Αφηρημένο

Ιστορικό

microRNAs (miRNAs) είναι μικρά RNAs μη κωδικοποιητική που ρυθμίζουν συγγενές mRNAs στο μετα-μεταγραφικό στάδιο. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι miRNAs ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση σε κύτταρα θηλαστικών με ζευγάρωμα βάσεων σε συμπληρωματικές θέσεις στο 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR) των mRNA στόχου.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

στην παρούσα μελέτη, miR-24 βρέθηκε να στοχεύσει fas σχετίζεται παράγοντα 1 (FAF1) μέσω σύνδεσης με αμινοξύ της αλληλουχίας κωδικοποίησης (CDS) περιοχή, με τον τρόπο αυτό τη ρύθμιση της απόπτωσης σε DU-145 κύτταρα. Αυτό το αποτέλεσμα υποστηρίζει ένα μοντέλο επαυξημένης οποία miRNAs ζώο μπορούν να ασκήσουν τα αποτελέσματά τους μέσω σύνδεσης προς την περιοχή CDS του mRNA στόχου. Επιμόλυνση του miR-24 αντιπληροφοριακό ολιγονουκλεοτίδιο (miR-24-ASO) και απόπτωση που επάγεται σε HGC-27, MGC-803 και HeLa κύτταρα.

Συμπεράσματα /Σημασία

Βρήκαμε ότι το miR-24 ρυθμίζει την απόπτωση με στοχοθέτηση FAF1 σε καρκινικά κύτταρα. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι miR-24 θα μπορούσε να είναι ένας αποτελεσματικός φαρμακευτικός στόχος για τη θεραπεία των ορμονο-ευαίσθητος καρκίνο του προστάτη ή άλλους τύπους καρκίνων. Η μελλοντική εργασία μπορεί να αναπτύξει περαιτέρω miR-24 για θεραπευτικές εφαρμογές στη βιολογία του καρκίνου

Παράθεση:. Qin W, Shi Υ, Zhao Β, Γιάο C, Jin L, Ma J, et al. (2010) miR-24 Ρυθμίζει την απόπτωση με στόχευση το ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) Περιφέρεια FAF1 στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 5 (2): e9429. doi: 10.1371 /journal.pone.0009429

Επιμέλεια: Syed A. Αζίζ, Health Canada, Καναδάς

Ελήφθη: 19 Γενάρη 2010? Αποδεκτές: 4 Φλεβάρη του 2010? Δημοσιεύθηκε: 25 Φλεβάρη 2010

Copyright: © 2010 Qin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Key Βασική Έρευνα και την Ανάπτυξη του Προγράμματος (2005CB724602) και Προγράμματα από την κινεζική Ακαδημία Επιστημών (KSCX-2-SW-228 και KSCX1-YW-R-64). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

microRNAs (miRNAs) είναι ενδογενείς, εξελικτικά συντηρημένη μικρό (περίπου 22 nt) μη κωδικοποιητική RNAs που έχουν αποδειχθεί να ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση μετα-μεταγραφικά [1], [2]. miRNAs συνήθως ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων στόχων τους, υποβαθμίζοντας μεταγραφές mRNA στόχο ή την αναστολή της μετάφρασης του mRNA [3], [4]. Οι miRNAs έχουν εμπλακεί σε διάφορες βιολογικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων αναπτυξιακές χρονισμού, διαμόρφωση και εμβρυογένεση, τη διαφοροποίηση και οργανογένεση, ανοσοαπόκριση, έλεγχος της ανάπτυξης και της απόπτωσης. Ωστόσο, τα γονίδια-στόχους και τις λειτουργίες των περισσότερων miRNAs είναι ακόμη ασαφείς [5] – [9].

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι miRNAs ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση σε κύτταρα θηλαστικών με ζευγάρωμα βάσεων προς συμπληρωματικές θέσεις στο 3′- αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR) του στόχου mRNA τους [4], [10], [11]. Πιο πρόσφατα, έχει καταδειχθεί ότι μπορεί να ρυθμίσει miRNAs mRNAs στόχων με σύνδεση προς το αμινοξύ αλληλουχία κωδικοποίησης (CDS) [12] – [14]

Η απόπτωση είναι μια μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (PCD), ότι. συμβαίνει σε πολυκύτταρους οργανισμούς. Ορισμένοι τύποι βλάβης προκαλέσει μια σειρά βιοχημικών γεγονότων, που οδηγεί σε μια χαρακτηριστική μορφολογία των κυττάρων και του θανάτου [15], [16]. Είναι ένα καλά ενορχηστρωμένη κυτταρικός μηχανισμός που να εξισορροπεί τις επιδράσεις του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικού θανάτου [17]. Είναι σαφές ότι η αυστηρή ρύθμιση της αποπτωτικής λειτουργίας μέσω miRNAs είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη και άλλες κυτταρικές διεργασίες. Αρκετές miRNAs που ρυθμίζουν την απόπτωση έχουν αναγνωριστεί, αν και καμία από αυτές δεν ρυθμίζουν την απόπτωση με δέσμευση της περιοχής CDS των στόχων τους [17] – [22]. Πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι miRNAs μπορεί να δρουν ως ογκογονίδια και κατασταλτικά του όγκου με στόχευση κύριοι ρυθμιστές της ανάπτυξης των κυττάρων [23] – [25].

