Abstract

Τα οιστρογόνα και ταμοξιφένη (ένα αντιοιστρογόνο) ασκούν τις δράσεις τους με ενεργοποίηση του υποδοχέα οιστρογόνου (ER) μέσω γονιδιωματική και μη γονιδιωματικών μηχανισμών και εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου του ενδομητρίου. Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι η οιστραδιόλη και ταμοξιφένη επάγουν πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του ενδομητρίου μέσω GPR30 (μη γονιδιωματική ER) οδό σηματοδότησης. Εδώ, αποδεικνύουμε ότι η φωσφορυλίωση του κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ) εμπλέκεται στην κυτταρική μετανάστευση που προκαλείται από οιστραδιόλη, το tamoxifen και G1 (ένας αγωνιστής GPR30) μέσω της διαμεμβρανικής ER (GPR30) σε ενδομητρίου καρκινικές κυτταρικές γραμμές, με ή χωρίς ΕΚα (Ishikawa και RL95 -2). Επιπλέον, ο GPR30 μεσολάβηση κυτταρικής μετανάστευσης περαιτέρω καταργήθηκε με χορήγηση είτε ειδικών GPR30 στόχευσης παρεμβολή RNA ή έναν αναστολέα ΡΑΚ. Επιπλέον, έχουμε επικυρωθεί ότι η σηματοδότηση μεταξύ GPR30 και φωσφορυλιωμένη FAK πράγματι τη μεσολάβηση του EGFR /ΡΙ3Κ /μονοπατιού ERK. Κλινικά, μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του GPR30 και φωσφορυλιώνεται FAK (pFAK) που παρατηρήθηκε σε ανθρώπινους καρκινικούς ιστούς του ενδομητρίου με χαμηλή ή χωρίς ΕΚα περαιτέρω προταθεί ότι η φωσφορυλίωση των οιστρογόνων που προκαλείται από FAK και η μετανάστευση των κυττάρων πιθανότατα προκαλείται από ενεργοποίηση GPR30. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχονται νέες πληροφορίες για την κατανόηση των παθοφυσιολογικών λειτουργιών του GPR30 στο ανθρώπινο ενδομήτριο καρκίνους

Παράθεση:. Tsai C-L, Wu Η-Μ, Lin C-Y, Λιν Υ-J, Chao Α, Wang Τ-H, et al. (2013) Η οιστραδιόλη και Tamoxifen Προκαλέστε μετανάστευση των κυττάρων μέσω της GPR30 και ενεργοποίηση της κινάσης εστιακής συγκόλλησης (ΡΑΚ) σε ενδομητρίου με χαμηλό ή χωρίς πυρηνικά υποδοχέα οιστρογόνων α (ΕΡα). PLoS ONE 8 (9): e72999. doi: 10.1371 /journal.pone.0072999

Επιμέλεια: Antimo Migliaccio, ΙΙ Università di Napoli, Ιταλία

Ελήφθη: 22 Μαρτίου, 2013? Αποδεκτές: 16 του Ιούλη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 9 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Tsai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις NSC-96-2314-B-182-016 και NSC-97-2314-Β-182-014-my3 (στην HSW) και η NSC-99 – 2321-Β-182Α-003-my3 (σε CLT ) από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν? και CMRPG381671 (σε HMW) από Chang Gung Memorial Hospital. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα οιστρογόνα δεσμεύονται και ενεργοποιούν τους υποδοχείς οιστρογόνου (ER) για τη ρύθμιση της μεταγραφής των γονιδίων στόχων [1] μέσω γονιδιωματική και μη γονιδιωματικών μηχανισμών. Οι γονιδιωματικής (ή κλασική) οιστρογόνο-προκλητά δυναμικά είναι μέσω πυρηνικών υποδοχέων Ετα και Ετβ [2]. ΕΚα είναι ο υποδοχέας υπεύθυνη για 17β-οιστραδιόλη (Ε2) επαγόμενη σηματοδότηση, ενώ η λειτουργία του ΕΚβ είναι αντίθετη με εκείνη του ΕΚα [3]. Οι γονιδιωματικές λειτουργίες σηματοδότησης ER ως παράγοντες μεταγραφής εξαρτώμενη από συνδετήρα που προσδένονται άμεσα με στοιχεία απόκρισης οιστρογόνου (Eres) στην περιοχή προαγωγού των γονιδίων στόχων και συνήθως διαρκεί ώρες έως ημέρες για να παράγουν φυσιολογικές επιδράσεις στα κύτταρα [4]. Σε αντίθεση, μη-γονιδιωματικό σηματοδότηση ER είναι μέσω ενός υποδοχέα διαμεμβράνης για οιστρογόνου [2], [5].

Ο υποδοχέας συζευγμένος με G πρωτεΐνη 30 (GPR30) είναι ένας λειτουργικός υποδοχέας μεμβράνης που εμπλέκονται σε μη γονιδιωματική οιστρογόνο σηματοδότηση [6] – [8]. Η σηματοδότηση οιστρογόνο GPR30 μεσολάβηση διεγείρει την παραγωγή cAMP και ενδοκυτταρικού Ca

2+ κινητοποίηση, και στη συνέχεια ενεργοποιεί διάφορες κινάσες που συμβάλλει στην ανάπτυξη των κυττάρων και μετανάστευση [2], [9], [10]. Σε καρκινικά κύτταρα του μαστού που στερούνται Π.Α., GPR30 μεσολαβεί πάνω ρύθμιση της c-fos πρωτεΐνης παρουσία των οιστρογόνων, που οδηγεί σε προαγωγή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων [11]. Επιπλέον, και οι δύο οιστραδιόλης και ταμοξιφένης επάγουν την έκφραση του

μονοπάτι c-fos

και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω της GPR30 (μη γονιδιωματική ER) σηματοδότησης σε διάφορους καρκίνους [12], [13]. Επιπλέον, είναι επίσης προφανές ότι η υπερέκφραση του GPR30 υποδηλώνει κακή πρόγνωση των καρκίνων του ενδομητρίου, των ωοθηκών και του μαστού [14] – [16]

Η μετανάστευση των κυττάρων είναι απαραίτητη για την εισβολή των όγκων.. Κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ), μια κινάση τυροσίνης μη υποδοχέα που ελέγχει την κυτταρική σηματοδότηση μονοπατιών της κυτταρικής μετανάστευσης [17], εμπλέκεται στο σχηματισμό και τον κύκλο εργασιών των εστιακών θέσεων προσκόλλησης [18], [19]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του FAK έχει αποδειχθεί για να δείξει επιθετική πιθανότητα και κακή πρόγνωση σε διαφόρους ανθρώπινους καρκίνους [20].

