Αφηρημένο

Ιστορικό

Απελευθέρωση των

EGFR

σηματοδότησης είναι κοινή σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και η διαπίστωση αυτή οδήγησε στην ανάπτυξη των αναστολέων της κινάσης της τυροσίνης (ΤΚΙδ), που είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικό σε ένα υποσύνολο του NSCLC. Μεταλλάξεις του

EGFR

(m

EGFR

) και τον αριθμό αντιτύπου κέρδη (CNGS) του

EGFR

(ζ

EGFR

) και

HER2

(ζ

HER2

) έχουν αναφερθεί να προβλέψει για την απάντηση ΤΚΙ. Μεταλλάξεις στο

KRAS

(m

KRAS

) σχετίζονται με την πρωτογενή αντοχή σε TKIs.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Ερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ των μεταλλάξεων, CNGS και απόκριση σε ΤΚΙδ σε ένα μεγάλο πάνελ κυτταρικών γραμμών NSCLC. Γονίδια που μελετήθηκαν ήταν

EGFR

,

HER2

,

HER3 HER4

,

KRAS

,

BRAF

και

PIK3CA

. Μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν με αλληλούχιση, ενώ CNGS προσδιορίσθηκαν με ποσοτική PCR (qPCR), φθορισμό in situ υβριδισμού (FISH) και συστοιχία συγκριτική γενωμική υβριδοποίησης (aCGH). Οι τιμές IC50 για το gefitinib TKIs (Iressa) και erlotinib (Tarceva) προσδιορίστηκαν με δοκιμασία MTS. Για οποιαδήποτε από τις επτά γονιδίων που δοκιμάστηκαν, μεταλλάξεις (39/77, 50.6%), αντίγραφο κέρδη αριθμός (50/77, 64.9%) ή είτε (65/77, 84.4%) ήταν συχνή στις γραμμές NSCLC. Μεταλλάξεις του

EGFR

(13%) και

KRAS

(24,7%) ήταν συχνές, ενώ ήταν λιγότερο συχνή για τα άλλα γονίδια. Οι τρεις τεχνικές για τον καθορισμό CNG ήταν καλά συσχετίζονται, και τα στοιχεία qPCR χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω αναλύσεις. CNGS ήταν σχετικά συχνή για

EGFR

και

KRAS

σε αδενοκαρκινώματα. Ενώ οι μεταλλάξεις ήταν σε μεγάλο βαθμό αλληλοαποκλείονται, CNGS δεν ήταν.

EGFR

και

KRAS

μεταλλαγμένες γραμμές αποδεικνύεται συχνά μεταλλαγμένο αλληλόμορφο συγκεκριμένη ανισορροπία δηλαδή τη μεταλλαγμένη μορφή ήταν συνήθως σε μεγάλη περίσσεια σε σχέση με τη μορφή άγριου τύπου. Σε μοριακή βάση, ευαισθησία στο gefitinib και erlotinib συσχετίζονταν ισχυρά. αναλύσεις πολυμεταβλητή οδήγησε στα ακόλουθα αποτελέσματα:

1. m

EGFR

και ζ

EGFR

και ζ

HER2

ήταν ανεξάρτητοι παράγοντες που σχετίζονται με gefitinib ευαισθησία, κατά φθίνουσα σειρά σπουδαιότητας.

2. m

KRAS

συσχετίστηκε με αυξημένη in vitro αντίσταση στην gefitinib.

Συμπεράσματα /σημασία

μας in vitro μελέτες επιβεβαιώνουν και επεκτείνουν τις κλινικές παρατηρήσεις και καταδεικνύουν τη σχετική σημασία των δύο

EGFR

μεταλλάξεις και CNGS και

HER2

CNGS στην ευαισθησία σε TKIs

Παράθεση:. Γκάντι J, Ζανγκ J, Xie Υ, Soh J, Shigematsu Η Zhang W, et al. (2009) Μεταβολές στα γονίδια του EGFR μονοπάτι σηματοδότησης και τη σχέση τους με το EGFR κινάσης τυροσίνης Inhibitor Ευαισθησία στον καρκίνο του πνεύμονα Κυτταρικές Γραμμές. PLoS ONE 4 (2): e4576. doi: 10.1371 /journal.pone.0004576

Επιμέλεια: Alfred Lewin, Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16η Σεπτεμβρίου του 2008? Αποδεκτές: 18 Δεκ 2008? Δημοσιεύθηκε: 24 Φεβρουαρίου 2009

Copyright: © 2009 Gandhi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήταν λάβαμε από το Πρόγραμμα Specialized της ερευνητικής αριστείας στον καρκίνο του πνεύμονα (P50CA70907) και την έγκαιρη διάγνωση Δίκτυο Ερευνών, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Bethesda, Maryland (U01CA084971). Ταμεία και από τις δύο επιχορηγήσεις χρησιμοποιήθηκαν για την υποστήριξη των μισθών και για την εκτέλεση των δοκιμασιών. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Δρ. Gazdar είναι αμειβόμενη σύμβουλος /λέκτορας για την AstraZeneca PLC. Ο Δρ Γκαρσία recieves Χρηματοδότηση Ερευνητικών & gt? 10.000 από AstraZeneca, Genentech και OSI? Αμοιβή & lt? 10.000 από τη Roche. Ο Δρ Minna λαμβάνει στήριξη της έρευνας από την AstraZeneca PLC.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. Παρά τις πρόσφατες εξελίξεις στη διάγνωση και πολυτροπικότητα θεραπείες για τον καρκίνο του πνεύμονα, η πρόγνωση παραμένει φτωχή με ποσοστά 5ετούς επιβίωσης μόλις 16% για όλα τα στάδια [2].

Ο καρκίνος του πνεύμονα χαρακτηρίζεται από τη συσσώρευση των πολλαπλών γενετικές και επιγενετικές μεταβολές συμπεριλαμβανομένων σωματικές μεταλλάξεις και τα κέρδη αριθμού αντιγράφων γονιδίου ή και τα δύο που έχει σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των ογκογονιδίων ή αδρανοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων [3]. υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (

EGFR

) απορρύθμιση έχει παρατηρηθεί σε πολλούς τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένων των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLCs) [4]. Hirsch et. al. προσδιορίζονται συχνή

EGFR

πρωτεΐνη υπερέκφραση (62%) σε NSCLCs των πλακωδών κυττάρων και αδενοκαρκίνωμα υποτύπους [5].

