Αφηρημένο

Παρά τις πρόσφατες εξελίξεις στη θεραπεία του ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου, η αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας κατά του καρκίνου του παχέος εντέρου είναι ακόμα μη ικανοποιητικός. Στην παρούσα μελέτη, εξετάστηκαν επιδράσεις της ταυτόχρονης αναστολή του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και το DNA μεθυλοτρανσφεράσης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Αποδείξαμε ότι Decitabine (ένας αναστολέας μεθυλοτρανσφεράσης DNA) synergized με gefitinib (ένα αναστολέα EGFR) για τη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών σε SW1116 και τα κύτταρα LOVO. Ωστόσο, ο συνδυασμός των δύο ενώσεων που εμφανίζονται ελάχιστη τοξικότητα σε κύτταρα NCM460, ενός φυσιολογικού ανθρώπινου βλεννογόνου του κόλου επιθηλιακή κυτταρική γραμμή. Ο συνδυασμός ήταν επίσης πιο αποτελεσματική στην αναστολή της ΑΚΤ /mTOR /S6 κινάσης. Επιπλέον, ο συνδυασμός του δεκιταβίνη με gefitinib ανέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση του κόλου καρκινικό κύτταρο. Επιπλέον, gefitinib συνεργικά ενισχυμένη δεκιταβίνη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα οφειλόταν κυρίως σε απόπτωση, όπως φαίνεται από την επισήμανση αννεξίνης V που μετριάζει z-VAD-fmk, ένα τηγάνι αναστολέα κασπάσης. Ταυτοχρόνως, η απόπτωση των κυττάρων που προκύπτουν από τη συν-θεραπεία του gefitinib και δεκιταβίνη συνοδεύτηκε από επαγωγή ΒΑΧ, διασπασμένη κασπάση 3 και διασπασμένη PARP, μαζί με τη μείωση του Bcl-2 σε σύγκριση με τη θεραπεία με κάθε φάρμακο μόνο του. Είναι ενδιαφέρον ότι, η συνδυασμένη θεραπεία με αυτά τα δύο φάρμακα αύξησαν την έκφραση του ΧΙΑΡ σχετιζόμενη παράγοντα 1 (XAF1) τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στην κυτταρική απόπτωση. Η απόπτωση Επιπλέον, μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA) εξάντληση των XAF1 σημαντικά εξασθενημένη καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων που επάγεται από τον συνδυασμό των δύο φαρμάκων. Τα ευρήματά μας πρότεινε ότι gefitinib σε συνδυασμό με δεκιταβίνη εξασκείται αυξημένη απόπτωση των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου είχαν εμπλακεί σε μιτοχονδριακή μεσολάβηση μονοπάτι και επαγωγή της έκφρασης XAF1. Εν κατακλείδι, με βάση τις παρατηρήσεις από τη μελέτη μας, προτείναμε ότι η συνδυασμένη χορήγηση αυτών των δύο φαρμάκων θα μπορούσε να θεωρηθεί ως μια νέα θεραπευτική αγωγή για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Lou Yf, Ζου Zz, Chen Pj , Huang Gb, Li Β, Zheng άς, et al. (2014) Συνδυασμός Gefitinib και μεθυλίωσης του DNA αναστολέα Decitabine Ασκεί Synergistic Αντικαρκινική Δραστηριότητα στον Καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 9 (5): e97719. doi: 10.1371 /journal.pone.0097719

Επιμέλεια: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Ιανουαρίου 2014? Αποδεκτές: 23 του Απρίλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: May 29, 2014

Copyright: © 2014 Lou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από το Normal University Ταμείο Νότιας Κίνας επιστήμη για νέους επιστήμονες (Grant Νο 13KJ19 να Zheng Zhi-Ζου), το Προεδρείο της Dongguan της επιστήμης της πόλης και Τεχνολογίας 2010 κλειδί Ταμείο έργου (Grant Νο 201028 για να Xiao-Yong Luo). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ένας από τους πιο συχνά εμφανιζόμενων όγκων και μια σημαντική αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο, γεγονός που καθιστά επιτακτικότερη την ανάγκη για αποτελεσματικές στρατηγικές για την πρόληψη και τη θεραπεία αυτής της κακοήθειας. Θεραπείες που είναι διαθέσιμες για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου περιλαμβάνουν χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία, χημειοθεραπεία, ανοσορυθμιστική θεραπεία, και μοριακά στοχευμένες θεραπείες όπως αντι-υποδοχέα του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGFR) και αντι-υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) θεραπεία [1], [ ,,,0],2]. Μεταξύ αυτών μοριακά στοχευμένες θεραπείες, που στοχεύουν EGFR θεραπεία ως μία από τις σημαντικές κλινικές στρατηγικές έχει εφαρμοστεί όλο και ευρύτερα σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου [3].

