Αφηρημένο

NQO1 είναι μια αναδυόμενη και πολλά υποσχόμενη θεραπευτικός στόχος στη θεραπεία του καρκίνου . Αυτή η μελέτη ήταν να προσδιοριστεί αν η δράση κατά του όγκου του ΙΙΑ Tanshinone (TSA) εξαρτάται NQO1 και για τη διαλεύκανση των υποκείμενων οδούς θανάτου αποπτωτικού κυττάρου. NQO1

+ κύτταρα Α549 και isogenically συμφωνημένα NQO1 επιμολυσμένα και αρνητικά κύτταρα Η596 χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο των ιδιοτήτων και των μηχανισμών του TSA επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Η in νίνο αποτελεσματικότητα κατά του όγκου και οι ιδιότητες κατανομής στους ιστούς του TSA ελέγχθηκαν σε όγκο ξενομοσχεύτηκε γυμνούς ποντικούς. Παρατηρήσαμε ότι TSA προκάλεσε μια υπερβολική παραγωγή ROS, βλάβης του DNA, και δραματική αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε NQO1

+ κύτταρα Α549 και Η596-NQO 1 κύτταρα, αλλά όχι σε NQO1

– κύτταρα Η596. Αναστολή ή σιωπή του NQO 1, καθώς και το αντιοξειδωτικό NAC αναστραφεί σημαντικά TSA προκαλούμενη αποπτωτικά αποτελέσματα. θεραπεία TSA καθυστερεί σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου των ξενομοσχευμάτων Α549 όγκου, η οποία ήταν σημαντικά ανταγωνίζεται από δικουμαρόλη συν-θεραπεία, παρά τις αυξημένες και παρατεταμένη συσσωρεύσεις TSA σε ιστούς όγκων. TSA ενεργοποιείται ένας ROS ενεργοποιείται, ρ53 ανεξάρτητη και εξαρτώμενη από κασπάση μιτοχόνδρια αποπτωτικό μονοπάτι κυτταρικού θανάτου που χαρακτηρίζεται με αυξημένη αναλογία του Βαχ προς Bcl-XL, μιτοχονδριακό δυναμικό διάρρηξη της μεμβράνης, απελευθέρωση κυτοχρώματος c, και την επακόλουθη ενεργοποίηση της κασπάσης και PARP-1 διάσπασης. Τα αποτελέσματα αυτών των ευρημάτων υποδηλώνουν ότι η TSA είναι ένα πολύ συγκεκριμένο παράγοντα στόχου NQO1 και είναι πολλά υποσχόμενη για την ανάπτυξη ως ένα αποτελεσματικό φάρμακο στη θεραπεία του NQO1 θετικό NSCLC

Παράθεση:. Liu F, Yu G, Wang G, Liu Η Γου Χ, Wang Q, et al. (2012) Μια NQO1-Ξεκίνησε και p53-Ανεξάρτητη αποπτωτικό μονοπάτι Καθορίζει το Anti-Tumor Επίδραση της Tanshinone ΙΙΑ εναντίον μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (7): e42138. doi: 10.1371 /journal.pone.0042138

Επιμέλεια: Siyaram Pandey, Πανεπιστήμιο του Windsor, Καναδάς

Ελήφθη: 16 του Μάρτη του 2012? Αποδεκτές: 2 Ιούλη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 27, Ιουλίου 2012

Copyright: © Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε οικονομικά από ένα Ίδρυμα για τον συγγραφέα του Εθνικού Εξαιρετική Διδακτορικής Διατριβής της Κίνας (200.979), Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (BK2011065), Ίδρυμα Επιστημών για τους μελετητές Νεολαίας του Υπουργείου Παιδείας της Κίνας (200.803.161.012), το Πρόγραμμα για New Century εξαιρετικά ταλέντα στο Πανεπιστήμιο (NCET-09-0770), και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αρ. 91029746, 30801422). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 80~85% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα, και είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου στους άνδρες και τη δεύτερη με τον καρκίνο του μαστού σε γυναίκες [1]. Η χημειοθεραπεία συνδυασμού, συνήθως με βάση την πλατίνα, είναι σήμερα η θεραπεία πρώτης γραμμής της επιλογής για NSCLCs. Ωστόσο, η πρόγνωση για τους ασθενείς με προχωρημένο NSCLC παραμένει κακή με μέσο χρόνο επιβίωσης από 8 έως 11 μήνες και το ποσοστό επιβίωσης 1-χρόνου των 30% [2], [3]. Η (5 ετών) ποσοστό μακροχρόνιας επιβίωσης ήταν ακόμη φτωχή σε περίπου 15% [4]. Η πρόσφατη ανάπτυξη διαφόρων φαρμάκων μοριακού στόχου και ο συνδυασμός τους με φάρμακα χημειοθεραπείας βελτιώνει την έκβαση της θεραπείας NSCLC? Ωστόσο, παραμένει απογοητευτική στη θεραπεία του προχωρημένου NSCLC. Προφανώς, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για την αναγνώριση νέων θεραπευτικών στόχων και την ανάπτυξη του όγκου-εκλεκτική χημειοθεραπευτικών φαρμάκων ειδικά για NSCLCs

