Αφηρημένο

Η ανάπτυξη στοχευμένων θεραπειών μοριακής προσέφερε αξιοσημείωτη πρόοδος στην θεραπεία ανθρώπινων καρκίνων. Ωστόσο, στους περισσότερους όγκους η επιλεκτική πίεση που προκλήθηκε από αντικαρκινικούς παράγοντες ενθαρρύνει τα καρκινικά κύτταρα να αποκτήσουν μηχανισμούς ανθεκτικότητας. Η παραγωγή νέων ορθολογικά σχεδιασμένα παράγοντες στόχευσης που δρουν στο μονοπάτι ογκογόνο (ες) σε πολλαπλά επίπεδα είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για μοριακή θεραπείες. 2-φενυλιμιδαζο [2,1

β

] παράγωγα βενζοθειαζολίου έχουν επισημανθεί για τις ιδιότητές τους στόχευσης σηματοδότησης ογκογόνων Met κινάσης τυροσίνης (RTK). Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε το μηχανισμό δράσης ενός από τα πιο ενεργά ιμιδαζο [2,1

b

] παράγοντες ήμισυ που βασίζεται βενζοθειαζολ-2-υλφαινυλ, Triflorcas, σε ένα πάνελ καρκινικών κυττάρων με διακριτές χαρακτηριστικά. Δείχνουμε ότι Triflorcas παρεμποδίζει in vitro και in vivo ογκογένεση των καρκινικών κυττάρων που φέρουν Met μεταλλάξεις. Επιπλέον, Triflorcas εμποδίζει την επιβίωση και την ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων που χαρακτηρίζεται από «RTK εναλλαγή» παρεμβαίνοντας με φωσφορυλίωση PDGFRβ. Μια συγκρατημένη επίδραση της Triflorcas στις μεταβολικές γονίδια συσχετίζεται με την απουσία σημαντικών παρενεργειών in vivo. Μηχανιστικά, πέραν της στόχευσης Met, Triflorcas μεταβάλλει τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ΡΙ3Κ-Akt μονοπάτι, μεσολαβώντας ογκογόνο εξάρτηση με Met, εκτός από ρετινοβλάστωμα και nucleophosmin /B23, με αποτέλεσμα αλλαγμένο πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και μιτωτική αποτυχία. Τα ευρήματά μας δείχνουν πώς η ασυνήθιστη δέσμευσης πλαστικότητα του ενεργού κέντρου Met προς δομικά διαφορετικών αναστολέων μπορεί να αξιοποιηθεί για την παραγωγή φαρμάκων μπορούν να στοχεύουν Met ογκογόνο εξάρτηση σε διαφορετικά επίπεδα. Επιπλέον, η ασθένεια προσανατολισμένη Screen NCI Anticancer Drug αποκάλυψε ότι Triflorcas αποσπά ένα μοναδικό προφίλ ανάπτυξης ανασταλτικής-αποκρίσεις σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, υποδεικνύοντας ένα νέο μηχανισμό δράσης του φαρμάκου. Η δραστικότητα κατά του όγκου που προκαλείται από 2-φαινυλιμιδαζο [2,1

b

] παράγωγα βενζοθειαζολίου μέσω της συνδυασμένης αναστολής διακριτών τελεστές σε καρκινικά κύτταρα τα αποκαλύψει να είναι πολλά υποσχόμενη αντικαρκινικοί παράγοντες για περαιτέρω διερεύνηση.

Παράθεση: Furlan Α, Β Roux, Lamballe F, Conti F, Issaly Ν, Daian F, et al. (2012) συνδυαστικό φάρμακο Δράση 2-φαινυλιμιδαζο [2,1

β

] παράγωγα βενζοθειαζολίου σε καρκινικά κύτταρα Σύμφωνα με τους Ογκογόνες Μοριακής υπογραφές. PLoS ONE 7 (10): e46738. doi: 10.1371 /journal.pone.0046738

Επιμέλεια: Olivier Gires, Πανεπιστήμιο Ludwig-Maximilians, Γερμανία

Ελήφθη: May 25, 2012? Αποδεκτές: 4 Σεπ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 Οκτώβρη, 2012

Copyright: © Furlan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα ταμεία της από την Inca (Institut National du Cancer), ARC (Association pour la Recherche contre le καρκίνο), FRM (Fondation pour la Recherche médicale), FDF (Fondation de France), Fondation Bettencourt-Schueller, Marie Curie υποδοχής Fellowship για τη μεταφορά γνώσεων (MTKD-CT-2.004 με 509.804), Protisvalor, Valorpaca και OSEO σε FM. Αυτή η έρευνα έχει αναπτυχθεί στο πλαίσιο του COST Action CM0602 «αναστολείς αγγειογένεσης: σχεδιασμός, σύνθεση και βιολογική εκμετάλλευση». AF υποστηρίχθηκε από το Inca και ARC? NI από Valorpaca, FC από την Ιταλική Ένωση Έρευνας για τον Καρκίνο (ARC) και από OSEO. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν λάβει χρηματοδότηση από Protisvalor. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλα τα PLoS ONE πολιτικής για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

κινάσης τυροσίνης υποδοχέα (RTK) σηματοδότηση έχει ενοχοποιηθεί στην εξέλιξη του όγκου για την ικανότητά της να η μοίρα των κυττάρων επιρροή μέσω αλλαγών σε βασικά ρυθμιστικά κυκλώματα [1] – [3]. Όπως αποδεικνύεται από τον καρκίνο γονιδιωματικές μελέτες, RTK σηματοδότηση είναι μία βασική οδός μεταβάλλεται συχνά στον ανθρώπινο καρκίνο [4], [5]. Δείξαμε πρόσφατα το ενδιαφέρον των κόμβων σηματοδότησης διασύνδεσης RTK και των βασικών οδών p53 και τις επιπτώσεις της στόχευσης αυτών των κόμβων κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου [6], [7]. Η σημασία των αλλαγμένη RTKs στην ογκογένεση έχει καταρτίσει τεράστιο ενδιαφέρον για την ταυτοποίηση παραγόντων μπορεί να το συγκρατήσει δραστηριότητα και λειτουργία τους. Μέχρι σήμερα, οι μοριακές θεραπείες για «RTK-εθισμένος» καρκινικά κύτταρα βασίζεται κυρίως στην εφαρμογή των ενώσεων που επιλεκτικά στοχεύουν την ογκογόνο RTK [1]. Ωστόσο, η επιτυχία αυτών των στρατηγικών έχει περιορισμένη, δεδομένου ότι η αναστολή του «πρωτογενούς RTK-εθισμό» πυροδοτεί μια επιλεκτική πίεση σε καρκινικά κύτταρα να αποκτήσουν αντίσταση μέσω της «RTK εναλλαγή» [8], [9]. Οι περιορισμοί αυτοί επιβάλλουν την αναγνώριση ή τη συνδυασμένη χρήση, των παραγόντων που όχι μόνο στοχεύουν εξάρτηση σηματοδότησης RTK, αλλά και εμποδίζουν την προσαρμογή που προκαλείται από απολύσεις στο δίκτυο σηματοδότησης RTK [10].

