Αφηρημένο

κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK) είναι μια κυτταροπλασματική κινάση της τυροσίνης που είναι αυξημένα σε μια ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων. Ενώ FAK εμπλέκεται σε πολλές κυτταρικές διεργασίες που διαταράσσονται στον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού, ακτίνη και τη δυναμική προσκόλληση, πόλωση και εισβολή, υπάρχει μόνο μερικές περιορισμένες πληροφορίες σχετικά με το ρόλο της FAK στην επιβίωση ακτινοβολία. Έχουμε αξιολογηθεί κατά πόσο ΡΑΚ είναι ένας γενικός στόχος Ραδιοευαισθητοποίησης, όπως έχει προταθεί από προηγούμενες εκθέσεις. Χρησιμοποιήσαμε ένα καθαρό γενετικό σύστημα στο οποίο FAK διαγράφηκε από κύτταρα καρκινώματος πλακωδών κυττάρων ποντικού (SCC) (FAK – /-), και να ανασυσταθεί με εξωγενή FAK άγριου τύπου (wt). Παραδόξως, η απουσία FAK συσχετίστηκε με αυξημένη ραδιο-αντίσταση στην προηγμένη κύτταρα SCC. FAK επανέκφραση ανέστειλε ρ53-διαμεσολαβούμενη μεταγραφική άνω ρύθμιση του p21, και ένα υπο-σύνολο άλλων γονιδίων στόχων του ρ53 εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA, μετά από θεραπεία με ιονίζουσα ακτινοβολία. Επιπλέον, η εξάντληση ρ21 προωθείται ραδιοευαισθητοποίησης, υπονοώντας ότι FAK μεσολάβηση αναστολή της επαγωγής ρ21 είναι υπεύθυνη για την σχετική ραδιο-ευαισθησίας των κυττάρων SCC FAK-καλά. Το έργο μας προσθέτει σε ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία που αποδεικνύουν ότι υπάρχει στενή λειτουργική σχέση μεταξύ ιντεγκρίνης /FAK σηματοδότηση και την πορεία p53 /p21, αλλά αποδεικνύει ότι ο ρόλος της FAK στην επιβίωση μετά το στρες είναι το πλαίσιο που εξαρτάται, τουλάχιστον στα καρκινικά κύτταρα. Προτείνουμε ότι θα πρέπει να υπάρχει προσοχή όταν αξιολογούν την αναστολή ΡΑΚ σε συνδυασμό με ακτινοβολία, δεδομένου ότι αυτό δεν μπορεί πάντα να είναι κλινικά επωφελής

Παράθεση:. Graham K, Moran-Jones Κ, Sansom ΕΕ, Brunton VG, Frame MC ( 2011) ΡΑΚ Διαγραφή Προωθεί p53-μεσολαβούμενη επαγωγή της p21, απαντήσεις βλάβη του DNA και Radio-Αντίσταση σε κύτταρα προχωρημένο καρκίνο εκ πλακωδών. PLoS ONE 6 (12): e27806. doi: 10.1371 /journal.pone.0027806

Επιμέλεια: Roger Chammas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Βραζιλία

Ελήφθη: 27 του Ιουνίου 2011? Αποδεκτές: 25 Οκτωβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 14 Δεκεμβρίου, 2011

Copyright: © 2011 Graham et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Cancer Research UK πρόγραμμα επιχορήγησης (C157 /A9148). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ακτινοθεραπεία είναι ένα στήριγμα της θεραπείας του καρκίνου σε πολλαπλά πλαίσια της νόσου, αλλά η θεραπεία δεν είναι πάντα θεραπευτική. Ένα μεγάλο μέρος της προσπάθειας στρέφεται όχι μόνο στη βελτίωση της παράδοσης της ακτινοθεραπείας από ολοένα και πιο εξελιγμένες χωρική και δοσιμετρικές μεθόδους, καθώς επίσης και να προσδιορίσει τις στρατηγικές συνδυασμού για τη βελτίωση απαντήσεις ακτινοβολία. Όσον αφορά το τελευταίο, ιονίζουσα ακτινοβολία μπορεί να προωθήσει την ενεργοποίηση του υποδοχέα και μη υποδοχέα κινασών τυροσίνης (ΤΚ), και διαμόρφωση των κυτταροπροστατευτικών επιδράσεις, όπως αυξημένη επιδιόρθωση του DNA, πολλαπλασιασμό και μειωμένη απόπτωση [1], [2], [3] , [4], [5], [6], [7]. Δεδομένου ότι αυτές οι αποκρίσεις συμβάλλουν στην κυψελοειδή ραδιο-αντίσταση, η οποία μπορεί προφανώς να περιορίσει την αποτελεσματικότητα της ακτινοθεραπείας στην αγωγή του καρκίνου, η κατανόηση της συμβολής της ΤΚ μπορεί να παρέχει νέες μοριακοί στόχοι για ραδιο-ευαισθητοποίηση, και ενδεχομένως να βελτιώσει ανταποκρίσεις όγκου. Ένα παράδειγμα είναι η υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), η οποία είναι η τρέχουσα πιο εκτεταμένα μελετηθεί ΤΚ στο πλαίσιο αυτό. Ισχυρή προκλινικές αποδείξεις συνεπάγεται μια ικανότητα αναστολής EGFR για να ενισχύσει τα αποτελέσματα αντι-όγκου της ιονίζουσας ακτινοβολίας, και αυτό έχει μεταφραστεί σε κλινικό περιβάλλον με βάση τα αποτελέσματα μιας μελέτης Φάσης ΙΙΙ σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου [8], [9]. Αυτό αποδεικνύει τη σημασία των τεκμηριωμένων στρατηγικών παρέμβασης για να διαπιστωθεί κατά πόσον συγκεκριμένο ΤΚ συμβάλλουν στην κυτταρική ραδιο-ευαισθησία, ή να ραδιο-αντίσταση.