NAD (P) H:. Κινόνης οξειδοαναγωγάση (NQO1, ΕΚ 1.6.99.2) είναι ένα κυτοσολικό flavoenzyme ότι καταλύει την υποχρεωτική μείωση δύο ηλεκτρονίων από μια ποικιλία υποστρωμάτων κινόνης, χρησιμοποιώντας τόσο NADH και NADPH ως δότες ηλεκτρονίων [5]. Αρχικά, NQO1 ήταν ευρέως πιστεύεται ότι είναι ένα ένζυμο αποτοξίνωση ενόψει της περιουσίας της μείωσης των δύο ηλεκτρονίων, παρακάμπτοντας την αναγωγή ενός ηλεκτρονίου που παράγουν ασταθή και ιδιαίτερα αντιδραστικό ημικινόνες [6], [7]. Τον τελευταίο καιρό, διαπιστώθηκε ότι ορισμένα κινόνες όπως μιτομυκίνη C, στρεπτονιγρίνη, Ε09, και RH1 [8], [9], [10], [11], [12] είχαν βιοενεργοποιούνται με NQO1. Η ιδιότητα βιοενεργοποίηση του NQO1 υπόσχεται ένα ιδανικό στόχο για την ανάπτυξη φαρμάκων κατά των όγκων, επειδή διαφόρων ανθρώπινων όγκων [13] έχουν αυξημένα δραστηριότητες NQO1. Στην περίπτωση των όγκων του πνεύμονα, δραστικότητας του NQO 1 είναι αυξημένη έως και 80 φορές σε NSCLC όγκους σε σχέση με το φυσιολογικό πνεύμονα, και 20~35 φορές σε σχέση με SCLC κυτταρικές γραμμές [14]. Ένα τέτοιο διαφοροποιημένο τρόπο έκφρασης του NQO 1 μεταξύ όγκων και φυσιολογικών ιστών υποδεικνύει ότι φάρμακα στόχος NQO1 θα ήταν άκρως επιλεκτικός στη θανάτωση κυττάρων όγκου κατά την αποθήκευση τους φυσιολογικούς ιστούς. RH1 είναι ένα υποψήφιο φάρμακο βιοενεργοποιούνται με NQO1 να παράγουν υδροκινόνη στην ενεργοποίηση των δακτυλίων αζιριδίνης και την επακόλουθη αλκυλίωση του DNA και διασταυρώσεις μεταξύ των δεσμών. Σε αυτήν την περίπτωση, NQO 1 χρησιμοποιείται ως όγκος επιλεκτικό ένζυμο να bioactivate το προφάρμακο και έτσι να πραγματοποιήσει ένα συγκεκριμένο όγκο τοξικότητα. Εκτός από την ιδιότητα του ως οξειδοαναγωγάση, NQO1 έχει επίσης βρεθεί εμπλέκονται άμεσα στη σταθεροποίηση του ζωτικού καταστολείς όγκων ρ53 /ρ73 /ρ33 [15], [16]. Επιπλέον, NQO1 πολυμορφισμός που οδηγεί στο ένζυμο αδράνεια έχει βρεθεί να είναι ένας ισχυρός προγνωστικός και προγνωστικός παράγοντας στην κακή έκβαση του καρκίνου του μαστού [17]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η φαρμακολογική ρόλος του NQO1 είναι πολύ πέρα ​​από ενζυμική δράση της στη μείωση κινόνες. Λαμβάνοντας μαζί, θα ήταν μεγάλου ενδιαφέροντος για τον προσδιορισμό των θεραπευτικών δυνατοτήτων και των υποκείμενων μηχανισμών των παραγόντων στόχων NQO 1 σε όγκους. β-Lapachone (Lap), ένα καλά μελετημένο υπόστρωμα NQO1, έχει αναγνωριστεί ως μια πολλά υποσχόμενη παράγοντας για διάφορα θεραπεία του καρκίνου [18]. Ωστόσο, επανειλημμένη αγωγή της στοματικής Lap επάγει αναιμία τόσο σε αρουραίους όσο και σε ανθρώπους που μπορεί να περιορίσουν σημαντικά την εφαρμογή του [19], [20]. Ένας άλλος περιορισμός της Lap είναι NQO1 συγκεκριμένη δραστηριότητα της μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο μέσα σε ένα σχετικά στενό χρονικό παράθυρο εύρους συγκέντρωσης και την έκθεση [18]? είναι αμφίβολο αν μια τέτοια κατάσταση μπορεί να ελεγχθεί in vivo των κρατών.

Tanshinone ΙΙΑ (TSA) ήταν ένα παράγωγο του φαινανθρενίου-κινόνης απομονωθεί από Salvia miltiorrhiza (Danshen, στα κινέζικα), ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο φυτικό φάρμακο. Αν και παραδοσιακά η χρήση του εστιάζεται κυρίως σε καρδιαγγειακά νοσήματα και εγκεφαλικά [21], [22], [23], [24], η δράση κατά των όγκων της TSA και άλλα δομικά παρόμοια tanshinones επιβεβαιώθηκαν κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών [25], [ ,,,0],26], [27]. Διάφορες μελέτες έδειξαν ότι η TSA ασκείται κυτοτοξικά αποτελέσματα έναντι ενός ευρέος φάσματος ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών όγκου [28]. Παρά τις προηγούμενες προσπάθειες για την αποκάλυψη των μηχανισμών του [29], [30], το μοριακό στόχο της TSA να εκμαιεύσει αντινεοπλασματική της δράση παραμένει άπιαστο. Έχουμε βρει πρόσφατα ότι καταλύεται NQO1 μείωση κινόνη ακολουθείται από άμεση γλυκουρονιδίωση είναι η κύρια μεταβολική οδός της TSA τόσο σε αρουραίους [31] και στον άνθρωπο [32]. NQO1 μειώνει TSA για να σχηματίσουν ένα εξαιρετικά ασταθές κατεχίνης ενδιάμεσο, το οποίο auto-οξειδώνει πίσω στη μητρική TSA και αποτελεί μια μάταιη κύκλο οξειδοαναγωγής παραγωγή οξειδωτικού στρες [31]. Τα ευρήματα αυτά μας ώθησε να υποθέσει ότι NQO1 μπορεί να είναι το κύριο ενδοκυτταρικό στόχο της TSA σε καρκινικά κύτταρα.

Η παρούσα μελέτη έχει ως στόχο να καθορίσει αν NQO1 διαδραματίζει καίριο ρόλο για την έναρξη του αντικαρκινική δράση της TSA, τόσο in vitro και in vivo. Isogenically συμφωνημένα NQO1

+ και NQO1

– ανθρώπινη υψηλή έκφραση της ανθρώπινης Α549 κυτταρικές σειρές NSCLC Η596 και NQO1 εφαρμόστηκαν για τον προσδιορισμό του NQO1 κυτταροτοξικότητα εξαρτώμενη, αποπτωτικό αποτέλεσμα, η παραγωγή ROS, βλάβες στο DNA και την κυτταρική πρόσληψη της TSA. Έχουμε αποδείξει ότι η TSA είναι ένας υποσχόμενος NQO1 παράγων συγκεκριμένο στόχο, η οποία επάγει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο των κυττάρων NSCLC μέσω ενός μοναδικού NQO1-κινήθηκε και ROS μεσολάβηση ενεργοποίηση ενός ρ53-ανεξάρτητη αλλά κασπάσης-εξαρτώμενη μιτοχονδριακό αποπτωτικό μονοπάτι.