Η παρατεταμένη έκθεση σε ενδογενή ή εξωγενή οιστρογόνα και ταμοξιφένη (ένας ανταγωνιστής οιστρογόνου) είναι ένας από τους παράγοντες κινδύνου για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τη μετανάστευση σε καρκίνο του ενδομητρίου [21] – [23]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα των οιστρογόνων επί των κυττάρων του ενδομητρίου μετανάστευση καρκίνων με χαμηλή ή χωρίς ΕΚα δεν είχαν προηγουμένως διερευνηθεί, αν και προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα οιστρογόνα επάγει ταχεία φωσφορυλίωση της FAK στα ενδομητρίου στρώμα και τα καρκινικά κύτταρα [23]. Noteworthily, εξακολουθεί να είναι ασαφές αν τα οιστρογόνα και η ταμοξιφαίνη απλά διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ενδομητρίου

in situ

ή αν, επίσης, καθιστούν αυτά τα κύτταρα να εισβάλουν σε ένα τοπικό χώρο.

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι η θεραπεία της οιστραδιόλης (Ε2), G1 (ένας αγωνιστής GPR30) και ταμοξιφένη (4-υδροξυταμοξιφένη, ΟΗΤ) επαγόμενη φωσφορυλίωση της FAK στα Y397 και μετανάστευση των κυττάρων σε καρκίνο του ενδομητρίου κυτταρικές σειρές. Η μηχανιστική σύνδεση και η κλινική σχετικότητα μεταξύ GPR30 και σηματοδότηση ΡΑΚ επίσης αποδειχθεί.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και ιστών δείγματα

Σαράντα-εννέα ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση στο Chang Gung Νοσοκομείο Memorial (CGMH) και είχε συμπεριλήφθηκαν παθολογική επιβεβαίωση του καρκίνου του ενδομητρίου. Γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους συμμετέχοντες. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Chang Gung Memorial Hospital (CGMH-IRB # 98-2576B).

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

Η κυτταρική σειρά RL95-2, που προέρχεται από μια καλά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα του ενδομητρίου [24], ελήφθη από την American Type Culture Collection. Η κυτταρική σειρά Ishikawa, ένα καλά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα του ενδομητρίου, είναι ένα δώρο από τον Dr. Nishida (Kasumigaura Εθνικό Νοσοκομείο, Japan) [25]. κύτταρα Ishikawa διατηρήθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο (α-ΜΕΜ) που περιέχει 15% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), καθώς και 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 mg /ml στρεπτομυκίνη. RL95-2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο Dulbecco (DMEM /F12) με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? Biological Industries, Israel), 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 mg /ml στρεπτομυκίνη. Αμφότερα τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO2. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή και μεταφέρονται σε μέσο ελεύθερο ορού για 24 ώρες πριν από τη θεραπεία με 17β-οιστραδιόλη (Ε2), G1 και 4-υδροξυταμοξιφένη (ΟΗΤ) και οξικής μεδροξυπρογεστερόνης (ΜΡΑ). Ε2, ΟΗΤ, G1, MPA (Sigma), λαπατινίμπη (ένας αναστολέας του EGFR, GlaxoSmithKline plc, London, UK), FAK αναστολέα 14 (Tocris Bioscience, UK) και SRC αναστολέα 1 (Sigma) διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO).

η φωσφορυλίωση της κινάσης σειρά

Μια φωσφορυλίωση της κινάσης σειρά (σετ array Proteome Profiler ™, R & amp? συστήματα D) χρησιμοποιήθηκε για να αναζητήσετε συγκεκριμένες κινάσες φωσφορυλίωση εμπλέκονται στην Ε2 που προκαλείται από μονοπάτι σηματοδότησης. Πριν από τη δοκιμασία, τα κύτταρα RL95-2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με Ε2 (1 μΜ) ή DMSO (έλεγχος) για 5 λεπτά ακολουθούμενο από διαλυτοποίηση με ρυθμιστικό λύσης (που παρέχεται με το κιτ). Τα προκύπτοντα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης (500 μg) επωάστηκαν με μεμβράνες νιτροκυτταρίνης που περιέχουν 46 θέσεις φωσφορυλίωσης της κινάσης σε 4 ° C όλη τη νύκτα ακολουθούμενο από ανίχνευση με αντισώματα ανίχνευσης και Στρεπταβιδίνη-HRP. Τα σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) κιτ (Millipore). Πυκνομετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού του ΟΗΕ-SCAN-IT (Silk Scientific).