Σε αντίθεση με την αναδυόμενη αποδείξεις για EGFR, ο ρόλος των άλλων ΤΚ, ειδικά μη ΤΚ υποδοχέα, είναι λιγότερο σαφής. Focal Adhesion Kinase (ΡΑΚ) βρίσκεται στις θέσεις πρόσφυσης ιντεγκρίνης από όπου μετάγει σήματα σε κύτταρα που ελέγχουν πολλαπλές σχετίζονται με τον καρκίνο ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένης πρόσφυση και ακτίνης δυναμική, η μετανάστευση, εισβολή, την αγγειογένεση, την προστασία των κυττάρων από την αναστολή που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο ( μερικές φορές ονομάζονται anoikis) και τον πολλαπλασιασμό σε 3-διαστάσεις [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. FAK είναι συχνά υπερεκφράζεται στον ανθρώπινο καρκίνο [18], [19], [20], [21], και παίζει ένα ρόλο στην ογκογένεση, όπως καταδεικνύεται σε πολλαπλούς τύπους ιστών

in vivo

[22], [23], [24], [25], [26], [27], [28]. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι η διαγραφή FAK αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του δέρματος του ποντικιού και κακοήθη εξέλιξη, και ότι η διαγραφή FAK προάγει αποπτωτικό θάνατο των φυσιολογικά κερατινοκύτταρα του δέρματος σε καλλιέργεια [25]. Πιο πρόσφατα, έχουμε επίσης κάνει χρήση του Κ14-Cre-ER

T2 /f

LOX

σύστημα -FAK ποντίκι για να αντλήσει καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων (SCC) από χημικά που προκαλείται από όγκους [29], [ ,,,0],30]. διαγραφή FAK προκαλεί πολλαπλές βλάβες, συμπεριλαμβανομένων μειωμένη πόλωση και απαντήσεις για την κατευθυντήρια συνθήματα, όπως χημειοτακτική εισβολή, καθώς επίσης και μειωμένη ανάπτυξη σε 3-διαστάσεις (παρόλο που η αύξηση σε πλαστικά 2-D δεν επηρεάζεται) και καθυστερημένη ανάπτυξη ως ξενομοσχεύματα

in vivo

[29], [30].

οι

FAK λειτουργίες στις οποίες μεσολαβεί προ-επιβίωσης πιστεύεται ότι παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, και ότι αυτό πιθανόν εμπλέκει την ρ53 μονοπάτι [31]. Επιπλέον, ο προαγωγός ΡΑΚ περιέχει ρ53 ανταποκρινόμενα στοιχεία και μπορεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω από την βλάβη του DNA σε ένα ρ53-εξαρτώμενο τρόπο, ενώ η έκφραση της FAK συσχετίζεται με μεταλλαγμένο p53 στον καρκίνο του μαστού [32], [33], [34]. Υπάρχει επίσης

in vitro

και

in vivo

στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η FAK knock-down μπορεί να ευαισθητοποιήσει κύτταρα στην κυτταροτοξική χημειοθεραπεία [2], [35], [36], [37], [ ,,,0],38], [39], [40], [41]. Αντίθετα, υπάρχουν σχετικά λίγες μελέτες σχετικά με το ρόλο της FAK στην ευαισθησία ακτινοβολίας. φωσφορυλίωση της FAK προκαλείται μετά από έκθεση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία

in vitro

[42], αν και αυτό μπορεί μόνο να ήταν μια παροδική αντίδραση στο στρες, όπως ο ρόλος της FAK δεν είχε διερευνήσει. Ωστόσο, υπάρχει μία αναφορά ότι siRNA μεσολάβηση FAK knock-down προωθεί ραδιοευαισθητοποίησης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [43], αν και ο υποκείμενος μηχανισμός δεν είναι σαφής. Επιπροσθέτως, υπερέκφραση του FAK στα κύτταρα HL-60 προσδίδει σημαντική αντίσταση σε μια ποικιλία αποπτωτικών ερεθισμάτων, συμπεριλαμβανομένων ιοντίζουσας ακτινοβολίας [44], όλα υποδηλώνοντας ότι η αναστολή της σηματοδότησης μέσω της FAK είναι πιθανό να προωθήσει ραδιο-ευαισθησίας. Εδώ έχουμε χρησιμοποιήσει ένα καθαρό σύστημα γενετική διαγραφή /την ανασύσταση να δοκιμάσει ρόλο FAK στην κυτταρική απόκριση ακτινοβολίας

in vitro

και

in vivo

, ειδικά σε ΡΑΚ-ανεπαρκή κύτταρα SCC (και τους ΡΑΚ εκφράζουν ομολόγους), και να αρχίσουν να τεμαχίσει το υποκείμενο μηχανισμό.

Αποτελέσματα

Εμείς προέρχονται τα κύτταρα SCC από χημικά προκαλείται από πλακώδες καρκίνους κυττάρων σε ποντίκια που εκφράζουν μια

floxed

μορφή η ΑΤΡ-δέσμευσης κωδικοποίησης εξόνιο του

ΡΑΚ

υπό τον έλεγχο του δέρματος ειδική (Κ14)

Cre recombinase

συντήκεται με το οιστρογόνο υποδοχέα [25]. Εκτομή του

floxed

–

ΡΑΚ

κι έναν ενιαίο κατεργασία με 4-υδροξυ-ταμοξιφένη (4-ΟΗΤ) οδήγησε σε πλήρη ανεπάρκεια πρωτεΐνης ΡΑΚ [29], [30] (βλέπε επίσης Σχ. 1C και 2Β), το οποίο θα μπορούσε να αντιστρέψει την εκ νέου εκφράζουν κ.β. ΡΑΚ, που μας επιτρέπει να μελετήσουμε πώς τα καρκινικά κύτταρα να αντιμετωπίσουν με σοβαρή διαταραχή της οδού ιντεγκρίνης /FAK σηματοδότησης. Για να εκτιμηθεί ραδιο-ευαισθησίας, μια περιοριστική αραίωση κλωνογόνο δοκιμασία διεξήχθη συγκρίνοντας FAK – /- με κύτταρα FAK κ.β. σε αυξανόμενες δόσεις της ακτινοβολίας μέχρι και 10 Gy. Αυτό αποκάλυψε ότι η πλήρης απουσία της FAK στα κύτταρα αυτά σχετίστηκε με αυξημένη ραδιο-αντίσταση

in vitro

(Εικ. 1Α). Μία στατιστικά σημαντική διαφορά στην κλάσμα επιβίωσης παρατηρήθηκε σε δόσεις των 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy και 10 Gy (ρ τιμές του 0,0136, 0,0097, 0,0045, και 0,0036 αντίστοιχα, αναλύονται με μη ζευγαρωμένο t-τεστ του Student, η = 9).