EGFR είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη με έναν εξωκυτταρικό τομέα δέσμευσης του EGF και ενδοκυτταρική περιοχή που περιέχει το πεδίο κινάσης της τυροσίνης που ρυθμίζει οδούς για τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τη διαφοροποίηση, φάρμακα και ακτινοβολία ευαισθησία σηματοδότησης, και την αγγειογένεση [4]. Η έκφραση ενός υψηλού επιπέδου EGFR έχει βρεθεί σε διάφορους τύπους ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου, γαστρικό καρκίνο, καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνο του μαστού, και πλακώδες καρκίνωμα της κεφαλής και του λαιμού [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Η υπερέκφραση και ενεργοποίηση των συστατική EGFR έχουν συσχετιστεί με κακή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Καθώς η ενεργοποίηση του EGFR σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου, ο EGFR έχει ο στόχος των αντικαρκινικών προσπάθειες ανάπτυξης φαρμάκων. Αυτές οι στρατηγικές που στοχεύουν EGFR περιλαμβάνουν τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων, όπως cetuximab, και αναστολείς μικρού μοριακού τυροσινικής κινάσης (TKI), όπως gefitinib και erlotinib. Το gefitinib είναι ένα συνθετικό ανιλινοκουιναζολίνης και από του στόματος ενεργός εκλεκτικός EGFR-ΤΚΙ που μπλοκάρει η οδός μεταγωγής σήματος που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Σε ένα κλινικό περιβάλλον, η θεραπεία gefitinib έχει εγκριθεί για διάφορους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του παχέος εντέρου [11]. Ωστόσο, η αναδυόμενη κλινική εμπειρία έχει απογοητευτικά αποκάλυψε ότι παρά gefitinib επιδεικνύοντας κάποια αντικαρκινική δράση στον καρκίνο του παχέος εντέρου, υπάρχει ένα υψηλό επίπεδο

de novo

αντίσταση σε τέτοια θεραπεία [12]. Ως εκ τούτου, οι προσπάθειες βρίσκονται σε εξέλιξη για την ανάπτυξη της αντι-παχέος εντέρου αγωγές καρκίνου που θα συνδυάζουν gefitinib με άλλα φάρμακα.

Επιγενετική τροποποιήσεις, κυρίως μεθυλίωση του DNA και ιστονών ακετυλίωση, τώρα αναγνωρίζονται ως οι κύριοι μηχανισμοί που συμβάλλουν στην όγκου κακοήθη φαινότυπο [13]. Κατά συνέπεια, έχουν αρκετά φάρμακα που επηρεάζουν επιγενετικές οδοί έχουν εγκριθεί για τη θεραπεία του καρκίνου και περισσότερο βρίσκονται σήμερα σε κλινικές δοκιμές [14], [15]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η αναστρεψιμότητα της επιγενετικές τροποποιήσεις από τους αναστολείς μικρού μορίου σημαίνει ότι εκτός επιδράσεις στόχος θα πρέπει να είναι ελάχιστες και αναστρέψιμες μετά τη διακοπή της θεραπείας. Πρόσφατα, αναστολείς μεθυλτρανσφεράσης DNA είναι σε πιο κλινικά προχωρημένο στάδιο ανάπτυξης από τους αναστολείς των αποακετυλασών ιστόνης ή μεθυλτρανσφεράσες ιστόνης, έχοντας δοκιμαστεί εκτενώς στη φάση Ι-ΙΙΙ κλινικών δοκιμών [16]. Ο αναστολέας αρχέτυπο ϋΝΑ μεθυλτρανσφεράση Decitabine (δηλαδή, 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη), ένα ανάλογο της δεσοξυριβόζης 5-αζακυτιδίνη, επί του παρόντος χρησιμοποιείται για τη θεραπεία του μυελοδυσπλαστικού συνδρόμου (MDS), και είναι υπό έρευνα για την θεραπευτική αγωγή οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας (AML) και άλλα στερεά του καρκίνου [17], [18]. Επιπλέον, Decitabine και suberanilohydroxamic οξύ (SAHA, ένας αναστολέας των αποακετυλασών των ιστονών) συνεργάζονται για την ευαισθητοποίηση του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα να συνδέτη απόπτωση που επάγεται από Fas [19].

Προς το παρόν, σημαντικές προσπάθειες έχουν γίνει για να αναπτύξουν κάποιες αντικαρκινικές θεραπείες που βασίζονται σε τα μικρά μόρια που στοχεύουν ειδικά πρωτεΐνη απομεθυλίωσης DNA ή EGFR, ενώ δεν είναι γνωστές πολλές πληροφορίες σχετικά με τις συνδυασμένες επιδράσεις των αναστολέων EGFR και παράγοντες απομεθυλίωση σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν gefitinib μπορούσαν να υποχωρήσουν αντίσταση χημειοθεραπεία μέσω της αναστολής διαμεμβρανική μεταφορείς της οικογένειας ABC, συμπεριλαμβανομένης της Ρ-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp), η πρωτεΐνη πολυφαρμακευτικής αντίστασης 1 (MRP1) και η πρωτεΐνη αντοχής στον καρκίνο του μαστού (BCRP) [20]. Με βάση αυτές τις εγκαταστάσεις, αποφασίσαμε να καθορίσει εάν ο συνδυασμός των gefitinib και Decitabine έχει συνεργική δράση στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

Στην παρούσα μελέτη, υπό τον όρο προκλινικά δεδομένα που έδειξε το συνδυασμό των gefitinib και Decitabine ήταν συνεργιστική σε αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, μετανάστευση και επάγει απόπτωση σε καλλιεργημένα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. Επιπλέον, παρέχονται τα αποδεικτικά στοιχεία ότι το gefitinib σε συνδυασμό με Decitabine ρυθμίζεται κυτταρική απόπτωση συμμετείχαν στο μιτοχονδριακό μεσολάβηση της οδού και την επαγωγή της έκφρασης XAF1. Στο σύνολό τους, αυτά συσσωρεύονται τα δεδομένα μπορεί να καθοδηγήσει την ανάπτυξη νέων θεραπειών για τον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture, Αντιδραστήρια και τα ναρκωτικά Θεραπεία