αποτελέσματα

προκαλείται από TSA κυτταροτοξικότητα εξαρτάται και p53-ανεξάρτητη NQO1

Για να καθορίσει τον ρόλο του NQO 1, δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας TSA πραγματοποιήθηκαν σε NQO1 κύτταρα Α549 υψηλή έκφραση, NQO1 αρνητικά και επιμολυσμένα Η596 κύτταρα? Τα επίπεδα της πρωτεΐνης NQO 1 και ενζυμικές δραστηριότητες σε κύτταρα NSCLC που φαίνεται στο Σχ. 1Α. Η έκφραση πρωτεΐνης και δραστικότητα ενζύμου του NQO 1 δεν μπορούσε να ανιχνευθεί σε κύτταρα Η596? Η δραστικότητα του ενζύμου NQO1 σε Η596-NQO 1 κύτταρα είναι πολύ χαμηλότερη από ότι σε κύτταρα Α549, το οποίο είναι συνεπές με προηγούμενα ευρήματα [18]. TSA προκάλεσε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα Α549 με τιμή IC50 στο 5,32 μΜ. Σε αντίθεση, NQO1 κύτταρα αρνητικά Η596 ήταν σε μεγάλο βαθμό ανθεκτικό σε TSA κυτταροτοξικότητα με IC50 & gt? 40 μΜ (Εικ. 1Β). αναστολή NQO 1 η δικουμαρόλη ειδικό αναστολέα NQO 1 (DIC, 10 μΜ) θα μπορούσε να αποτρέψει σε μεγάλο βαθμό την κυτταροτοξικότητα της TSA σε κύτταρα Α549? NQO1 siRNA knockdown θα μπορούσε επίσης να καταργήσει την κυτταροτοξική δράση του TSA, αν και σε μικρότερο βαθμό από ότι DIC (Σχ. 1C, D). Η επιμόλυνση NQO1 σε κύτταρα Η596 αποκατασταθεί ευαισθησία της σε TSA προκαλούμενη κυτταροτοξικότητα. Η IC50 του TSA σε Η596-NQO 1 και σε κυτταρικές γραμμές Η596-φορέα είναι από 23.56 μΜ και & gt? 80 μΜ, αντίστοιχα (Εικόνα 1 Ε.). Αξίζει να σημειωθεί, οι τιμές IC50 σε κύτταρα Α549 ήταν πολύ χαμηλότερες από ότι σε Η596-NQO 1 κύτταρα, τα οποία είναι σε συμφωνία με την διαφορά των δραστηριοτήτων του ενζύμου μεταξύ αυτών των δύο κυτταρικών σειρών. Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι TSA που προκαλείται κυτταροτοξικότητα εξαρτάται NQO1. Επιπλέον, φαίνεται ότι η TSA έδειξε καλύτερη εξειδίκευση στόχου NQO1 από Lap? η διαφορά τιμή IC50 μεταξύ των κυττάρων Α549 και κύτταρα Η596 για TSA (5,32 μΜ VS & gt? 40 μΜ) είναι πολύ υψηλότερη από εκείνη για την Lap (1,94 μΜ VS 3,93 μΜ). Επιπλέον, η προ-θεραπεία με τυπικό ρ53 αναστολέα pifithrin-α (PFT-α) [33] και της ρ53 σιωπή με siRNA είχε αμελητέα επίδραση στη TSA επαγόμενη κυτταροτοξικότητα (Εικ. 1 F), γεγονός που υποδηλώνει TSA προκαλούμενη κυτταροτοξικότητα σε ρ53-ανεξάρτητο τρόπο.

Α, τα επίπεδα της πρωτεΐνης και των δραστηριοτήτων ένζυμο NQO1 στα κύτταρα NSCLC. NQO1 δραστηριότητα & lt? 1,0 nmol⋅min

-1⋅μg

-1 υποδείχθηκε μη ανιχνεύσιμα (ΝΔ). Β, κυτταροτοξικότητα της TSA και Lap στα κύτταρα NSCLC? κύτταρα εκτέθηκαν σε κλίση συγκεντρώσεις TSA (0,4 έως 40 μΜ) ή Lap (0,5-10 μΜ) για 72 ώρες. C, επιδράσεις της NAC ή DIC προεπεξεργασίας? Α549 κύτταρα προκατεργάστηκαν με 5 mM του NAC για 1 ώρα ή 10 μΜ DIC για 30 λεπτά. D, τα αποτελέσματα της NQO1 σιωπής στα κύτταρα Α549. Ε, TSA κυτταροτοξικότητα σε Η596 και NQO1-επιμολυσμένα Η596 κύτταρα. F, αποτέλεσμα της αναστολής Ρ53 ή τη σιωπή? Α549 κύτταρα προκατεργάστηκαν με 10 μΜ PFT-α για 5 ώρες ή προεπεξεργασία με P53 siRNA. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

TSA προκαλεί εξαρτώμενη και p53-ανεξάρτητη NQO1 θάνατο αποπτωτικών κυττάρων

αναλύσεις TUNEL διενεργήθηκαν για να επιβεβαιωθεί ότι η TSA θάνατο που προκαλείται από κύτταρο είναι λόγω της επαγωγής των εξαρτώμενων NQO1 απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, TSA προκάλεσε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση της απόπτωσης και τα θετικά κύτταρα ΤΟΥΝΕΛ φτάσει πάνω από το 80% με 40 μΜ της θεραπείας TSA σε κύτταρα Α549, ενώ τα θετικά κύτταρα ΤΟΥΝΕΛ ανιχνεύονται από Η596 κύτταρα κατά την αγωγή TSA δεν έχει καμία διαφορά από τη θεραπεία ελέγχου. Επιπλέον, τόσο DIC και NQO1 siRNA μπορούσε να αντιστρέψει σημαντικά TSA επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα Α549 (Σχ. 2Α, Β). Ομοίως, η επιμόλυνση των NQO1 να Η596 κύτταρα που αποκαθίστανται σημαντικά την ευαισθησία της σε TSA απόπτωση που επάγεται, η οποία χαρακτηρίζεται με 38,02% έναντι 7,28% TUNEL θετικά κύτταρα σε Η596-NQO 1 κύτταρα και Η596-φορέα κυττάρων (Σχ. 2C), αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα των δοκιμασιών TUNEL είναι σε πλήρη συμφωνία με εκείνα από τις μελέτες κυτταροτοξικότητας ΜΤΤ βάση, γεγονός που υποδηλώνει έντονα ότι η TSA επάγει NQO1 κυτταρικό θάνατο εξαρτάται αποπτωτικών σε NSCLC. Συνεπής με αποτέλεσμα ΜΤΤ, η δοκιμασία TUNEL έδειξε επίσης ότι αναστολέας ρ53 PFT-α και Ρ53 siRNA είχε αμελητέα επίδραση στην απόπτωση που επάγεται από TSA, υποδεικνύοντας μία ρ53 ανεξάρτητη απόπτωση που επάγεται από την TSA.