(Α) πληθυσμούς Υποσυρρέουσες του FAK – /- και wT κύτταρα FAK τρυψινοποιήθηκαν και αραιώθηκαν σε μέσο ανάπτυξης σε μία τελική συγκέντρωση η οποία θα επιτρέπει την ανάπτυξη μόνο αποικία. 100 μΙ αυτού του εναιωρήματος προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων. Μετά από επώαση για 6 ώρες για να επιτραπεί προσκόλληση των κυττάρων, οι πλάκες ακτινοβολούνται με 0, 2, 4, 6, 8 ή 10 Gy. Τα κύτταρα αναλύθηκαν εις τριπλούν για κάθε δόση ακτινοβολίας. Μετά από 7 ημέρες, ο αριθμός των αποικιών ανά πλάκα απαριθμήθηκε και το κλάσμα επιζών υπολογιστεί. Η γραφική αναπαράσταση που φαίνεται αντιπροσωπεύει το μέσο ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα. Surviving κλάσματα σε κάθε δόση ακτινοβολίας συγκρίθηκαν με κύτταρα μη-ακτινοβολημένα με μη ζευγαρωμένο t-τεστ του Student, η = 9. (Β) 2 × 10

5 FAK – /- κύτταρα και FAK wt εγχύθηκαν υποδορίως στην δεξιά πλευρά θηλυκών γυμνών ποντικών. Ξενομοσχευμάτων αφέθηκαν να φθάσουν περίπου 150 mm

3. Τα ζώα στη συνέχεια ακτινοβολούνται με 5 Gy ακτινοβόληση ολόκληρου του σώματος ή ψευδο ακτινοβολημένα. Μετά από 7 ημέρες τα ξενομοσχεύματα μετρήθηκαν και οι ποντικοί θανατώθηκαν. Οι μέσες ξενομοσχεύματος όγκοι ± SEM πριν την ακτινοβολία (άνω πάνελ) και μετά από ακτινοβολία (κάτω πάνελ) που φαίνεται. Η στατιστική ανάλυση των mock ακτινοβοληθεί έναντι ακτινοβολημένων όγκων στις 7 ημέρες αξιολογήθηκε με μη ζευγαρωμένο t-test μαθητή, * δηλώνει ρ & lt? 0,05, η = 10. (Γ) εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν από τα ξενομοσχεύματα, διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη , και στυπώθηκαν με αντι-ΡΑΚ (άνω) και αντι-β-ακτίνης (κατώτερο) αντισώματα. Ένα δείγμα από πέντε διακριτές εκχυλίσματα από κάθε ομάδα παρουσιάζεται. Ένας θετικός μάρτυρας (εκχύλισμα ΡΑΚ wt κυττάρων) προστέθηκε στην τελική λωρίδα της FAK – /-. Ξενομοσχεύματος δείγματα

Η

(Α) FAK – /- και τα κύτταρα FAK wt ακτινοβολήθηκαν με 5 Gy σε 70% συρροή και προϊόντα λύσης που παρασκευάζονται στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Ανοσοκηλίδωση συνέχεια διεξήχθη με αντι-ρ21 (άνω πάνελ), και αντι-β-ακτίνης (κάτω πάνελ). (Β) εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν από ταπήτιο FAK – /- και FAK wt κυτταρικούς πληθυσμούς, διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη και γίνεται αποτύπωμα με αντι-ΡΑΚ (άνω πάνελ), αντι-ρ21 (μεσαίο πλαίσιο) και αντι- β-ακτίνης (κάτω πάνελ) αντισώματα. (C) RNA εξήχθη από ταπήτιο FAK – /- κύτταρα και FAK κ.β., PCR εκτελέστηκε και το προϊόν αναλύθηκε. β-ακτίνη φόρτωση παρουσιάζεται επίσης (κατώτερο πάνελ). (D) εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν από FAK – /- και FAK wt κυτταρικών πληθυσμών σε επίπεδο συρροή υποδεικνύεται. Ανοσοκηλίδωση συνέχεια διεξήχθη με αντι-ρ21 (άνω πάνελ) και αντι-β-ακτίνης (κάτω πάνελ) αντισώματα.

Η

Μπορούμε επίσης δοκιμαστεί εάν FAK επηρεάζεται ραδιο-ευαισθησίας

in vivo

, με σύγκριση FAK – /- και FAK wt SCC ξενομοσχεύματα. 2 × 10

5 κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως στο δεξί πλευρό θηλυκών γυμνών ποντικών και τα ζώα ήταν είτε ακτινοβολημένων με 5 Gy (με τη μορφή του ακτινοβόληση ολόκληρου σώματος) ή ψευδο ακτινοβολημένα όταν τα ξενομοσχεύματα έφθασαν περίπου 150 mm

3. Αυτό το μέγεθος επελέγη ως η FAK – /- οι όγκοι είχαν ξεπεράσει μια αρχική καθυστέρηση στην ανάπτυξη τους

in vivo

, και ο ρυθμός πολλαπλασιασμού τους σε αυτό το σημείο δεν διαφέρει σημαντικά από τα αντίστοιχα FAK wt τους. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι το στέλεχος CD1 άτριχων ποντικών μπορούσαν να ανεχθούν 5 δόση ολικού σώματος Gy για 10-14 ημέρες. Μετά από 7 ημέρες, τα ξενομοσχεύματα μετρήθηκαν και τα ζώα θυσιάστηκαν. Οι όγκοι του όγκου υπολογίζονται πριν και μετά από 5 Gy ακτινοβολίας ή ψευδο ακτινοβολία, και αναλύθηκαν με μη συζευγμένο τεστ t σπουδαστών. Μια στατιστικά σημαντική μείωση στον όγκο του όγκου παρατηρήθηκε στα ακτινοβολημένα ξενομοσχεύματα κ.β. ΡΑΚ σε σύγκριση με τα ψευδο-ακτινοβολημένα δείγματα αναφοράς (ρ = 0,0030, η = 10), αλλά αυτό δεν επαναλήφθηκε στις FAK – /- ξενομοσχεύματα (ρ = 0.3300, Ν = 10) (Σχ. 1Β). Εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν από 5 ποντίκια σε κάθε ομάδα και υποβλήθηκε σε στύπωση western για να επιβεβαιωθεί το επίπεδο της έκφρασης της FAK στα FAK – /- και όγκους FAK wt (Εικ. 1 C). Τα χαμηλά επίπεδα της FAK παρούσας από FAK – /- που προέρχονται από όγκους υλικό είναι πιθανό από το μικρό ποσό των στρωματικών ή ανοσολογικής διήθηση (Σχήμα 1C).

