Αφηρημένο

Ανθρώπινο bocavirus είναι το δεύτερο αυτόνομο ανθρώπινο παρβοϊό με υποτεθεί παθογόνο δυναμικό. Άλλες παρβοϊούς είναι γνωστό ότι διατηρείται και ακόμη ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του ξενιστή, συμβάλλοντας τελικά στην πολλαπλών σταδίων ανάπτυξης του καρκίνου. Ανθρώπινα bocavirus επιμένει επίσης σε ένα άγνωστο ποσοστό των κλινικά ασυμπτωματικούς ασθενείς εκτός από εκείνους με πρωτογενή μόλυνση. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η ανάλυση του ρόλου των ανθρώπινων bocavirus στον πνεύμονα και του παχέος εντέρου. Ως εκ τούτου,, εγκλεισμένοι σε παραφίνη, αρχειοθετημένα δείγματα όγκων σταθεροποιημένο με φορμαλίνη σαρώθηκαν για τα Ανθρώπινα DNA bocavirus με PCR, κηλίδωση Southern, και αλληλούχιση. Θετικές ιστοί υποβλήθηκαν περαιτέρω σε φθορισμό σε ανάλυση in situ υβριδισμού για την ανίχνευση ειδικά ανθρώπινο DNA bocavirus στα μολυσμένα κύτταρα. Συνολικά, 11 από τα 60 (18,3%) των πνευμόνων και 9 από τα 44 (20,5%) του παχέος όγκους ήταν θετικοί για το ανθρώπινο DNA bocavirus με PCR και επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση και φθορισμό στην ανάλυση υβριδισμού επί τόπου. Έτσι, το ανθρώπινο DNA bocavirus είναι παρούσα στους πυρήνες των μολυσμένων κυττάρων, είτε σε μονές ή πολλαπλά αντίγραφα, και φαίνεται να σχηματίσουν αλυσιδωτής σύνδεσης. Η εμφάνιση αυτών των δομών ανθρώπινης bocavirus DNA υποστηρίζει την ύπαρξη της μικρού σ- ή του τροχαίου-φουρκέτα μηχανισμός αντιγραφής. Επιπλέον, ο φθορισμός in situ υβριδισμού μοτίβα ενέπνευσε την υπόθεση ότι το ανθρώπινο DNA bocavirus είτε παραμένει ως cccDNA ή είναι ενσωματωμένο στο γονιδίωμα του ξενιστή. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι ο ιός αυτός μπορεί να συνεισφέρει έμμεσα στην ανάπτυξη ορισμένων μορφών καρκίνου του παχέος εντέρου και του πνεύμονα, όπως και άλλοι ιοί DNA, όπως ο ιός της ανθρώπινης ηπατίτιδας Β, ή μπορεί να παίζει ενεργό ρόλο στον καρκίνο από την αλληλεπίδραση με το γονιδίωμα του ξενιστή.

Παράθεση: Schildgen V, Malecki Μ, Tillmann RL, Brockmann Μ, Schildgen O (2013) Η ανθρώπινη Bocavirus έχει σχέση με ορισμένες πνεύμονα και του παχέος εντέρου και εμμένει σε συμπαγείς όγκους. PLoS ONE 8 (6): e68020. doi: 10.1371 /journal.pone.0068020

Επιμέλεια: Amit Kapoor, το Πανεπιστήμιο Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8, Φλεβάρη του 2013? Αποδεκτές: 24 Μάη 2013? Δημοσιεύθηκε: 27 Ιουνίου του 2013

Copyright: © 2013 Schildgen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση χωρίς περιορισμό από την Else Kröner-Fresenius Stiftung, Γερμανία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

από την ανακάλυψή του το 2005 από τον Tobias Allander [1], υπάρχουν αυξανόμενα στοιχεία ότι οι εκτεταμένες ανθρώπινες bocavirus (HBoV) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος (υπότυπος 1), και γαστρεντερικές λοιμώξεις (υπότυποι 2- 4) [2-6]. Επιπλέον, HBoV είναι η τέταρτη πιο κοινή ιός ανιχνεύεται σε λοιμώξεις του αναπνευστικού [7] και θεωρείται ότι είναι η δεύτερη παρβοϊός που είναι ικανός να μολύνει τον άνθρωπο με τη δυνατότητα να προκαλέσει κλινική νόσο. Ωστόσο, ο ρόλος του στην γαστρεντερικές λοιμώξεις είναι πλέον σε αμφιβολία βασίζεται σε ένα μυθιστόρημα μελέτη από το Ηνωμένο Βασίλειο [8].