EGFR υπερέκφραση συνδέεται συχνά με κακή πρόγνωση [6]. Η κινάση τυροσίνης υποδοχέα (RTK) υπερ-οικογένεια των υποδοχέων κυτταρικής επιφάνειας χρησιμεύει ως μεσολαβητές κυτταρική σηματοδότηση από εξωκυτταρικά αυξητικούς παράγοντες. Μέλη της οικογένειας erbB των RTK συμπεριλαμβανομένου

EGFR (HER1 /ErbB1)

,

HER2 (ΕΚΒΒ2 /EGFR2)

,

HER3 (ErbB3 /EGFR3)

και

HER4 (ErbB4 /EGFR4)

έχουν λάβει μεγάλη προσοχή δίνεται ισχυρή συσχέτιση τους με κακοήθη πολλαπλασιασμό.

Το RAS /ΜΑΡΚ και μονοπάτια /AKT PI3K είναι μεγάλα δίκτυα σηματοδότησης που συνδέουν

EGFR

ενεργοποίησης για να κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης [7]. Όπως συζητείται παρακάτω,

EGFR

σηματοδότησης γονίδια οδού έχει αναφερθεί να μεταλλαχθεί σε NSCLC. Ανάλογα με τη γεωγραφική θέση,

EGFR

και

έχουν KRAS

μεταλλάξεις έχουν ταυτοποιηθεί σε ~ 10% -30% των NSCLCs [3], [8].

EGFR

μεταλλάξεις ανεξάρτητα σχετίζονται με αδενοκαρκίνωμα ιστολογίας, της Ασίας εθνότητα Ανατολή, ποτέ δεν το κάπνισμα κατάσταση και το γυναικείο φύλο. Μεταλλάξεις του

KRAS

στοχεύουν επίσης αδενοκαρκίνωμα ιστολογίας, αλλά κατά τα άλλα διαφέρουν από

EGFR

μεταλλάξεις επειδή είναι σχετικά σπάνια στην Ανατολική Ασία και συμβαίνουν πιο συχνά σε άνδρες και καπνιστές [9]. Λιγότερο συχνά, σωματικές μεταλλάξεις έχουν βρεθεί επίσης και σε άλλες

γονίδια EGFR

πορεία, περιλαμβανομένων

HER2

(~ 2%) [10],

HER4

(~ 2%) [ ,,,0],11],

BRAF

(~ 2%) [12], και

PIK3CA

(~ 4%) [13], [14].

αντίγραφο Gene κέρδη αριθμό (CNGS) λόγω εστιακή ενίσχυση ή χρωμοσωμικό πολυσωμία, είναι ένα από τα άλλα μεγάλα μηχανισμούς ενεργοποίησης ογκογονιδίου [15]. Lockwood et al. προσδιορίζονται πολλαπλά συστατικά του

EGFR

μονοπάτι σηματοδότησης ήταν συχνά ενισχύεται και υπερ-εκφράζεται σε NSCLC. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαν επίσης ότι

EGFR

γονίδιο της οδού ενίσχυσης ήταν πιο συχνή σε αδενοκαρκίνωμα υπότυπο του NSCLC.

Λόγω της συχνής απορρύθμιση των

EGFR

γονίδια οδού στον NSCLC, EGFR έγινε ένα από τα πρώτα ορθολογικά επιλεγμένα μόρια για στοχευμένη θεραπεία. Ενώ οι αρχικές στοχοθετημένων προσεγγίσεων χρησιμοποιηθούν μονοκλωνικά αντισώματα τα οποία μπλοκάρουν την αλληλεπίδραση συνδέτη-υποδοχέα, νεότερες προσεγγίσεις έχουν χρησιμοποιηθεί μικρό μόριο αναστρέψιμοι αναστολείς της τυροσινικής κινάσης (ΤΚΙδ). Η δραστικότητα της κινάσης της τυροσίνης του

EGFR

απαιτείται για τις βιοχημικές αντιδράσεις που προκαλούνται από αυτόν τον υποδοχέα [7], [16], [17]. Δύο TKIs, gefitinib (Iressa, η AstraZeneca) και erlotinib (Tarceva, Genentech) έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη θεραπεία του προχωρημένου ή επαναλαμβανόμενες NSCLC. Απαντήσεις που παρατηρήθηκαν σε υποσύνολα, της Ασίας εθνότητα κυρίως Ανατολή, το γυναικείο φύλο, δεν το κάπνισμα κατάσταση και το αδενοκαρκίνωμα ιστολογίας [18], [19], [20]. Στη συνέχεια,

EGFR

μεταλλάξεις που εντοπίζονται στην περιοχή κινάσης της τυροσίνης, και η προβλεπόμενη για απόκριση σε ΤΚΙ στην ίδια υποομάδα ασθενών [21], [22], [23]. Σύμφωνα με μια μετα-ανάλυση 1170 ασθενών, πάνω από το 70% των NSCLCs με

EGFR

μεταλλάξεις ανταποκρίθηκαν στην TKIs, ενώ το 10% των όγκων χωρίς να

EGFR

μετάλλαξη απάντησε [24]. Ωστόσο, περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι άλλοι παράγοντες εκτός από

EGFR

μεταλλάξεις μπορεί να παίζουν ρόλο στον προσδιορισμό της απόκρισης και την επιβίωση μετά τη θεραπεία ΤΚΙ.

EGFR

κέρδος αριθμού αντιγράφων γονιδίου σχετίστηκε με σημαντικά βελτιωμένη ευαισθησία ΤΚΙ και η επιβίωση σε μια μεγάλη μη επιλεγμένα μελέτη με κατάλληλους ελέγχους [25]. Επιπλέον, άλλα μέλη του

EGFR

οικογένεια δηλαδή

HER2

[26] και

EGFR3

[27] μπορεί να είναι σημαντικοί παράγοντες που εμπλέκονται στην ευαισθησία ΤΚΙ. Ένα επιπλέον πολυπλοκότητα είναι η κλινική παρατήρηση ότι οι σωματικές μεταλλάξεις του

KRAS

παρέχουν ενδογενή ανθεκτικότητα σε TKIs [28].