Τα κύτταρα SCC χρησιμοποιήσαμε εδώ εκφράζονται άγριου τύπου ρ53 (επιβεβαιώθηκε. με ανάλυση αλληλουχίας (δεν φαίνεται)), και αναγνωρίσαμε μια FAK εξαρτώμενη διαφορά στην επαγωγή του γονιδίου στόχου ρ53, ρ21, μετά την ακτινοβολία (σχήμα 2? βλ. επίσης παρακάτω). Συγκεκριμένα, η επαγωγή της ρ21 ήταν εμφανές μετά από 2 ώρες μετά την αγωγή FAK – /- κυττάρων με 5 Gy ακτινοβολίας? Αντιθέτως, ρ21 δεν επάγεται όταν FAK ήταν παρούσα (Εικ. 2Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα βασικά επίπεδα της ρ21 πρωτεΐνης και του mRNA σε υπο-συρρέουσες πληθυσμοί των δύο FAK – /- κύτταρα και FAK wt ήταν παρόμοια (Σχήμα 2Β και 2C, αντίστοιχα.), Ενώ τα επίπεδα ρ21 ήταν αυξημένα στις δύο κυτταρικές σειρές με αυξανόμενη συρροή (Εικ . 2D). Αυτό ήταν σύμφωνο με την ευρέως αποδεκτή ρόλο για την ρ21 στη διακοπή του κυτταρικού κύκλου επαφών που προκαλείται (Σχ. 2D), και απέδειξε ότι ένα διαφορετικό ερέθισμα ήταν σε θέση να αυξήσει τα επίπεδα του p21 ανεξάρτητα από το καθεστώς FAK. Για να εξασφαλιστεί η διαφορά στην επαγωγή της p21 μετά από έκθεση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία δεν σχετιζόταν με τις διαφορές στην πυκνότητα των κυττάρων, ελήφθη μέριμνα σε όλα τα πειράματα για να εξασφαλιστεί ότι τα κύτταρα είχαν ακτινοβοληθεί σε συγκρίσιμες συρροή, συνήθως το 70%.

Η FAK -dependence της ρύθμισης p21 είχε αναπαραχθεί

in vivo

. Συγκεκριμένα, γυμνά ποντίκια ενέθηκαν υποδορίως με 2.5 χ 10

5 FAK – /- ή ΡΑΚ wt κυττάρων, ξενομοσχεύματα αφέθηκαν να αποδείξει, και τα ζώα στη συνέχεια ακτινοβολούνται με 5 Gy ακτινοβολία όταν οι όγκοι έφθασαν περίπου 500 mm

3 σε όγκο. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν στις 0, 2 ώρες, 6 ώρες, και 24 ώρες μετά την ακτινοβολία (η = 3 ανά ομάδα) και τα επίπεδα ρ21 αξιολογήθηκαν τόσο από κηλίδωση Western προϊόντων λύσης όγκου και ανοσοϊστοχημεία (IHC) χρώση ενσωματωμένα σε παραφίνη ιστού. Οι FAK – /- ξενομοσχεύματα παρουσίασαν μια αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ21 ήδη 2 ώρες μετά την ακτινοβολία (σχήμα 3Α, αριστερά πάνελ.)? επίπεδα p21 εμφανίστηκε μέγιστη όλο αυτό το διάστημα. Η αύξηση του ρ21 ήταν επίσης ορατή με IHC (Σχ. 3Α, δεξιά πάνελ). Σημαίνει θετικότητα p21 (με βάση την βαθμολογία των 20 πεδία) αναλύθηκε σε όλες τις χρονικές στιγμές και αυτό έδειξε μια σημαντική διαφορά στα επίπεδα του p21 στους όγκους των ακτινοβολημένων

έναντι

ζώα un-ακτινοβολημένα (Kruskal-Wallis, p = 0.038, η = 3). Περαιτέρω, οι μεμονωμένες σύγκριση των ξεχωριστών χρονικά σημεία απεικονίζεται μια στατιστικά σημαντική αύξηση σε ρ21 βαθμολόγησης σύγκριση με τα επίπεδα βασικής γραμμής (Mann Whitney, ρ = 0,0404, η = 3). Σε αντίθεση, τα ξενομοσχεύματα κ.β. FAK δεν έδειξε καμία συνεπής αύξηση των επιπέδων ρ21 σε οποιοδήποτε από τα χρονικά σημεία που εξετάστηκαν. Κηλίδωση Western των προϊόντων λύσης όγκου wt-εκφράζοντα FAK επιβεβαίωσε την παρουσία του FAK, αλλά δεν υπήρξε καμία σημαντική αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ21 (Εικ. 3Β). Περαιτέρω ανάλυση IHC (Σχ. 3Β, δεξιά πάνελ) επιβεβαίωσε δεν υπήρξε σημαντική αύξηση στην έκφραση ρ21 σε 2 ώρες (ρ = 0,6625), 6 ώρες (ρ = 0,6625), ή 24 ώρες (ρ = 0,3827) (Mann Whitney, . n = 3), σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

(Α) FAK – /- SCC κύτταρα ή (Β) ΡΑΚ κ.β. κύτταρα SCC, ενέθηκαν υποδορίως στο δεξί πλευρό θηλυκών γυμνών ποντικών. Όταν ξενομοσχεύματα έφθασαν περίπου 500 mm

3, τα ποντίκια ακτινοβολήθηκαν με 5 Gy και θυσιάστηκαν σε 0, 2 ώρες, 6 ώρες, και 24 ώρες (η = 3 ανά ομάδα). Το ήμισυ του ξενομοσχεύματος μονιμοποιήθηκε σε φορμαλίνη έπειτα ενσωματωμένα σε παραφίνη και το άλλο ήμισυ καταψύχθηκε σε υγρό άζωτο. Εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάζονται από τα κατεψυγμένα τμήματα, διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη και γίνεται αποτύπωμα με αντι-ΡΑΚ (πίνακας κηλίδα άνω), αντι-ρ21 (πίνακας κηλίδα μέση), και αντι-β-ακτίνης (κάτω πάνελ blot ). Οι τομές παραφίνης χρωματίστηκαν ενσωματωμένα με ρ21 και ρ21-θετικών κυττάρων απεικονίστηκαν με IHC (δεξιά πάνελ). Αντιπροσωπευτικά φωτεινές εικόνες τομέα της p21 χρωματισμένο ιστού σε 0, 2 ώρες, 6 ώρες και 24 ώρες μετά την ακτινοβολία εμφανίζονται (γραμμή κλίμακας, 0,1 mm).