Ο καρκίνος που προέρχονται από κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου SW1116 και LOVO ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και αναπτύχθηκαν σε μέσο DMEM (Gibco? ϋίβ Technologies, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) (Gibco? Technologies Life, Carlsbad, CA) στους 37 ° C σε 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μονοστιβάδα και περάστηκαν ρουτίνας 2-3 φορές την εβδομάδα. Decitabine και gefitinib αγοράστηκαν από Σέλεκ Chemicals LLC (Houston TX, USA). ΜΤΤ [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου], διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), το Ζ-Val-Ala-Asp-φθορομεθυλοκετόνη (z-VAD-fmk), necrostatin-1 , necrostatin-5 αγοράστηκαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). Για τη θεραπεία των ναρκωτικών, δεκιταβίνη, gefitinib, z-VAD-fmk, necrostatin-1, και necrostatin-5 διαλύθηκαν σε DMSO αντίστοιχα, δείγματα φυλάχθηκαν στους -80 ° C. Στοκ διαλύματα αραιώθηκαν στις επιθυμητές τελικές συγκεντρώσεις με μέσο ανάπτυξης μόλις πριν από τη χρήση. Πριν από τη θεραπεία φαρμάκων, τα κύτταρα επωάστηκαν για τουλάχιστον 12 ώρες και στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με μέσο που περιείχε τα φάρμακα? κύτταρα DMSO-αγωγή χρησιμοποιήθηκαν ως εικονικές ελέγχου.

Βιωσιμότητας Κυττάρων, Κλωνογόνος Επιβίωση κυττάρων και την απόπτωση Δοκιμασίες

Κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας πρότυπη δοκιμασία ΜΤΤ. Εν συντομία, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 0,5-1 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάζονται για 12 ώρες σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C πριν από τη θεραπεία του εκτίθενται σε ναρκωτικά. Τα μέσα στη συνέχεια απομακρύνθηκαν, και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δεκιταβίνη και /ή gefitinib. Αφού τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες, 100 μL διαλυμάτων ΜΤΤ (2 mg /mL) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και η πλάκα επωάστηκε για άλλες 4 ώρες στους 37 ° C. Οι σχηματισθέντες κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν εντός DMSO (200 μL ανά φρεάτιο) με συνεχή ανακίνηση για 5 λεπτά. Η απορρόφηση του διαλύματος μετρήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ένα αναγνώστη Micro-πλάκα (Bio-Rad, Hercules, CA) στα 495 nm. Αυτή η δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν

Για πειράματα κλωνογονική επιβίωση των κυττάρων, τα συνδεδεμένα κύτταρα από τον ίδιο δίσκο των 10 εκ καλλιέργειας που θρυψινοποιήθηκαν με 1 mL τρυψίνη-ΕϋΤΑ. (Gibco? Life Technologies, Carlsbad, CA) και αδρανοποιημένο με μέσα που περιέχουν 10% FBS. Τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο και επιστρώθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα (1000 ανά φρεάτιο σε έξι φρεατίων). Μετά από 24 ώρες, τα φάρμακα προστέθηκαν σε ένδειξη συγκέντρωσης για 24 ώρες. Μετά την απομάκρυνση των ναρκωτικών, τα κύτταρα αφέθηκαν να πολλαπλασιαστούν σε υγροποιημένη 5%

2, 37 ° C περιβάλλοντος CO για 15 ημέρες σε φρέσκο ​​μέσο. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με 0,005% κρυσταλλικό ιώδες (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) για ανάλυση των κλωνογόνων επιβίωσης των κυττάρων, όπως περιγράφεται προηγουμένως [21]. Η μονάδες σχηματισμού με περισσότερα από 100 κύτταρα αποικία μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός.

Μέτρηση της απόπτωσης διεξήχθη με Annexin V-FITC (ισοθειοκυανική φλουορεσκεϊνη) /ΡΙ (ιωδιούχο προπίδιο) ανάλυση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν και αγωγή με τα φάρμακα για 48 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και 1 × 10

6 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 1 mL 1 ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης αννεξίνης V ×. Τα κύτταρα που υποβάλλονται σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο αναλύθηκαν μετρώντας τα κύτταρα που χρωματίζονται θετικά για αννεξίνη V-FITC και αρνητικά για ΡΙ, και όψιμου σταδίου απόπτωσης όπως αννεξίνης V-FITC και ΡΙ θετικά χρησιμοποιώντας ροής FACS Calibur κυτταρόμετρο (BD Biosciences, San Jose, CA , USA).

