSC-124854 επί sn-και LP-BER δραστηριότητες. Γραμμή 1 δείχνει το 63-μερές

32Ρ-σημασμένο U-DNA, λωρίδα 2 δείχνει το προϊόν 23-μερές μετά APE1 τομή, Λωρίδα 3 δείχνει την ενσωμάτωση 1-nt από Pol-β, Λωρίδα 4 δείχνει κλώνου εκτόπισμα προϊόντα μετά την προσθήκη του Fen1. Οι διαδρομές 5 και 6 δείχνουν το 63-μερές συνδεδεμένο προϊόν του sn-και LP-BER δραστηριότητες, αντίστοιχα. Lane 8-19 δείχνει την επίδραση της NSC-124854 για την απόφραξη του 1-nt (24-μερές προϊόν) ενσωμάτωση. Λωρίδες 8-11 απεικονίζουν NSC-124854 μεσολάβηση μπλοκ της σύνθεσης μετάθεσης κλώνου. Περαιτέρω, λωρίδες 12-15 και λωρίδες 16-19 δείχνουν την επίδραση της NSC-124854 για την παρεμπόδιση της sn-και δραστηριοτήτων LP-BER με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών διαφορετικών πειραμάτων.

Η

Η έκφραση του άγριου τύπου APC προκαλεί αντίσταση στη θεραπεία TMZ το οποίο καταργήθηκε με τη θεραπεία με NSC-124854

Σε προηγούμενες μελέτες, έχουμε έχουν δείξει ότι η APC αλληλεπιδρά με δραστηριότητες LP-BER [14] Pol-β και Fen1 και μπλοκ sn-και, [45], [46], [52] – [54]. Έχουμε, επίσης, δείξει ότι HCT-116 κύτταρα (εκφράζουν άγριου τύπου APC) είναι πιο ευαίσθητα σε μεθυλομεθάνιο σουλφονικό (MMS) και θεραπείες ΤΜΖ σε σύγκριση με HCT-116-APC (KD) κύτταρα (νοκ-κάτω APC με pSiRNA) [36], [45], [46]. Στην παρούσα μελέτη, προσδιορίσαμε την ευαισθησία της ΤΜΖ παρουσία NSC-124854 σε αρκετές καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές (HCT-116, HCT-116-APC (KD), HCT-116 + CH3, Caco-2, ΗΤ29, SW480, LoVo και RKO) χρησιμοποιώντας κλωνογονική δοκιμασία [18], [36], [46]. Τα IC

50 αποτελέσματα έδειξαν ότι όλες οι κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν έδειξαν μεγαλύτερη ευαισθησία στη θεραπεία συνδυασμού NSC-124854 με ΤΜΖ (Πίνακας 1). Το IC

50 δεδομένα έδειξαν ότι NSC-124854 ήταν σε θέση να ενισχύσει την επίδραση αναστολής της ανάπτυξης της ΤΜΖ και στις δύο κυτταρικές σειρές HCT-116 και HCT-116-APC (KD)? Ωστόσο, η επίδραση ήταν μεγαλύτερη σε HCT-116 από ό, τι σε HCT-116-APC (KD) κύτταρα (Πίνακας 1). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τα προηγούμενα ευρήματά μας ότι η άγριου τύπου APC αναστέλλοντας ΚΑΚ μονοπάτι αυξάνει την ευαισθησία των ναρκωτικών DNA-alkylaying [36], [46], [54]. Ωστόσο, άλλες κυτταρικές σειρές που εκφράζουν είτε άγριου τύπου ή κολοβωμένη APC, όπως RKO (310 kDa), SW480 (147 kDa), Caco-2 (150 kDa), LoVo (120 kDa) και ΗΤ29 (110 και 200 ​​kDa) δεν παρουσίασαν άμεση συσχέτιση του ρόλου του APC στην ευαισθησία αυτών των φαρμάκων. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι γενετικοί παράγοντες εκτός από μεταλλάξεις στο

APC

γονίδιο μπορεί επίσης να παίζουν ρόλο στον προσδιορισμό της ευαισθησίας του NSC-124854 και ΤΜΖ σε διαφορετικά κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. Μία από τις κρίσιμες παραμέτρους για αυτή την διαφορική ευαισθησία ελέγχεται από τη διαφορική κατάσταση της δραστηριότητας MMR, το οποίο συζητείται παρακάτω.