Α, άνω, Α549 κύτταρα και κύτταρα Η596 εκτέθηκαν σε ένδειξη συγκέντρωσης του TSA για 48 ώρες? χαμηλότερη, τα κύτταρα Α549 προκατεργάστηκαν με 10 μΜ του DIC για 30 λεπτά, 5 mM της NAC για 1 ώρα, ή 10 μΜ PFT-α για 5 ώρες και στη συνέχεια εκτίθενται σε 40 μΜ TSA για 48 ώρες. Β, τα αποτελέσματα της NQO1 ή p53 σιωπή σχετικά με TSA προκαλούμενη απόπτωση σε κύτταρα Α549. C, Η596-φορέα και Η596-NQO 1 κύτταρα εκτέθηκαν σε TSA για 48 ώρες? η δοκιμασία TUNEL διεξήχθη χρησιμοποιώντας Click-iT ΤΟΥΝΕΛ Alexa Fluor 594 Imaging Assay Kit. Οκτώ έως δέκα πεδία εξετάστηκαν σε κάθε πείραμα, το σήμα TUNEL εμφανίζεται με κόκκινο χρώμα και Hoechst 33342 πυρηνική χρώση δείχνεται στο μπλε. Δεξιά είναι οι αντιπροσωπευτικές εικόνες της χρώσης TUNEL. Όλα τα δεδομένα δείχνονται ως μέση τιμή ± SE τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (# Ρ & lt? 0,05, ## Ρ & lt? 0,01, ### Ρ & lt? 0.001, NAC, DIC προεπεξεργασία σε σύγκριση με τη θεραπεία με TSA και μόνο, NQO1 siRNA προεπεξεργασία σε σχέση με τον έλεγχο του siRNA προθεραπείας, Η596-NQO1 κυττάρων σε σύγκριση με το Η596-φορέα κύτταρα? ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001, θεραπεία TSA σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου)

Η

TSA προκαλεί NQO1 εξαρτάται από βλάβες στο DNA

.

Επειδή βλάβες στο DNA είναι ένα κεντρικό εμπνευστής για την πρόκληση αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο [34], επιδιώξαμε να καθορίσει εάν η θεραπεία TSA προκαλεί NQO1 εξαρτώμενη από βλάβες στο DNA και τα διαλείμματα. Όπως ήταν αναμενόμενο, TSA προκάλεσε μια δραματική και εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση βλάβη στο DNA σε Α549 και Η596-NQO 1 κύτταρα αλλά ελάχιστα σε NQO1 αρνητική Η596 και DIC ή siRNA προεπεξεργασία Α549 κύτταρα (Σχ. 3Α, Β και C). H

2O

2 (200 μΜ) αγωγή για 4 ώρες επαγόμενη σχεδόν ταυτόσημη βλάβη του DNA σε όλες τις κυτταρικές σειρές. δεδομένα πορεία Χρόνος έδειξαν ότι η TSA προκαλούμενη βλάβη του DNA NQO1-dependnet φτάσει το μέγιστο μετά την θεραπεία 24 ώρες αλλά μειώθηκαν ελαφρά μετά από 48 ώρες, πιθανόν λόγω της υπερβολικής κυτταρικού θανάτου (Εικ. 3Α). Επισημάνθηκε επίσης ότι η TSA στα 40 μΜ προκαλείται από αρκετά παρόμοια ποσότητα της βλάβης του DNA σε κύτταρα Α549 και Η596-NQO1 κύτταρα παρά τις διαφορετικές NQO1 ενζυματική δραστηριότητα μεταξύ των κυττάρων Α549 και Η596-NQO1 κύτταρα. Προτείναμε ότι είναι πιθανόν ότι η TSA στα 40 μΜ μπορεί να προκαλείται από ένα μέγιστο βλάβες στο DNA και για τις δύο Α549 και Η596-NQO1 κύτταρα και έτσι δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά. Ωστόσο, τα κύτταρα Α549 είναι πράγματι να είναι πολύ πιο ευαίσθητη από Η596-NQO1 κυττάρων σε TSA προκαλούμενη βλάβη του DNA σε χαμηλότερη δόση πρόκλησης (Σχ. 3Β, C).

βλάβες του DNA προσδιορίστηκε με δοκιμασίες αλκαλικής κομήτη. Α, TSA προκαλούμενη βλάβη του DNA σε Α549 και Η596 κύτταρα, καθώς και η επίδραση της NAC ή DIC προεπεξεργασία. Β, αποτέλεσμα της NQO1 σιωπής στην TSA που προκαλείται από βλάβες του DNA σε κύτταρα Α549. C, βλάβη του DNA σε Η596-NQO1 και Η596-φορέα κύτταρα. Αριστερό πλαίσιο, ο εκπρόσωπος μορφολογική εμφάνιση των κυττάρων με κατεργασία TSA για 24 ώρες? δεξιό πίνακα, ποσοτικά αποτελέσματα εκφράζονται ως φορές μεταβολής (T /C) του κομήτη μήκη ουρά ή εκφράζεται ως κομήτη μήκη ουράς (αυθαίρετη μονάδα). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. (# P & lt? 0,05, ## Ρ & lt? 0,01 NQO1 σιωπή έναντι του ελέγχου siRNA ή Η596-NQO1 εναντίον H596-φορέα? * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001, TSA ή H

2O

2 θεραπεία σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου).