Η

Εμείς εξάγεται RNA από υπο-συρροή πληθυσμών FAK – /- και FAK wt κύτταρα σε διάφορα χρονικά σημεία μετά 5 Gy ακτινοβολίας, και qRT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές για την ενδογενή ρ21. Υπήρξε μια διφασική αύξηση των επιπέδων του mRNA p21, και κορυφώθηκε σε 2 ώρες και 6 ώρες μετά την ακτινοβόληση σε FAK – /- κύτταρα? από ρ21 αντίθετα επίπεδα του mRNA δεν προκλήθηκαν σε κυτταρική γραμμή FAK wt μετά την ακτινοβόληση (Σχ. 4Α). RNA εκχυλίστηκε επίσης από τις δύο κυτταρικές σειρές 2 ώρες μετά από ένα εύρος δόσεων ακτινοβολίας (0, 2, 5, 10, 20, και 30 Gy) και αναλύθηκαν με qRT-PCR. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα του mRNA p21 αυξήθηκε σε FAK – /- SCC κυττάρων σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (περιοχή από 2 έως 10 Gy Gy)? περαιτέρω κλιμάκωση της δόσης δεν οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση του mRNA p21. Η δοσοεξαρτώμενη αύξηση στη μεταγραφή του p21 εξασθένησε με την εκ νέου έκφραση του FAK wt στις FAK κύτταρα με ανεπαρκές SCC (Εικ. 4Β). Παράλληλα πειράματα, βρήκαμε ότι η αυξημένη επίπεδα σταθερής κατάστασης της πρωτεΐνης p21 ήταν εμφανής μετά την ακτινοβολία σε διάφορες δόσεις στο FAK – /- SCC κυττάρων, και ότι αυτό ήταν εξασθενημένος όταν αποκαταστάθηκε η έκφραση της FAK (Εικ. 4C, συγκρίνετε αριστερά και δεξιά πάνελ) . Για να συμπληρωθεί η γενετική διαγραφή της FAK, χρησιμοποιήσαμε επίσης έναν αναστολέα κινάσης FAK (PF-562271? [45]) σε μία δόση των 0,5 μΜ (η οποία είναι η βέλτιστη για την αναστολή της δραστηριότητας της κινάσης FAK στα κύτταρα αυτά (δεν φαίνεται)) για 2 ώρες πριν από την ακτινοβόληση, και συλλέγεται πρωτεΐνη προϊόντα λύσης για ανοσοκηλίδωση σε 0, 2, 4, και 6 ώρες μετά από 5 Gy. επίπεδα ρ21 ήταν εμφανώς αυξήθηκε κατά 2 ώρες μετά την ακτινοβολία σε 0,5 μΜ PF-562271 αγωγή FAK κ.β. κύτταρα σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ 4D.)

(Α) RNA εξήχθη από υποσυρρέοντα FAK -. /- και FAK wt κυτταρικών πληθυσμών σε διάφορα χρονικά σημεία μετά από 5 Gy ακτινοβολίας. ανάλυση qRT-PCR πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια εις τριπλούν. Φορές αύξηση στα επίπεδα mRNA ρ21 υπολογίστηκε με τη μέθοδο της ddC (t) με β-ακτίνη ως έλεγχο φόρτισης. Γραφική αναπαράσταση των συνδυασμένων μέση ± SEM από τρία πειράματα αποδεικνύεται. (Β) RNA εκχυλίστηκε από υπο-συρρέουσα FAK – /- και πληθυσμών FAK wt κυττάρων 2 ώρες μετά 0, 2, 5, 10, 20, και 30 Gy ακτινοβολία. cDNA μετά δημιουργήθηκε και qRT-PCR για ρ21 πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. (Γ) εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν από FAK – /- πληθυσμούς και FAK wt κυττάρων 2,5 ώρες μετά την έκθεση σε διάφορες δόσεις ακτινοβολίας. Τα εκχυλίσματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη και γίνεται αποτύπωμα με αντι-ρ21 (άνω πάνελ) και αντι-β-ακτίνης (κάτω πάνελ). (D) κύτταρα κ.β. FAK επωάστηκαν για 2 ώρες με είτε ο αναστολέας FAK PF-562271 σε 0,5 μΜ, ή μόνο 0,1% DMSO, στη συνέχεια ακτινοβολούνται με 5 Gy. Εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάζονται σε 0, 2, 4, και 6 ώρες και ανοσοαποτυπώματα ανιχνεύθηκαν με αντι-ρ21 (άνω πάνελ), και αντι-β-ακτίνης (κάτω πάνελ). Εκπρόσωπος ανοσοαποτυπώματα από 0,1% DMSO (αριστερά) και 0,5 μΜ ναρκωτικών αντιμετωπίζεται (δεξιά) κυτταρικών πληθυσμών εμφανίζονται.

Η

Όπως ήταν αναμενόμενο, p21 σταθερής κατάστασης επίπεδα στα κύτταρα SCC ήταν τουλάχιστον εν μέρει εξαρτάται από ρ53, και προκαλούμενη από ακτινοβολία ρ21 σε κύτταρα SCC ανεστάλη από knock-down της ρ53 χρησιμοποιώντας siRNA (Σχ. 5Α-C). Ωστόσο, σημειώνεται, επίσης, ότι η επαγωγή ρ53 μετά την ακτινοβολία δεν ήταν ιδιαίτερα ισχυρή και ήταν παρόμοια σε αμφότερα FAK – /- και FAK wt SCC κύτταρα (Σχ 5D.), Υποδεικνύοντας ότι η παρουσία του FAK οδηγούσε σε κάποια αποσύνδεση της επαγωγής ρ53 και ρ21 , και ευαισθησία σε ακτινοβολία σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα. Πυκνομετρία διεξήχθη για τον ποσοτικό προσδιορισμό φορές αλλαγές στα επίπεδα ρ21 και ρ53 πρωτεΐνης μετά την ακτινοβολία του FAK-καλά και ΡΑΚ με ανεπάρκεια SCC κύτταρα (Σχήμα S1). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι ουσιαστικά αυξημένη μεταγραφή και έκφραση της πρωτεΐνης ρ21 εμφανίζεται σε FAK – /- κύτταρα μετά από κλινικά σχετικές δόσεις ιονίζουσας ακτινοβολίας, και ότι αυτή η απόκριση αμβλύνεται από την παρουσία του FAK. Έτσι, FAK λειτουργίες σε αυτές τις προηγμένες καρκινικά κύτταρα για την καταστολή της ρ53-εξαρτώμενη μεταγραφή του p21 μετά την ακτινοβόληση. Αυτό δεν είναι εμφανώς συνδεδεμένο με διαφορική επαγωγή της διακοπής κύκλου κυττάρου (Σχήμα S3 (που προσδιορίζεται όπως περιγράφεται στις Μεθόδους S1)) ή απόπτωση, η οποία είναι δύσκολο να ανιχνευθούν μετά την ακτινοβόληση των κυττάρων SCC όπως κρίνεται από την έλλειψη περιεχόμενο DNA υπο-G1 (δεν φαίνεται) . Αυτό συμβαίνει παρά διαφορική ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου p53 PUMA (Σχήμα S4) που μπορούν να συσχετιστούν με την απόπτωση