Προηγουμένως, ομάδα εντοπίστηκαν αλληλουχίες DNA μας περιέχει «head-to-ουρά» θραύσματα γονιδιώματος που συνδέονται με μια νέα προσδιορίζονται τέντωμα συνδετήρα. Μετά τη δημοσίευση, η παρατήρηση ότι οι αλληλουχίες «head-to-ουρά» να συμβεί για HBoV υποτύπου 1 επιβεβαιώθηκε από Kapoor και οι συνεργάτες του, οι οποίοι προσδιορίζονται αυτές τις δομές ως επισωματικό ομοιοπολικά κλειστό κυκλικό (CCC) του DNA σε ασθενείς που έχουν μολυνθεί με HBoV υπότυπο 3 [9]. Kapoor και οι συνεργάτες του, καθώς και ομάδες από την Κίνα [10,11] και στις ΗΠΑ [12], κατέληξε στο συμπέρασμα ότι αυτές οι δομές cccDNA μπορεί να είναι ιογενής γονιδιώματα εμμονή σε αυτά τα κύτταρα. Το συμπέρασμα αυτό υποστηρίζει την υπόθεση ότι HBoV μπορεί να παραμείνουν στο μολυσμένο ξενιστή και μπορούν να υπάρχουν σε ένα ασυμπτωματικό αλλά παραγωγική κατάσταση, η οποία με τη σειρά της θα μπορούσε να εξηγήσει το σχετικά υψηλό ποσοστό των ασυμπτωματικών ασθενών που ρίξει τον ιό.

Ένα άλλο παράδειγμα ενός ιός DNA που επιμένει σε ένα ομοιοπολικά κλειστό κυκλικό δομή και επάγει βλάβη ιστού είναι ο ιός της ανθρώπινης ηπατίτιδας Β (HBV). Σε όλες τις χρόνιες λοιμώξεις HBV, cccDNA υπάρχει σε ηπατικά κύτταρα, και αυτό cccDNA εμμονή προκαλεί χρόνια φλεγμονή που δεν επηρεάζει την κατάσταση του ασθενούς για μεγάλο χρονικό διάστημα, αλλά σιγά-σιγά οδηγεί σε ήπαρ ίνωση, κίρρωση, και, τέλος, του καρκίνου σε ένα αξιοσημείωτο ποσοστό χρόνιας λοιμώξεις HBV [13-17].

Δεδομένου ότι άλλοι parvoviruses είναι σε θέση να ενσωματώσει στο γονιδίωμα του ξενιστή [18], και το πρώτο γνωστό παθογόνο ανθρώπινο παρβοϊό, παρβοϊό Β19, συνδέεται με διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των λεμφωμάτων [ ,,,0],19], των όρχεων όγκους [20], θηλώδες και αναπλαστικό θυρεοειδή καρκινώματα [21,22], και χρόνιες φλεγμονώδεις ασθένειες όπως θυρεοειδίτιδα του Hashimoto [23], φαίνεται δυνατόν καρδιομυοπάθεια και μυοκαρδίτιδα [24] ένας παρόμοιος μηχανισμός για HBoV σχετιζόμενη παθογένεση.

Η πορεία της νόσου από τους στενότερους συγγενείς HBOV, δηλαδή, βόεια παρβοϊό (BPV) και λεπτά ιού του σκύλου (MVC, CNMV, επίσης γνωστή ως CPV-1), τα αποτελέσματα από μια αρχική μόλυνση του αεραγωγού, που ακολουθείται από η μόλυνση του εντέρου και την επακόλουθη απόπτωση μέσω της αναπνευστικής /εντερική οδό [25]. Οι υποθέσεις που HBoV μπορεί να επιμείνει σε οποιοδήποτε όργανο-στόχο και ότι οι προσβεβλημένων ιστών βιώνουν μακροχρόνια βλάβη θα πρέπει, συνεπώς, να ελεγχθεί.

Έτσι, εξέτασε το ζήτημα του κατά πόσον HBoV, κατ ‘αναλογία με τον ιό της ηπατίτιδας Β, μπορεί να να ανιχνευθεί σε όγκους. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η παθογένεση των μολύνσεων HBoV ξεκινά στους αεραγωγούς και καταλήγει στο γαστρεντερικό σωλήνα, αναλύσαμε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) όγκων και όγκων του παχέως εντέρου. Και οι δύο είναι καρκίνοι στους οποίους ανάπτυξη του όγκου είναι ελάχιστα κατανοητή και στην οποία μια ιογενής συνεισφορά δεν έχει αποκλειστεί μέχρι στιγμής [26-29].