η

ROS παράγονται από NQO1 βιοενεργοποίηση είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής στην TSA προκαλούμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο

Έχουμε διαπιστώσει ότι η TSA μειώθηκε με NQO1 για την παραγωγή ενός εξαιρετικά ασταθές κατεχόλης ενδιάμεσο, το οποίο θα μπορούσε να είναι είτε με το γλυκουρονικό οξύ παρουσία τρανσφερασών UDP-γλυκουρονικό οξύ (UGTs) ή αυτο-οξειδώνεται πίσω σε TSA χωρίς αυτά [31]. Επειδή παρατηρήθηκε έλλειψη UGTs σε κύτταρα NSCLC, είναι λογικό να υποθέσουμε ότι TSA μπορεί να προκαλέσει μια μάταιη κύκλο οξειδοαναγωγής υπέρμετρες ROS σε NQO1 θετικά κύτταρα. Για να υποστηρίξει αυτήν την εξέταση, χρώση και ποδηλασία γλουταθειόνης δοκιμασία DCF εφαρμόστηκαν στην παρακολούθηση σχηματισμό ROS TSA που προκαλείται. Χρονική πορεία των δεδομένων χρώσης DCF έδειξαν ότι TSA (10 μΜ) προκάλεσε υπερβολικό σχηματισμό ROS εντός 30 λεπτών και επέλθει κορεσμός σε 60 min σε κύτταρα Α549, αλλά όχι σε Η596 και DIC προεπεξεργασία Α549 κύτταρα (Σχ. 4Α). NQO1 σιωπή εμποδίζεται σε μεγάλο βαθμό TSA προκαλούμενη σχηματισμό ROS σε Α549 κύτταρα (Σχ. 4C). Συνέπεια, η επιμόλυνση του NQO1 στα κύτταρα Η596 αποκατέστησε την ικανότητα της TSA που προκαλείται από την παραγωγή των ROS από το μάταιο κύκλο (Σχ. 4D). Τα αποτελέσματα προέκυψαν από την ανάλυση ποδηλασία γλουταθειόνη (Σχ. 4Ε, F) υποστηρίζεται περαιτέρω ότι TSA προκαλούμενη παραγωγή ROS σε NQO1 εξαρτώμενο τρόπο. Σε αντίθεση, H

2O

2 που προκαλείται σχεδόν ταυτόσημη παραγωγή ROS σε όλες τις περιπτώσεις, ανεξάρτητα από την έκφραση NQO1.

γενιάς Η ενδοκυτταρική ROS μετράται με χρώση DCF. Α, για μελέτη χρονικής πορείας, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ του TSA με ή χωρίς προεπεξεργασία με 10 μΜ του DIC ή 5 mM της NAC? Β, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε υποδεικνυόμενες δόσεις του TSA επί 1 ώρα? C, επίδραση της NQO1 σιωπή σχετικά με TSA προκάλεσε το σχηματισμό ROS? κύτταρα εκτέθηκαν σε 4 μΜ ή 40 μΜ της TSA επί 1 ώρα? D, H595-NQO 1 κύτταρα και Η596-φορέα κύτταρα εκτέθηκαν σε 10 μΜ ή 40 μΜ της TSA επί 1 ώρα. H

2O

2 (400 μΜ) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας. δοκιμασίες ποδηλασία Ε και F, γλουταθειόνη? Ε, τα κύτταρα NSCLC εκτέθηκαν σε υποδεικνυόμενες δόσεις του TSA με ή χωρίς προεπεξεργασία DIC για 24 ώρες. F, Η596-φορέα και Η596-NQO 1 κύτταρα εκτέθηκαν σε TSA για 24 ώρες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως σχετικές μεταβολές στην κενό ελέγχους και εκφράζονται ως μέση ± SE από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. (# P & lt? 0,05, ## Ρ & lt? 0,01, ### Ρ & lt? 0.001 NQO1 siRNA έναντι του ελέγχου siRNA, Η596-NQO1 εναντίον H596-φορέα, Α549 με DIC εναντίον TSA μόνο? * P & lt? 0.05, ** P & lt ? 0,01, *** P & lt?. 0.001, TSA ή H

2O

2 μεταχείρισης έναντι των αντίστοιχων κυττάρων ελέγχου τους)

η

Κατά την άποψη ότι NQO1 ενεργοποιείται η παραγωγή ROS είναι πολύ νωρίς και συνεχή περίπτωση, είναι σημαντικό να καθοριστεί αν ROS παράγονται από TSA κινόνες και την ανακύκλωση κατεχίνης είναι ένας βασικός παράγοντας στην TSA προκαλούμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Η προεπεξεργασία Α549 κυττάρων με 5 mM Ν-ακετυλο κυστεϊνη (NAC), ένα τυπικό ROS καθαριστή, ήταν αρκετή για να απομακρυνθεί TSA προκαλούμενη ενδοκυττάρια ROS (Σχ. 4Α). NAC προεπεξεργασία θα μπορούσε να εμποδίσει σημαντικά TSA προκαλούμενη κυτταροτοξικότητα (Εικ. 1C), απόπτωση (Σχ. 2Α), και βλάβη του DNA (Σχ. 3Α). Επιπλέον, σε όλες τις πτυχές της δοκιμής, τα αντιστρέφοντας επιδράσεις της NAC προκατεργασίας είναι σχεδόν συγκρίσιμες με αυτήν που επιτυγχάνεται με DIC προεπεξεργασία. Όλα τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ROS παράγονται από NQO1 καταλύεται ανακύκλωση είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής στην επαγωγή αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο των κυττάρων NSCLC.

TSA προκάλεσε NQO1 και ROS μεσολάβηση, ρ53 ανεξάρτητη ενεργοποίηση της μιτοχονδριακής οδού

Όπως φαίνεται στο Σχ. 5, TSA προκάλεσε μια δοσο-εξαρτώμενη διαταραχή των ΜΜΡ, το οποίο είναι συνεπές με μία προηγούμενη μελέτη από Chiu et al [35], με την οποία διαπιστώθηκε TSA να επάγει ROS μεσολάβηση μιτοχονδριακό αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Επειδή βρήκαμε εδώ ότι TSA προκαλούμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο ήταν NQO1 εξαρτώμενο, έτσι προσπάθησε να καθορίσει το ρόλο του NQO 1 στην ενεργοποίηση της μιτοχονδριακής αποπτωτικό μονοπάτι κυτταρικού θανάτου. αναστολέα NQO 1 DIC, NQO 1 siRNA, καθώς και NAC προεπεξεργασίας θα μπορούσε σημαντικά αναστρέφουν TSA προκαλούμενη διάσπαση ΜΜΡ, υποδεικνύοντας μια NQO1 εξαρτώμενα και ROS μεσολάβηση μιτοχονδριακή διαταραχή που προκαλείται από την TSA. P53 siRNA είχε καμία επίδραση στην TSA επαγόμενη διατάραξη του ΜΜΡ, γεγονός που υποδηλώνει ρ53-ανεξάρτητο μηχανισμό.