ανοσοκηλίδας ανάλυση

Οι διαδικασίες ανάλυσης Western Blot έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [26], [27]. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ένα ρυθμιστικό που περιέχει 20 mM Tris, ρΗ 7.4, 2 mM EGTA, 2 mM Na

2VO

3, 2 mM Να

4P

2O

7, 2% Triton Χ -100, 2% SDS, 1 μΜ απροτινίνη, 1 μΜ λευπεπτίνη και 1 mM PMSF. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης αναλύθηκε με ένα κιτ προσδιορισμού πρωτεϊνών με τα πρότυπα BSA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Ίσες ποσότητες κυτταρολύματος διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου SDS (PAGE) και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Hybond-C, Amersham Pharmacia Biotech Inc., Oakville, ΟΝ). Μετά από αποκλεισμό με αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS) που περιέχει 5% άπαχο ξηρό γάλα για 1 h, οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντισώματα έναντι ΕΚα (epitomics), GPR30 (Genetex), FAK (κυτταρική σηματοδότηση), φωσφορυλιωμένη ΡΑΚ σε Y397 (pY397-ΡΑΚ) (Abcam), φωσφορυλιωμένη FAK στα 576/577 (pFAK-576/577) (Cell σηματοδότηση), φωσφο-ERK1 /2 (Santa Cruz), ERK1 /2 (Santa Cruz), φωσφορυλιωμένη Src κατά Y416 (pSrc-416) (Cell Signaling), Src αναστολέα 1 (Sigma) και β-ακτίνης (Sigma), που ακολουθείται από επώαση με αντίστοιχα συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα. Ανοσοαντιδραστικές ζώνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) κιτ (Millipore).

δοκιμασία Μετανάστευση

μετανάστευση κυττάρων αξιολογήθηκε με τη χρήση ενός θαλάμου χημειοταξίας (Corning), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [28], [29]. Κύτταρα (1 χ 10

5) σε 200 μΐ μέσου καλλιέργειας εφαρμόστηκαν στον άνω θάλαμο της συσκευής, και 800 μΙ μέσου που περιείχε 5 μg /ml ινονηκτίνης προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Μια μεμβράνη πολυανθρακικού με μέγεθος πόρου 8 μm τοποθετήθηκε μεταξύ των δύο θαλάμων. Μετά από 6 ώρες επώασης στους 37 ° C, η μεμβράνη σταθεροποιήθηκε σε μεθανόλη για 10 λεπτά και χρωματίστηκαν σε 20: 2 νερό /διάλυμα Giemsa (Sigma) για 1 ώρα. Κύτταρα που μετανάστευσαν επί της μεμβράνης μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο.

Ανοσοϊστοχημεία των κλινικών δειγμάτων

Οι διαδικασίες του ανοσοϊστοχημική χρώση αναφέρθηκαν προηγουμένως [30]. Οι 4 μm πάχους διαφάνειες από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένους σε παραφίνη ιστούς τομές αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώνεται με μια σειρά διαβαθμισμένης αιθανόλης. Οι τομές στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ένα αντι-ανθρώπινο GPR30 πολυκλωνικό αντίσωμα (Genetex), ενός αντι-ανθρώπινου ΕΚα μονοκλωνικό αντίσωμα (epitomics) ή ένα αντι-pFAK στο Y397 μονοκλωνικό αντίσωμα (Invitrogen), χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο βαφεύς IHC με την ανίχνευση Ventana Basic DAB kit (Tucson, ΑΖ, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Αντιχρωματισμός διεξήχθη με αιματοξυλίνη. Τα επίπεδα έκφρασης των ΕΚα, GPR30 και pFAK στις ενδομητρίου καρκινικούς ιστούς εξετάστηκαν και βαθμολογήθηκαν από έναν παθολόγο. Histoscore (0-300) ελήφθη με το σκορ (0-3) της έντασης πολλαπλασιάζοντας το ποσοστό (0-100) των κυττάρων βάφονται.

GPR30 shRNA κατασκευή και επιμόλυνση DNA

Η shRNA αλληλουχίες του GPR30 που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη έχουν αναφερθεί προηγουμένως [31]. Δύο ολιγονουκλεοτίδια, shGPR30F: ATCCCCCGCT -CCCTGCAAGCAGTCTTTTTCAAGAGAAAAGACTGCTTGCAGGGAGCG -TTTTTA και shGPR30R: AGCTTAAAAACGCTCCCTGCAAGCAGTCTTTT -CTCTTGAAAAAGACTGCTTGCAGGGAGCGGGG είχαν anneled σε ένα ρυθμιστικό containing100mM οξικό κάλιο, 30 mM Hepes-ΚΟΗ και 2 mM μαγνήσιο acctate, και συνδέθηκε με Hind III /Bgl II /CIP επεξεργασία pSuper-neo φορέας (OligoEngine). Αλληλουχία επιβεβαιώθηκε με autosequencing.

Διαδικασίες διαμόλυνσης DNA διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [32]. Εν συντομία, τα κύτταρα RL95-2 ήταν trypsined και επανα-εναιωρήθηκαν σε ελεύθερο ορού RPMI σε συγκέντρωση 10

7 κύτταρα /ml. Κυτταρικά εναιωρήματα (200 μΙ) αναμίχθηκαν με 10 μg πλασμιδίου shGPR30 και μεταφέρθηκαν σε μία κυψελίδα ηλεκτροδιάτρησης με ένα κενό 2 mm. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σημάνθηκαν στους 120 Τάση για 70 χιλιοστά του δευτερολέπτου σε μια ηλεκτροδιατρητή (ΒΤΧ ECM2001, Συσκευή Harvard, Inc., Holliston, ΜΑ, USA). Στη συνέχεια, τα κύτταρα επανα-σπείρονται σε πλάκες έξι φρεατίων και διατηρήθηκαν σε DMEM /F12 με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό επί μία νύκτα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής εντός μέσου χωρίς ορό επί 24 ώρες, και στη συνέχεια κατεργάζεται Ε2, G1 και ΟΗΤ.

Επιμόλυνση μικρό παρεμβαλλόμενο (SI) RNA

Ishikawa κυττάρων (3×10

5 κύτταρα σε πλάκες 6 φρεατίων) επιμολύνθηκε με 50 ηΜ δίκλωνου RNA σε Lipofectamine RNAimax (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μικρό παρεμβαλλόμενο (SI) -RNAs για GPR30 και EGFR αγοράσθηκαν από την Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA). Μετά από 72 h επιμόλυνσης, η καταστολή των στοχευμένων γονιδίων επιβεβαιώθηκε με RT-QPCR και αναλύσεις κηλίδος western

Η αλληλουχία του GPR30 siRNA που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη ήταν:. 5′-UCCUGUGCACCUUCAUGUCGCUCTT-3 ‘(νοηματικό).