Η

Η συνδυασμένη θεραπεία του NSC-124854 ενισχύει την ανασταλτική της ανάπτυξης δράση της ΤΜΖ στο MMR ανεπαρκή και MMR-καλά καρκινικά κύτταρα κόλου

MMR πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην χημειοθεραπευτική απόκριση του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων, και ελάττωμα σε πρωτεΐνη (ες) MMR είναι παρούσα στο κληρονομικό μη-πολυποειδούς ορθοκολικού καρκίνου (HNPCC) [55]. Δύο από τις πρωτεΐνες MMR συνηθέστερα μεταλλάσσεται σε ανθρώπινους καρκίνους, MLH1 και MSH2. MMR-ανεπαρκή κύτταρα είναι συχνά ανθεκτικά σε DNA-αλκυλιωτικούς παράγοντες [55]. Για τον προσδιορισμό του ρόλου του MMR στο συνδυασμό επίδραση του NSC-124854 με ΤΜΖ στην αναστολή της ανάπτυξης, χρησιμοποιήσαμε διάφορες κυτταρικές σειρές MMR-καλά και MMR ανεπάρκεια του καρκίνου του παχέος εντέρου. HCT-116, HCT-116-APC (KD), και RKO κυτταρικές σειρές είναι ανεπαρκή σε MMR, λόγω της έλλειψης έκφρασης του hMLH1, ένα ένζυμο κλειδί της οδού αυτής [56], ενώ τα κύτταρα LoVo είναι MMR ανεπάρκεια λόγω της απουσίας MSH2 έκφρασης [57]. Το HCT-116 + CH3 κυττάρων έχει γίνει MMR-καλά με την καθιέρωση ενός ενιαίου αντίγραφο του χρωμοσώματος 3 που φέρει το

hMLH1

γονίδιο [58]. ΤΜΖ είναι γνωστό ότι προκαλεί αντίσταση στην MMR-ανεπαρκή κύτταρα [26]. Σε προηγούμενες μελέτες, έχει προταθεί ότι η διαταραχή του BER μονοπατιού μπορεί να καταργήσει ανθεκτικότητα στο φάρμακο προκαλείται από MMR-ανεπάρκειας [59]. Στην παρούσα μελέτη, προσδιορίζεται εάν η θεραπεία της ΤΜΖ ευαισθητοποιεί MMR-καλά κύτταρα συγκριτικά περισσότερο από τις MMR-ανεπαρκή κύτταρα, και αν ο αποκλεισμός της ΚΑΚ μονοπατιού από NSC-124854 μπορεί να καταργήσει την αντίσταση ΤΜΖ σε MMR-ανεπαρκή κύτταρα. Όπως ήταν αναμενόμενο, οι MMR-καλά κυτταρικές σειρές SW480 (IC

50 108,1 ± 3,2 μΜ), HCT-116 + CH3 (IC

50 130,7 ± 4,3 μΜ) και Caco-2 (IC

50 449,2 ± 42,4 μΜ), εκτός από ΗΤ29 (IC

50 962,7 ± 62,7 μΜ) έδειξαν μεγαλύτερη ευαισθησία στο ΤΜΖ σε σύγκριση με το MMR ανεπάρκεια κυτταρικές σειρές HCT-116 (IC

50 739,0 ± 25,9 μΜ), HCT-116- APC (KD), (IC

50 877,7 ± 49,2 μΜ), LoVo (IC

50 838,8 ± 53,1 μΜ) και RKO (IC

50 1572,6 ± 89,9 μΜ) (Πίνακας 1). Επιπλέον, η θεραπεία συνδυασμού του NSC-124854 μειωθεί περαιτέρω το IC

50 της ΤΜΖ κατά δύο φορές σε όλες τις επτά κυτταρικές σειρές ανεξάρτητα από το καθεστώς τους MMR δραστηριότητας (Πίνακας 1). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η θεραπεία συνδυασμού του NSC-124854 με ΤΜΖ θα μπορούσε να είναι ένα χρήσιμο χημειοθεραπευτικό στρατηγικής για τη διαχείριση των δύο MMR ανεπάρκεια και MMR-καλά παχέος όγκους.