(Α) FAK -. /- Κύτταρα επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ siRNA (είτε ως κωδικοποιημένο πισίνα ή p53 siRNA) σε 50% συρροή. Μετά από 24 ώρες, εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν και ανοσοαποτυπώματα ανιχνεύθηκαν με αντι-ρ53 (άνω πάνελ), αντι-ρ21 (μεσαίο πλαίσιο) και αντι-β-ακτίνης (κάτω πάνελ). (Β) Πυκνότητας συγκρίνοντας τα επίπεδα του p21 σε FAK – /- εκτελέσθηκε εκχυλισμάτων πρωτεΐνης θεραπεία είτε με μια ομελέτα πισίνα του siRNA ή p53 siRNA. Τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ21 ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη και τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά του ενός από τα τρία ξεχωριστά πειράματα. (Γ) FAK – /- κύτταρα σε 50% συρροή επιμολύνθηκαν με είτε 100 ηΜ siRNA ομελέτα ή 100 ηΜ siRNA ρ53, επωάστηκαν για 24 ώρες, στη συνέχεια ακτινοβολούνται με 5 Gy. Τα προϊόντα λύσης συλλέχθηκαν στα χρονικά σημεία που υποδεικνύονται και ανοσοαποτυπώματα ανιχνεύθηκαν με αντι-ρ53 (άνω πάνελ), αντι-ρ21 (μεσαίο πλαίσιο) και αντι-β-ακτίνης (κάτω πάνελ). (D) εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν από FAK – /- κύτταρα WT και ΡΑΚ 2 ώρες μετά την έκθεση σε διάφορες δόσεις ακτινοβολίας (0-30 Gy). Τα εκχυλίσματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και ανοσοαποτυπώματα ανιχνεύθηκαν με αντι-ρ53 (άνω πάνελ) και αντι-β-ακτίνης (κάτω πάνελ). Η δεξιά λωρίδα σε κάθε τζελ περιέχει εκχυλίσματα πρωτεΐνης από FAK – /- ή ΡΑΚ κ.β. κύτταρα που εκτέθηκαν σε ολονύκτια επεξεργασία με 0,1 μΜ ακτινομυκίνης D.

Η

Προηγούμενη εργασία έχει δημιουργήσει σαφείς δεσμούς μεταξύ FAK και p53 που προωθεί επιβίωση μετά από στρες που προκαλείται από σηματοδότηση (σε κύτταρα που στερούνται p21),

μέσω

δεσμεύει τον τομέα FAK FERM να ρ53 στον πυρήνα, διευκολύνοντας αποικοδόμηση ρ53 και επιβίωση [46]. Ως εκ τούτου, ανοσοκαταβυθίστηκαν FAK από προϊόντα λύσης του FAK κ.β. SCC κυττάρων πριν και μετά από 5 Gy ακτινοβολία, και ανοσοστυπώθηκαν για ρ53 και για Src (ως θετικός μάρτυρας). Όπως ήταν αναμενόμενο, Src ήταν υποχρεωμένη να FAK, και αυτό ήταν αναλλοίωτη με ακτινοβολία (Σχήμα S2A (που προσδιορίζεται όπως περιγράφεται στις Μεθόδους S1)). Ωστόσο, βρήκαμε ότι FAK δεν αλληλεπιδρά με ρ53 (Εικ. S2A). Τα υλικά λύσεως ανιχνεύθηκαν για FAK, Src και p53 να διασφαλιστεί η ίση φόρτωση (Σχ. S2B). Βρήκαμε επίσης ότι η ρ53 αποτελεσματικά μετατοπίζεται στον πυρήνα και στα δύο FAK – /-. Και FAK wt κυττάρων μετά από ακτινοβολία (δεν φαίνεται)

Από ρ21 έχει συσχετιστεί με τόσο αντοχή και ευαισθησία σε παράγοντες που βλάπτουν το DNA, συμπεριλαμβανομένων ιονίζουσα ακτινοβολία, έχουμε την επόμενη απεμπλουτισμένο p21 με τη χρήση siRNA. Πετύχαμε περίπου 90% knock-down του p21 στα κύτταρα SCC (Εικ. 6Α και 6Β). Κλωνογονικότητας συνέχεια αξιολογήθηκε στις 0, 4, και 8 Gy και σύγκριση γίνεται μεταξύ κυτταρικών πληθυσμών επιμολυσμένα με ρ21 siRNA, ομελέτα siRNA ή κύτταρο ελέγχου πληθυσμούς οι οποίοι είχαν ψευδώς μετεμβολιασμένα. Βρήκαμε μια σημαντική διαφορά στην επιβίωση κλάσματος σε 8 Gy (p = 0,0129) μεταξύ του κωδικοποιημένα siRNA- και ρ21 κύτταρα siRNA-θεραπεία, έτσι ώστε p21 προωθούνται ραδιο-αντίσταση στα κύτταρα SCC (Εικ. 5C). Επομένως, υπάρχει ισχυρή σχέση μεταξύ της ακτινοβολίας που προκαλείται από ρ21 σε ΡΑΚ-ανεπαρκή κύτταρα (αλλά όχι σε ομολόγους τους ΡΑΚ-έκφραση) και η διαπίστωση ότι η απώλεια ΡΑΚ προκαλεί ραδιο-αντίσταση στο οποίο p21 έχει έναν αιτιώδη ρόλο στα κύτταρα SCC.