Η ακολουθία για EGFR siRNA ήταν: 5′-GCAGUCUUAUCUAACUAUGAUGCAA-3 ‘(έννοια)

Η ακολουθία για Ετα siRNA ήταν:. 5′-AUCAGGUGGAUCAAAGUGUCUGUGA-3′. (λογική)

Αποτελέσματα

Τα οιστρογόνα που προκαλείται φωσφορυλίωση της FAK στη τυροσίνη 397 σε RL95-2 καρκίνο του ενδομητρίου κύτταρα

Ένα ΕΡα-αρνητικό, GPR30 θετικά RL95-2 καρκίνο του ενδομητρίου κυτταρική σειρά ιδρύθηκε από στερώντας RL95-2 κύτταρα του οιστρογόνου σε μερικούς διόδων (Εικ. 1Α). Χρησιμοποιώντας ένα σύνολο φωσφόρου κινάσης συστοιχίες, θεραπεία του ΕΚα-αρνητικών RL95-2 ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα με Ε2 για 5 λεπτά επαγόμενη σημαντικά φωσφορυλίωση των ERK1 /2 και της FAK στα Y397 (Εικ. 1Β). Ποσοτικά, τα επίπεδα φωσφορυλιωμένης ERK1 /2 και FAK ρυθμίστηκαν προς τα πάνω κατά 1,4 και 1,9 πτυχώσεις, αντίστοιχα, μετά την επεξεργασία της Ε2 σε σύγκριση με τον έλεγχο (DMSO) σε κύτταρα RL95-2 (Εικ. 1 C).

(Α) έκφραση ΕΚα και GPR30 σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα. Σε RL95-2 κύτταρα, GPR30 ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται όπου ΕΡα δεν εκφράστηκε μετά από αρκετές κυτταρικές διόδους με την στέρηση οιστρογόνων. Σε αντίθεση, τα κύτταρα Ishikawa εκφράζεται τόσο ΕΚα και GPR30. (Β) Φωσφορυλίωση αμφοτέρων ERK και FAK αυξήθηκε μετά την κατεργασία του ΕΚα-αρνητικών κυττάρων RL95-2 με Ε2 (1 μΜ), χρησιμοποιώντας ένα σύνολο συστοιχιών φωσφορυλίωσης. (C) Διπλώστε αλλαγές της φωσφορυλίωσης της ERK και ΡΑΚ στις συστοιχίες φωσφορυλίωσης (Β) δείχνονται. DMSO χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος σε σύγκριση με εφέ Ε2. Αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD).

Η

οιστρογόνο επαγόμενη φωσφορυλίωση της ERK και ΡΑΚ κατά Y397 μέσω GPR30 σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα με ή χωρίς πυρηνική Ετα

ΕΚα-αρνητικά RL95-2 κυττάρων, τα επίπεδα έκφρασης των φωσφορυλιωμένων ERK και φωσφορυλιωμένη FAK κατά Y397 αυξήθηκαν σημαντικά μετά τη θεραπεία είτε Ε2, G1 (ένας αγωνιστής GPR30) ή ταμοξιφένη (ανταγωνιστής ΟΗΤ, ΕΡα) για 5 λεπτά (Σχ. 2Α και 2C). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε καρκίνο του ενδομητρίου Ishikawa κύτταρα τα οποία ήταν και τα δύο ΕΚα-θετικά και GPR30-θετικό (Σχ. 2Β και 2D). Χρησιμοποιώντας ένα ειδικό GPR30 shRNA ή siRNA που στοχεύει, η ενδογενής έκφραση του GPR30 κατεστάλη στα δύο κύτταρα RL95-2 και Ishikawa (Σχ. 2Ε και 2F). Στη συνέχεια, Ε2-επαγόμενη φωσφορυλίωση της FAK στα Y397 καταργήθηκαν σε κύτταρα με GPR30 νοκ ντάουν (Σχ. 2Ε και 2F). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η Ε2-επαγόμενη φωσφορυλίωση της FAK κατά Y397 ήταν μεσολάβηση GPR30 (το μη-γονιδιωματικό οιστρογονική οδό σηματοδότησης) σε GPR30-θετικά ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα, με ή χωρίς τον υποδοχέα πυρηνικής ΕΚα. Ωστόσο, knockdown του ΕΚα χρησιμοποιώντας siRNA μερικώς καταργηθεί φωσφορυλίωση των FAK επαχθεί από την Ε2 και ΟΗΤ σε κύτταρα Ishikawa (GPR30-θετικά και ΕΚα-θετικά) (Σχ. 2G). Ομοίως, Ε2- και ΟΗΤ επαγόμενη φωσφορυλίωση των FAK επίσης αποκλειστεί παρουσία ICI 182,780 (ένας ανταγωνιστής του ΕΚα) (Σχ. 2Η). Συλλογικά, Ε2 και ΟΗΤ μπορεί να επάγει φωσφορυλίωση του ΡΑΚ τόσο μέσω GPR30 και πυρηνικών ΕΚα.

RL95-2 (A, C, E) και τα κύτταρα Ishikawa (Β, D, F) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μΜ Ε2, G1 και ΟΗΤ επί 5 λεπτά. Η φωσφορυλιωμένη ERK1 /2 (pERK) (Α, Β) και FAK στα Y397 (pFAK) (C, D) ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. Αυξημένα επίπεδα pERK και pFAK δείχθηκε μετά από αγωγή με Ε2, G1 και ΟΗΤ σε σύγκριση με τον έλεγχο (DMSO). Η ενδογενής GPR30 χτυπήθηκε κάτω από shRNA σε RL95-2 (Ε) ή με siRNA σε κύτταρα Ishikawa (F). Μετά τη θεραπεία με 1 μΜ Ε2 και ΟΗΤ επί 5 λεπτά, τα επίπεδα του pFAK είχαν κατασταλεί σε αμφότερες ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα με knockdown του GPR30 (E, F). (G) σε κύτταρα Ishikawa, νοκ ντάουν της Ετα χρήση siRNA μερικώς καταργηθεί φωσφορυλίωση της FAK που προκαλείται από Ε2 και ΟΗΤ. Ομοίως, Ε2- και ΟΗΤ επαγόμενη φωσφορυλίωση των FAK επίσης αποκλειστεί παρουσία ICI 182,780 (ένας ανταγωνιστής του ΕΚα) (Η). Αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD).