μπορεί να χρησιμοποιηθεί συνδυασμός του NSC-124854 με ΤΜΖ ως πιθανή χημειοθεραπευτική προσέγγιση για να αυξήσει παχέος ανάπτυξη του όγκου

in vivo

η

για να επαληθεύσετε περαιτέρω το

in vitro

αποτελέσματα για την αποτελεσματικότητα της θεραπείας συνδυασμού της NSC-124854 και ΤΜΖ με ένα καλά χαρακτηρίζεται και ειδικών στόχων του Pol-β να μειώνει τις δόσεις της ΤΜΖ που μπορεί να εξαλείψει παρενέργειες και ταυτόχρονα να καταργήσει το MMR-αντίσταση, πραγματοποιήσαμε μια

in vivo

μελέτη ξενομοσχεύματος χρησιμοποιώντας σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια ( SCID, λείπει λειτουργικών Τ και Β κύτταρα) ποντικού, όπως περιγράφεται στην Εικόνα 6

A

. Η επιλογή μας για θηλυκά ποντίκια βασίστηκε σε πρόσφατη μελέτη που περιγράφει ότι οι εκτιμώμενες νέες περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου το 2009 προβλέπεται να είναι υψηλότερο στις γυναίκες σε σύγκριση με τους άνδρες [60]. Επιλέξαμε μια δόση των 20 mg /kg σωματικού βάρους της ΤΜΖ για αυτά τα πειράματα, η οποία είναι 10- και 4-φορές χαμηλότερη από τη μέγιστη ανεκτή δόση σε ποντίκια και ανθρώπου, αντίστοιχα [61] – [65]. Επίσης, η δόση των 10 mg /kg σωματικού βάρους για NSC-124854 είναι περισσότερο από 20-φορές μικρότερη από IC του

50 σε καλλιέργεια (Πίνακας 1). Αν και δεν έχουμε καθορίσει τη μέγιστη ανεκτή δόση (MTD) του NSC-124854 σε ποντίκια, η επιλεγείσα συγκέντρωση είναι πάρα πολύ στο ασφαλέστερο εύρος.

Πίνακας

Μια

δείχνει τη σχηματική αναπαράσταση του πειραματικό πρωτόκολλο. Πίνακας

Β

δείχνει τη μεταβολή του όγκου του όγκου στο 42

ου ημέρα του πειράματος. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι η μέση τιμή ± SD από τέσσερα έως έξι ζώα σε κάθε ομάδα. *, Σημαντικά διαφορετική από έλεγχο?

†, διαφέρει σημαντικά από ό, τι NSC-124854. P & lt?. 0.05

Η

Αυτά τα φάρμακα δόθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (.

ε.π.

) για πέντε συνεχόμενες ημέρες. Η αναστολή της ανάπτυξης των όγκων παρακολουθήθηκε μέχρι 42 ημέρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια αύξηση του όγκου του όγκου στην ομάδα ελέγχου σε χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο για όλες τις κυτταρικές γραμμές,

δηλαδή

, HCT-116, HCT-116-APC (KD) και HCT-116 + CH3. Ο όγκος του όγκου έφθασε ένα μέγιστο από 1.120 mm

3 εντός 42 ημερών από την εμφύτευση ξενομοσχεύματος, η οποία φαίνεται στο Σχήμα 6

B

. Η ανάπτυξη του όγκου στο μη επεξεργασμένο HCT-116 ξενομόσχευμα ήταν υψηλότερη από HCT-116-APC (KD) και HCT 116-+ CH3 κύτταρα. Η επίδραση κατά των όγκων της ΤΜΖ μόνο ήταν σημαντικά διαφορετική σε HCT 116-+ CH3 κύτταρα (MMR-καλά) και ήταν λιγότερο έντονη σε HCT-116 και HCT-116-APC κύτταρα (KD) (Εικ. 6

B

). Η θεραπεία με NSC-124854 και μόνο μείωσε επίσης την ανάπτυξη των όγκων με όλες τις κυτταρικές σειρές, η οποία ήταν εντονότερη όταν συνδυάζεται με ΤΜΖ (Εικ. 6