Μια προσέγγιση για την παράκαμψη «RTK εναλλαγή «θα μπορούσε να είναι ο προσδιορισμός των φαρμάκων παρεμβαίνει με εξάρτηση ογκογονίδιο ενεργώντας σε πολλαπλά επίπεδα εντός της διαδρομής του εθισμού. Ένα παράδειγμα αυτής της έννοιας παρέχεται από Sorafenib, ένα μικρό χημικό παράγοντα ικανό να αναστείλει διάφορες RTKs, συμπεριλαμβανομένων VEGFR, PDGFRβ, Kit, FGFR1, Ret, και την ενδοκυτταρική κινάση Raf [11]. Η δραστικότητα ευρέος φάσματος των Sorafenib σε διάφορα μοντέλα καρκίνου είναι πιθανό να οφείλεται στο ευρύ φάσμα των στόχων της. Παρ ‘όλα αυτά, η δραστηριότητα Sorafenib σε μερικούς τύπους μοντέλων όγκων οφείλεται στην ταυτόχρονη αναστολή της RTK με γνώμονα την αγγειογένεση και την RTK κατάντη μονοπάτι Raf /ΜΑΡΚ [11]. Η γενιά των παραγόντων, που στοχεύουν ογκογόνο διαδρομή (ες) σε πολλαπλά επίπεδα, δεν είναι ένα απλό θέμα, σε αντιδιαστολή στόχοι απαιτούν ακριβή δομή των ναρκωτικών και χημικές τροποποιήσεις των φαρμάκων μπορεί να είναι είτε επηρεάζουν την επιλεκτικότητα (π.χ. με τη στόχευση πολλαπλών RTK), την αποτελεσματικότητα, ή της τοξικότητας . Σε αντίθεση με άλλες RTKs, η αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων (HGF) του υποδοχέα Met χαρακτηρίζεται από ασυνήθιστα δομική πλαστικότητα ως δραστική θέση του μπορεί να υιοθετήσει τρόπους δεσμευτικές διακριτές αναστολέα [12]. Πράγματι, ένα ευρύ φάσμα των μικρών μορίων έχουν ανακαλυφθεί ως Met αναστολείς [13], [14]. Παρ ‘όλα αυτά, προσπάθειες συνεχίζονται για να αποκαλύψει νέα αντι-Met για στοχευμένες θεραπείες και τους σχετικούς μηχανισμούς ανθεκτικότητας [8], [15] – [17].

Για την ταυτοποίηση των χημικών παραγόντων ικανών να αναστέλλουν ογκογόνο Met σηματοδότηση στα καρκινικά κύτταρα, εφαρμόσαμε προηγουμένως Met-εστιασμένη οθόνης που βασίζεται σε κύτταρα. Είχαμε αιτιολογημένη ότι μια τέτοια στρατηγική θα προσφέρει τη δυνατότητα προσδιορισμού ενώσεων που μπορεί: α) να προκαλέσουν ανασταλτικές επιδράσεις απευθείας στο Met? β) στοχεύουν άλλα ουσιώδη συστατικά του καταρράκτη σηματοδότησης Met? γ) να είναι καλά ανεκτή λόγω της περιορισμένης τοξικές επιδράσεις σε βιολογικά δραστικές συγκεντρώσεις [18] – [20]. Έχουμε αναφερθεί ότι η νέα αμίδια αμινοξέων που περιέχει την ιμιδαζο [2,1

b

] στόχος ήμισυ βενζοθειαζολ-2-υλφαινυλ Met άμεσα και αναστέλλουν ογκογόνο λειτουργία Met, χωρίς να προκαλούν σημαντικές παρενέργειες in vitro [19]. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την αντικαρκινική δράση ενός από τους πιο δραστικούς παράγοντες έχουμε εντοπίσει, Triflorcas (TFC), σε ένα πάνελ καρκινικών κυττάρων με διαφορετικά χαρακτηριστικά και διερευνήθηκαν μηχανισμό της δράσης του φαρμάκου από μία σειρά συμπληρωματικών προσεγγίσεων. Δείχνουμε ότι Triflorcas στοχεύει τα καρκινικά κύτταρα είτε μεταφέρουν Met μεταλλάξεις ή χαρακτηρίζεται από RTK εναλλαγή. Έχουμε αποδείξει ότι Triflorcas είναι καλά ανεκτό in vivo και δεν μεταβάλλει σημαντικά την έκφραση αρκετών γονιδίων κυτταρικής τοξικότητας και το άγχος. Βιοχημικές και φωσφο-διαλογή μελέτες αποκάλυψαν ότι συστοιχία Triflorcas μεταβάλλει κυρίως τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι, το οποίο εξασφαλίζει ογκογόνο εξάρτηση με Met, καθώς και ρετινοβλάστωμα (Rb), και nucleophosmin /B23. Αυτές οι αλλαγές λειτουργικά συσχετίζονται με τις αλλαγές στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου αποτυχία υποκείμενη μιτωτική. Παρά το γεγονός ότι Triflorcas αντικαρκινική δράση συσχετίζεται με την ανασταλτική δράση της επί Met, οι μηχανισμοί δράσης για τα ναρκωτικά της δεν μπορεί απλώς να περιοριστεί σε Met ίδιο στόχο. Η μοναδική ικανότητα του Triflorcas να διαμορφώνουν πολλαπλές οδούς απελευθερωθεί σε καρκινικά κύτταρα με παρεκκλίνουσα Met σηματοδότηση ενισχύει περαιτέρω την προοπτική της εκμετάλλευσης του εύκαμπτου-δεσμευτική ικανότητα λειτουργίας του Met ενεργού κέντρου για τον εντοπισμό νέων παραγόντων με ανασταλτικές ιδιότητες στην επίτευξη των στόχων που απαιτείται για να εκτελέσει το ογκογόνο πρόγραμμα σηματοδότησης. Τέλος, η αξιολόγηση του προφίλ ανασταλτικής απόκρισης σε καρκινικά κύτταρα μέσω της οθόνης αντικαρκινικό φάρμακο Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου προτείνει ότι Triflorcas χαρακτηρίζεται από ένα νέο μηχανισμό δράσης του φαρμάκου. μελέτες Βιοπληροφορική υποδεικνύουν πιθανές μοριακές υπογραφές που συσχετίζονται με την ευαισθησία του καρκίνου σε ιμιδαζο [2,1