Η

Το οιστρογόνο που επάγεται μετανάστευση των κυττάρων έγινε μέσω GPR30 και ΡΑΚ σηματοδότησης σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα

Από ΡΑΚ έχει αναφερθεί ότι δρα ως κινάση της τυροσίνης και παίζουν ένα ρόλο στην εισβολή των κυττάρων του όγκου [33], εξετάσαμε περαιτέρω την μετανάστευση των κυττάρων RL95-2 και Ishikawa μέσω GPR30-ΡΑΚ μονοπάτι παρουσία Ε2 ή ταμοξιφαίνη (ΟΗΤ ) από φρεατίων δοκιμασία μετανάστευσης. Για να αναλύσουμε περαιτέρω το ρόλο της φωσφορυλιωμένης FAK στη μετανάστευση των κυττάρων, ένα ΡΑΚ-ειδικός αναστολέας πρόληψη φωσφορυλίωσης FAK κατά Y397 (ΡΑΚ αναστολέας 14) [34] χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν μεταβολές στο επίπεδο της φωσφορυλιωμένης FAK στα Y397 και την επακόλουθη επίδρασή της στην κυτταρική μετανάστευση . Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α και 3Β, η φωσφορυλίωση της FAK στα Y397 επαχθεί από την Ε2 ή ΟΗΤ αποκλείστηκαν με FAK αναστολέα 14. Θεραπεία της Ε2 και ΟΗΤ διεγείρεται κυτταρική μετανάστευση κατά 2,3 και 2,5 πτυχώσεις σε κύτταρα RL95-2, και κατά 2,3 και 1,9 πτυχώσεις σε κύτταρα Ishikawa , αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον έλεγχο (DMSO). Αντίθετα, Ε2 ή ΟΗΤ επαγόμενη κυτταρική μετανάστευση καταργήθηκαν με την κατεργασία με FAK αναστολέα 14 σε κύτταρα RL95-2 και Ishikawa (Σχ. 3C και 3D). Διερευνήσαμε επίσης το ρόλο του GPR30 στη μετανάστευση των κυττάρων που προκαλείται από Ε2 ή ΟΗΤ (Σχ. 3Ε και 3F). Η ικανότητα μετανάστευσης προκλήθηκε με 2.1 πτυχώσεις (σε RL95-2 κύτταρα) και 2,4 πτυχώσεις (σε κύτταρα Ishikawa) παρουσία του Ε2 σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο shRNA, και την επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης μετά την αγωγή με Ε2 έχει αποκλειστεί και στις δύο κύτταρα με GPR30 νοκ ντάουν. Ομοίως, ταμοξιφένη (ΟΗΤ) ενεργοποιείται κυτταρική μετανάστευση κατά 1,7 πτυχώσεις (σε RL95-2 κύτταρα) και 2,4 πτυχώσεις (σε κύτταρα Ishikawa), και αυτά τα αποτελέσματα ανεστάλησαν στα δύο κύτταρα με knockdown του GPR30. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης από το οιστρογόνο και tamoxifen προκαλείται μέσω GPR30 σηματοδότηση και τη φωσφορυλίωση της FAK κατά Y397 σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα.

RL95-2 κύτταρα (Α) και τα κύτταρα Ishikawa (Β) ήταν προ-αγωγή με ΡΑΚ αναστολέα 14 (15 μΜ) για 2 ώρες, στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1 μΜ Ε2 ή ΟΗΤ για 5 λεπτά, και κυτταρολύματα αναλύθηκαν μέσω στυπώματος Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον pFAK Y397. Τα επίπεδα έκφρασης του pFAK στο Y397 επαχθεί από την Ε2 ή ΟΗΤ κατεστάλησαν με FAK inhibitor14. Ε2- και OHT- μετανάστευση που προκαλείται από κύτταρο επίσης καταργηθεί με την παρουσία του FAK αναστολέα 14 στην RL95-2 (C) και τα κύτταρα Ishikawa (D). Μετά knockdown ενδογενών GPR30 σε κύτταρα RL95-2 (Ε) και τα κύτταρα Ishikawa (F), η μετανάστευση των κυττάρων αναστάλθηκε σε σύγκριση με ψευδο εξάντληση. Αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD).

Η

E2, G1 και ΟΗΤ επαγόμενη φωσφορυλίωση της FAK μέσω EGFR-ΡΙ3Κ-ΕΚΚ μονοπάτι σε RL95-2 καρκίνο του ενδομητρίου κύτταρα