Α549 κύτταρα εκτέθηκαν σε TSA των συγκεντρώσεων κλίση (4, 10, και 40 μΜ) μόνο του ή σε προεπεξεργασία με DIC, NAC , ή να υποβληθεί σε NQO 1 και p53 σιωπή, πριν από την επεξεργασία του 40 μΜ του TSA. Τα κύτταρα κατεργάστηκαν όπως δεικνύεται για 24 ώρες φορτώθηκαν με 3 μΜ JC-1 για 15 λεπτά στους 37 ° C, στη συνέχεια απαλά πλύθηκαν με PBS για δύο φορές. Στο κυτοσόλιο, η μονομερής μορφή της παρούσας χρωστικής φθορίζει πράσινο και εντός της μιτοχονδριακής μήτρας, υψηλής συγκέντρωσης JC-1 σχηματίζει συσσωματώματα που φθορίζουν κόκκινο. A, εκπρόσωπος φωτογραφίες που ελήφθησαν από τη Leica BMI3000 Β μικροσκόπιο με ένα ομοεστιακό εφαρμογή μικροσκοπίου. Β, ο φθορισμός αναγνώστηκε στα 488 nm διέγερση και 530 nm εκπομπή για το πράσινο, και στα 540 nm διέγερση και 590 nm εκπομπή για το κόκκινο χρησιμοποιώντας φθορόμετρο Synergy-H1 (Bio-Tek Instruments) και τις αλλαγές στο μιτοχονδριακό δυναμικό υπολογίστηκαν ως ο κόκκινο πράσινο λόγο /για κάθε κατάσταση. (## Ρ & lt? 0,01, ### Ρ & lt? 0.001, DIC, NAC προεπεξεργασίας σε σύγκριση με τη θεραπεία TSA μόνο του ή NQO1 siRNA προεπεξεργασίας σε σύγκριση με το siRNA ελέγχου προεπεξεργασία κυττάρων? ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001, θεραπεία TSA σύγκριση με κύτταρα ελέγχου).

Η

TSA θεραπεία προκάλεσε μια φορά και εξαρτάται από τη συγκέντρωση προς τα πάνω ρύθμιση προ-αποπτωτικών Βαχ και προς τα κάτω ρύθμιση των προ-επιβίωσης Bcl-XL σε NQO1 και ROS εξαρτώμενη αλλά ρ53 ανεξάρτητο τρόπο (Σχ. S1, Σχ. 6Α). Αυτό οδήγησε σε μια δραματική αύξηση της αναλογίας του Βαχ /Bcl-XL, η οποία είναι γνωστή σημαντικό παράγοντα για διέπουν απόπτωση των κυττάρων μέσω της διατάραξης των μιτοχονδρίων [36]. διάσπαση μιτοχόνδρια στη συνέχεια να οδηγήσει στην απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από μιτοχόνδρια, όπως αποδεικνύεται από το κυτοσολικό αύξηση αλλά μιτοχονδριακού μείωση του κυτοχρώματος c (Εικ. 6Β).

Α549 κύτταρα εκτέθηκαν σε TSA των συγκεντρώσεων κλίση (4, 10 , και 40 μΜ) μόνο του ή σε προεπεξεργασία με DIC, NAC, ή να υποβληθούν σε NQO 1 και p53 σιωπή, πριν από την επεξεργασία του 40 μΜ του TSA για 48 ώρες. Α, ολόκληρο κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν μετά ενδεικνυόμενη θεραπεία και ανάλυση κηλίδας Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντι-Βαχ, -Bcl-XL, -PARP, -cleaved PARP, -NQO1, -ρ53 και -GAPDH αντισώματα. Β, κυτοσολίου και μιτοχονδριακών πρωτεϊνών προετοιμάστηκαν για ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-κυτοχρώματος c αντίσωμα? διακυμάνσεις στην πρωτεΐνη φόρτωσης μεταξύ δείγματα παρακολουθήθηκαν με επίπεδα GAPDH ή COX-IV, αντίστοιχα. Η σχετική αξία πυκνότητα κάθε ζώνης παρουσιάζεται κάτω από την κηλίδα Western. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά ενός τυπικού πειράματος που διεξήχθη τρεις φορές (μέσες τιμές, Ρ & lt? 0,05)

Η

Η ενεργοποίηση της κασπάσης στη συνέχεια αναλύθηκε με προσδιορισμό δραστικότητας χρησιμοποιώντας υποστρώματα του δραστικού διασπάται κασπάσης και μία κηλίδα Western. ανάλυση της διάσπασης PARP (Σχ. 6Α, και το Σχ. 7Α, Β). TSA εξαρτάται από τη δόση αύξησε τις δραστηριότητες της κασπάσης-3, -9, και -8. Η εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση επαγωγή της διάσπασης PARP υποστηρίζεται περαιτέρω κασπάσης-3 ενεργοποίησης. Ο αναστολέας παν-κασπάσης, z-VAD-fmk, σε μεγάλο βαθμό εξασθενημένο TSA προκαλούμενη απόπτωση (Σχ. 7C). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι TSA προκαλούμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο είναι κασπάσης με τη μεσολάβηση. Συνεπής με τις άλλες πτυχές εξετάστηκαν στη μελέτη μας, TSA που προκαλείται από την κατάρρευση της MMP, απελευθέρωση κυτοχρώματος c, και κασπάσης ενεργοποίηση ήταν όλα NQO1 και ROS εξαρτάται όμως p53 ανεξάρτητη

Α και Β, δοκιμή δραστικότητας της κασπάσης.? Τα κύτταρα Α549 εξετέθησαν σε TSA των συγκεντρώσεων κλίση (4, 10, και 40 μΜ) μόνο του ή σε προεπεξεργασία με DIC, NAC, ή να υποβληθούν σε NQO 1 και σιωπή ρ53, πριν από τη θεραπεία του 40 μΜ του TSA για 48 ώρες. C, TUNEL δοκιμασία TSA απόπτωση που επάγεται με ή χωρίς προεπεξεργασία του αναστολέα παν-κασπάσης z-VAD-fmk. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. (## Ρ & lt? 0,01, ### Ρ & lt? 0.001, DIC, NAC ή z-VAD-fmk προεπεξεργασίας σε σύγκριση με τη θεραπεία TSA μόνο, NQO1 siRNA προεπεξεργασίας σε σύγκριση με το siRNA ελέγχου προεπεξεργασία κυττάρων? * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01 , *** P & lt? 0.001, θεραπεία TSA σε σύγκριση με το κενό κύτταρα ελέγχου)