Δείκτη συνδυασμού

για συνδυασμένη θεραπεία του δεκιταβίνη και gefitinib, δεδομένα προσδιορισμού ΜΤΤ μετατράπηκαν σε κλάσμα της ανάπτυξης επηρεάζεται από το άτομο φάρμακο ή τα κύτταρα έλαβαν συνδυασμό σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CalcuSyn (Biosoft, Ferguson, ΜΟ, USA) για να προσδιοριστεί εάν ο συνδυασμός ήταν συνεργιστικός. Το πρόγραμμα αυτό βασίζεται στην εξίσωση Chou-Talalay [23], η οποία υπολογίζει ένα δείκτη συνδυασμού (CI). Η γενική εξίσωση για την κλασική ισοβολόγραμμα δίνεται από: CI = (D)

1 /(Dx)

1+ (D)

2 /(Dx)

2. Όταν Dx υποδεικνύει την δόση μιας ένωσης μόνης απαιτείται για να παραχθεί ένα αποτέλεσμα, (D)

1 και (D)

2 είναι οι δόσεις των ενώσεων 1 και 2, αντίστοιχα, είναι απαραίτητο για να παραχθεί το ίδιο αποτέλεσμα σε συνδυασμό. Από την ανάλυση αυτή, οι συνδυασμένες επιπτώσεις των δύο ενώσεων μπορούν να συνοψιστούν ως εξής: CI & lt? 1, CI = 1, Γ & gt? 1 δείχνουν συνεργιστική, πρόσθετης ύλης και ανταγωνιστικά αποτελέσματα, αντίστοιχα

Ανάλυση Western Blot

.

τα κύτταρα λύθηκαν επί πάγου για 30 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% δεοξυχολικό οξύ, 0,02% αζίδιο του νατρίου, 1% ΝΡ-40, 2,0 mg /mL απροτινίνη, 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο). Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 12.000 rpm για 30 λεπτά στους 4 ° C. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bradford χρωστικής. Ίσες ποσότητες (30 έως 60 μg) του κυτταρικού εκχυλίσματος υπεβλήθησαν σε ηλεκτροφόρηση σε 6-12,5% δωδεκύλο θειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore, Darmstadt, Γερμανία) για κηλίδωση αντισώματος. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν και στη συνέχεια επωάζονται με ρ-mTOR (Ser2448), mTOR, ΑΚΤ1, ρ-ΑΚΤ (Ser473), ρ-S6K, S6K, ΒΑΧ, Bcl-2, διασπασμένη κασπάση 3 (Asp175), διασπασμένη PARP (Asp214) και αντισώματα ακτίνης (όλα από την Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA). Και τα αντισώματα XAF1, ΧΙΑΡ αγοράστηκαν από Abcam (Cambridge, υ.Κ.). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες επωάστηκαν με ένα συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα (Protein Tech Group, Chicago, IL) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με το κιτ ECL (GE Healthcare? Μόναχο, Γερμανία)., Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή

Δοκιμασία Caspase Δραστηριότητα

φθορομετρικές δοκιμασίες δραστικότητας κασπάσης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα Ac -DEVD-AMC (BD Pharmingen, San Diego, CA) για κασπάσης 3 και Ac-IETD-AMC (BD Pharmingen, San Diego, CA) για κασπάσης 8. εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (10 mM HEPES, 142 mM ΚΟΙ, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0.2% ΝΡ-40 και ρΗ 7,2) με 10 mM DTT. Μετά την επώαση για 30 λεπτά σε πάγο, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 12.000 rpm για 30 λεπτά στους 4 ° C και η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη στα υπερκείμενα προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bradford χρωστικής. Κλάσματα των 10 mg /όγκο δοκιμασίας 100 mL επωάστηκαν με 140 mM site-specific τετραπεπτίδιο υποστρώματα Ac-DEVD-AMC για κασπάσης 3 και Ac-IETD-AMC για κασπάσης 8 με ρυθμιστικό δοκιμασίας κασπάσης (20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,01% (w /v) CHAPS, 10% (β /ο) σακχαρόζη και ρΗ 7,2) με 10 mM DTT για 30 λεπτά. Η απελευθέρωση του φθορογόνου ομάδα AMC προσδιορίστηκε στους 37 ° C σε ένα VersaFluor φθοριόμετρο (Bio-Rad, Hercules, CA) με διέγερση στα 380 nm και εκπομπή στα 440 nm.

παρεμβολή RNA

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) για προς τα κάτω ρύθμιση έκφρασης γονιδίου XAF1 έγινε με επιμόλυνση του RNA ολιγονουκλεοτιδίων με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση, SW1116 και LOVO κύτταρα απλώθηκαν σε ένα δίσκο καλλιέργειας 35 mm σε RPMI-1640 πλήρες μέσο. Αφού τα κύτταρα φθάσουν το 50% -60% συρροή, αυτά επιμολύνθηκαν με τα siRNA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 1 mL siRNA μίγματος με 100 ηΜ siRNA και 5 μL λιποφεκταμίνης 2000. Μετά από 8 ώρες από την επιμόλυνση, 1 mL RPMI-1640 πλήρες μέσο προστέθηκε, και τα πειράματα διεξήχθησαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα επίπεδα πρωτεΐνης αναλύθηκαν με κηλίδα Western. Το αρνητικό έλεγχο (NC) siRNA και siRNA εναντίον XAF1 συντέθηκαν από την Σαγκάη GenePharma Co. Για XAF1: 5′-AUGUUGUCCAGACUCAGAG-3 ‘[25]?