B

). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η θεραπεία συνδυασμού του NSC-124854 βελτιώνει την θεραπευτική αποτελεσματικότητα της TMZ εξίσου καλά και στις δύο MMR ανεπάρκεια και MMR-καλά το μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου

in vivo

. Για να προσδιοριστεί η ανοχή των φαρμάκων, καταγράψαμε το σωματικό βάρος των ζώων δύο φορές την εβδομάδα μέχρι το τέλος του πειράματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν παρόμοια αύξηση του σωματικού βάρους του ελέγχου και θεραπείας ομάδα ζώων με NSC-124854 και ΤΜΖ μόνες ή σε συνδυασμό (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, φαίνεται ότι οι δόσεις των 10 mg /kg σωματικού βάρους για NSC-124854 και 20 mg /kg σωματικού βάρους για την ΤΜΖ ήταν καλά ανεκτές και δεν προκάλεσε εμφανή παρενέργειες σε πειραματόζωα μας.

Συζήτηση

σε προηγούμενες μελέτες, Pol-β έχει χρησιμοποιηθεί ως στόχος για την ανάπτυξη χημειοθεραπευτικό φάρμακο [23], [34], αλλά δεν έφθασε πέρα ​​από την προ-κλινικό επίπεδο. Η αποτελεσματικότητα των προηγούμενων ενώσεων έχει λιγότερο αποτελεσματική επειδή απαιτούν πολύ υψηλές συγκεντρώσεις για να επιτευχθεί η επιθυμητή κυτταροτοξικότητα

in vitro

και δεν ελέγχθηκαν συστηματικά

in vivo

. Επιπλέον, ήταν κυρίως στοχεύουν να εμποδίσουν SN-BER. Η χρήση της ΤΜΖ για τη θεραπεία των κακοηθειών εκτός γλοιοβλάστωμα και μελάνωμα έχει περιοριστεί, ειδικά για τη θεραπεία των όγκων παχέος εντέρου, λόγω της λιγότερο έντονη επίδραση στην καταστολή της ανάπτυξης του όγκου [39], [40]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε δομή που βασίζεται μοριακή προσέγγιση για τον εντοπισμό μικρών μορίων τα οποία μπορούν να μιμηθούν την αλληλεπίδραση του APC με Pol-β και μπλοκ Pol-β-κατευθυνόμενη BER που μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως χημειοθεραπευτικός στόχος. Η στρατηγική μας της μοριακής σύνδεσης στην APC-δεσμευτική τσέπη του Pol-β ήταν να εντοπίσει ένα μικρό μόριο το οποίο μπορεί να μπλοκάρει και τις δύο δραστηριότητες sn-και LP-BER και να αποδείξει κυτταροτοξικότητα και στα δύο

in vitro

και

στο vivo

δοκιμασίες σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις

Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε περίπτωση επιτυχίας, η προτεινόμενη στρατηγική θα είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στην πρόληψη των δύο MMR-καλά και MMR ανεπάρκεια του παχέος εντέρου.? Αυτό έχει σημασία, διότι τα MMR με ανεπάρκεια του παχέος εντέρου αποτελεί μεγαλύτερο κίνδυνο αντίστασης στα φάρμακα DNA-αλκυλίωση λόγω της υπερ-έκφραση του MGMT ή MMR-ανεπάρκειας [27] – [29]. Τα κύτταρα ανεπαρκή σε MGMT δεν είναι σε θέση να επεξεργάζονται το O

6MeG κατά τη διάρκεια της σύνθεσης του DNA, και αν της αποκατάστασης της, μια G: C προς G: T μετάβαση μετάλλαξη συμβαίνει [27]. Η G: αναντιστοιχία Τ στη συνέχεια επισκευάστηκε από MMR οδού [28]. Ωστόσο, εάν η O

6MeG δεν επισκευάζεται πριν από το βήμα επανασύνθεση σε MMR, ο θυμίνη είναι πιθανό να εισαχθεί εκ νέου απέναντι στην αλλοίωση. Πιστεύεται ότι η επαναληπτική κύκλος των μάταιη MMR αποτελεσμάτων σε μια γενιά τριτοταγούς αλλοιώσεων, πιθανότατα gapped DNA.