Μια νέα κατηγορία χημικώς μηχανικής ολιγονουκλεοτιδίων, που ονομάζεται «antagomirs», μπορεί να σιωπή αποτελεσματικά ενδογενή miRNAs και έχουν χρησιμοποιηθεί για την κατάργηση της παρεκκλίνουσα έκφραση ογκο-miRNAs [26], [27]. Αυτό καταδεικνύει μια πιθανή θεραπευτική εφαρμογή για την αποτελεσματική αποσιώπηση του ογκο-miRNAs στη θεραπεία ορισμένων τύπων καρκίνου. [9]

Fas-σχετίζεται παράγοντα 1 (FAF1) είναι ένα συστατικό του θανάτου που επάγει σύμπλεγμα σηματοδότησης ( DISC) και αλληλεπιδρά με κασπάση-8 και FADD αν και στερείται των «μοτίβα θάνατος» τυπική των πρωτεϊνών απόπτωσης [28]. Αρκετές πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η υπερ-έκφραση του FAF1 διεγείρεται απόπτωση σε κύτταρα Jurkat, κύτταρα L και τα κύτταρα BOSC23 παρά την απουσία οποιουδήποτε εξωγενούς σήμα θανάτου [28] – [30]. FAF1 έχει δειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην φυσιολογική ανάπτυξη και την επιβίωση των νευρώνων των κυττάρων, ενώ FAF1 μειορρύθμιση μπορεί να συνεισφέρει σε πολλαπλές πτυχές της ογκογένεσης [31]. Χρησιμοποιώντας μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) για τη στόχευση FAF1, παρατηρήθηκε ότι τα κάτω ρύθμιση FAF1 ενίσχυσε την επιδεκτικότητα στην απόπτωση που πυροδοτείται από CP [32].

Μέχρι στιγμής, δεν είναι γνωστό αν FAF1 ρυθμίζεται από miRNAs. Για τις γνώσεις μας, καμία μελέτη δεν έχει διερευνηθεί πώς miRNAs που στοχεύουν την περιοχή CDS του γονιδίου-στόχου συμβάλλουν στην απόπτωση του όγκου. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι το miR-24 μπορεί να ρυθμίσει την ανθρώπινη FAF1 (hFAF1) έκφραση μέσω της σύνδεσης με την περιοχή CDS της hFAF1 mRNA. Επιπλέον, έχουμε αποδείξει ότι το miR-24 ρυθμίζει την απόπτωση και τον πολλαπλασιασμό σε DU-145, HGC-27, MGC-803 και τα κύτταρα HeLa με τη στόχευση του γονιδίου FAF1. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι miR-24 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός στόχος φαρμάκου γονίδιο για την θεραπεία των ορμονο-ευαίσθητου καρκίνου του προστάτη και άλλων τύπων καρκίνου.

Αποτελέσματα

miR-24-ASO-Mediated Down -Κανονισμός του miR-24 επάγει την απόπτωση και επηρεάζει Διάδοση στο DU-145 κύτταρα

για να εξερευνήσετε το λειτουργικό αποτέλεσμα του miR-24 στην επιβίωση των κυττάρων, μετρήσαμε την απόπτωση σε DU-145 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-24-ASO . Κάτω ρύθμιση του miR-24 με miR-24-ASO αυξημένη απόπτωση σε DU-145 κύτταρα, όπως μετρήθηκε με ανάλυση FACS των κυττάρων για ιωδιούχο προπίδιο και χρώση αννεξίνης V (Σχ. 1Α). Η σταυροσπορίνη χρησιμοποιήθηκε για να επάγει απόπτωση σε 48 ώρες μετά την miR-24-ASO διαμόλυνση. Η απόπτωση ήταν πολύ υψηλότερο σε DU-145 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-24-ASO ό, τι σε κύτταρα επιμολυσμένα με Αρνητικός Έλεγχος NC-ASO (Εικ. 1Β). Στη συνέχεια, η επίδραση του miR-24 στον πολλαπλασιασμό των DU-145 κύτταρα διερευνήθηκε με ένα κιτ μέτρησης CCK8. Όπως είχε προβλεφθεί, ο πολλαπλασιασμός των DU-145 κύτταρα μειώθηκε σημαντικά μετά miR-24 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω με miR-24-ASO, πιθανόν λόγω της απόπτωσης που επάγεται από miR-24-ASO (Εικ. 1 C). Η έκφραση της κασπάσης-8 επίσης αυξημένη σε κύτταρα επιμολυσμένα με miR-24-ASO, ενώ η κασπάση-8 ήταν ελαφρώς προστατεύεται από ενεργοποίηση σε κύτταρα που υπερεκφράζουν miR-24 (Σχ. 1D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι miR-24 κάτω ρύθμιση σε DU-145 κύτταρα μπορούν να επάγουν την απόπτωση, ενδεχομένως μέσω της κασπάσης-8 οδό.