Εκχύλιση του ολικού RNA και σε πραγματικό χρόνο Ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής

Ολικό RNA εκχυλίστηκε με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA παρασκευάστηκε από ολικό RNA χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές (Promega, Madison, USA) και το κιτ Omniscript RT (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Τα σχετικά επίπεδα του mRNA προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (RT-PCR) χρησιμοποιώντας ένα Eppendorf Realplex Mastercycler (Eppendorf, Hamburg, Germany) και κιτ Quantitect SYBR Green PCR (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). XAF1 Primer αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως εξής: 5′-ATGGAAGGAGACTTCTCGGT-3 ‘και 5′-TTGCTGAGCTGCATGTCCAG-3’ [26]. Ακτίνης (BioVision, Palo Alto, CA, USA) τα επίπεδα mRNA χρησιμοποιήθηκαν για την κανονικοποίηση.

Στατιστικά

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD.

P

τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας t δοκιμασία του μαθητή και

P

αξία & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Η στατιστική ανάλυση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το στατιστικό πακέτο για Κοινωνικές Επιστήμες (SPSS) λογισμικού (έκδοση 16.0).

Αποτελέσματα

Synergistic Αντινεοπλασματικά αποτελέσματα που προκαλούνται από Decitabine και Gefitinib στον Καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

για τον προσδιορισμό των αποτελεσμάτων της θεραπείας συνδυασμού ϋΝΑ μεθυλτρανσφεράση δεκιταβίνη αναστολέα και αναστολέα EGFR gefitinib επί ανθρώπινου κόλον βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων, SW1116 [27] και τα κύτταρα LOVO [28] που μεταφέρουν άγριου τύπου

EGFR

γονίδιο εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις δεκιταβίνη ή μόνα τους ή σε συνδυασμό για μέχρι και 48 ώρες gefitinib, ακολουθούμενη από τον προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων με χρήση του προσδιορισμού ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α και Β, Decitabine ή gefitinib και μόνο προκάλεσε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστολή της βιωσιμότητας κυττάρων με IC

50 τιμές του 24,2 μΜ (Decitabine) και 4,71 μΜ (gefitinib) σε κύτταρα SW1116, και IC

50 τιμές του 21,9 μΜ ( δεκιταβίνη) και 5,33 μΜ (gefitinib) σε κύτταρα LOVO. Επιπλέον, το Σχ. 1Α και Β έδειξαν ότι ένας συνδυασμός δεκιταβίνη και gefitinib είχε ισχυρότερη ανασταλτική επίδραση στην κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων SW1116 και LOVO, είτε από ένωση μόνη. Επιπροσθέτως, η Εικ. 1Α έδειξε ότι η θεραπεία των κυττάρων SW1116 με σταθερές συγκεντρώσεις δεκιταβίνη μείωσε το IC

50 τιμές του gefitinib από 4,71 μΜ (σε απουσία δεκιταβίνη) έως 1,25 μΜ (παρουσία 5 μΜ δεκιταβίνη) και 0,19 μΜ (στην παρουσία 10 μΜ δεκιταβίνη). Παρομοίως, κατεργασία των κυττάρων LOVO με σταθερές συγκεντρώσεις δεκιταβίνη μειώθηκε το IC

50 τιμές του gefitinib από 5,33 μΜ (σε απουσία δεκιταβίνη) έως 0,63 μΜ (με την παρουσία 10 μΜ δεκιταβίνη) και 0,12 μΜ (παρουσία 20 μΜ δεκιταβίνη) (Σχ. 1Β).

(Α) και (Β) SW1116 και LOVO κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες ελέγχου (DMSO) ή παρουσία των υποδεικνυόμενων συγκεντρώσεων Decitabine (DAC) και gefitinib (GEF), μόνο του ή σε συνδυασμό, για 48 ώρες, και στη συνέχεια αξιολογούνται για βιωσιμότητα με δοκιμασία ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα είναι μέσα διπλούν εκτιμήσεων από ένα από τα τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Γ) και (Δ) κύτταρα SW1116 και LOVO κύτταρα απλώνονται, η επεξεργασία, και σε επεξεργασία όπως στο Α και Β Η καμπύλη δόσης-απόκρισης του κάθε φαρμάκου προσδιορίστηκε και ο συνδυασμός του δείκτη (CI) τιμές για αναλογίες συγκέντρωσης DAC /GEF (2,5 :1 σε κύτταρα SW1116, 2:01 σε κύτταρα LOVO) υπολογίστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο του Chou-Talalay κατά τη χρονική στιγμή 48 ώρες, με το βιολογικό απόκριση εκφράζεται ως το κλάσμα των κυττάρων που επηρεάζονται. Ορθογώνιο σύμβολο και το σύμβολο διαμάντι ορίσει την τιμή CI για κάθε κλάσμα που πλήττονται (επίδραση). CI & lt? 1, CI = 1, Γ & gt? 1 δείχνουν συνεργιστική, πρόσθετης ύλης και ανταγωνιστικά αποτελέσματα, αντίστοιχα. Η επίδραση κυμαίνεται από 0 (καμία αναστολή) έως 1 (πλήρης αναστολή). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Ε) Επίδραση των κυττάρων SW1116 και κυττάρων LOVO για τον αριθμό των κυττάρων σχηματισμού αποικίας, όπως αξιολογείται από κλωνογόνο προσδιορισμό. Για δοκιμασία σχηματισμού αποικιών, η κλωνογονική δοκιμασία έγινε όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Στήλες, σημαίνει τριών προσδιορισμών? μπαρ, SD. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001, σε σύγκριση με το DAC-επεξεργασμένα κύτταρα. ##,