Για την περαιτέρω κατανόηση της σχέσης μεταξύ της ευαισθησίας ΤΚΙ και η απορρύθμιση των

EGFR

γονίδια οδού, εξετάσαμε τη μετάλλαξη και αντιγράψτε το καθεστώς αριθμός επτά από αυτά τα γονίδια (

EGFR

,

HER2

,

HER3

,

HER4

,

KRAS

,

BRAF

, και

PIK3CA

) σε ένα μεγάλο πίνακα των κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα και συσχετίστηκαν τα δεδομένα με in vitro ευαισθησία στο TKIs.

Υλικά και Μέθοδοι

όγκων κυτταρικές σειρές

Μελετήσαμε συνολικά 112 κυτταρικές σειρές που αποτελείται από 77 NSCLC και 32 μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) και τρεις γραμμές από μικροκυτταρικό καρκίνο σε εξωπνευμονικά χώρους (εξωπνευμονική μικρό κύτταρο καρκίνους, ExPuSC) [29]. Όλα εκτός από τρεις από αυτές τις κυτταρικές σειρές καθιερώθηκαν από τους συγγραφείς [30] σε ένα από δύο θέσεις. Οι κυτταρικές σειρές που ξεκίνησε στο NCI έχουν το πρόθεμα NCI-H, ενώ γραμμές που χαράσσονται στο UT Southwestern έχουν την HCC πρόθεμα. NCI-H3255 ελήφθη από τον Dr. Bruce Johnson (Lowe Κέντρο Θώρακος Ογκολογίας, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) [22]. PC-9 (αρχικά από το Τόκιο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Τόκιο, Ιαπωνία) ελήφθη από τον Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins University School of Medicine, Βαλτιμόρη, MD). Calu-3 αγοράστηκε από την American Type Culture Center (Manassas, VA). Ερευνήσαμε επίσης οκτώ απαθανάτισε ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κυτταρικές σειρές (HBECs, HBEC1KT, HBEC3KT, HBEC4KT, HBEC5KT, HBEC17KT, HBEC30KT, HBEC31KT και HBEC34KT), οι οποίες ξεκίνησαν από εμάς [31].

Οι περισσότεροι του καρκινικού κυττάρου γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI1640 συμπληρωμένο με ορό 5-10% εμβρυϊκό ορό (FBS). Λίγες κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε ACL4 (για τις γραμμές NSCLC) και HITES (για SCLC γραμμές) συμπληρωμένο με 5% FBS. Όλες οι κυτταρικές σειρές HBEC διατηρήθηκαν σε κερατινοκύτταρα SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA) με εκχύλισμα βόειας υπόφυσης (ΒΡΕ) και αυξητικό παράγοντα ανασυνδυασμένο επιδερμικό (EGF) [31]. Όλες οι κυτταρικές σειρές επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2.

Ελήφθη Το γενετικό αποτύπωμα της κάθε κυτταρικής σειράς (Powerplex 1.2 σύστημα, Promega, Madison, WI) και κάθε κυτταρική γραμμή είχε ένα μοναδικό γενετικό προφίλ το οποίο ήταν ταυτόσημο με το προφίλ που λαμβάνεται από την Συλλογή Καλλιεργειών Αμερικανικού τύπου.

DNA και RNA εκχύλιση

Γονιδιωματικό DNA λήφθηκε από σφαιρίδια κυτταρική σειρά με πρότυπες φαινόλης-χλωροφορμίου (1:01) η εκχύλιση ακολουθείται από καταβύθιση αιθανόλης [32] ή με χρήση DNeasy Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA). Ολικό RNA ελήφθη από κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit Plus (QIAGEN). cDNA παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14].

Gene Sequencing

αλληλουχίας του DNA και ανάλυση μεταλλάξεων για

EGFR

(εξόνια 18-21),

HER2

(εξώνια 19 και 20),

KRAS

(κωδικόνια 12, 13, και 61),

BRAF

(εξώνια 11 και 15) και

PIK3CA

(εξόνια 9 και 20) έγιναν όπως αναφέρθηκε από εμάς προηγουμένως [10], [14], [32].

HER3

(εξόνια 18-21) και

HER4

(exons18-23) κατάσταση μετάλλαξης αναλύθηκαν με ενίσχυση PCR του γονιδιωματικού DNA ή cDNA και άμεση αλληλούχιση των PCR προϊόντων [10]. Οι μεταλλάξεις σε αυτά τα γονίδια προσδιορίστηκαν με τη χρήση των εκκινητών PCR όπως απαριθμούνται (Πίνακας S6). Όλες οι PCR διεξήχθησαν σε 25 όγκους μι που περιείχε 100 ng του DNA με τη χρήση HotStarTaq DNA πολυμεράση (QIAGEN Inc., Valencia, CA). DNA ενισχύθηκε για 32 έως 34 κύκλους στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 62 ° C έως 68 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα που ακολουθείται από προέκταση 7 λεπτά στους 72 ° C. Όλα τα προϊόντα PCR επωάσθηκαν με χρήση εξωνουκλεάσης Ι και αλκαλική φωσφατάση γαρίδας (Amersham Biosciences Co., Piscataway, NJ) και προσδιορίστηκε η ακολουθία απευθείας χρησιμοποιώντας τη μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας κύκλου Applied Biosystems PRISM χρωστικής τερματισμού (Perkin-Elmer Co., Foster City, CA). Όλες οι μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν από ανεξάρτητη αλληλουχίας και στις δύο κατευθύνσεις.

Αντιγραφή

αξιολόγηση αριθμό

Αντιγραφή αριθμού κέρδη μπορεί να αξιολογηθεί με έναν αριθμό μεθόδων. Για κλινικά δείγματα, φθορισμό in situ υβριδισμού (FISH) χρησιμοποιείται συχνά, καθώς μπορεί να κάνει διάκριση μεταξύ όγκου και μη-κακοήθη κύτταρα. Εργαστηριακές μελέτες των κυτταρικών γραμμών όγκου (τα οποία είναι ελεύθερα από μη-κακοήθη κύτταρα) χρησιμοποιούν συχνά ποσοτική PCR (qPCR). Μια εναλλακτική μέθοδος είναι η σειρά συγκριτική γονιδιωματική υβριδισμού (aCGH). Επειδή άμεσες συγκρίσεις των μεθόδων αυτών σπάνια έχουν αναφερθεί [33], θα χρησιμοποιηθούν και τις τρεις μεθόδους.