β

] βενζοθειαζολ-2-υλφαινυλ παράγοντες ομάδα που βασίζεται.

Αποτελέσματα

Triflorcas Αναστέλλει επιβίωση και Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων που φέρουν Μεταλλαγμένα Met

Εξετάσαμε πρώτα την επίδραση της Triflorcas σε δύο ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου (NSCLC) που φέρουν μεταλλάξεις Met: H2122 και H1437 κυττάρων, φιλοξενούν σημειακές μεταλλάξεις στο υπόλειμμα αμινοξέος N375S και R988C, αντίστοιχα [21]. Triflorcas εξασθενημένη επιβίωση και αγκύρωση ανεξάρτητη ανάπτυξη του H2122 και H1437, αντίστοιχα (Σχήμα 1Α και Β). Κανένας από τους αναστολείς Met που χρησιμοποιούνται ως ενώσεις αναφοράς, όπως SU11274, crizotinib και PHA665752 παρενέβαινε με την επιβίωση και την in vitro ογκογένεση αυτών των κυττάρων (Σχήμα 1Α και Β). Αντίθετα, όλα τα ελεγμένα αναστολείς εξασθενημένη επιβίωση και αγκύρωση ανεξάρτητη ανάπτυξη του ανθρώπινου γαστρικού καρκινώματος GTL-16 που χαρακτηρίζεται από ενίσχυση Met (Εικόνα 1Α και Β), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [19], [21]. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι Triflorcas ασκεί μία σημαντική ανασταλτική επίδραση σε καρκινικά κύτταρα με Met μεταλλάξεις, οι οποίες δεν είναι ευαίσθητες σε άλλους αναστολείς Met, εκτός από κύτταρα που φέρουν Met ενίσχυση.

(Α) Η επιβίωση των H2122 και GTL-16 κύτταρα μειώθηκε κατά Triflorcas στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση (μΜ? n = 3). Σε αντίθεση, SU11274 (SU), crizotinib (crizo), και PHA665752 (ΡΗΑ) εξασθενημένη επιβίωση του GTL-16, αλλά όχι από H2212 κυττάρων. Τα κύτταρα τον ορό επί 24 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με τις ενώσεις επί 48 ώρες. (Β) Triflorcas μπλοκάρει αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη από H1437 και GTL-16 κύτταρα σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο (n = 3). SU11274, crizotinib, και PHA665752 μειωμένη in vitro ογκογένεση του GTL-16, αλλά όχι από H1437 κυττάρων. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσοι ± s.e.m. ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001? Μαθητές για

t

τεστ.

Η

Triflorcas παρεμβαίνει Met φωσφορυλίωση, με Met Localization, και με την PI3K-Akt μονοπάτι ενεργοποίησης

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι Triflorcas παρεμβαίνει με φωσφορυλίωση Met σε ζωντανά κύτταρα και με την ενεργοποίηση Met in vitro [19]. Ως εκ τούτου, ερεύνησε τις επιπτώσεις της Triflorcas για Met στην H1437 κύτταρα ακολουθώντας φωσφορυλίωση Met σε δύο κατάλοιπα τυροσίνης που βρίσκεται στην περιοχή της κινάσης του, Tyr

1234 και Tyr

1235. Η ανοσοκυτταροχημική ανάλυση έδειξε φωσφορυλίωσης Met κυρίως από τη μεμβράνη του πλάσματος όταν τα κύτταρα H1437 εκτέθηκαν σε διέγερση HGF (Εικόνα 2Α). Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι Triflorcas οδηγεί σε αλλαγές στη φωσφορυλιωμένη Met: α) ρύθμιση προς τα κάτω των επιπέδων φωσφορυλίωσης της και β) ένα κυρίαρχο εντοπισμό σε ενδοκυτταρικά διαμερίσματα (Εικόνα 2Α). Η θεραπεία με χλωροπρομαζίνη, ένα κατιονικό αμφιπαθικό φάρμακο που αναστέλλει κλαθρίνη ενδοκυττάρωση, αποκαταστάθηκε φωσφο-Met εντοπισμό στη κυτταρική μεμβράνη, δείχνοντας έτσι ότι Triflorcas ενισχύει Met εσωτερίκευση (Σχήμα 2Α) Μειωμένη φωσφορυλίωση Met παρατηρήθηκε επίσης σε προϊόντα λύσης πρωτεΐνης από H1437 κύτταρα συνοδεύεται από μειωμένη Met επίπεδα πρωτεΐνης (Σχήμα 2Β). Η πυκνομετρική ανάλυση έδειξε ότι Met προς τα κάτω ρύθμιση, μέσω ενδοκυττάρωσης προκαλεί τη μείωση στην φωσφορυλίωση Met (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Σταθερά, βρήκαμε μειωμένη φωσφορυλίωση της Gab1, η οποία είναι μια άμεση στόχος σηματοδότηση του Met (Εικόνα 2Β).