(Α) DU-145 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 ηΜ miR-24-ASO ή NC-ASO για 48 ώρες. Η απόπτωση μετρήθηκε με FACS με Annexin V και χρώση ιωδιούχου προπιδίου (η = 3 ± SE? *

ρ

& lt? 0,01). Κάτω ρύθμιση του miR-24 προκαλούμενη απόπτωση σε DU-145 κύτταρα. (Β) Απόπτωση επάχθηκε για 2 ώρες με 1 μΜ σταυροσπορίνη, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση 20 ηΜ miR-24-ASO ή NC-ASO (η = 3 ± SE? *

ρ

& lt? 0,01). ευαισθησία απόπτωση αυξήθηκε σημαντικά μετά την επιμόλυνση με miR-24-ASO. (Γ) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με CCK-8 kit στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση με 20 ηΜ miR-24-ASO ή NC-ASO (η = 3 ± SE). Κάτω ρύθμιση του miR-24 επηρέασε την εξάπλωση των DU-145 κύτταρα. (D) κασπάση-8 ενεργοποίηση ανιχνεύθηκε με ανάλυση western blot των προ-κασπάσης 8 και την ώριμη μορφή της κασπάσης-8 μετά από 24 ώρες θεραπείας (όπως παραπάνω). Κασπάσης-8 ενεργοποιήθηκε μετά από επιμόλυνση με miR-24-ASO.

Η

miR-24 Ρυθμίζει την FAF1 Gene μέσω σύνδεσης με την περιοχή ORF της FAF1

Χρησιμοποιώντας τις μεθόδους που περιγράφονται από Karginov και συναδέλφους [33], με κάποιες τροποποιήσεις, βρήκαμε ότι FAF1 είναι ένας υποθετικός στόχος του miR-24. Ανάλυση με λογισμικό RNA22 (IBM) έδειξε ότι δεν υπάρχει θέση δέσμευσης miRNA στην περιοχή 3’UTR του γονιδίου FAF1, αλλά δύο υποθετικές θέσεις πρόσδεσης miR-24 βρέθηκαν μέσα στο ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) περιοχή του FAF1 (Σχ. 2Α). Περαιτέρω, οι αλληλουχίες στόχοι miR-24, ειδικά το ‘περιοχή σπόροι », στην περιοχή ORF του FAF1 βρέθηκαν να είναι εξαιρετικά διατηρημένη μεταξύ οκτώ είδη (Εικ. 2Β).

(Α) λογισμικό RNA22 χρησιμοποιήθηκε να προβλέψει ότι η περιοχή CDS της FAF1 mRNA φιλοξενεί δύο υποθετικές θέσεις πρόσδεσης miR-24. Η αλληλουχία του miR-24, θέσεις πρόσδεσης του, και ενέργειες εμφανίζονται. (Β) Οι προβλεπόμενες θέσεις σύνδεσης του FAF1 διατηρήθηκαν σε οκτώ διαφορετικά είδη. Οι βάσεις μεταβάλλονται σε μεταλλαγμένα κατασκευάσματα FAF1 παρουσιάζονται επίσης. Κόκκινο: ζεύγη βάσεων? πράσινο: G: U ζεύγος? βάσεις μεταλλαγμένο: μπλε. (Γ) Κύτταρα 293Τ διαμολύνθηκαν με ένα φορέα ρεπόρτερ που αποτελείται από ένα γονίδιο λουσιφεράσης που περιέχει το άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο θέσεις δέσμευσης miR-24) στην περιοχή 3′-UTR του (FAF1 /pGL3 ή FAF1-M12 /pGL3, 20 ng /φρεάτιο σε κάθε πλάκα 24 φρεατίων). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν επίσης με ένα φορέα λουσιφεράσης CMV-Renilla (20 ng /φρεάτιο σε κάθε τρυβλίο 24 φρεατίων) ως εσωτερικό πρότυπο. Η έκφραση της λουσιφεράσης περιέχει προβλεπόμενη miR-24 αλληλουχίες πρόσδεσης μειώθηκε κατόπιν θεραπείας με 20 ηΜ miR-24-μιμητικό σύγκριση με τη θεραπεία με NC-μιμητικό, ενώ η λουσιφεράση που περιέχουν μεταλλαγμένες αλληλουχίες δεν θα μπορούσε να ρυθμίζεται προς τα κάτω (η = 3 ± SE? *