P

& lt? 0,01, ###,

P

& lt?. 0.001, σε σύγκριση με το GEF-επεξεργασμένα κύτταρα

Η

Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η δύο ενώσεις, δεκιταβίνη και gefitinib, ίσως συνεργούν για την αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Για να επιβεβαιωθεί αυτό το συνεργισμό, υποβάλλαμε σε αγωγή κυττάρων με ένα συνδυασμό των δύο παραγόντων σε μια σταθερή αναλογία μεταξύ τους και να χρησιμοποιηθούν λογισμικό CalcuSyn για τον υπολογισμό του δείκτη συνδυασμού (CI) ακολουθώντας τη μέθοδο των Chou και Talalay, όπως περιγράφεται υπό Μέθοδοι. Σύκο. 1C και D αποκάλυψε μια σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο παραγόντων (CI & lt? 1) στην SW1116 και τα κύτταρα LOVO. Επιπλέον, με τη δοκιμασία κλωνογονική επιβίωση των κυττάρων, βρήκαμε ότι δεκιταβίνη και gefitinib ασκείται συνεργιστικά αποτελέσματα για να αναστέλλουν την κλωνογόνο δραστικότητα των SW1116 και κυττάρων LOVO (Εικ. 1 Ε). Περαιτέρω, τα λίγα κύτταρα που επιβιώνουν δεκιταβίνη συν gefitinib δημιουργούνται αποικίες που ήταν πολύ μικρότερα σε μέγεθος από εκείνα που δημιουργούνται από τα κύτταρα που επιβιώνουν είτε από αυτούς τους παράγοντες μόνο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αξίζει να σημειωθεί ότι, όταν χρησιμοποιούνται μαζί, η θεραπεία των κυττάρων NCM460, ένα φυσιολογικό ανθρώπινο κόλον βλεννογονικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή, με δεκιταβίνη και gefitinib έδειξαν επίδραση μεγαλύτερη από όταν κάθε ένωση χρησιμοποιήθηκε μεμονωμένα, αλλά τα αποτελέσματα ήταν λιγότερο από προσθετικό υποδηλώνοντας ανταγωνισμό (Εικ. S1 Α και Β ). Επιπλέον, ο συνδυασμός της χαμηλής συγκέντρωσης του Decitabine (2,5 μΜ) και gefitinib (1 μΜ για τα κύτταρα LOVO και 0,5 μΜ για τα κύτταρα SW1116) αποδοτικά κατήργησε την κυτταρική μετανάστευση σε ένα συνεργικό τρόπο (Εικ. S2A). Εν τω μεταξύ, ανιχνεύσαμε την κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων καρκίνου του κόλου σε επεξεργασία με τη χρήση των δύο παραγόντων μόνο ή σε συνδυασμό (Εικ. S2B), και βρήκαν ότι ο συνδυασμός χαμηλής συγκέντρωσης δεκιταβίνη και gefitinib δεν μειώθηκαν σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μείωση των κυττάρων μετανάστευση που προκαλείται από τα δύο φάρμακα δεν συμμετείχε στην αναστολή της κυτταρικής βιωσιμότητας.

Decitabine και Gefitinib Συνδυασμός θεραπεία είναι πιο αποτελεσματική στην αναστολή της ΑΚΤ και mTOR μονοπάτια σηματοδότησης στον Καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

Decitabine και gefitinib ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των δύο τύπων καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων σε σύγκριση με τη θεραπεία με κάθε παράγοντα ξεχωριστά. Όπως ΑΚΤ και mTOR μονοπάτια σηματοδότησης παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη και την κυτταρική απόπτωση, προσδιορίσαμε τις επιδράσεις της δεκιταβίνη και gefitinib στην ενεργοποίηση αυτών των οδών. Υπολογίσαμε τις τιμές CI να βρει περαιτέρω ότι ο συνδυασμός 10 μΜ δεκιταβίνη με 5 μΜ gefitinib σε κύτταρα SW1116 ή 4 μΜ gefitinib σε κύτταρα LOVO ήταν η πιο αποτελεσματική. SW1116 και LOVO κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δεκιταβίνη και gefitinib είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για στύπωμα Western όπως περιγράφεται στο μεθόδους. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α και Β, Decitabine (10 μΜ) δεν θα μπορούσε να οδηγήσει σε σημαντικές αλλαγές στην AKT, ή δραστηριότητα mTOR, όπως αξιολογείται με κηλίδα Western για την φωσφορυλίωση της ΑΚΤ, mTOR και S6K. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ελάχιστη μείωση της φωσφορυλίωσης της ΑΚΤ, mTOR και S6K με 5 μΜ gefitinib στο SW1116 και 4 μΜ σε κύτταρα LOVO. Ωστόσο, ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων καταργείται τελείως δραστηριότητες ΑΚΤ και mTOR σε SW1116 και κυττάρων LOVO (Σχ. 2Α και Β).