Σε πραγματικό χρόνο qPCR

Οι αριθμοί αντιγράφων γονιδίων προσδιορίστηκαν με τη χρήση πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR χρησιμοποιώντας το Chromo4 Σύστημα PCR (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Για τον προσδιορισμό του αριθμού αντιγράφων του γονιδίου-στόχου, χρησιμοποιήσαμε γονίδια ελέγχου βρίσκονται στο ίδιο χρωμόσωμα με το γονίδιο-στόχο (Πίνακας S6). Οι προκύπτουσες αναλογίες συγκρίθηκαν με παρόμοιες αναλογίες από διπλοειδή κύτταρα (οι μέσες τιμές των οκτώ κυτταρικές σειρές HBEC. Μεθοδολογία TaqMan χρησιμοποιήθηκε εκτός για

PIK3CA

[14]. Εκκινητές και ανιχνευτές επιλέχθηκαν από TaqMan Primer Express ™ 1.5 (Applied Biosystem, Foster City, CA). Οι εκκινητές αγοράστηκαν από την Invitrogen και ανιχνευτές από την Biosearch Technologies (Novato, CA). Οι αλληλουχίες των εκκινητών και ανιχνευτών φαίνεται στον πίνακα S6. κατασκευάστηκαν πρότυπες καμπύλες με σειριακές αραιώσεις των ειδικών PCR προϊόντων. μείγματα Amplification (25 μΙ) περιείχε το δείγμα DNA (20 ng), 10 × ρυθμιστικού TaqMan (2,5 μΐ), 200 μΜ dNTP, 1,25 U HotStar Taq ™ DNA πολυμεράση, 200 ηΜ από κάθε εκκινητή και 100 ηΜ ιχνηλάτη. Οι συνθήκες θερμικού κύκλου που αποτελείται 5 λεπτά στους 95 ° C και 40 κύκλους στους 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 30 s. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν. η παράμετρος C

t ορίζεται ως ο αριθμός κλασματικών κύκλος στον οποίο ο φθορισμός που παράγεται από διάσπαση του ανιχνευτή περνάει ένα σταθερό όριο άνω βασική γραμμή. Ο αριθμός αντιγράφων του γονιδίου-στόχου σε άγνωστα δείγματα προσδιορίζεται ποσοτικά δια μετρήσεως C

t αξιών και με τη χρήση μίας πρότυπης καμπύλης για τον προσδιορισμό του αριθμού αντιγράφων [34]. αριθμός αντιγράφων του γονιδίου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: G = (S

T /S

C) /(N

T /N

C).

PIK3CA

αριθμού αντιγράφων αξιολογήθηκε όπως περιγράφεται από εμάς προηγουμένως [14].

μονοπάτι Πλακάκια aCGH

aCGH διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], [15]. Γονιδιωματικής ανισορροπίες ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας aCGH-Ομαλή [35] όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36].

δοκιμασίες FISH

δοκιμασίες FISH διπλού χρώματος πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με ένα πρότυπο πρωτόκολλο [37], [38 ]. Τα σετ καθετήρα, EGFR /CEP7 και PathVysion και η έλεγχοι CEP7 ελήφθησαν από την Abbott Μοριακής (Des Plaines, Illinois), HER3 /CEP12 ελήφθη από QBiogene? ανιχνευτής BRAF δημιουργήθηκε από το βακτηριακό κλώνο τεχνητού κλώνος (BAC) που χρησιμοποιείται για aCGH. Οι αριθμοί αντιγράφου των γονιδίων στόχων (επισημασμένο με κόκκινο φθοροφόρα) και οι ανιχνευτές CEP (επισημαίνονται Spectrum Πράσινο) ελέγχθηκαν σε τουλάχιστον 100 κύτταρα μεσόφαση και 20 επάλειψη μετάφαση. Εικόνες συνελήφθησαν και συγχωνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το CytoVision εργασίας (Applied Imaging, San Jose, CA).

Υπο-κλωνοποίηση

Το γονιδιακό DNA απομονώθηκε από μεταλλαγμένα

EGFR

ή

KRAS

κυτταρικές σειρές NSCLC και χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για PCR ενίσχυση του

EGFR

ή

KRAS

. Οι εκκινητές και οι συνθήκες αντιδράσεις PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν σε φορέα ρΟΚ2.1-ΤΟΡΟ χρησιμοποιώντας το κιτ κλωνοποίησης ΤΟΡΟ ΤΑ (Invitrogen). επιλέχθηκαν περίπου 20 κλώνους (range15-25) για αλληλούχιση χρησιμοποιώντας είτε Μ13 πρόσθιο εκκινητή ή αντίστοιχο

EGFR

ή

KRAS

εκκινητές. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων που υπάρχουν στο συνολικό αριθμό κλωνοποιηθεί.

ΤΚΙ ευαισθησία

Η χρωματομετρική δοκιμασία MTS (Promega) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αυτή η δοκιμασία βασίζεται στη μετατροπή του MTS σε φορμαζάνη διαλυτού από ενδογενή ένζυμα αφυδρογονάσης βρέθηκαν σε μεταβολικά δραστικά κύτταρα. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε 1 × 10

3-4 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε ιστοκαλλιέργεια αγωγή πλάκες 96-φρεατίων. Την επόμενη ημέρα, ΤΚΙ (gefitinib ή erlotinib) προστέθηκε σε κάθε πλάκα σε μία σειρά αραίωσης σε ολόκληρη την πλάκα, έτσι ώστε οκτώ διαφορετικές συγκεντρώσεις του φαρμάκου ελέγχθηκαν. Την ημέρα 5, προστέθηκαν 20 μΙ MTS, ακολουθούμενη από 1 ώρα επώασης στους 37 ° C και στη συνέχεια η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm σε αναγνώστη πλακός.