σ

& lt? 0,01). (D) miR-24 ρυθμίζει το γονίδιο FAF1. Κύτταρα 293Τ σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται και επιμολύνθηκαν με 100 ng pcDNA3.1-FAF1. Η έκφραση του FAF1 ήταν κάτω-ρυθμίζονται μετά από επιμόλυνση με 20 ηΜ miR-24-μιμητικό και διασώθηκαν μετά από 100 ηΜ miR-24-ASO που επιμολυνθεί. (Ε) δοσοεξαρτώμενη καταστολή των FAF1 με miR-24 σε κύτταρα 293Τ. Κύτταρα 293Τ συν-επιμολύνθηκαν με 100 ng pcDNA3.1-FAF1 και 1, 5, ή 20 ηΜ miR-24-μιμητικό μετά από 24 ώρες και ανοσοστυπώθηκαν όπως παραπάνω. (F) Mutant FAF1 δεν θα μπορούσε να ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά από διαμόλυνση με 1 ηΜ ή 5 ηΜ miR-24-μιμητικό για 24 ώρες. FAF1 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω ελαφρώς μετά από επιμόλυνση με 20 ηΜ miR-24-μιμητικό? Αυτό δύναμη επειδή η μετάλλαξη να FAF1 ήταν κάπως μικρό.

Η

Για να δοκιμαστεί εάν miR-24 θα μπορούσε να ρυθμίσει FAF1 με σύνδεση προς αυτά τα δύο προβλεπόμενες θέσεις, τα θραύσματα που περιέχουν αυτές τις δύο αλληλουχίες ή μεταλλαγμένες αλληλουχίες κλωνοποιήθηκαν στον 3 ‘UTR περιοχή του γονιδίου λουσιφεράσης του φορέα pGL3 ανταποκριτή, που ονομάστηκε FAF1 /pGL3 ή FAF1-M12 /pGL3 (Σχ. 2C). Αυτές φορέων αναφοράς λουσιφεράσης που περιέχει miR-24 στοιχεία απόκρισης ή μεταλλαγμένες αλληλουχίες συν-επιμολύνθηκαν σε κύτταρα 293Τ με NC-μιμητικό ελέγχου ή miR-24-μιμητικό. Στη συνέχεια, η λουσιφεράση και η δραστηριότητα της Renilla σε κάθε φρεάτιο μετρήθηκε. Διαπιστώθηκε ότι miR-24 ήταν σε θέση να μειώσει τη δραστικότητα της λουσιφεράσης του φορέα ανταποκριτή που περιέχει miR-24 στοιχεία απόκρισης, ενώ ο ανταποκριτής που περιέχει μεταλλαγμένες αλληλουχίες δεν ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω (Σχ. 2C). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι miR-24 μπορεί να ρυθμίζει προς τα κάτω τους στόχους της μέσω δέσμευσης σε αυτά τα δύο προβλεπόμενες θέσεις πρόσδεσης.

Για να δοκιμαστεί εάν miR-24 μειώνει την έκφραση του FAF1, κύτταρα 293Τ συν-επιμολύνθηκαν με miR-24 μιμείται και pcDNA3.1-FAF1. Ως μάρτυρας, ορισμένα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με NC-μιμείται και pcDNA3.1-FAF1. Διαπιστώθηκε ότι miR-24 μιμείται μειωμένα FAF1 επιπέδων πρωτεΐνης σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικ. 2D και Ε). Επιπλέον, miR-24-ASO, miR-24 μιμείται και pcDNA3.1-FAF1 συν-επιμολύνθηκε σε κύτταρα 293Τ. Η ρύθμιση προς τα κάτω της FAF1 ανατράπηκε από miR-24-ASO, αλλά όχι από NC-ASO (Σχ. 2D).