GPR30 διαενεργοποιεί υποδοχείς του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFRs) και με τη σειρά του ενεργοποιεί κατάντη signalings συμπεριλαμβανομένων ενεργοποιημένων από μιτογόνο κινασών πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) και φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάσες (ΡΙ3Κ) οδών [2]. Είναι επίσης προφανές ότι ΡΙ3Κ ρυθμίζει φωσφορυλίωση της FAK κατά Y397, το πρώτο βήμα για την ενεργοποίηση FAK [35]. Για να βεβαιωθείτε ότι τα οιστρογόνα που προκαλείται από σηματοδότηση GPR30 επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση του EGFR /PI3K /FAK μονοπατιού στο ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε ειδικούς αναστολείς ή siRNA να δοκιμάσουν αυτή την οδό. Πρώτον, knockdown έκφρασης EGFR με siRNA ή απόφραξη της δραστηριότητας τυροσίνης κινάσης του χρησιμοποιώντας λαπατινίμπη (έναν αναστολέα EGFR) ανέστειλε φωσφορυλίωση των FAK επαχθεί από την Ε2, G1 ή ΟΗΤ σε RL95-2 ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα (Σχ. 4D και 4Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι οιστρογόνα επαγόμενη σηματοδότηση GPR30 προκαλείται μέσω EGFR. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση τόσο της ΑΚΤ και ERK ήταν επίσης καταστέλλεται μετά την εφαρμογή του siRNA που στοχεύει EGFR ή λαπατινίμπη (Σχ. 4D και 4Ε), πρότεινε ότι ΡΙ3Κ μπορεί να εμπλέκεται στα κατάντη του EGFR. Πράγματι, η θεραπεία της Wortmanin, ενός αναστολέα της ΡΙ3Κ, μπλοκάρει φωσφορυλίωση της FAK στα Y397 επαχθεί από την Ε2, G1 ή ΟΗΤ σε RL95-2 καρκίνο του ενδομητρίου κύτταρα. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώνουν περαιτέρω προηγούμενες εκθέσεις που Ε2 ενεργοποιείται σηματοδοτικό μονοπάτι GPR30 είναι μέσω της PI3K και ERK1 /2 κατάντη σήματα [36]. Επιπλέον, η καταστολή της δραστηριότητας ΕΚΚ από PD98059 (αναστολέας ΕΚΚ) απέτρεψε επίσης φωσφορυλίωση της FAK στα Y397. Μαζί, αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι E2-επαγόμενη φωσφορυλίωση της FAK προκαλείται μέσω μονοπατιού σηματοδότησης EGFR GPR30–ΡΙ3Κ-ΕΚΚ.

RL95-2 κύτταρα προκατεργάστηκαν με αναστολέα ΕΚΚ (PD98059, 100 μΜ) ή έναν αναστολέα ΡΙ3Κ ( Wortmanin, 100 ηΜ) για 1 ώρα που ακολουθείται από τη χορήγηση του 1 μΜ (Α) Ε2, (Β) G1 ή (Γ) ΟΗΤ επί 5 λεπτά. Οι αναστολείς ERK και ΡΙ3Κ κατέστειλε φωσφορυλίωση του ΡΑΚ με την παρουσία της Ε2, G1 ή ΟΗΤ. (Δ) Η φωσφορυλίωση της FAK, ΑΚΤ και ERK καταστάλθηκε σε RL95-2 κυττάρων με knockdown του EGFR χρησιμοποιώντας siRNA μετά τη θεραπεία με 1 μΜ Ε2, G1 ή ΟΗΤ επί 5 λεπτά. (Ε) με την εξαίρεση των Src, την φωσφορυλίωση των FAK, ΑΚΤ, ERK και EGFR καταργήθηκε σε κύτταρα RL95-2 προεπεξεργασία με 120 ηΜ λαπατινίμπη (ένας αναστολέας του EGFR) για 2 ώρες που ακολουθείται από κατεργασία με 1 μΜ Ε2, G1 ή ΟΗΤ για 5 λεπτά. (F) σε κύτταρα RL95-2, Ε2-, G1- και ΟΗΤ επαγόμενη φωσφορυλίωση των FAK, τόσο σε 397 και 576/577 ήταν καταστέλλεται με την παρουσία του αναστολέα Src 1. Τα αποτελέσματα δείχνονται ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD).

η

η συμμετοχή της Src στην φωσφορυλίωση της FAK που προκαλείται από Ε2, G1 και ΟΗΤ στη RL95-2 καρκίνο του ενδομητρίου κύτταρα

Για την επαλήθευση των συμμετοχή των Src στην φωσφορυλίωση των FAK, έχουμε προ-επεξεργασμένα RL95-2 κυττάρων με 50 ηΜ Src αναστολέα 1 για 24 ώρες ακολουθούμενη από κατεργασία με 1 μΜ Ε2, G1 ή ΟΗΤ επί 5 λεπτά. Κατά συνέπεια, Ε2-, G1- και ΟΗΤ επαγόμενη φωσφορυλίωση των FAK, τόσο σε 397 και 576/577 ήταν καταστέλλεται παρουσία Src αναστολέα 1 (Εικ. 4στ), υποδεικνύοντας ότι Src εμπλέκεται στην οδό σηματοδότησης GPR30-EGFR. Ωστόσο, σε αντίθεση μειωμένη φωσφορυλίωση της FAK με λαπατινίμπη (ένας αναστολέας EGFR), ο φωσφορυλίωση της Src δεν ήταν καταργήθηκε με την παρουσία της λαπατινίμπης σε κύτταρα RL95-2 (Εικ. 4Ε), υποδηλώνοντας ότι η φωσφορυλίωση της Src μπορεί να ρυθμίζεται ταυτόχρονα από άλλες μονοπάτια σηματοδότησης αντί EGFR.

Η συμμετοχή της φωσφορυλίωσης του FAK στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα ενδομητρίου

Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι η φωσφορυλίωση της FAK εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [38] και ότι c-fos (ένα γονίδιο στόχος του GPR30) παίζουν επίσης ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [11]. Για την επαλήθευση του ρόλου της φωσφορυλίωσης του FAK στη ρύθμιση της c-fos, η έκφραση του mRNA του c-fos επάγεται από G1 (ένας συναγωνιστής GPR30) παρουσία ή απουσία FAK αναστολέα 14 προσδιορίστηκε με Taqman πραγματικού χρόνου αλυσίδα ποσοτικής αντίδρασης πολυμεράσης ( PCR) σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα. Κατά συνέπεια, η έκφραση του mRNA του c-fos επάγεται από G1 καταργήθηκε με την παρουσία του FAK αναστολέα 14 και στα δύο του ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα RL95-2 και Ishikawa (Σχήμα S1). Χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία incorportation BrdU, κυτταρικό πολλαπλασιασμό των RL95-2 επαχθεί από την Ε2 ή ΟΗΤ ουσιαστικά καταστέλλεται παρουσία FAK αναστολέα 14 (σχήμα S2). Τα ευρήματα έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση της FAK έπαιξε ρόλο στη ρύθμιση της c-fos και με τη σειρά του πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