(Α) και (Β) SW1116 και LOVO κύτταρα απλώνονται, σε θεραπεία για 48 h με Decitabine (DAC) και gefitinib (GEF) είτε μόνο του ή σε συνδυασμό, και τα επίπεδα έκφρασης του ΑΚΤ, mTOR, S6K, και φωσφορυλίωση προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western, όπως περιγράφεται υπό Μέθοδοι. Έκφραση της β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Decitabine αυξάνει συνεργικά Gefitinib επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

Για να προσδιοριστεί εάν τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του gefitinib σε συνδυασμό με Decitabine ήταν λόγω της επαγωγής της απόπτωσης, SW1116 και LOVO κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις δύο ενώσεις, μόνη ή σε συνδυασμό, για 48 ώρες και στη συνέχεια την κυτταρική απόπτωση προσδιορίστηκε με Annexin V-FITC και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α και C, η θεραπεία με gefitinib (2 μΜ ή 5 μΜ) ή δεκιταβίνη (10 μΜ) είχε μόνος ασθενή δράση στην απόπτωση σε κύτταρα SW1116. Ωστόσο, υπήρχε ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό απόπτωσης βρέθηκε κατά την κατεργασία με το συνδυασμό του gefitinib και δεκιταβίνη (Σχ. 3Α και C). Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν σε κύτταρα LOVO (Σχ. 3Β και C). Επιπλέον, η κυτταρική απόπτωση μετρήθηκε με ανίχνευση πληθυσμού υπο-G1 με χρώση ΡΙ και κυτταρομετρία ροής αναλύσεις. Όπως φαίνεται στο Σχ. S3, τα ποσοστά του πληθυσμού υπο-G1 που επάγεται από τις κατεργασίες με τον συνδυασμό δύο φαρμάκων ήταν μεγαλύτερες από εκείνες που προκαλούνται από τα φάρμακα ξεχωριστά.

(Α) και (Β) SW1116 και τα κύτταρα LOVO καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες ελέγχου ( DMSO) ή παρουσία των υποδεικνυόμενων συγκεντρώσεων Decitabine (DAC) και gefitinib (GEF), μόνο του ή σε συνδυασμό, για 48 ώρες. Και στη συνέχεια τα κύτταρα βάφτηκαν με Αννεξίνη V-FITC και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Αυτό το πείραμα έγινε εις τριπλούν και αντιπροσωπευτικά διαγράμματα αννεξίνης δοκιμασίες V-FITC απεικονίζονται. (Γ) Η ποσοτική μέτρηση της ροής αννεξίνης V-FITC κυτταρομετρίας αναλύσεις έδειξαν θετικά αποπτωτικών κυττάρων σε απόκριση προς DAC και GEF, μόνα τους ή σε συνδυασμό. Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD. **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001, σε σύγκριση με το DAC-επεξεργασμένα κύτταρα. ##,

P

& lt? 0,01, ###,

P

& lt? 0.001, σε σύγκριση με το GEF-επεξεργασμένα κύτταρα. (Δ) και (Ε) SW1116 και LOVO κύτταρα προ-επεξεργασία με 10 μΜ z-VAD-fmk (zVAD) ή 20 μΜ necrostatin-1 (Nec1) ή necrostatin-5 (Nec5) επί 1 ώρα ακολουθούμενη από επεξεργασία με το υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της DAC και GEF, μόνος ή σε συνδυασμό, για επιπλέον 48 ώρες. Και στη συνέχεια τα αποπτωτικά κύτταρα προσδιορίστηκαν με Annexin V-FITC /χρώση ΡΙ και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD. **

P

& lt?. 0.01

Η

Για να καθοριστεί εάν ή όχι gefitinib συν Decitabine προκαλείται κασπάσης καταρράκτη, χρησιμοποιήθηκε το τηγάνι αναστολέας κασπάσης z-VAD-fmk (10 μΜ) να επεξεργάζονται SW1116 ή LOVO κύτταρα πριν από τη θεραπεία του gefitinib συν Decitabine. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3D και Ε, Ζ-VAD-fmk μπορούσε αξιοσημείωτα συγκρατήσει την απόπτωση κυττάρων που προκαλείται από το gefitinib συν δεκιταβίνη. Ωστόσο, η απόπτωση των κυττάρων που ενεργοποιούνται με τις δύο ενώσεις σε συνδυασμό δεν θα μπορούσε να αποκλειστεί από necrostatin-1 ή necrostatin-5, μία νέα κατηγορία ισχυρών αναστολέων μικρών μορίων της κυτταρικής νέκρωσης. Αυτά τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι το αποπτωτικό μονοπάτι είχε εμπλακεί στο θάνατο κυττάρου που διεγείρεται από gefitinib σε συνδυασμό με δεκιταβίνη, σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

Decitabine και Gefitinib Θεραπεία Συνδυασμού μεταβάλλει τα επίπεδα έκφρασης των αποπτωτικών ρυθμιστικών παραγόντων σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου

Δεδομένου ότι η απόπτωση ρυθμίζεται στενά από προ- και αντι-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών Bcl-2, οι προ-αποπτωτικών παραγόντων ΒΑΧ, BID και ΒΙΜ καθώς αντιαποπτωτικού πρωτεΐνες Bcl-2 και Bcl-XL μελετήθηκαν σε SW1116 και LOVO κύτταρα μετά από θεραπεία με δεκιταβίνη ή gefitinib ή ο συνδυασμός τους με ανάλυση αποτύπωσης Western. SW1116 και LOVO κύτταρα ανταποκρίνονται σε δεκιταβίνη συν gefitinib εκδηλώνεται αυξημένες ποσότητες της προαποπτωτικών ΒΑΧ, καθώς και σημαντική μείωση στα επίπεδα των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 (Σχ. 4Α και Β). Ωστόσο, οι δύο ενώσεις σε συνδυασμό απέτυχαν να επηρεάσουν τα επίπεδα έκφρασης των άλλων μελών της οικογένειας πρωτεϊνών Bcl-2, συμπεριλαμβανομένων των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών BID και ΒΙΜ καθώς αντιαποπτωτικό πρωτεΐνη Bcl-XL (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