Για να επιβεβαιώσετε ότι το miR-24 ρυθμίζεται το γονίδιο FAF1 μέσω σύνδεσης με δύο προέβλεψε δεσμευτικές θέσεις του ORF, συνώνυμη μεταλλάξεις των δύο αυτών τόπων κατασκευάστηκαν (Εικ. 2Β). Τα κύτταρα 293Τ συν-επιμολύνθηκαν με miR-24-μιμητικό και pcDNA3.1-FAF1. Το μεταλλαγμένο FAF1 δεν είναι κάτω ρυθμισμένα με επιμόλυνση του miR-24 μιμείται όσο FAF1 /pCDNA3.1 έκανε (Σχ. 2F). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι το miR-24 μπορεί να συνδεθεί και να ρυθμίζουν αυτά τα δύο στοιχεία απόκρισης στην περιοχή CDS του γονιδίου FAF1.

miR-24 Ρυθμίζει την απόπτωση σε DU-145 κύτταρα με τη στόχευση της FAF1 Gene

για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι miR-24 ρυθμίζει απόπτωση σε DU-145 κύτταρα με τη στόχευση του γονιδίου FAF1, χρησιμοποιήσαμε ανάλυση FACS για τη διερεύνηση της απόπτωσης των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με μια σειρά αντιδραστηρίων. Υπερ-έκφραση του FAF1 επαγόμενη απόπτωση, όπως έκανε και ρύθμιση προς τα κάτω του miR-24. Όταν FAF1 και miR-24-ASO συν-επιμολύνθηκαν σε DU-145 κύτταρα, το ποσοστό απόπτωσης ήταν πολύ υψηλότερη όταν FAF1 διαμολύνθηκε και miR-24 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω ταυτόχρονα, σε σύγκριση με τα αποτελέσματα του επιμόλυνση είτε FAF1 ή miR-24 -ASO μόνο. Πράγματι, απόπτωση που επάγεται από FAF1 θα μπορούσαν να διασωθούν από την υπερ-έκφραση του miR-24 (Σχ. 3). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η απόπτωση που επάγεται από τα κάτω ρύθμιση του miR-24 μπορεί να δράσει μέσω της ρύθμισης του FAF1.

DU-145 κύτταρα κατεργάστηκαν με τις δεικνυόμενες αντιδραστήρια και απόπτωση μετρήθηκε με FACS 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (n = 3 ± SE, *

σ

& lt? 0,01). Δεν έκανε μόνο προς τα κάτω ρύθμιση του miR-24 επάγει απόπτωση, αλλά υπερέκφραση FAF1 επάγεται επίσης απόπτωση στα DU-145 κύτταρα. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων έγινε πολύ υψηλότερη όταν pcDNA3.1-FAF1 και miR-24-ASO συν-επιμολύνθηκαν. Απόπτωση που επάγεται από την υπερ-έκφραση του FAF1 μπορούσαν να διασωθούν από το miR-24-μιμητικό. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η υπερ-έκφραση του miR-24 μπορεί να προστατεύει DU-145 κύτταρα από FAF1 επαγόμενη απόπτωση και ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-24 μπορεί να αυξήσει την απόπτωση που επάγεται από FAF1 σε DU-145 κύτταρα. Φορείς επιμολύνθηκαν σε συγκέντρωση 100 ng ανά φρεάτιο? μιμείται και ASO επιμολύνθηκαν σε συγκέντρωση 20 ηΜ ανά φρεάτιο σε μια 12 φρεατίων πλάκα.

Η

Μετάλλαξη των θέσεων σύνδεσης miR-24 στο FAF1 Gene ευαισθητοποιεί κύτταρα σε απόπτωση

Οι θέσεις σύνδεσης του miR-24 στο FAF1 ORF μεταλλάχθηκαν για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι miR-24 ρυθμίζει απόπτωση σε DU-145 κύτταρα με στόχο την περιοχή ORF του γονιδίου FAF1. Τα αποτελέσματα αυτού του πειράματος δείχνουν ότι DU-145 κυττάρων με μεταλλαγμένο FAF1 ήταν περισσότερο επιρρεπή σε απόπτωση από κύτταρα που περιέχουν το γονίδιο FAF1 άγριου τύπου. Για να καθοριστεί εάν η μεταλλαγμένη FAF1 μπορούσε να ρυθμίζεται από miR-24, ένα μεταλλαγμένο γονίδιο FAF1 και miR-24-μιμητικό συν-επιμολύνθηκαν σε DU-145 κύτταρα. Η υπερ-έκφραση του miR-24 δεν μπόρεσε να διασώσει τα κύτταρα από την απόπτωση που επάγεται από μεταλλαγμένο γονίδιο FAF1 (Εικ. 4). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση μας ότι miR-24 ρυθμίζει την απόπτωση με δέσμευση της περιοχής ORF του γονιδίου FAF1.

DU-145 κύτταρα κατεργάστηκαν όπως υποδεικνύεται και η απόπτωση μετρήθηκε με FACS 36 ώρες μετά την επιμόλυνση (n = 3 ± SE, *

σ

& lt? 0,01, **

σ

& lt? 0,05). Συνώνυμες μεταλλάξεις στα προβλέψει miR-24 θέσεις πρόσδεσης στο FAF1 που προκαλείται υψηλότερα επίπεδα απόπτωσης. Υπερ-έκφραση του miR-24 δεν προστατεύει DU-145 κύτταρα από την απόπτωση που επάγεται από μεταλλαγμένο FAF1. Φορείς επιμολύνθηκαν σε συγκέντρωση 100 ng ανά φρεάτιο? μιμείται και ASO επιμολύνθηκαν σε συγκέντρωση 20 ηΜ ανά φρεάτιο σε μια 12 φρεατίων πλάκα.