96 φρεατίων δεδομένα πλάκα εισήχθησαν μια in-house Βάση δεδομένων του φαρμάκου in vitro ευαισθησία δοκιμασίες (DIVISA από τον Luc Girard, χειρόγραφο υπό προετοιμασία), όπου υπολογίζονται IC50s καθώς και διάφορα στατιστικές αναλύσεις. Για τον υπολογισμό των τιμών IC50, τα δεδομένα ήταν αφαιρεθεί το υπόβαθρο (στήλες 1 και 12 συνήθως περιέχονται μέσα ενημέρωσης χωρίς κύτταρα ή τα ναρκωτικά και υπηρέτησε ως τιμές φόντο), και τοποθετείται στο μοντέλο Λαϊκή Δημοκρατία του Κονγκό (R πακέτο «ΛΔΚ» από τον Christian Ritz και Jens Streibig, https://www.bioassay.dk) για να δημιουργηθεί σιγμοειδή καμπύλη από την οποία προσδιορίστηκε η συγκέντρωση που αναστέλλει το 50% των κυττάρων (IC50).

Στατιστικές αναλύσεις

του Fisher δύο ουρά ακριβής τεστ προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Prism 4 (Graph Pad, San Diego, CA). Ρ τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές. Οι άλλες στατιστικές αναλύσεις συζητούνται υπό τις κατάλληλες κατηγορίες στην ενότητα Αποτελέσματα.

Αποτελέσματα

Μεταλλάξεις (m) και CNGS (ζ) σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα

Εξετάσαμε 32 SCLC και τρεις γραμμές από μικρό κελί καρκίνων από εξωπνευμονική sites (εξωπνευμονική μικροκυτταρικό καρκίνο, ExPuSC), για σωματικές μεταλλάξεις και CNGS του

EGFR

γονίδια οδού. Βρήκαμε συνολικά μόνο τρεις μεταλλάξεις σε 35 κυτταρικές σειρές και οι τρεις ήταν

PIK3CA

μεταλλάξεις (Πίνακας S1). CNGS για

EGFR

γονίδια οδού ήταν σπάνια συναντώνται σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (Πίνακας S2). Από σωματικές μεταλλάξεις και CNGS για

EGFR

γονίδια μονοπάτι ήταν σπάνια σε SCLC, θα περιοριστεί περαιτέρω μελέτες μας να NSCLC.

Για οποιαδήποτε από τις επτά γονίδια που εξετάστηκαν, οι μεταλλάξεις (39/77, 50,6% ), αντίγραφο κέρδη αριθμό (50/77, 64,9%) ή είτε (65/77, 84,4%) ήταν συχνές σε γραμμές NSCLC. Τα ευρήματα αυτά συζητούνται με μεγαλύτερη λεπτομέρεια παρακάτω.

Μεταλλάξεις (m) του

γονίδια EGFR

οδού στον NSCLC

Εξετάσαμε τις γραμμές NSCLC, για σωματικές μεταλλάξεις του

EGFR γονίδια

οδού, όπως αναφέρεται στην ενότητα Μέθοδοι. Βρήκαμε συνολικά 40 μεταλλάξεις σε κυτταρικές γραμμές 39 (50,6%) (Σχ 1α, Πίνακας S3). Αυτές οι μεταλλάξεις αποτελούνταν από 19

KRAS

(24,7%), 10

EGFR

(13%), πέντε

BRAF

(6,5%), τέσσερα

PIK3CA

(5,2%), ένα

HER2

(1,3%), ένα

HER4

(2,2%) και καμία για

HER3

. m

EGFR

, m

BRAF

και m

HER2

ήταν παρόντες αποκλειστικά σε αδενοκαρκινώματα, ενώ m

KRAS

ήταν πιο συχνές σε αδενοκαρκίνωμα και μεγάλο ιστολογίες κυττάρων. m

PIK3CA

ήταν οι μόνες μεταλλάξεις που δεν στοχεύουν αδενοκαρκίνωμα ιστολογίας (Εικ. 1γ).

Σχήμα 1α. δείχνει την συχνότητα των μεταλλάξεων και τον αριθμό αντιτύπου κέρδη

γονίδια EGFR

οδού (

EGFR

,

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

,

HER2

,

HER3

και

HER4

). Σαράντα μεταλλάξεις ταυτοποιήθηκαν σε 39 κυτταρικές γραμμές. Μεταλλάξεις και τον αριθμό αντιτύπου κέρδη ήταν πιο συχνή για

EGFR

(13%, 40,3%) και

KRAS

(24,7%, 14,3%) από ό, τι άλλο γονίδιο. CNGS για

HER2

(18,2%) ήταν επίσης κοινά. Εντοπίσαμε μόνο ένα

HER2

και ένα

HER4

σωματική μετάλλαξη. Οι αριθμοί πάνω από τις στήλες δείχνουν τον αριθμό των κυτταρικών σειρών με μεταλλάξεις (μπλε στήλες) ή τον αριθμό αντιγράφων κέρδη (κόκκινο στήλες). Σχ 1β. Το σχήμα απεικονίζει τον αριθμό των γονιδίων που αποδεικνύουν CNGS σε μεταλλάξεως και αγρίου τύπου κυτταρικές σειρές. Από τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν 77, 39 (50,6%) είχαν μετάλλαξη σε τουλάχιστον ένα από τα επτά γονίδια οδού EGFR που εξετάστηκαν. CNGS ήταν συχνές και στις δύο μεταλλάξεως και αγρίου τύπου κυτταρικές σειρές. Σχ 1γ. δείχνει τη συχνότητα των μεταλλάξεων με βάση την NSCLC υπότυπο. Μεταλλάξεις του

EGFR

και

BRAF

βρέθηκαν αποκλειστικά σε αδενοκαρκίνωμα υπότυπο. Η ενιαία

HER2

μετάλλαξη ήταν σε αδενοκαρκίνωμα σε σύγκριση με το

HER4

σωματική μετάλλαξη που ταυτοποιήθηκε σε ένα πλακωδών κυττάρων ca. Σχ 1δ. δείχνει την συχνότητα του αριθμού αντιγράφων κέρδη (CNGS) (ζ & gt? 4 με qPCR) βάσει του NSCLC υπότυπο. CNGS για

BRAF

και

PIK3CA

παρατηρήθηκαν κυρίως σε αδενοκαρκίνωμα και το καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων, αντίστοιχα. CNGS για το υπόλοιπο των γονιδίων δεν ευνοεί οποιοδήποτε υπότυπο.