SW1116 και LOVO κύτταρα απλώνονται, αγωγή για 48 (DAC) και gefitinib (GEF) είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό. (Α) και (Β) τα επίπεδα έκφρασης διασπώνται-κασπάσης 3, διασπασμένη PARP-, XAF1, ΧΙΑΡ, ΒΑΧ, Bcl-2 προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western, όπως περιγράφεται υπό Μέθοδοι. Έκφραση της β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) και (Δ) Η δραστηριότητα κασπάσης 3 ποσοτικοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο μεθόδους. Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001. (Ε) και (ΣΤ) Η δραστηριότητα κασπάσης 8 ποσοτικοποιήθηκε όπως περιγράφεται υπό το Μέθοδοι. Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt?. 0.001

Η

αναστολέας της πρωτεΐνης απόπτωσης (ΙΑΡ) είναι μια οικογένεια πρωτεϊνών που δρουν μέσω της αναστολής της δραστηριότητας κασπάσης. Το Χ-συνδεδεμένο ΙΑΡ (ΧΙΑΡ), ένα μέλος του ΙΑΡ, και ΧΙΑΡ-σχετίζεται παράγοντας 1 (XAF1) εξετάστηκαν σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα διεγερμένα με δεκιταβίνη μαζί με gefitinib. Σύκο. 4Α και Β έδειξαν ότι καμία αλλαγή στα επίπεδα πρωτεΐνης ΧΙΑΡ βρέθηκαν στην SW1116 και LOVO κύτταρα επεξεργασμένα με δεκιταβίνη και gefitinib μόνα τους ή σε συνδυασμό. Ειδικότερα, η συνδυασμένη θεραπεία με δύο φάρμακα αύξησε αξιοσημείωτα την έκφραση των XAF1 σύγκριση με την θεραπεία απλού παράγοντα (Εικ. 4Α και Β).

Για να ελεγχθεί η ικανότητα των gefitinib συνδυασμό με δεκιταβίνη να ενεργοποιήσει κασπάσες, διασπασμένη κασπάση 3 και διασπάται PARP μελετήθηκαν σε κύτταρα SW1116 και LOVO μετά τη θεραπεία με gefitinib ή δεκιταβίνη ή ο συνδυασμός τους με ανάλυση αποτύπωσης Western. Σημαντική αύξηση των ποσών των δύο διασπασμένη κασπάση 3 και διασπασμένη PARP παρατηρήθηκαν σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου σε επεξεργασία με δύο φάρμακα σε συνδυασμό σε σύγκριση με τη θεραπεία με απλούς παράγοντες (Εικ. 4Α και Β). Επιπλέον, ο καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρα κατεργάζονται με τις δύο ενώσεις αναλύθηκαν για κασπάσης 3 και κασπάση 8 δραστηριοτήτων από φθορισμογόνο υπόστρωμα διάσπασης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4C και D, ο καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρα κατεργασμένα με δύο ενώσεων σε συνδυασμό παρουσίασαν σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα της κασπάσης 3. Επιπλέον, δεκιταβίνη συν gefitinib ασκείται χρονικά εξαρτώμενη κασπάσης 3 επαγωγές δραστικότητα επί SW1116 και τα κύτταρα LOVO (Σχ. 4C και D). Αντίθετα, δεν βρέθηκαν αλλαγές στο κασπάσης 8 δραστηριότητες (Εικ. 4Ε και F).

XAF1 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην κυτταρική απόπτωση Διέγερση από Decitabine συνδυασμό με Gefitinib

Τα στοιχεία που παρουσιάζονται παραπάνω αναφέρεται ότι Decitabine σε συνδυασμό με gefitinib αύξησε τα επίπεδα XAF1 στα κύτταρα SW1116 και LOVO. Στη συνέχεια ρώτησε αν τα δύο φάρμακα σε συνδυασμό θα μπορούσαν να ενισχύσουν τα επίπεδα XAF1 mRNA σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α και Β, τα επίπεδα XAF1 mRNA αυξήθηκαν σημαντικά από Decitabine συν gefitinib. Επιπλέον, ο καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με τα δύο φάρμακα σε συνδυασμό για διαφορετικά χρονικά διαστήματα. Δείξαμε ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης και mRNA XAF1 αυξήθηκαν κατά δεκιταβίνη συν gefitinib σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 5C, D, Ε και F).

(Α) και (Β) SW1116 και LOVO κύτταρα ήταν αγωγή για 48 ώρες με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις Decitabine (DAC) και gefitinib (GEF) είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της XAF1 προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR. Έκφραση της β-ακτίνης χρησίμευσε ως έλεγχος. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD. **

P

& lt? 0,01? **

P

& lt? 0.001. (Γ) και (Δ) SW1116 και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία LOVO για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις DAC και GEF σε συνδυασμό. Τα επίπεδα έκφρασης του XAF1 προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western, όπως περιγράφεται στο μεθόδους. Έκφραση της β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. μπαρ, SD. μπαρ, SD. Όπως φαίνεται στο Σχ. μπαρ, SD.