φωσφορυλίωσης (Α) Met αναλύθηκε με ανοσο-κυτταροχημεία επί H1437 κύτταρα χωρίς θεραπεία, θεραπεία με HGF, με Triflorcas (TFC? 10 μΜ για 24 ώρες) ή με Triflorcas (10 μΜ για 24 ώρες) συν χλωροπρομαζίνη (Chlor? 10 μg /ml για 2 ώρες) ακολουθούμενη από HGF διέγερση (20 ng /ml για 30 λεπτά). Triflorcas μείωσε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης Met που προκαλείται από HGF. Σημειώστε επίσης ότι τον επαγόμενο από HGF φωσφο-Met εντοπίζεται στη μεμβράνη των κυττάρων ελέγχου πλάσματος, ότι φαίνεται εσωτερικευθεί σε κύτταρα που εκτίθενται σε Triflorcas. αναστολή Ενδοκυττάρωση με το φάρμακο χλωροπρομαζίνη αποκατασταθεί φωσφο-Met εντοπισμό στη κυτταρική μεμβράνη. Τα βέλη υποδεικνύουν σύμπλεγμα φωσφορυλιωμένου Met στη μεμβράνη πλάσματος (40Χ μεγέθυνση). (Β) τον επαγόμενο από HGF (20 ng /ml) επίπεδα φωσφορυλίωσης Met, Gab1, Akt, και ρ70

S6K μειώθηκαν σε H1437 κύτταρα που εκτίθενται σε Triflorcas. Σε αντίθεση, δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές στα επίπεδα φωσφορυλίωσης των ERKs. Παρόμοια επίπεδα έκφρασης του συνόλου των Gab1, Akt, και ρ70

S6K βρέθηκαν επίσης, υποδεικνύοντας ότι Triflorcas παρενέβαινε με φωσφορυλίωση τους και όχι με τα επίπεδα έκφρασης τους. αναλύσεις κηλίδος Western διεξήχθησαν επί ολικής πρωτεΐνης λύματα. (C) επίπεδα φωσφορυλίωσης της Akt, p70

S6K, και S6 ριβοσωμικής πρωτεΐνης, αλλά δεν ΕΚΚ, μειώθηκαν σε GTL 16-κύτταρα που εκτέθηκαν σε Triflorcas. Ακτίνης ή πρωτεΐνη τουμπουλίνης επίπεδα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες φόρτωσης σε όλα τα πειράματα (κατώτερο πάνελ Β και C). (Δ και Ε) Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη των H1437 (D) και της GTL-16 κύτταρα (Ε) ήταν μειωμένη παρουσία Triflorcas (TFC), LY294002 (αναστολέας της PI3K), ή A443654 (αναστολέας Akt). Οι τιμές εκφράζονται ως μέσοι ± s.e.m. ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001? Μαθητές για

t

τεστ.

Η

Η βιολογική επίδραση των Triflorcas στα κύτταρα που φέρουν μεταλλάξεις Met και ενίσχυση Met (Εικόνα 1) [19] μας οδήγησε να αξιολογήσει την κατάσταση φωσφορυλίωσης της RTK κατάντη τελεστές. Μεταξύ των οδών που απαιτούνται σε καρκινικά κύτταρα με ογκογόνο Met, έχει δειχθεί ότι μόνο ένα υποσύνολο του Met-ενεργοποιημένες πορείες στηρίζει την εξάρτηση των καρκινικών κυττάρων σε Met. Ειδικότερα, το Ras /ERKs και η PI3K /Akt είναι δύο οδούς που εξασφαλίζουν κυρίως την εξάρτηση από ογκογόνο Met [22]. Ως εκ τούτου διερευνηθεί κατά πόσο Triflorcas περιορίζει την ενεργοποίηση των δύο αυτών οδών, ακολουθώντας το επίπεδο φωσφορυλίωσης των ERKs και της Akt σε H1437 κυττάρων. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές παρατηρήθηκαν σε επαγόμενο από HGF φωσφορυλίωση ERK όταν τα κύτταρα H1437 εκτέθηκαν σε Triflorcas (Σχήμα 2Β). Αντίθετα, η φωσφορυλίωση της Akt ήταν σημαντικά μειωμένη μετά την επεξεργασία Triflorcas (Σχήμα 2Β). Μειωμένη φωσφο-Ακί ήταν παράλληλα με μια μείωση στα επίπεδα φωσφορυλίωσης της p70 κατάντη σήμα της

S6K (Εικόνα 2Β). Σταθερά, μειωμένα επίπεδα φωσφορυλίωσης της Akt και κατάντη σήματα ρ70 του

S6K και ριβοσωμικής πρωτεΐνης S6, αλλά δεν ERKs, παρατηρήθηκαν επίσης σε κύτταρα GTL-16 (Σχήμα 2C). Επιβεβαιώσαμε τη λειτουργική συνάφεια του ανέπαφου ΡΙ3Κ /Akt σηματοδότηση για αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη από H1437 και GTL-16 κύτταρα με φαρμακολογικά αποκλεισμό της ενεργοποίησης του με LY294002 (αναστολέας ΡΙ3Κ) ή Α-443654 (αναστολέας Akt) (Σχήμα 2D, Ε, S1A, και 1Β). Η μείωση της φωσφορυλίωσης Akt μετά τη θεραπεία Triflorcas παρατηρήθηκε επίσης στις ErbB1-εθισμένος ανθρώπινα κύτταρα του μαστού καρκίνο ΒΤ474, όπου τα επίπεδα φωσφορυλίωσης ErbB1 ήταν αμετάβλητος (Σχήμα S1c) [19]. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μείωση της ενεργοποίησης της οδού PI3K /Akt από Triflorcas δεν είναι απλώς συνέπεια της αναστολής των ανάντη δραστηριότητα RTK. Βρήκαμε επίσης ότι η δραστικότητα Akt δεν απαιτείται για την επιβίωση των κυττάρων ΒΤ474 (Σχήμα S1D). Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν γνώσεις σχετικά με την αντίσταση των κυττάρων ΒΤ474 στη θεραπεία Triflorcas δείχνοντας ότι ο εθισμός τους σε ογκογόνους ErbB1 διασφαλίζεται από μονοπάτι (ες) εκτός από PI3K /Akt. Μαζί, αυτά τα ευρήματα αποκαλύπτουν ότι η δράση κατά των όγκων που προκαλούνται από Triflorcas συμβαίνει μέσω των συνδυασμένων αποτελεσμάτων σε ξεχωριστή δράστες που εμπλέκονται στην RTK με γνώμονα την ογκογόνο εξάρτησης.