Η

Οι μεταλλάξεις είναι αμοιβαία αποκλειόμενες

Εξετάσαμε για οποιαδήποτε συσχέτιση μεταξύ σωματικές μεταλλάξεις σε μεμονωμένες κυτταρικές σειρές. Προκειμένου να ελεγχθεί η υπόθεση ότι

γονιδίου EGFR

οδού μεταλλάξεις αλληλοαποκλείονται, χρησιμοποιήσαμε προσομοιώσεις Monte Carlo για τον υπολογισμό της εμπειρικής p-value. Η μηδενική υπόθεση είναι ότι οι μεταλλάξεις θα συμβεί ανεξάρτητα. Προσομοιώσαμε την από κοινού διανομή των γεγονότων μετάλλαξης μεταξύ αυτών των επτά γονιδίων χρησιμοποιώντας τις παρατηρηθείσες οριακούς συντελεστές μετάλλαξη και την ανεξάρτητη υπόθεση. Σε κάθε προσομοίωση, σημειώσαμε τον αριθμό των κυτταρικών σειρών με πολλαπλές μεταλλάξεις. Επαναλάβαμε τις προσομοιώσεις 10.000 φορές και έλαβε την εμπειρική κατανομή του αριθμού των κυτταρικών σειρών με πολλαπλές μεταλλάξεις? τότε συγκρίναμε την παρατηρούμενος αριθμός κυτταρικών σειρών με πολλαπλές μεταλλάξεις με αυτή την εμπειρική διανομή για τον υπολογισμό της p-value

Για τη μελέτη αυτή, η ρ-τιμή μονόπλευρη είναι 0,0014.? Ως εκ τούτου, απορρίψαμε την μηδενική υπόθεση και κατέληξε στο συμπέρασμα ότι οι μεταλλάξεις γονιδίων είναι αμοιβαία αποκλειστικές εκδηλώσεις για αυτά τα γονίδια σε κυτταρικές σειρές NSCLC, με μία εξαίρεση (Πίνακας 1). Μεγάλες γραμμή καρκίνωμα NCI-Η460 είχε τόσο

KRAS

και

PIK3CA

μεταλλάξεις.

Η

Σύγκριση των μεθόδων για τον καθορισμό αριθμού κέρδη αντίγραφο

aCGH , FISH και qPCR χρησιμοποιήθηκαν για να δοκιμαστούν οι αριθμοί αντιγράφου γονιδίου για κυτταρικές γραμμές NSCLC. Δεν υπάρχει σαφής αξία των βιολογικών όριο για τον καθορισμό των ανώμαλη αριθμό αντιγράφων για ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC? επιλέξαμε τις τιμές κατωφλίου που θα μπορούσε να επιτύχει την καλύτερη δυνατή θετική ή αρνητική συμφωνίας κατηγορία μεταξύ των τριών δοκιμών. Συγκεκριμένα, υπολογίσαμε τις στατιστικές Kappa [39] μεταξύ των τεστ aCGH και qPCR πάνω από δύο διαστάσεων cut-off πλέγματα ως 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 και 5? και στη συνέχεια έκανε το ίδιο για τα ψάρια και qPCR. Οι τιμές cut-off που πέτυχε την καλύτερη συμφωνία μεταξύ των τριών δοκιμών ήταν ως εξής: 4 για qPCR, 3 για CGH και 4.5 για ψάρια? και χρησιμοποιήσαμε αυτές τις τιμές για να καθορίσει την παρουσία του αντιγράφου κέρδη αριθμό σε κυτταρικές σειρές NSCLC. Χρησιμοποιώντας αυτές τις τιμές cut-off και όλα τα διαθέσιμα στοιχεία, υπήρξε πολύ σημαντική συμφωνία (p & lt? 0.001) μεταξύ των τριών μεθόδων, όπως φαίνεται στον Πίνακα 2.

Η

γονιδίου EGFR

μονοπάτι CNGS

Καθώς τα στοιχεία qPCR ήταν πλήρης για όλες τις γραμμές (ενώ υποσύνολα ελέγχθηκαν από τις άλλες δύο μεθόδους, οι οποίες είναι πιο επίπονη και δαπανηρή), χρησιμοποιήσαμε τα στοιχεία qPCR για όλες τις περαιτέρω αναλύσεις. Αντιγραφή κέρδη αριθμός ήταν συχνές (& gt? 10%) για

EGFR

,

HER2

,

HER3

και

KRAS

(Σχήμα 1α, Πίνακας S4) . Ειδικότερα, τα κέρδη για το

EGFR

ήταν περισσότερο από δύο φορές τόσο συχνά (40%) από ό, τι για οποιοδήποτε άλλο γονίδιο. Σε γενικές γραμμές, με τις εξαιρέσεις του ζ

BRAF

(περιορίζεται σε αδενοκαρκίνωμα ιστολογίας), και ζ

PIK3CA

(περιορίζεται σε μεγάλο βαθμό στην ιστολογία εκ πλακώδους επιθηλίου), CNGS δεν έδειξε καμία εμφανή ιστολογία υπότυπο προκατάληψη ( Εικ. 1γ).

Σχέση μεταξύ μεταλλάξεις και τον αριθμό αντιγραφής κέρδη

Σε αντίθεση με μεταλλάξεις, ο αριθμός αντιτύπων κέρδη δεν ήταν αμοιβαία αποκλειόμενα, είτε με άλλα CNGS ή με μεταλλάξεις (Εικ. 2). Βρήκαμε CNGS για δύο ή περισσότερα γονίδια σε 32,5% (25/77) των κυτταρικών σειρών (Πίνακας S4). Ωστόσο, σημείωσε μια πολύ σημαντική συσχέτιση μεταξύ μεταλλάξεων του

EGFR

ή

KRAS

και CNGS των αντίστοιχων γονιδίων τους (Σχήμα 3α, 3β).