η

η αντικαρκινική δράση της TSA in vivo είναι NQO1 εξαρτώμενη

Για να επιβεβαιωθεί ο ρόλος του NQO1, το. αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της TSA ερευνήθηκε περαιτέρω σε ξενομοσχεύματα Α549 όγκου με κατεργασία TSA μόνη ή σε συνδυασμό με DIC (Εικ. 8Α). TSA κατεργασία (20 mg /kg) θα μπορούσε να καταστείλει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου? μετά την επεξεργασία 20 ημέρες, ο όγκος των όγκων σε ομάδα που έλαβε αγωγή TSA ήταν 279 ± 46 mm

3 (Ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου από 552 ± 90 mm

3). αγωγή DIC μόνος επίσης ελαφρώς ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου που χαρακτηρίζεται με τον όγκο του όγκου από 439 ± 99 mm

3? για το αντίθετο, DIC προεπεξεργασία ανταγωνίστηκε σημαντικά την επίδραση καταστολής του όγκου του TSA, υποδηλώνοντας ότι η αντικαρκινική δράση της TSA in vivo ήταν επίσης NQO1 εξαρτώμενη. Οι ιστολογικές εξετάσεις έδειξαν μεγάλη νέκρωσης των όγκων και της απόπτωσης εμφανίστηκε στην ομάδα που έλαβε αγωγή TSA των ποντικών, και της σημείωσης, δεν τοξικότητα σε φυσιολογικούς ιστούς οργάνων παρατηρήθηκε κατά την αγωγή TSA για 20 ημέρες (Εικ. 8Β).

Α, ανώτερο, μέτρηση του όγκου του όγκου (P & lt? 0,01, TSA έναντι του ελέγχου? P & lt? 0,05, TSA εναντίον TSA + DIC)? κάτω, το βάρος του όγκου (# P & lt? 0,05, TSA εναντίον TSA + DIC, *** P & lt? 0.001, TSA έναντι του ελέγχου)? Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE των έξι ποντικών. Β, ιστολογικές εξετάσεις? τομές όγκων και ιστών αναλύθηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για ιστολογική χρώση χαρακτηριστικά. C, βιοκατανομή της TSA στο Α549 όγκου φορτωθεί γυμνά ποντίκια? Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE από 6 ποντικούς.

Η

Για την εκτίμηση των επιπέδων συσσώρευσης του όγκου του TSA, μελέτη κατανομής ιστού διεξήχθη σε ποντικούς που φέρουν ξενομοσχεύματα Α549 όγκων (Σχ. 8C). Σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη μας κατανομών TSA σε αρουραίους [37], TSA που παρασκευάστηκε ως μία στερεά διασπορά με PEG6000 κατανέμονται επιλεκτικά στα δικτυοενδοθηλιακά συστήματα. Παρά τον περιορισμό αυτό, TSA θα μπορούσε ακόμα αποτελεσματικά τη διανομή στους ιστούς του όγκου? TSA έδειξαν υψηλότερα επίπεδα συσσώρευσης και παρατεταμένη χρόνους έκθεσης σε όγκους από εκείνο στο πλάσμα. DIC προεπεξεργασία, παρά ανταγωνισμό της επίδρασης καταστολής όγκου του TSA, αύξησε σημαντικά τα επίπεδα έκθεσης του TSA συμπεριλαμβανομένων ότι σε ιστούς όγκου, με ένα μηχανισμό αναστολής του μεταβολισμού TSA μέσω NQO1 /UGTs [31]. Βελτίωση της παροχής TSA που μπορεί να ξεφύγει από την πρόσληψη δικτυοενδοθηλιακού συστήματος αναμένεται να αυξηθούν περαιτέρω τα επίπεδα συσσώρευσης του όγκου του και, επομένως, καλύτερη αποτελεσματικότητα κατά των όγκων.

Συζήτηση

Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι NQO1 είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στόχευση για διάφορους όγκους, ειδικά για NSCLC, στην οποία NQO1 υπερεκφράζεται σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό του πνεύμονα [14]. Παρ ‘όλα αυτά, δεν υπάρχει επί του παρόντος καμία ειδική NQO1 φάρμακα στόχους που χρησιμοποιούνται στην κλινική και έτσι θεραπευτική αξία του παραμένει ανεξερεύνητο. Αν και μερικά φάρμακα κατά των όγκων όπως μιτομυκίνη μπορούν να βιοενεργοποιούνται με NQO1, όλα αυτά δεν διαθέτουν επαρκείς εκλεκτικότητα και ειδικότητα στην NQO 1 και αντι-νεοπλασματικές επιδράσεις τους εξηγείται καλύτερα από άλλους μηχανισμούς [38], [39]. Τα στοιχεία που συλλέγονται από τις μελέτες του Lap δείχνει ότι το ενεργοποιημένο NQO1 μάταιη κύκλο οξειδοαναγωγής μπορεί να επάγει ένα μοναδικό μονοπάτι κυτταρικού θανάτου, εμπνέοντας τη νέα ιδέα της ανάπτυξης φαρμάκων κατά των όγκων στόχου NQO1. Η μελέτη αυτή συμβάλλει να εντοπίσει ένα συγκεκριμένο TSA υπόστρωμα NQO1, η οποία προκαλεί μια μοναδική ρ53 ανεξάρτητη ενεργοποίηση της μιτοχονδριακής αποπτωτικό μονοπάτι κατά NQO1 βιοενεργοποίηση.

Η υπόθεση του NQO1 ως ενδοκυτταρικό στόχο της TSA βασίστηκε σε προηγούμενα ευρήματα ότι NQO1 είναι το ένζυμο ελέγχου για τον προσδιορισμό του μεταβολισμού TSA [31] ρυθμό, [32]. Για να το επαληθεύσετε, μελετήσαμε το ρόλο του NQO1 στον καθορισμό των αντικαρκινικές επιδράσεις της TSA κατά NSCLC. Σε όλες τις εξετασθείσες πτυχές, TSA εκτίθενται σε NQO1 εξαρτώμενο τρόπο σχετικά με την επαγωγή κυτταροτοξικότητας, απόπτωση, την παραγωγή ROS, και βλάβη του DNA? Όλα αυτά τα γεγονότα θα μπορούσε να παρατηρηθεί μόνο σε NQO1 θετικές κυτταρικές σειρές Α549 και Η596-NQO1. Συνέπεια, η σιωπή του NQO1 από ειδικό αναστολέα DIC και siRNA θα μπορούσε να καταργήσει σε μεγάλο βαθμό όλα αυτά τα γεγονότα σε κύτταρα Α549. Το πιο σημαντικό, ο NQO1 εξαρτώμενη επίδραση κατά του καρκίνου του TSA επιβεβαιώθηκε περαιτέρω στα ξενομοσχεύματα Α549 όγκου. TSA (20 mg /kg) της θεραπείας καθυστέρησε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου, ενώ η συγχορήγηση του DIC θα μπορούσε να καταργήσει σε μεγάλο βαθμό αυτό το αποτέλεσμα. Ήταν πολύ ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι DIC αυξάνει σημαντικά τη συσσώρευση όγκου του TSA ενώ μειώνει την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου της (Εικ. 8). Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από το γεγονός ότι TSA ήταν κυρίως μεταβολίζονται από το NQO1 και UGTs. Ωστόσο, NQO1 είχε μικρή επίδραση στην κυτταρική πρόσληψη του TSA, όπως αποδεικνύεται από την παρατήρηση ότι η κυτταρική συσσωρεύσεις TSA σε Α549 και κυτταρικές σειρές Η596 ήταν σχεδόν πανομοιότυπα και το siRNA σιωπή του NQO1 σε Α549 κύτταρα είχε μικρή επίδραση στην πρόσληψη TSA (σχ . S2). Μια τέτοια φαρμακοκινητικές και φαρμακοδυναμικές παράδοξο δείχνει έντονα ότι η NQO1 μεσολάβηση βιοενεργοποίηση είναι ζωτικής σημασίας για τον προσδιορισμό αντι-NSCLC αποτελεσματικότητα της TSA.