Η

miR-24-ASO-Mediated κάτω ρύθμιση των miR-24 επάγει επίσης απόπτωση και επηρεάζει πολλαπλασιασμός σε HGC-27, MGC-803 και HeLa κύτταρα

Είμαστε δίπλα χρησιμοποίησε τον καρκίνο του τραχήλου κυτταρική σειρά HeLa και δύο είδη του ανθρώπινου γαστρικού κυτταρικές γραμμές καρκινώματος (HGC-27 και MGC-803) για να διερευνήσει κατά πόσον miR-24 θα μπορούσε να ρυθμίζουν την απόπτωση σε άλλα καρκινικά κύτταρα. Απόπτωση προκλήθηκε με 20 ηΜ miR-24-ASO χωρίς άλλη επαγωγή μετά από 48 ώρες σε HGC-27 και MGC-803 κύτταρα (Σχ. 5Α). Σε κύτταρα HeLa, απόπτωση επήχθη with1 ηΜ σταυροσπορίνη. Το ποσοστό απόπτωσης σε ήταν πολύ υψηλότερο σε κύτταρα επιμολυσμένα με 20 ηΜ miR-24-ASO ό, τι σε κύτταρα επιμολυσμένα με NC-ASO (Εικ. 5Β). Τα δεδομένα παραπάνω υποδηλώνουν ότι η ρύθμιση της απόπτωσης από miR-24 θα μπορούσε να είναι ένας κοινός μηχανισμός σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων.

(Α) HGC-27 και MGC-803 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 ηΜ miR-24- ASO ή NC-ASO και η απόπτωση μετρήθηκε με FACS με Annexin V και χρώση ιωδιούχου προπιδίου μετά από 48 ώρες (η = 3 ± SE? *

ρ

& lt? 0,01). Κάτω ρύθμιση του miR-24 προκαλούμενη απόπτωση σε HGC-27 και MGC-803 κύτταρα. (Β) Η απόπτωση που επάγεται με 1 μΜ σταυροσπορίνη για 2 ώρες μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση με χρήση 20 ηΜ miR-24-ASO ή NC-ASO (η = 3 ± SE? *

ρ

& lt? 0,01). Η αποπτωτική απόκριση σε σταυροσπορίνη αυξήθηκε μετά από επιμόλυνση με miR-24-ASO.

Η

Συζήτηση

miRNAs είναι γνωστό ότι αναστέλλουν την έκφραση του γονιδίου δια συνδέσεως με τις 3 ‘UTRs των αντιγράφων στόχων τους [34]. Πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι η miRNAs μπορεί επίσης να ρυθμίσει την γονιδιακή έκφραση με ζευγάρωμα βάσεων στην περιοχή CDS των mRNAs στόχου. Για παράδειγμα, το αφήνω-7 miRNA στοχεύει άμεσα το ένζυμο miRNA-επεξεργασίας Dicer με κωδική αλληλουχία της, δημιουργώντας έτσι ένα μηχανισμό για miRNA /Dicer αυτορύθμισης αρνητικό βρόχου ανάδρασης [12] – [14].

Προηγούμενες μελέτες έχουν βρει ότι κάτω ρύθμιση FAF1 μέσω παρεμβολής RNA θα μπορούσε να ενισχύσει την ευαισθησία σε απόπτωση [32]. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το miR-24 δρα ως ενδογενές siRNA για FAF1, και την απόπτωση που προκαλείται από FAF1 μπορεί να διασωθεί από την υπερ-έκφραση του miR-24.

Το κύριο εύρημα της μελέτης αυτής είναι ότι το miR-24 στόχους FAF1 μέσω σύνδεσης με CDS περιοχή του, με τον τρόπο αυτό τη ρύθμιση της απόπτωσης σε DU-145 κύτταρα. Η μελέτη μας υποστηρίζει μια επαυξημένης μοντέλο στο οποίο miRNAs των ζώων μπορεί να ρυθμίσει τα mRNA με σύνδεση προς τους στόχους εξωτερικό, καθώς και μέσα αμετάφραστη περιοχή 3 ‘, και εκτείνεται κατανόησή μας για το πώς miR-24 και FAF1 ρυθμίζουν την απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα.