Σχήμα 2α. δείχνει ότι ο αριθμός αντιτύπων κέρδη και οι μεταλλάξεις δεν αλληλοαναιρούνται. Όπως προκύπτει από το σχήμα CNGS για

EGFR

και

KRAS

είναι πολύ πιο συχνές σε

EGFR

και

KRAS

μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές, αντίστοιχα (p & lt? 0,05 ). Υπήρχε μόνο ένα

HER2

και

HER4

μεταλλαγμένο NSCLC κυτταρική σειρά και έτσι δεν είχαν συμπεριληφθεί σε αυτό το σχήμα. Σχήμα 2Β. δείχνει ότι ο αριθμός αντιτύπων κέρδη δεν αλληλοαναιρούνται και τα κέρδη ενός γονιδίου μπορεί να συμβεί με την παρουσία των κερδών για άλλα γονίδια.

Η

EGFR

και

KRAS

γονίδια έχουν κατά προτίμηση αριθμό αντιγράφων κέρδη (CNG) σε κυτταρικές σειρές που φέρουν τις αντίστοιχες μεταλλάξεις (πλαίσια α και β). Στο μεταλλαγμένο γραμμές, το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο σχεδόν πάντοτε είναι σε περίσσεια σε σχέση με το αλληλόμορφο άγριου τύπου (πάνελ c και d), ένα φαινόμενο που ονομάζεται έχουμε MASI. Στις περισσότερες περιπτώσεις MASI το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο αποδεικνύει CNGS? Ωστόσο MASI μπορεί επίσης να υπάρχουν σε κυτταρικές γραμμές που έχουν διπλοειδή αριθμό αντιγράφων του ογκογονιδίου, (επίκτητη μονογονεϊκή δισωμία) είτε ομοιόμορφη (ΝΟΙ-Η460) ή ετερογενείς (NCI-H1975).

Η

μεταλλαγμένο αλληλόμορφο ειδικές ανισορροπία (MASI) για

EGFR

και

KRAS

γονίδια

Όπως προαναφέρθηκε CNGS του

EGFR

και

KRAS

ήταν πιο συχνές σε κυτταρικές γραμμές που φέρουν αυτές τις μεταλλάξεις. Χρησιμοποιεί τη μέθοδο της υπο-κλωνοποίησης που περιγράφηκε προηγουμένως, ερευνήσαμε εάν η

EGFR

και

KRAS

γονίδια αποδεικνύεται κατά προτίμηση μεταλλαγμένο αλληλόμορφο ειδικές CNGS σε κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν τις αντίστοιχες μεταλλάξεις (Εικ. 3). Τα δεδομένα για τις δοκιμές με το αν οι μεταλλαγμένα αλληλόμορφα ενισχύονται σε γονίδιο μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές συγκεντρωμένα δεδομένα με δυαδική έκβαση. Κάθε κυτταρική γραμμή είναι ένα σύμπλεγμα και η μηδενική υπόθεση είναι ότι ο ρυθμός μετάλλαξης είναι 0,5. Επειδή ο αριθμός των υποκλώνων σε κάθε κυτταρική σειρά ποικίλει, χρησιμοποιήσαμε την προσέγγιση ανάλυσης για τον σύμπλεγμα δυαδικό αποτέλεσμα με διάφορα μεγέθη σύμπλεγμα [40]. Στο μεταλλαγμένο γραμμές, το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο ήταν σχεδόν πάντοτε σε περίσσεια σε σχέση με το αλληλόμορφο άγριου τύπου, ένα φαινόμενο που ονομάζεται έχουμε MASI. Η τιμή p για

EGFR

μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές ήταν 0.019 και για

KRAS

μεταλλαγμένη κυτταρική γραμμή ήταν 0,0003 δείχνει ότι οι μεταλλαγμένα αλληλόμορφα ήταν κατά προτίμηση κυρίαρχο και στις δύο περιπτώσεις. Οι περισσότερες περιπτώσεις MASI οφείλονταν σε αυξημένο αριθμό αντιγράφων του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου. Ωστόσο, σε λίγες περιπτώσεις MASI σημειώθηκε επίσης σε κύτταρα που έχουν διπλοειδή ή κοντά διπλοειδή αριθμό αντιγράφων (αποκτήθηκε μονογονεϊκή δισωμία). Έτσι χρησιμοποιήσαμε τον όρο MASI σε αντίθεση με μεταλλαγμένο αλληλόμορφο συγκεκριμένες κέρδη.

Χαρακτηριστικά

EGFR

της Mutant Γραμμές κυττάρων

Οι κλινικο-παθολογικές και μοριακών δεδομένων για την NSCLC κελί 10 γραμμές που φιλοξενούν

οι EGFR

μεταλλάξεις συνοψίζονται στον πίνακα 3. Όλες περιείχαν μία από τις δύο μεγάλες μεταλλάξεις στην περιοχή κινάσης, είτε διαγραφές του εξονίου 19 (n = 7) ή μετάλλαξη L858R στο εξόνιο 21 (n = 3 ). Μεταλλάξεις παρατηρήθηκαν αποκλειστικά σε αδενοκαρκίνωμα και ποτέ καπνιστές ή σε ασθενείς με χαμηλή έκθεση καπνού (≤10 ετών pack). Ένα

EGFR

μεταλλαγμένη κυτταρική σειρά αναπτύχθηκε στην Ιαπωνία και τα υπόλοιπα εννέα αναπτύχθηκαν στη Βόρεια Αμερική. Από τις εννέα που αναπτύχθηκε στη Βόρεια Αμερική, μόνο μία ήταν από ένα άτομο της ασιατικής εθνικότητας. Επιπλέον, εντοπίσαμε ότι

EGFR

μεταλλάξεις ήταν πιο συχνές σε συγκριτικά νεότερη ηλικιακή ομάδα (& lt? 55 χρόνια).

Η

Επτά από αυτές τις κυτταρικές σειρές ήταν ευαίσθητα στο gefitinib. Οι τρεις ανθεκτικές γραμμές είχε μια δεύτερη μετάλλαξη: είτε η αντίσταση Τ790Μ σχετίζεται μετάλλαξη στο εξόνιο 20 (n = 2) ή μια ομόζυγη διαγραφή των

ΡΤΕΝ

γονιδίου και απουσία της πρωτεΐνης της [41] (μη δημοσιευμένες παρατηρήσεις των συγγραφέων ).