Τα κύρια χαρακτηριστικά του NQO1 καταλύεται βιοενεργοποίηση είναι να παράγει ένα εξαιρετικά ασταθές κατεχίνης ενδιάμεσο ότι auto-οξειδώνεται προς το γονέας κινόνες σχηματίζοντας ένα μάταιο κύκλο οξειδοαναγωγής που καθιστά τα κύτταρα σε συνεχείς προκλήσεις ROS. Έχει αναφερθεί ότι πρόσφατα ROS παράγονται από τον κύκλο οξειδοαναγωγής NQO1 μεσολάβηση έπαιξε κρίσιμο ρόλο στην προκαλούμενη Lap απόπτωση [40]. Φαίνεται ότι ROS μπορεί επίσης να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην TSA επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, αφού NAC συν-θεραπεία θα μπορούσε να καταργήσει σε μεγάλο βαθμό TSA βλάβη που προκαλείται DNA, κυτταρική απόπτωση, και κυτταροτοξικότητα σε NQO1 θετικά κύτταρα (Σχ. 1, 2, και 3).

Ο καταστολέας όγκου ρ53 είναι ένα κεντρικό ρυθμιστική συνιστώσα που ανιχνεύει διάφορες ενδογενείς και εξωγενείς πιέσεις και ενεργοποιεί αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο [41]. Επιπλέον, η υποβάθμιση πρωτεΐνη ρ53 ρυθμίζεται αρνητικά από NQO1 μέσω της αναστολής της μιας ουμπικουϊτίνης-ανεξάρτητο 20S πρωτεόσωμα μεσολάβηση οδός αποδόμησης [42]. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να καθοριστεί ο ρόλος της ρ53 στην αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που επάγεται από υποστρώματα NQO1. Όλα τα στοιχεία που συγκεντρώθηκαν από την παρούσα μελέτη έδειξε ότι η προκαλούμενη TSA αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο είναι ανεξάρτητη p53. Πρώτον, η προ-θεραπεία με τυπικό αναστολέα ρ53 και η ρ53 σιωπή με siRNA είχε αμελητέα επίδραση στη TSA επαγόμενη κυτταροτοξικότητα, απόπτωση, και όλες οι δοκιμασμένες γεγονότα της μιτοχονδριακής αποπτωτικών οδών σε κύτταρα Α549 (Εικ. 1 F, Εικ. 2Α, Β, εικ. 5 , Σχ. 6, Σχ. 7). Δεύτερον, TSA θα μπορούσε να προκαλέσει προφανή και εξαρτάται από τη συγκέντρωση κυτταροτοξικότητας και της απόπτωσης σε Η596-NQO1 κύτταρα (Εικ. 1 Ε, 2C) στην οποία η ρ53 είναι πολύ γνωστό να μεταλλαχθεί [43]. Τέλος, η θεραπεία TSA σε κύτταρα Α549 προκάλεσε μία εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση επίδραση στη μείωση των περιεχομένων πρωτεϊνών p53 και των τόκων, η DIC αναστολέας NQO1 μπορεί να συνεργήσει με TSA για τη μείωση περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη ρ53 στα κύτταρα Α549 αλλά αντιστρέψει την αρνητική ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης NQO1 (Εικ. S3 ). Αν και οι λεπτομερείς μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω επίδραση της TSA στα επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 κάτω ρυθμιστική δικαιολογούν περαιτέρω έρευνα, τα παρόντα αποτελέσματα δείχνουν ότι το αποτέλεσμα αυτό μπορεί να προκληθεί από NQO1 ρυθμίζεται ουβικιτίνης ανεξάρτητα αποικοδομήσεις ρ53, επειδή η θεραπεία TSA οδήγησαν επίσης στην προς τα κάτω ρύθμιση NQO1 σε παράλληλο προς την μεταβολή των επιπέδων της πρωτεΐνης ρ53 (Εικ. S3). NQO1 θα μπορούσε να σταθεροποιήσει ρ53 με την πρόληψη μιας ουμπικουϊτίνης-ανεξάρτητο αποικοδόμηση του πρωτεασώματος [15], [44]. Σταθερά, ο αναστολέας NQO1 σαν DIC θα μπορούσε να προωθήσει αυτή την οδό αποδόμησης και έτσι παρεμβαίνει με ρ53 κινηθεί αποπτωτικό μονοπάτι [45]. Τα ευρήματά μας που TSA συνεργούσα με DIC στη μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης p53 παρέχει λογική εξήγηση γιατί υποστρώματα NQO1 που προκαλείται από τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο είναι ανεξάρτητη p53. Μπορεί να δείχνουν ότι υποστρώματα NQO1, σαν τυπικό αναστολείς NQO1, μπορεί επίσης να προωθήσει την ουμπικουϊτίνης-ανεξάρτητο υποβάθμιση του πρωτεασώματος? λεπτομερείς μηχανισμοί είναι επί του παρόντος υπό εξέταση στο εργαστήριο μας.

Από κασπάσης χρησιμεύει ως κεντρικό στοιχείο των μηχανημάτων απόπτωση, έχουμε δίπλα επιδίωξε να προσδιορίσει το ρόλο της στη TSA προκαλούμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.