Η λειτουργία του miRNAs είναι ιδιαίτερα πολύπλοκη, και miR-24 μπορεί να έχει άλλους στόχους εκτός FAF1 που επίσης εμπλέκεται στην επιβίωση των κυττάρων. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι miR-24 καταστέλλει τις φάσεις έναρξης και επιμήκυνσης της μετάφρασης του mRNA που κωδικοποιεί το ρ16 καταστολέα όγκου (ΙΝΚ4 &) [35]. Έχει επίσης βρεθεί ότι miR-24 απαιτείται για να καταστείλει την απόπτωση στον αναπτυσσόμενο νευρικό αμφιβληστροειδή [36]. Έτσι, FAF1 μπορεί να είναι μία από τις πολλές διαφορετικές στόχους του miR-24 που συμβάλλουν στην επίδραση της απόπτωσης.

DU-145 είναι η «κλασική» καρκίνο του προστάτη ανθρώπινη κυτταρική σειρά, που προέρχεται από μια εγκεφαλική μετάσταση. DU-145 κύτταρα έχουν μέτρια μεταστατικό δυναμικό, δεν είναι ορμονο-ευαίσθητος και δεν εκφράζουν PSA (ειδικό προστατικό αντιγόνο) [37] – [39]. Ορμόνες ευαίσθητο καρκίνους προστάτη αντιμετωπίζονται με ορμονική θεραπεία συνήθως δείχνουν καλή πρόγνωση. Ωστόσο, υπάρχουν λίγες αποτελεσματικές θεραπείες για τη θεραπεία των ορμονο-ευαίσθητος καρκίνους του προστάτη που αντιπροσωπεύεται από DU-145 [40]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η υπερ-έκφραση του FAF1 μετά miR-24 κάτω ρύθμιση επαγόμενη απόπτωση σε περίπου 70% των DU-145 κύτταρα μετά από 48 ώρες (Εικ. 3). Αυτό δείχνει ότι miR-24 θα μπορούσε να είναι ένα πολλά υποσχόμενο στόχο θεραπεία στην αντιμετώπιση της ορμόνης-ευαίσθητου καρκίνου του προστάτη.

Επιπλέον, miR-24 είναι ένα από τα πιο άφθονα miRNAs στην τραχηλική καρκινικά κύτταρα [41], και φέρεται επάνω ρυθμισμένη σε στερεά καρκίνος του στομάχου [42]. Άλλες μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι η έκφραση FAF1 είναι μειωμένη σε γαστρικά καρκινώματα σε σύγκριση με μη νεοπλαστικό ιστό, και υπήρχε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της μείωσης της FAF1 και το περιεχόμενο των κυττάρων σφραγιστικό δαχτυλίδι σε γαστρικά καρκινώματα [43]. Οι εκθέσεις αυτές υποδεικνύουν ότι η έκφραση του FAF1 συσχετίζεται αντίστροφα με την ποσότητα του miR-24 σε γαστρικό καρκίνωμα. Η μελέτη μας δείχνει ότι FAF1 είναι ένας άμεσος στόχος του miR-24, και ότι το miR-24 μπορούν να ρυθμίσουν την απόπτωση σε κύτταρα HGC-27, MGC-803 και HeLa. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ρύθμιση της απόπτωσης μέσω miR-24 καταστολή της FAF1 μπορεί να είναι ένας κοινός μηχανισμός σε πολλά διαφορετικά είδη καρκίνων.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι ο παράγοντας FAF1 προ-αποπτωτικών ρυθμίζεται αρνητικά από miR-24 μέσω δύο ειδικά μοτίβα στόχο εντός της περιοχής FAF1 ORF. Επιπλέον, η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-24 επάγει απόπτωση σε DU-145 κύτταρα. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν μια επαυξημένης μοντέλο στο οποίο miRNAs μπορούν να στοχεύσουν άμεσα μεταγραφές εντός κωδική περιοχή τους, και προτείνει μια πλήρη έρευνα για τις ρυθμιστικές στόχους των miRNAs θα πρέπει να επεκταθεί στις περιοχές κωδικοποίησης των γονιδίων. Τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν περαιτέρω miR-24 να είναι ένας πιθανός στόχος για γονιδιακή θεραπεία και φάρμακο για τη θεραπεία ορμονικά μη ευαίσθητου καρκίνου του προστάτη. Όπως παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε HGC-27, MGC-803 και HeLa κύτταρα, υπάρχει επίσης μια ισχυρή λογική για μελλοντικές έρευνες του miR-24 ως θεραπευτική αγωγή για τραχήλου της μήτρας και καρκίνο του στομάχου.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και διαμόλυνση

κυτταρικές σειρές (293Τ, HeLa, HGC-27, MGC-803 και DU-145) λήφθηκαν από την Τράπεζα κυττάρων στην Κίνα Ακαδημία Επιστημών. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM, RPMI-1640 ή DMEM /F12, όλα συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα.