Triflorcas μειώνει in vivo την ανάπτυξη των όγκων των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων που μεταφέρουν Met μετάλλαξη, χωρίς προκαλώντας μεγάλη Παρενέργειες

Έχουμε πρόσφατα ανέφερε ότι Triflorcas είναι καλά ανεκτή από πρωτογενείς νευρώνες και τα ηπατοκύτταρα [19]. Για την περαιτέρω αξιολόγηση του δυναμικού θεραπευτική εφαρμογή αυτής της ένωσης, θα εκτιμηθεί αν είναι επίσης καλά ανεκτή μετά in vivo χορήγηση. Triflorcas ήταν ενδοπεριτοναϊκώς ένεση σε ποντικούς σε μία δόση των 30 mg.kg

-1 κάθε μέρα. Καθώς το σωματικό βάρος είναι ένας γενικός δείκτης της φυσιολογίας των ζώων επηρεάζεται, για παράδειγμα, μέσω του μεταβολισμού, τη δραστηριότητα των ζώων, και διατροφική συμπεριφορά, το βάρος του Triflorcas αγωγή ποντικών παρακολουθήθηκε με το χρόνο. Δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές σε σχέση με τους ελέγχους και τη διάρκεια της θεραπείας (

P

& gt? 0,05? Σχήμα 3Α). Μετρήσαμε επίσης το βάρος της καρδιάς, σπλήνα, τα νεφρά και το ήπαρ των ποντικών που υποβάλλονται σε θεραπεία για 21 ημέρες και δεν διαπιστώθηκαν διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων (

P

& gt? 0,05? Σχήμα 3Β).

(Α) Εξέλιξη του σωματικού βάρους σε ποντίκια, αγωγή ενδοπεριτοναϊκώς είτε με όχημα ή Triflorcas (TFC? 30 mg.kg

-1 κάθε μέρα) δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές. Το σωματικό βάρος εκφράζεται ως εξέλιξη του βάρους κατά τη διάρκεια της περιόδου των 21 ημερών θεραπείας. (Β) Το βάρος της καρδιάς, σπλήνα, τα νεφρά και το ήπαρ αξιολογήθηκε σε ποντικούς καθημερινά ένεση με Triflorcas (30 mg.kg

-1) ή όχημα για 21 ημέρες. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσοι ± s.e.m.

P

& gt? 0,05. (Γ και Δ) επεξεργασία Triflorcas (i.p. 30 και 60 mg.kg

-1 κάθε δεύτερη ημέρα) μείωσε τον όγκο του όγκου (Γ) και το βάρος (D) σε γυμνούς ποντικούς που ενέθηκαν υποδορίως με H1437 κύτταρα. Crizotinib (50 mg.kg

-1 ημερησίως) δεν βλάπτει την ανάπτυξη του όγκου. Οι τιμές αναφέρονται ως Boxplots και εκφράζονται ως μέσοι ± s.e.m. *

P

& lt? 0,05? Μαθητές για

t

τεστ.

Η

Είμαστε στο παρελθόν έδειξαν ότι Triflorcas προκαλεί αναστολή ανάπτυξης όγκου των GTL-16 κύτταρα in vivo (Σχήμα S2) [19]. Ως εκ τούτου, καθορίζεται εάν η αντικαρκινική δράση του Triflorcas παρατηρηθεί in vitro επί H1437 κυττάρων μπορεί επίσης να αποδεικνύεται ίη νίνο χρησιμοποιώντας ξενομοσχεύτηκε γυμνούς ποντικούς. κύτταρα H1437 (5 × 10

6) ήταν υποδόρια ένεση σε γυμνά ποντίκια. Μετά τον σχηματισμό του όγκου, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε αγωγή με Triflorcas, crizotinib, ή φορέα μόνο, και η ανάπτυξη του όγκου εξετάστηκε κατά τη διάρκεια και μετά τη θεραπεία. Αξιοσημείωτα, βρήκαμε μία μείωση 58,7% και 59% σε όγκο του όγκου όταν Triflorcas χορηγήθηκε σε μια δόση των 30 mg.kg

-1 ή 60 mg.kg

-1 κάθε δεύτερη ημέρα, αντίστοιχα (έλεγχος: 82.4 mm

3 ± 78.2? 30 mg.kg

-1 Triflorcas ένεση: 34.0 ± 24.5?

P

= 0,04? 60 mg.kg

-1 Triflorcas ένεση: 33,8 ± 24,2?

P

= 0,04? Σχήμα 3C). Μια μείωση του βάρους του όγκου παρατηρήθηκε επίσης σε Triflorcas αγωγή ποντίκια (έλεγχος: 147,1 mg ± 92,5? 30 mg.kg

-1 ένεση Triflorcas: 79,1 ± 58,1,

P

= 0,03? 60 mg. ένεση kg

-1 Triflorcas: 62,0 ± 38,9,

P

= 0,01? Σχήμα 3D). Αντίθετα, καμία μείωση στην ανάπτυξη όγκου σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με crizotinib σε δόσεις των 50 mg.kg

-1 κάθε μέρα (μέγεθος όγκου: 118,6 mm

3 ± 69,4? Μέγεθος του όγκου: 205,0 mg ± 84,8? Το Σχήμα 3C και D), σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [21]. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά αποδεικνύουν ότι in vivo Triflorcas αποσπά την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου των καρκινικών κυττάρων με ογκογόνο Met. Επιπλέον, η απουσία παρενεργειών υποδεικνύει ότι Triflorcas είναι καλά ανεκτή όταν εγχύεται σε ποντικούς σε δόσεις που απαιτούνται για την πρόκληση επιδράσεων κατά του όγκου του.