Η έκφραση της GPR30 και φωσφορυλιωμένη FAK σε Y397 στο ανθρώπινο ενδομήτριο καρκινικούς ιστούς

Από μας ευρήματα απέδειξαν ότι η GPR30 μεσολάβηση οιστρογόνου οδηγεί σε φωσφορυλίωση της FAK και επακόλουθη κυτταρική μετανάστευση σηματοδότησης, επιθυμούμε να διερευνήσει περαιτέρω την ασθένεια συσχέτιση αυτού του μονοπατιού σε κλινικά δείγματα. Για να γίνει αυτό, θα χρησιμοποιηθούν για ανοσοϊστοχημική χρώση για την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση της έκφρασης των ΕΚα, GPR30 και pFAK στο ανθρώπινο ενδομήτριο καρκίνους. Όπως έδειξε στα Σχ. 5Α και 5Β, η ανθρώπινη ενδομητρίου καρκίνων (n = 24) με χαμηλή έκφραση της πυρηνικής ΕΚα (histoscore ≤45) βρέθηκαν να έχουν σημαντικά υψηλότερη έκφραση τόσο GPR30 και pFAK σε σύγκριση με εκείνα (n = 25) με υψηλή ΕΚα (histoscore & gt ? 45) (ρ & lt? 0,0001) (Πίνακας 1). Κλινικά, περιπτώσεις με χαμηλή έκφραση του πυρηνικού Ετα μελετηθεί αποκαλύψει αποδεικτικά στοιχεία για αυξημένη τάση για εισβολή (σταδιοποίηση από ΙΒ IVA). Επιπλέον, το επίπεδο της φωσφορυλιωμένη FAK συσχετίστηκε σημαντικά με την έκφραση της GPR30 στην ανθρώπινη ενδομητρίου καρκίνων με χαμηλή Ετα (p & lt? 0,05) (Εικ. 5C), αλλά καμία τέτοια συσχέτιση διαπιστώθηκε μεταξύ της Ετα και pFAK

(Σχήμα 5D.).

(Α) σε κλινικά δείγματα ανθρώπινου ενδομήτριου καρκίνων με χαμηλή έκφραση του ΕΚα (histoscore = 10), σχετικά υψηλή έκφραση του GPR30 (histoscore = 270) και pFAK (histoscore = 225) παρατηρήθηκαν (40 × μεγέθυνση του αντικειμένου φακός). (Β) Οι histoscores τόσο GPR30 και pFAK ήταν χαμηλότερες σε ανθρώπινους καρκίνους ενδομητρίου με υψηλή ER (histoscore & gt? 45, αριστερό πάνελ) σε σύγκριση με εκείνους με χαμηλή ER (histoscore ≤45, δεξί πάνελ). (C) Υπήρξε θετική συσχέτιση της histoscores μεταξύ pFAK και GPR30 στο ανθρώπινο ενδομήτριο καρκίνους με χαμηλή Ετα. (Δ) Δεν βρέθηκε σε histoscores μεταξύ pFAK και ΕΡα στο ανθρώπινο ενδομήτριο καρκίνους. NS:. Μη σημαντική

Η

Συζήτηση

GPR30 έχει προταθεί για να ενεργεί ως υποδοχέα στεροειδών εντοπισμένη είτε στη μεμβράνη των κυττάρων του πλάσματος ή στο ενδοπλασματικό δίκτυο και να μεσολαβήσει ταχεία δράση των οιστρογόνων [21], [22]. Είναι επίσης προφανές ότι GPR30 προκαλεί κυτταρικό πολλαπλασιασμό μέσω της ενεργοποίησης του φωσφοκινασών, π.χ. φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) και ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ), σε απόκριση σε οιστρογόνο και tamoxifen [7], [8], [11]. Παρ ‘όλα αυτά, υπάρχουν μερικές αναφορές που δείχνουν ότι το οιστρογόνο δρα ανεξάρτητα από GPR30 σε ορισμένους ειδικούς τύπους κυττάρων [39] – [42]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μια μελέτη έχει δείξει ότι GPR30 είναι ανίκανη να μεσολαβεί δράση οιστρογόνων, όπως η αποτυχία ενεργοποίησης cAMP, ERK ή ΡΙ3Κ μετά τη θεραπεία με οιστρογόνα, σε ενδοθηλιακά κύτταρα χωρίς ΕΚα και ΕΚβ [41]. Στην παρούσα μελέτη, knockdown του GPR30 σε RL95-2 και καρκίνου του ενδομητρίου Ishikawa κύτταρα κατήργησε Ε2 και tamoxifen επαγόμενη φωσφορυλίωση των FAK και κατήργησε την επακόλουθη μετανάστευση των κυττάρων (Σχ. 2Ε, 2F, 3ε και 3στ), υποδεικνύοντας ότι GPR30 είναι ικανή να διαμεσολαβεί δράση των οιστρογόνων στον καρκίνο του ενδομητρίου κύτταρα με ή χωρίς πυρηνικά Ετα.

η ταμοξιφαίνη είναι ένας εκλεκτικός ρυθμιστής των οιστρογονικών υποδοχέων (SERM), που ενεργεί ως ανταγωνιστής ΕΡα στο στήθος, αλλά ένα ασθενές οιστρογόνο στο ενδομήτριο. αντικαρκινική θεραπεία με ταμοξιφένη στον καρκίνο του μαστού σχετίζεται με αυξημένη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του ενδομητρίου [43] – [46]. Μηχανιστικά, η ταμοξιφένη ενεργοποιεί ΜΑΡΚ μονοπάτι μέσω GPR30 για την προώθηση του πολλαπλασιασμού του ενδομήτριου καρκινικών κυττάρων [47]. Όπως και με την προώθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ταμοξιφένη ενεργοποίησε το μονοπάτι FAK στα δύο RL95-2 και Ishikawa ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα (Σχ. 3Α, 3Β, 3C και 3D). Επιπλέον, τα αποτελέσματα που αφορούν εξάντληση GPR30 έδειξε ότι GPR30 ήταν απαραίτητη για την προώθηση της ταμοξιφένη προκαλούμενη κυτταρικής μετανάστευσης ενδομητριακών καρκίνων (Σχ. 3Ε και 3F). Συλλογικά, ταμοξιφαίνη είναι ικανή να προκαλεί μετανάστευση κυττάρων μέσω GPR30 σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα με ή χωρίς πυρηνική ΕΚα.