(Α) FAK – /- SCC κύτταρα επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ siRNA (είτε ένα κωδικοποιημένο πισίνα ή p21 siRNA) σε 50% συρροή. Μετά από επώαση για 24 ώρες, εκχυλίσματα πρωτεΐνης ανοσοστυπώθηκαν και διερευνήθηκαν με αντι-ρ21 (άνω πάνελ) και αντι-β-ακτίνης (κάτω πάνελ). (Β) Πυκνότητας συγκρίνοντας τα επίπεδα του p21 σε FAK – /- εκτελέσθηκε εκχυλισμάτων πρωτεΐνης θεραπεία είτε με μια ομελέτα πισίνα του siRNA ή p21 siRNA. Τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ21 ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη επίπεδο και τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά του ενός από τα τρία ξεχωριστά πειράματα. (Γ) FAK – /- κύτταρα ήταν ψευδο-επιμολυσμένα ή επιμολυσμένα με 100 ηΜ είτε κωδικοποιημένα πισίνα siRNA ή ρ21 siRNA σε 50% συρροή. Μετά από 24 ώρες οι κυτταρικοί πληθυσμοί τρυψινοποιήθηκαν και αραιώθηκαν σε μέσο ανάπτυξης σε μία τελική συγκέντρωση η οποία θα επιτρέπει την ανάπτυξη μόνο αποικία. 100 μΙ αυτού του εναιωρήματος στη συνέχεια προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων. Μετά από επώαση για 6 ώρες για να επιτραπεί προσκόλληση των κυττάρων, οι πλάκες ακτινοβολούνται με 0, 4, ή 8 Gy. Οι πλάκες ρυθμίζονται εις τριπλούν για κάθε δόση ακτινοβολίας. Μετά από 7 ημέρες, ο αριθμός των αποικιών ανά τρυβλίο μετρήθηκε και το κλάσμα επιζών υπολογιστεί. Το γράφημα δείχνει τη μέση τιμή ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα. Επιζών κλάσματα p21 siRNA κατεργασμένων κυττάρων συγκρίθηκαν με μπερδεμένο siRNA κατεργασμένων κυττάρων σε κάθε δόση της ακτινοβολίας και η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με μη ζευγαρωμένο t-test μαθητή, * δηλώνει ρ & lt? 0,05, η = 9.

Η

Τέλος , θα εκτιμηθεί αν η ανεπάρκεια ΡΑΚ επηρεάζονται περισσότερο γενικά χαρακτηριστικά που σχετίζονται με βλάβες στο DNA. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα του mRNA από ένα αριθμό γονιδίων στόχων p53, τα οποία εμπλέκονται στην επιδιόρθωση μετά από την ιονίζουσα ακτινοβολία, δηλαδή

GADD45

,

p53R2

και

ddb2

, και είναι γνωστά να ρυθμίζεται προς τα κάτω από το c-Myc [47], διεγέρθηκαν σε FAK – /- SCC κύτταρα, αλλά με συνέπεια λιγότερο σε αντίστοιχά τους ΡΑΚ-εκφράζοντα (Εικ. 7). Αυτό ίσχυε ιδιαίτερα για

ddb2

στο χρονικό σημείο 2 ωρών, για

GADD45

σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία, και για το

p53R2

διάρκεια των 0-24 ώρες μετά την ακτινοβόληση ( Σχ. 7Α, Β και C). Δεδομένου δείξαμε ότι FAK απαιτείται για c-Myc ανοδική ρύθμιση προς τα κάτω του

Αρο

διαγραφή στο έντερο ποντικού [22], μπορεί να είναι ότι FAK εξασθενίζει την ακτινοβολία-επαγόμενη έκφραση των γονιδίων συντήρησης ακεραιότητα του γονιδιώματος σε κύτταρα SCC

μέσω

c-Myc μεσολάβηση καταστολή. Ωστόσο, σημειώνεται ότι το BRCA1 παρέχει ένα παράδειγμα ενός γονιδίου αποκρίνεται βλάβη του DNA που επηρεάζεται μόνο ελάχιστα από την απώλεια FAK? Πράγματι, η έκφραση BRCA1 καταστέλλεται από ανεπάρκεια ΡΑΚ σε μεταγενέστερους χρόνους μετά την ακτινοβόληση (Σχ. 7D). Έτσι, συμπεραίνουμε ότι προκαλείται από ακτινοβολία μεταγραφής ενός υπο-σετ του p53-γονιδίων που αποκρίνονται διαμορφώνεται από την παρουσία ή απουσία των FAK, και έτσι δεν οφείλεται απλά σε γενικές δυσλειτουργίας ρ53.

RNA εκχυλίστηκε από υποσυμβάλλουσες FAK – /- και FAK wt κυτταρικών πληθυσμών σε διάφορα χρονικά σημεία μετά από 5 Gy ακτινοβολίας. ανάλυση qRT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που κατευθύνονται έναντι Ddb2 (Α), GADD45 (Β), p53R2 (C) και BRCA 1 (Δ), και αυτά ήταν όλα κανονικοποιούνται σε β-ακτίνη.