Εφέ μεταλλάξεων και τον αριθμό αντιτύπου κέρδη από ευαισθησία στο TKIs

για να αξιολογηθεί η επίδραση των μεταλλάξεων και τον αριθμό αντιτύπου κέρδη από ευαισθησία στο TKIs, αναλύσαμε τις τιμές IC50 των 45 κυτταρικών σειρών NSCLC . Επειδή ΤΚΙ κλινική ευαισθησία στοχεύει επιλεκτικά αδενοκαρκίνωμα ιστολογίας, συμπεριλάβαμε 31 αδενοκαρκινώματα. Το σύνολο υποσύνολο περιλαμβάνεται το σύνολο των

EGFR

,

HER2

και

HER4

μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές και 12

KRAS

και 3

BRAF

κυτταρικές γραμμές. Επειδή

PIK3CA

μεταλλάξεις ευνοείται ιστολογία μη αδενοκαρκινώματος μόνο ένα

PIK3CA

μεταλλαγμένη κυτταρική σειρά είχε συμπεριληφθεί. Του συνόλου υποσύνολο 17 γραμμές ήταν άγριου τύπου για όλα τα γονίδια που εξετάστηκαν (Πίνακας S5)

Βρήκαμε μια εξαιρετική συμφωνία μεταξύ των τιμών IC50 μεταξύ gefitinib και erlotinib. (P & lt? 0.0001) (Σχήμα 4, Πίνακας S7). Επειδή τα στοιχεία μας που για την ευαισθησία gefitinib ήταν πιο εκτεταμένη έχουμε εκλεγεί για να χρησιμοποιούν τα δεδομένα gefitinib για περαιτέρω αναλύσεις

Σαράντα πέντε κυτταρικές σειρές που ελέγχθηκαν για ευαισθησία σε δύο φαρμάκων και η αντιστοιχία ήταν εξαιρετική (p & lt? 0.0001)..

Εικ. 5 απεικονίζει τα μοτίβα ευαισθησία των δοκιμαζόμενων κυτταρικών σειρών. Η in vitro συγκέντρωση 1 μΜ που χρησιμοποιούνται σε καλλιέργεια ιστού συσχετίζεται με τη συγκέντρωση στο πλάσμα του gefitinib σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με την τυποποιημένη δόση του gefitinib δηλαδή 250 mg την ημέρα. Το όριο αυτό έχει χρησιμοποιηθεί από ερευνητές στο παρελθόν για να διακρίνει τα ευαίσθητα από αδρανείς και /ή ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές [7]. Με βάση την ανωτέρω ορίου και το σχήμα της καμπύλης, θα χωρίζεται κυτταρικές γραμμές μας σε 3 κατηγορίες: ευαίσθητα (≤1 μΜ), το ενδιάμεσο (& gt? 1 μΜ αλλά ≤10 μΜ) και ανθεκτικά (& gt? 10 μΜ ) όπως φαίνεται στο σχήμα Σχ. 5. Οι τιμές IC50 ακολουθούν μια γραμμή που επέδειξε ένα σημείο αλλαγής κλίσης σε περίπου 10 μΜ, και έτσι αποδεικνύεται ένα προφανώς δικόρυφη κατανομή (Εικ. 5). Όπως κυτταρικές σειρές με τιμές κάτω από 1 μΜ θεωρήθηκαν ως ευαίσθητα, εμείς αυθαίρετα κατηγοριοποιούνται τιμές μεταξύ 1 και 10 μΜ ως ενδιάμεσο στην ευαισθησία.

Σχήμα 5. δείχνει μια καμπύλη καταγραφής των gefitinib τιμές IC50 για 45 κυττάρων NSCLC γραμμές. Αυτές οι εταιρείες κατατάσσονται σε τρεις κατηγορίες με βάση gefitinib IC50: Ευαίσθητη (IC50 & lt? 1 μΜ), ενδιάμεσο (IC50 & gt? 1, αλλά & lt? 10 μΜ) και ανθεκτικά (IC50 & gt? 10 μΜ). Από τις εννέα ευαίσθητες κυτταρικές σειρές, επτά από τους υποθάλπουν

EGFR

μεταλλάξεις, έχει κανείς CNGS για

EGFR

και πρέπει κανείς CNG για

HER2

. Από τα υπόλοιπα

EGFR

της μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές, δύο είχαν Τ790Μ μετάλλαξη (μία ενδιάμεση και μία ανθεκτική) και ένας είχε μια ομόζυγη διαγραφή του

PTEN

(ανθεκτικό).

KRAS

μεταλλαγμένων και άγριου τύπου κυτταρικές σειρές ήταν όλα ανθεκτικά στο gefitinib.

Η

Υπήρχαν εννέα γραμμές κυττάρων στην ευαίσθητη ομάδα και περιλαμβάνονται επτά από τις δέκα m

EGFR

γραμμές, ένα ζ

EGFR

κυτταρική γραμμή και ένα ζ

HER2

κυτταρική σειρά. Η ενδιάμεση κατηγορία αποτελείται από μόνο δύο κυτταρικές σειρές? a m

EGFR

κυτταρική γραμμή που έχει μια δευτερεύουσα μετάλλαξη Τ790Μ και ζ

HER2

κυτταρική σειρά. Η ανθεκτική κατηγορία κυτταρική γραμμή ήταν η μεγαλύτερη και περιλάμβανε δύο μ

EGFR

κυτταρικές σειρές, το ένα με το δευτερεύον μετάλλαξη Τ790Μ και το άλλο με ομόζυγη διαγραφή του

PTEN

γονίδιο. Οι υπόλοιπες ανθεκτικές γραμμές περιλαμβάνονται όλες από τις γραμμές άγριου τύπου και όλες οι γραμμές που έχουν

KRAS

,

BRAF

,

HER2

,

HER4

και

PIK3CA

μεταλλάξεις.

με μονοπαραγοντική δοκιμές, αναλύσαμε τη συσχέτιση μεταξύ της ευαισθησίας gefitinib και κατάστασης μεταλλάξεων ή CNGS των διαφόρων

γονίδια EGFR

οδού και βρήκαν μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της ευαισθησίας gefitinib με

EGFR

μετάλλαξη (p = 0,002) και

EGFR

αριθμού αντιγράφων κέρδη (p = 0,001). Ελέγξαμε την υπόθεση ότι KRAS μεταλλάξεις παρέχουν ενδογενή ανθεκτικότητα σε TKIs.