Μικρές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση Προφίλ του στρες και τοξικότητα διόδων μέσω Triflorcas συσχετίζονται με έλλειψη των τοξικών επιδράσεων in vivo

Όπως Triflorcas είναι καλά ανεκτό, τόσο in vitro [19], και in vivo (Σχήμα 3Α και Β), από την επόμενη ακολούθησε επίπεδα γονιδιακής έκφρασης ενός ανθρώπινου συστοιχίας RT-PCR επικεντρώθηκε στην τοξικότητα και το άγχος μονοπάτια. Το προφίλ έκφρασης του 84 γονίδια που σχετίζονται με το στρες και κυτταρική τοξικότητα αναλύθηκε σε GTL 16-κύτταρα που εκτίθενται σε Triflorcas, SU11274, ή όχημα. SU11274 μετέβαλε την έκφραση των γονιδίων 39 για τουλάχιστον 2 φορές (αυξάνοντας ή μειώνοντας τους?

P

& lt? 0,05). Αυτά τα γονίδια ανήκουν στην απόπτωση /νέκρωση (n = 10), φλεγμονή (n = 7), το οξειδωτικό /μεταβολικό στρες (n = 7), θερμικό σοκ (n = 6), πολλαπλασιασμό /καρκινογένεση (n = 5), και την ανάπτυξη μονοπάτια σύλληψης /γήρανση (n = 4? Σχήμα 4Α και Πίνακας S1). Σε αντίθεση, Triflorcas οδήγησε σε μια στατιστικά σημαντική μεταβολή στην έκφραση του μόνο 14 γονίδια (

P

& lt? 0,05). Μεταξύ αυτών, 13 γονίδια επικαλύπτονται με εκείνα μεταβληθεί από SU11274, και ανήκε σε απόπτωση /νέκρωση (n = 3), το οξειδωτικό /μεταβολικό στρες (n = 3), και ανάπτυξη σύλληψης /γήρανση (n = 3? Σχήμα 4Α και Πίνακας S1) . θα μπορούσε να παρατηρηθεί σημαντική μείωση της έκφρασης του γονιδίου πέραν του 50% σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου. Γονίδια που δείχνει πάνω από ένα 2-φορές αύξηση στα επίπεδα έκφρασης περιλαμβάνονται

TNF

(3,83 φορές?

P

= 0,0008),

gdf15

(3,18 φορές?

P

= 0.0007),

EGR1

(2,68 φορές?

P

= 0,003), και

serpine1

(2,42 φορές?

P

= 0.005). Περιέργως, Triflorcas οδήγησε σε μια ισχυρή και κυρίαρχη πάνω ρύθμιση της οξειδάσης του κυτοχρώματος

CYP1A1

γονίδιο (611-φορές?

P

= 0,0001? Εικόνα 4Α). Η έκφραση του

CYP1A1

γονίδιο αυξήθηκε επίσης από SU11274, αλλά σε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα (22 φορές?

P

= 0,02? Σχήμα 4Α). CYP1A1 είναι ένα μέλος της οικογένειας CYP1 του κυτοχρώματος Ρ450 που εμπλέκονται στον καρκίνο του κυττάρου απόκριση σε θεραπευτικούς παράγοντες. Η ανάλυση στυπώματος Western επιβεβαίωσε την αυξητική ρύθμιση των πρωτεϊνών CYP1A1 με Triflorcas, η οποία παρεμποδίζεται από αναστολέα acacetin του (Σχήμα 4Β) [23]. CYP1A1 πάνω ρύθμιση από Triflorcas ήταν ανεξάρτητη από τη δράση του σε Met, όπως διαπιστώθηκε, επίσης, στα κύτταρα, όπως τα ανθρώπινα καρκίνου του μαστού ΒΤ474 κύτταρα (Σχήμα 4C), που είναι εθισμένοι στο σηματοδότηση ErbB1. Μαζί, αυτές οι μελέτες υπογραμμίζουν ένα επιλεκτικό προφίλ δραστικότητας μεταβολισμός που προκαλείται από Triflorcas συνδέεται με την αυξητική ρύθμιση του ένα μικρό υποσύνολο του στρες και τοξικότητα γονίδια. Έτσι, ο ελάχιστος αριθμός των γονιδίων επηρεάζεται από Triflorcas υποδεικνύει ότι αυτή η ένωση προκαλεί περισσότερο εκλεκτική δράση σχετικά με το στρες και τοξικότητα γονιδίων σε σύγκριση με άλλους αντικαρκινικούς παράγοντες όπως Met SU11274.

(Α) Το προφίλ έκφρασης του 84 γονίδια που σχετίζονται με κύτταρο στρες και τοξικότητα αναλύθηκε σε κύτταρα GTL-16. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με Triflorcas (μαύρες στήλες? 3 μΜ) ή SU11274 (γκρι στήλες? 1 μΜ) για 24 ώρες, και η έκφραση του γονιδίου συγκρίθηκε με εκείνη των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Γονίδια ομαδοποιήθηκαν σε συστάδες που αντιστοιχούν σε οξειδωτικό /μεταβολικό στρες, θερμοσόκ, πολλαπλασιασμό /καρκινογένεση, διακοπή της ανάπτυξης /γήρανση, φλεγμονή, και την απόπτωση /σηματοδότηση νέκρωση. Μόνο στατιστικά σημαντικές αλλαγές στην έκφραση γονιδίων υποδεικνύονται (

P

& lt? 0,05). Triflorcas μετέβαλε την έκφραση των γονιδίων μόνο 14 σε σύγκριση με τη μεταβολή του 39 γονιδίων που προκαλείται από θεραπεία SU11274. Αξίζει να σημειωθεί ότι η έκφραση του

CYP1A1

αυξήθηκε 611 φορές υπό την παρουσία Triflorcas. (Β) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει την αυξητική ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης CYP1A1 σε κύτταρα που εκτίθενται σε Triflorcas (3 ή 10 μΜ). Acacetin (ACA? 10 μΜ) θεραπεία απέτρεψε CYP1A1 πάνω ρύθμιση από Triflorcas (TFC). (C) CYP1A1 πάνω ρύθμιση από Triflorcas σημειώθηκε επίσης σε κύτταρα καρκίνου ΒΤ474 ErbB1-εθισμένος. Gefitinib (GEF? 10 μΜ) και SU11274 (SU? 2 μΜ) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες

Η

Triflorcas Μηχανισμοί Φαρμάκων Δράσης και την επίδρασή του στην κυτταρικού κύκλου εξέλιξη οδηγεί σε μιτωτική αποτυχία

Τα αποτελέσματα της Triflorcas στην ΡΙ3Κ-Akt μονοπατιού αποδεικνύεται από βιοχημικές μελέτες (Σχήμα 2Β και C) δείχνουν ότι Triflorcas αντικαρκινικές ιδιότητες μπορεί να σχετίζονται με την δραστηριότητα της στην διακριτή στόχους σηματοδότησης εκτός από την Met. Μία προσέγγιση διαλογής που χρησιμοποιούνται ευρέως για να προσδιορίσει τους στόχους ενός δεδομένου χημικό παράγοντα είναι η KINOME

σάρωση

, το οποίο επιτρέπει την αξιολόγηση της δραστικότητας των ενώσεων έναντι ενός πάνελ κινασών μέσω δοκιμασίες σύνδεσης [24]. Triflorcas προβλήθηκε κατά 98 κινάσες σε μια ενιαία συγκέντρωση 10 μΜ, σε συμφωνία με τα πρότυπα πρωτόκολλα. Ωστόσο, η χαμηλή διαλυτότητα του Triflorcas σε συνθήκες ρυθμιστικού που χρησιμοποιούνται για αυτόν τον τύπο της οθόνης περιόρισε τη δυνατότητα προσδιορισμού στοχευμένων κινασών. Παρ ‘όλα αυτά, βρήκαμε ότι Triflorcas μειώνει κατά περισσότερο από 30% την σταθερά σύνδεσης μόνο 5 πάνω από 98 κινάσες αναλύονται: Abl-1 (είτε άγριου τύπου, ή Ε255Κ και T315I μεταλλαγμένες μορφές), ΙΚΚ-β, JAK2, MKNK1, και ΖΑΡ70 (Σχήμα 5 και Πίνακας S2). Παρά το γεγονός ότι το σχέδιο των κινασών που αλληλεπιδρούν με Triflorcas φαίνεται ιδιαίτερα εστιασμένη, αυτά τα αποτελέσματα πρέπει να λαμβάνει υπόψη το γεγονός ότι ένα μέρος των στόχων που είχαν πιθανώς δεν ανιχνεύεται λόγω της χαμηλής διαλυτότητας του Triflorcas σε συνθήκες ρυθμιστικού που χρησιμοποιούνται για αυτήν την οθόνη. . Για παράδειγμα, Met δεν εντοπίστηκε παρά το γεγονός ότι η ανασταλτική δράση Triflorcas προηγουμένως ιδρύθηκε με τη χρήση της υπηρεσίας ένωση προφίλ Kinexus [19]

Η Ένωση προβλήθηκε εναντίον ενός KINOME

σάρωση

(http: //www.kinomescan.com) πάνελ 98 κινασών. (Α) Ο πίνακας παρουσιάζει τις κινάσες, για τα οποία Triflorcas μειωθεί περισσότερο από 30% η σταθερά δέσμευσης. ενδείκνυται η δέσμευση για κάθε κινάση (% της κατάστασης ελέγχου) συνδέτη. (Β) TREEspot εικόνα των 98 κινασών σε διαλογή με τη θέση των στόχων Triflorcas: Abl άγριου τύπου, Abl Ε255Κ και Abl Τ315Ι μεταλλαγμένες μορφές, ΙΚΚ-β, JAK2, MKNK1, και ΖΑΡ70. Το πλήρες σύνολο δεδομένων παρουσιάζεται στον Πίνακα S2. ΤΚ: τυροσίνη κινάση? TKL: κινάση της τυροσίνης, όπως? STE: STE κινάσης? CK1: κελί kinase1? AGC: PKA, PKC, PKG κινάσες? CaMK: ασβέστιο καλμοδουλίνη ρυθμιζόμενη κινάση? CMGC:. CDK, MAP, GSK, CDK-όπως κινάσης

Η

Ως εκ τούτου, για να διερευνήσει περαιτέρω το μηχανισμό δράσης του φαρμάκου Triflorcas, εφαρμόσαμε μια δοκιμασία με βάση τα κύτταρα, η οποία επιτρέπει την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων του πράκτορα για πολλαπλές οδούς σηματοδότησης ογκογόνο στις συνθήκες καλλιέργειας συμβατές με Triflorcas διαλυτότητα και βιολογική δραστικότητα. Κατά συνέπεια, τα επίπεδα φωσφορυλίωσης αρκετών μορίων σηματοδότησης εξετάστηκαν με τη χρήση της συστοιχίας φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη οθόνη Kinexus. Ειδικότερα, σε σύγκριση τα επίπεδα φωσφορυλίωσης 44 σηματοδότηση φωσφο-επιτόπων σε κύτταρα GTL-16 αγωγή ή όχι με Triflorcas (Σχήμα 6, S3, και ο Πίνακας S3). Συνεπής με βιοχημικές μελέτες μας, βρήκαμε ότι η κατάσταση φωσφορυλίωσης αρκετών συστατικών μέσα στο μονοπάτι ΡΙ3Κ /Akt μεταβλήθηκε σε κύτταρα που εκτίθενται σε Triflorcas. Συγκεκριμένα, μείωσε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης παρατηρήθηκαν για Akt1, mTOR /FRAP, p70

ριβοσωμικής πρωτεΐνης S6Kb1, και S6 (Σχήμα 6Α και Β? Κόκκινους κύκλους). Περιέργως, βρήκαμε ότι Triflorcas μεταβάλλει σημαντικά την κατάσταση φωσφορυλίωσης του δύο επιπλέον πρωτεΐνες: την φωσφορυλίωση Rb σε διαφορετικές Ser υπολείμματα /Thr μειώθηκε (Σχήμα 6Α και Β? Μπλε κύκλοι)? Η φωσφορυλίωση του nucleophosmin /B23, πυρηνισκικού πρωτεΐνη βρέθηκε να είναι σημαντικά άφθονο σε όγκους [25], αυξήθηκε (Σχήμα 6Α και Β? πράσινοι κύκλοι). ανάλυση Western blot επιβεβαίωσε αλλαγές στην κατάσταση φωσφορυλίωσης της Rb και nucleophosmin /Β23 πρωτεΐνες μετά τη θεραπεία Triflorcas (Σχήμα 6C).