Η

Ως αναφέρθηκε, δεν υπήρχε εύκολα ανιχνεύσιμη διακοπή κύκλου απόπτωσης ή απόκλιση κύτταρο που μπορεί να αποδοθεί στην κατάσταση FAK. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε έπειτα φωσφορυλίωση επί της σερίνης 139 της ιστόνης γH2AX που συμβαίνει σε απόκριση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία [48] και θεωρείται ότι είναι ένας αξιόπιστος υποκατάστατο του διπλού επισκευής θραύσης κλώνου. Ποσοτικοποίηση του ποσοστού των πυρήνων που περιέχουν & lt? 5 ή ≥5 γH2AX εστίες έδειξαν ότι και οι δύο FAK – /- πληθυσμούς και FAK κ.β. είχε ≥5 γH2AX εστιών σε όλα σχεδόν τα κύτταρα 1 ώρα μετά την ακτινοβόληση με 5 Gy (Σχήμα 8Α).. Ωστόσο, οι FAK – /- κύτταρα άρχισαν να καταργήσετε αυτές τις εστίες μέσα σε 6 ώρες και αυτά επέστρεψε στο επίπεδο της γραμμής βάσης εντός 24 ωρών? σε αντίθεση FAK επανέκφραση σε κύτταρα FAK κ.β. προκάλεσε βραδύτερο ρυθμό κάθαρσης εστιών (συγκρίνατε 6 και 24 ώρας σημεία, (Σχήμα 8Α) Αυτό είναι συνεπές με πιο αποτελεσματική δραστικότητα επιδιόρθωσης του DNA στα FAK -.. /- κύτταρα, και ένα πιο αργό ρυθμό της επισκευής όταν ΡΑΚ είναι παρούσα Εκπρόσωπος εικόνες της γH2AX ανοσοφθορισμού σε FAK -. /- κύτταρα (πριν και 1 ώρα μετά από 5 Gy ακτινοβολίας) εμφανίζονται (Σχήμα 8Β). Βρήκαμε επίσης ότι η FAK -. /- SCC κύτταρα εμφανίστηκε να έχουν γενικά υψηλότερα επίπεδα γH2AX εστιών υπό συνθήκες ελέγχου (0 ώρες) από τους ομολόγους τους ΡΑΚ-εκφράζουν (εικόνες δεν φαίνεται), με τους περισσότερους FAK – /- κύτταρα που εμφανίζουν πολλές εστίες και περίπου 10-15% εμφανίζοντας ≥5 εστιών (Σχ. . 8Α, 0 ώρες) Αυτό υποδηλώνει ότι FAK με ανεπάρκεια κύτταρα SCC μπορεί να έχει μεγαλύτερη γενετική αστάθεια από τους ομολόγους τους κ.β. FAK? τουλάχιστον φαίνεται ότι η FAK – /- SCC κύτταρα έχουν γενικά βελτιωμένες λειτουργίες επιδιόρθωση του DNA και αυτό συσχετίζεται με ραδιο-αντίσταση . Είναι ενδιαφέρον, δεν βρήκαμε καμία διαφορά στην ΡΑΚ-εξαρτώμενη ρύθμιση της φωσφορυλίωσης της ακτινοβολίας που προκαλείται είτε p53 ή Chk2 (Εικ. S5)

(Α) FAK -. /- Κύτταρα και FAK wt απλώθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα σε γυάλινες καλυπτρίδες, επωάστηκαν για 24 ώρες και ακτινοβολήθηκε με 5 Gy. Σε διάφορα χρονικά σημεία, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν, περατά, χρωματίστηκαν με αντι-φωσφο-γH2AX (σερίνη 139) και εμφανίσθηκε με τη χρήση ομοεστιακού μικροσκοπίου. Ο αριθμός των εστιών ανά πυρήνα (& lt? 5 εστιών ή ≥5 εστίες) τεκμηριώθηκε σε τουλάχιστον 100 κύτταρα. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά του ενός από δύο ξεχωριστά πειράματα. (Β) Εκπρόσωπος εικόνες αποδεικνύουν un-ακτινοβολημένα και ακτινοβολημένα FAK – /- τα κύτταρα σε 1 ώρα μετά 5 Gy φαίνεται, πράσινο – φωσφο-γH2AX και μπλε – DAPI (κλίμακα bar, 20 μm), το βέλος στην πάνω δεξιά κουτί χέρι δείχνει σε ένας πυρήνας με & lt?. 5 εστίες και σπασμένο βέλος στο κάτω κουτί δεξί χέρι δείχνοντας σε έναν πυρήνα με ≥5 εστίες

η

Συζήτηση

Εμείς εδώ δείχνουν ότι, σε πλήρη αντίθεση με το προηγούμενη έκθεση στην οποία FAK knock-down ευαισθητοποιημένα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε ιοντίζουσα ακτινοβολία [43], διαγραφή FAK (και έναν αναστολέα κινάσης FAK) μπορεί να καταστείλει σηματοδότησης σε ακτινοβολία επαγόμενη, ρ53-διαμεσολαβούμενη επαγωγή της ρ21, και αυτό συνδέεται με ράδιο- αντίσταση σε προχωρημένο SCC κύτταρα. Θεωρούμε ότι είναι σημαντικό να καταγράψει ότι ο ρόλος της FAK στα κυτταρικές αποκρίσεις σε ιονίζουσα ακτινοβολία, και ίσως προ-σηματοδότησης επιβίωσης σε γενικές γραμμές, μπορεί να εξαρτώνται από το πλαίσιο, και ότι πρέπει να είναι πολύ προσεκτικοί όταν εξετάζουν οι θεραπευτικοί συνδυασμοί των αναστολέων FAK και ακτινοθεραπεία, καθώς αυτό υπάρχει δεν είναι πάντα κλινικά ευεργετική.

στην εργασία που περιγράφεται εδώ, δείχνουμε ότι η διαγραφή FAK (ή την αναστολή της δράσης της κινάσης της) μπορεί να απελευθερώσει τους περιορισμούς FAK θέσεις στη σηματοδότηση από ρ53 στην επαγωγή πολλών γονιδίων στόχων, δηλαδή ρ21 και τουλάχιστον ένα υποσύνολο των γονιδίων ρ53 ρυθμίζεται εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA σε SCC κύτταρα. Επιπλέον, FAK – /- SCC κύτταρα φαίνεται να είναι πιο αποτελεσματική στην επισκευή μετά προκαλούμενη από ακτινοβολία βλάβη του DNA. Ωστόσο, σε αυτά τα κύτταρα δεν βρήκαμε καμία σημαντική επίδραση της διαγραφής ΡΑΚ στη σταθερότητα της πρωτεΐνης p53 (είτε ως απάντηση σε ακτινοβολία ή φάρμακα που βλάπτουν το DNA), φωσφορυλίωση ρ53 ή την ικανότητα της ρ53 να μετατοπίζονται στον πυρήνα, και δεν μπορέσαμε να βρούμε αποδείξεις ενός συμπλόκου FAK /p53 που έχει αναφερθεί για να λειτουργεί σε άλλα πλαίσια. Έτσι, το έργο μας προσθέτει σε ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία που αποδεικνύουν ότι υπάρχει λειτουργική cross-talk μεταξύ των οδών σηματοδότησης FAK και p53, αλλά αποδεικνύει ότι υπάρχουν επιπλέον τρόποι με τους οποίους αυτό μπορεί να συμβεί. Αν και δεν μπορούμε να κατανοήσουμε πλήρως τον μηχανισμό, βρήκαμε ότι στα κύτταρα SCC από τα οποία θα μπορούσαμε να διαγράψει FAK με γενετικό ανασυνδυασμό, λειτουργίες ΡΑΚ να καταστείλει τις λειτουργίες επιδιόρθωσης του DNA που προκαλείται από ακτινοβολία του ρ53 αναστέλλοντας την επαγωγή του ρ21, και ότι αυτό είναι συνδεδεμένο