Τα κύτταρα σε περίπου 70% συρροή επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ (Polyplus, για επιμόλυνση με ολιγονουκλεοτίδια μόνο) ή Lipofectamine 2000 (Invitrogen, για διαμόλυνση με πλασμίδια) με διαφορετικές συγκεντρώσεις συνθετικού μιμείται miRNA, αρνητικούς ελέγχους (NC-μιμητικά) (Ambion), συνθετικά LNA-επισημασμένο ολιγο-ριβονουκλεοτίδια, miR-24-ASO και LNA-επισημασμένο NC-ASO (Takara), καθώς και πλασμίδια σύμφωνα με πρότυπα πρωτόκολλα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση για βιοχημικές ή βιολογικές δοκιμασίες. Οι αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιήθηκαν ήταν:

LNA NC-ASO, 5 ‘caCTTATCagtcAGACCAtcGT 3’?

LNA 24 ASO, 5 ‘ctGTTCCTgctgAACTGAgcCA 3’ (μικρά γράμματα δείχνουν τις LNA-επισημασμένο βάσεις).

Κατασκευή πλασμιδίου

Ένας φορέας έκφρασης πρωτεΐνης FAF1 δημιουργήθηκε με PCR κλωνοποίηση FAF1 cDNA (NM_007051) μεταξύ των θέσεων EcoRI και XhoI του pcDNA3.1 (-) (Invitrogen). FAF1 cDNA ενισχύθηκε από μια βιβλιοθήκη cDNA ανθρώπινου χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές:

5′-GAACTCGAGATTGGCGTCCAACATGGAC-3 ‘και 5′-GCGCGAATTCTTACTCTTTTGCTTCAAGG-3’. Πλασμίδια που περιέχουν μεταλλάξεις εντός των θέσεων δέσμευσης του miR-24 κατασκευάστηκαν με μια μέθοδο που βασίζεται στην PCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους μεταλλαγμένων εκκινητών:

FAF1-Mu-Β1-FW: 5′-TTAGCTACCTCACGCAAAATTTTATAACCTGGGCTT-3 ‘

FAF1-Mu-Β1-RV: 5′-TGCGTGAGGTAGCTAACAATGGATTCAGCACAAAG -3 ‘

FAF1-Mu-Β2-FW: 5′-CTCCCTCCGGAACCTAAGGAAGAAAATGCTGAGCCTG-3′

FAF1-Mu-Β2 RV: 5′-TTAGGTTCCGGAGGGAGGGCTTGCTCTAAGGACAG-3 ‘

λουσιφεράσης Δοκιμασία

ΜΙΚ-24 θέσεις πρόσδεσης συντέθηκαν και κλωνοποιήθηκε στην περιοχή 3’UTR του γονιδίου της λουσιφεράσης στον φορέα λουσιφεράσης pGL3 (Promega ). Το ληφθέν κατασκεύασμα συν-επιμολύνθηκαν με PRL-SV40 και miR-24 μιμείται ή μιμητικά NC (Ambion) σε κύτταρα 293Τ όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Μετά από 48 ώρες, η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε ως ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών με το Dual-Luciferase Reporter σύστημα (Promega).

Η απόπτωση Ανάλυση

Κάθε κυτταρική γραμμή επιμολύνθηκε με συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια ή φορείς . Μετά από μία επιπλέον επώαση 36 ή 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και ΡΙΤΟ-επισημασμένο αντι-αννεξίνης-ν αντίσωμα και αναλύθηκαν με FACS.

Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με ένα κύτταρο Μετρώντας Kit-8 (Dojindo). Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων εις τριπλούν σε περίπου 5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης. Στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία, οι αριθμοί των κυττάρων ανά φρεάτιο μετρήθηκαν με την απορρόφηση (450 nm) της μειωμένης WST-8 (2- (2-μεθοξυ-4-νιτροφαινυλ) -3- (4-νιτροφαινυλ) -5- ( 2, 4- δισουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο, μονονάτριο άλας).

Protein Εκχύλιση και Western Blot

τα κύτταρα συλλέχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα SDS φόρτωσης (Sigma). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF. Η μεμβράνη στη συνέχεια μπλοκαρίστηκε με PBST που περιέχει 5% σκόνη γάλακτος για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από υβριδοποίηση όλη την νύχτα στους 4 ° C σε TTBS που περιέχει 1% σκόνη γάλακτος και πρωτεύοντα αντισώματα. Πρωτογενή αντισώματα ανιχνεύθηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Sigma) και χημειοφωταύγειας (Pierce). Τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν:. Κουνελιού αντι-FAF (Cell Signaling Technologies) και GAPDH (Abcam)