(Α) Η κατάσταση φωσφορυλίωσης αρκετών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με την εφαρμογή της φωσφο-array KPSS 10.1 (Kinexus Βιοπληροφορική). Κύτταρα GTL-16 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φορέα (έλεγχος) ή Triflorcas (TFC? 3 μΜ) για 72 ώρες (αριστερά και δεξιά πάνελ, αντιστοίχως). Κόκκινοι κύκλοι τονίζουν συστατικά της Akt /mTOR /S6 οδού. Πράσινο και μπλε κύκλους γύρω από nucleophosmin /B23 και Rb φωσφο-επιτόπων, αντίστοιχα. (Β) Το γράφημα δείχνει την αναλογία των επιπέδων φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών που αναφέρονται στα κύτταρα χωρίς θεραπεία έναντι εκείνων που εκτίθενται σε Triflorcas. (C) Τα επίπεδα Φωσφορυλίωση nucleophosmin /B23 σε Ser

4 και Rb στην S

780 αυξήθηκαν και μειώθηκαν, αντίστοιχα, σε GTL 16-κύτταρα που εκτέθηκαν σε Triflorcas (TFC? 3 μΜ για 24 ώρες).

Καθώς τόσο Rb και nucleophosmin /Β23 είναι βασικοί ρυθμιστές της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου, είμαστε δίπλα αξιολογηθεί κατά πόσον αυτές οι αλλαγές στην κατάσταση φωσφορυλίωσης ήταν παράλληλα με τις μεταβολές του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και την κατανομή τους σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου καθορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Ανεπεξέργαστα GTL-16 κύτταρα πολλαπλασιάζονται, όπως επιβεβαιώνεται από το πρότυπο κυτταρομετρίας ροής (σχήμα 7Α και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). θεραπεία Triflorcas μεταβάλλει διανομή κύκλου GTL-16 κυττάρων, με αύξηση του πληθυσμού κυττάρων G0 /G1 σε βάρος των S και G2 /M του πληθυσμού (Σχήμα 7Α και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως έλεγχοι, η θεραπεία της GTL-16 κύτταρα είτε με SU11274 ή nocodazol οδήγησε σε έμφραξη σε G0 /G1 ή G2 /M φάση, αντίστοιχα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, Triflorcas επηρεάζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου του GTL-16 κύτταρα. Μορφολογική ανάλυση των κυττάρων που εκτίθενται σε Triflorcas έδειξαν μια σημαντική αύξηση στον αριθμό των πολυπύρηνων, η οποία υποδεικνύει μιτωτική αποτυχία (Σχήμα 7Β και C). Αντιθέτως, δεν μιτωτική ανεπάρκεια παρατηρήθηκε σε κύτταρα επεξεργασμένα με SU11274, crizotinib, ή PHA665752 (Σχήμα 7C). Μαζί, αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η αντικαρκινική δραστικότητα που προκαλείται από Triflorcas μπορεί εν μέρει να αντιπροσωπεύουν μεταβολές φωσφορυλίωση διακριτών στόχων σηματοδότησης, όπως συστατικά του ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι, Rb, και nucleophosmin /B23, η οποία συσχετίζεται με μεταβολές στην κυτταρικού κύκλου εξέλιξης και μιτωτική αποτυχία.

(Α) Διάγραμμα που δείχνει την αναλογία του ποσοστού των GTL-16 κύτταρα σε φάση G0 /G1 πάνω από το ποσοστό των κυττάρων σε S + G2 /M φάση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Triflorcas (TFC? 3 μΜ), ή όχημα (CNTR) για 48 ώρες, στη συνέχεια βάφονται με ιωδιούχο προπίδιο. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσοι ± s.e.m. *** P & lt? 0.001? Μαθητές για

t

δοκιμή (n = 3). Τα ποσοστά των κυττάρων σε G0 /G1, S και G2 /M φάσεις που αναφέρθηκαν στον πίνακα. (Β) GTL-16 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε παρουσία Triflorcas ή του οχήματος και οι πυρήνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας χρώση ϋΑΡΙ. Τα βέλη δείχνουν παράδειγμα των κυττάρων με πολλαπλούς πυρήνες (40Χ μεγέθυνση). (Γ) Ποσοτικοποίηση των κυττάρων με μιτωτικό αποτυχία εκφράζεται ως ποσοστό του συνολικού αριθμού των κυττάρων που αναλύθηκαν. Triflorcas (TFC? 3 ή 10 μΜ), αλλά όχι SU11274 (SU? 1 μΜ), crizotinib (crizo? 1 μΜ), ή PHA665752 (ΡΗΑ? 1 μΜ) οδήγησε σε σημαντική αύξηση του αριθμού των κυττάρων με μιτωτικό αποτυχία. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσοι ± s.e.m. *** P & lt? 0.001? Μαθητές για

t

τεστ.

Η

Triflorcas εξασθενεί επιβίωση και Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων Χαρακτηρίζεται από RTK Εναλλαγή

Ένας σημαντικός περιορισμός των μοριακών θεραπειών με τη χρήση μέσων στόχευση διακριτή RTKs είναι ο μηχανισμός ανθεκτικότητας στα φάρμακα, τα οποία μπορεί να είναι είτε ιδιοσυστατική ή επίκτητη μετά τη θεραπεία. Σε αυτό το πλαίσιο, έχει αποδειχθεί ότι Met, ErbBs και PDGFRs μπορούν αμοιβαίως να υποκαταστήσει το άλλο για να διατηρηθεί η δραστικότητα του RTK γνώμονα ογκογόνο οδών [9], [26] – [29]. Ως εκ τούτου, αξιολόγησε τις ανασταλτικές ιδιότητες των Triflorcas σε κυτταρικές σειρές καρκίνου, στα οποία αμοιβαία υποκατάσταση Met, ErbBs, και PDGFRβ προσδίδει αντίσταση στην ενιαία αναστολή RTK.