Υπάρχουν στοιχεία που αποδεικνύουν ότι τα οιστρογόνα ενεργοποιεί τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) μονοπάτι μέσω GPR30 σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [36 ]. Λαπατινίμπη είναι ένας αναστολέας τυροσίνης κινάσης του EGFR και μπλοκάρει EGFR κατάντη σηματοδότησης σε καρκινικές κυτταρικές [48]. Σε αυτή τη μελέτη, η λαπατινίμπη καταπιεσμένη τη φωσφορυλίωση της FAK επάγεται τόσο από Ε2 και tamoxifen ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα (Σχ. 4Ε). Επιπλέον, knockdown έκφρασης EGFR με siRNA ανέστειλε επίσης Ε2- και φωσφορυλίωση ταμοξιφένη επαγόμενη από FAK στα καρκινικά κύτταρα του ενδομητρίου (Εικ. 4D). Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι EGFR είναι ουσιαστική για την GPR30 μεσολάβηση μονοπάτι και περαιτέρω υποστηρίζουν την ιδέα ότι λαπατινίμπη, σε συνδυασμό με την ταμοξιφαίνη, μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ασθενείς με καρκίνους του μαστού για την πρόληψη της ανάπτυξης του καρκίνου του ενδομητρίου [49].

η μετανάστευση των κυττάρων είναι ένα κρίσιμο χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων που επηρεάζει όγκου επεμβατική δυναμικό σε γειτονικούς ιστούς. Μία καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού της κυτταρικής μετανάστευσης που προκαλείται από οιστρογόνα είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη αποδοτικών θεραπείες για τον καρκίνο του ενδομητρίου. Από αυτή την άποψη, ΡΑΚ έχει αναγνωριστεί για τον εντοπισμό στην μεμβράνη πλάσματος σε θέσεις σχηματισμού εστιακού συμπλοκών πρόσφυση και δρα ως ρυθμιστής κλειδί της μετανάστευσης των κυττάρων και των κυττάρων εισβολής που περιλαμβάνει πρωτεολυτική αποδόμηση της εξωκυτταρικής μήτρας [47]. Αποτελέσματα από την παρούσα μελέτη έδειξε επίσης ότι η οδός FAK διαδραμάτισε σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση κυτταρική μετανάστευση που προκαλείται από Ε2 και tamoxifen σε RL95-2 και Ishikawa ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα (Σχ. 3Α, 3Β, 3C και 3D). Επιπλέον, μελέτες που χρησιμοποιούν αναστολείς και siRNA απέδειξε επίσης ότι FAK εξαρτώμενη κυτταρική μετανάστευση προκαλείται μέσω EGFR, ΡΙ3Κ και ERK (Σχ. 4Α, 4Β, 4C, 4D και 4Ε). Συλλογικά, τα δεδομένα μας πρότειναν ότι τα οιστρογόνα που προκαλείται κυτταρική μετανάστευση προκαλείται μέσω της ενεργοποίησης των ΡΙ3Κ /ΕΚΚ /FAK οδού σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα με χαμηλή ή χωρίς πυρηνική ΕΚα.

Noteworthily, είναι επίσης δυνατόν ότι τα οιστρογόνα που προκαλείται μετανάστευση κυττάρων επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση του αυξητικού παράγοντα του συνδετικού (CTGF). Μια προηγούμενη έκθεση έδειξε ότι CTGF είναι ένα γονίδιο στόχος GPR30 και GPR30 σηματοδότηση προάγει την κυτταρική μετανάστευση μέσω της επαγωγής του CTGF σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού ER-αρνητική [37]. Αυτή η οδός πρέπει να αξιολογηθεί για τη διαλεύκανση περαιτέρω το μηχανισμό της επαγόμενης από οιστρογόνο κυτταρική μετανάστευση σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα.

Παθολογικά, οι τύπου 1 ανθρώπινης ενδομητρίου καρκίνων οιστρογόνο-ευαίσθητα και έχουν καλή πρόγνωση, ενώ τύπου 2 ανθρώπινες ενδομήτριες καρκίνων δεν συνδέονται με αυξημένη έκθεση σε οιστρογόνα και να χειρότερη πρόγνωση [50]. Στην παρούσα μελέτη, τα ανθρώπινα ενδομητρίου καρκίνων (n = 24) με χαμηλό Ετα βρέθηκαν να εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα GPR30 και pFAK σε σύγκριση με εκείνα (n = 25) με υψηλή ΕΚα (Εικ. 5Β και Πίνακας 1). Επιπλέον, GPR30 και pFAK σχετίστηκαν θετικά στο ανθρώπινο ενδομήτριο καρκίνους με χαμηλή Ετα, αλλά καμία τέτοια συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ ΕΡα και pFAK (Εικ. 5C και 5D). Αυτά τα αποτελέσματα από τα

in vivo

μελέτες έδειξαν ότι ενδομητρίου καρκίνων με χαμηλή ΕΚα θα μπορούσε να είναι εξαιρετικά ευαίσθητα σε οιστρογόνα. Συνεπώς, αυτές οι καρκίνοι του ενδομητρίου με χαμηλή ΕΚα ενδέχεται να εκφράσει υψηλότερα επίπεδα GPR30 και pFAK ακόμη και με χαμηλά επίπεδα κυκλοφορίας των οιστρογόνων στον ορό και χωρίς την προσθήκη εξωγενούς οιστρογόνου, πράγμα που σημαίνει ότι έχουν τη δυνατότητα να εισβάλλουν γειτονικούς ιστούς.