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι και σύμφωνα με ψηφοφορία της επιτροπής δεοντολογίας του Ιδιωτικού Πανεπιστημίου Witten-Herdecke (ψηφίσουν όχι. 73/2012). Η ψηφοφορία ήταν ειδικά εγκεκριμένο για την παρούσα μελέτη. Λόγω της αναδρομικής φύσης και των δειγμάτων διπλά τυφλή ασθενή που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη, η επιτροπή δεοντολογίας κατέληξε στο συμπέρασμα ότι δεν ήταν απαραίτητη η γραπτή συγκατάθεση. Η ομάδα μελέτης αποτελούνταν αποκλειστικά από ενήλικες ασθενείς.

Τα δείγματα ασθενών

Εξήντα, τμήματα του πνεύμονα όγκου φορμόλη σταθερό εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) και 44 του παχέος όγκους επιλέχθηκαν τυχαία από αρχειοθετημένα δείγματα από τη ρουτίνα μας κλινικό εργαστήριο. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 69,21 χρόνια, με διάμεση τιμή των 71 χρόνων. Η μελέτη διεξήχθη αναδρομικά. Δεν απαιτούνται περαιτέρω κλινικά δεδομένα, συμπεριλαμβανομένου του καθεστώτος της θεραπείας, τη συμπεριφορά του καπνίσματος, ή τη θεραπεία του καρκίνου, χρησιμοποιήθηκαν επειδή οι πληροφορίες δεν θα είχε καμία επιρροή στην έκβαση της μελέτης. Ως έλεγχοι, χωρίς όγκο ιστού από την περιοχή του κάθε όγκου αναλύθηκε για HBoV εφόσον διατίθενται. Ένα επιπλέον δείγματα ιστού 10 χωρίς όγκο, υγιή πνεύμονα και του παχέος αναλύθηκαν για ανθρώπινο DNA bocavirus. Ως επιπλέον μάρτυρες, τα δείγματα από 10 ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) θετική τραχήλου όγκους και 10 του HPV του τραχήλου της μήτρας αρνητική όγκους καθώς και 10 όγκους του μαστού υποβλήθηκαν σε διαλογή για HBoV DNA. Όλα τα κλινικά δείγματα συλλέχθηκαν το 2011 και το 2012.

PCR και αναλύσεις PCR σε πραγματικό χρόνο

DNA από δείγματα ιστών FFPE εξήχθη χρησιμοποιώντας το Maxwell 16 FFPE κιτ ιστού (Promega, Mannheim, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. PCR και πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [30,31].

Sequencing

Τα δείγματα που βρέθηκαν θετικά με πραγματικού χρόνου PCR για ανθρώπινη bocavirus υποβλήθηκαν σε συμβατική PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές HBoV-LC-Ku-1 και HBoV-LC-Ku-2 [30,31]. ΡΟΚ-ενισχυμένο DNA φορτώθηκε σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1,5% σε ΤΑΕ ρυθμιστικό και ήταν γέλης εξάγεται πριν από την αλληλούχιση. εκχύλισης πηκτής διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα κιτ Qiagen Gel καθαρισμού (Qiagen, Hilden, Germany) ακολουθώντας αυστηρά το ένθετο της συσκευασίας. Για αλληλούχιση, καθαρισμένα προϊόντα PCR προαναμίχθηκαν με είτε τον εκκινητή HBoV-LC-Ku-1 ή εκκινητή HBoV-LC-Ku-2 και αποστέλλονται σε Eurofins MWG (Μόναχο, Γερμανία) για τη τριχοειδή Sanger προσδιορισμό αλληλουχίας. Οι αλληλουχίες FASTA ελήφθησαν υποβλήθηκαν σε αναλύσεις αλληλουχίας και την ευθυγράμμιση με χρήση του λογισμικού Vector ΝΤΙ 12.0 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany). Διεξήχθη αλληλούχιση για όλους τους όγκους που ήταν θετικοί για HBoV με PCR (n = 20).

Αναλύσεις FISH

αναλύσεις FISH πραγματοποιήθηκαν ουσιαστικά όπως περιγράφεται για άλλα συνήθως δοκιμάζονται βιοδείκτες, όπως HER2neu και EML4-ALK, όπως προγενέστερα είχαν δημοσιευθεί [32], με την τροποποίηση ότι χρησιμοποιήθηκαν HBoV- και GAPDH-ειδικούς ανιχνευτές, το τελευταίο ως έλεγχος. Οι ανιχνευτές σχεδιάστηκαν να υβριδοποιούνται πλησίον των δύο τερματικές περιοχές του γονιδιώματος HBoV ή τόσο στο 5′-άκρο και το 3′-άκρο του γονιδίου ελέγχου (GAPDH).

Η μέθοδος δοκιμής ήταν παρόμοια με την break-χώρια προσέγγιση FISH χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της EML4-alk. Όταν δύο ανιχνευτές προσδένονται σε στενή εγγύτητα μεταξύ τους, τα κόκκινα και πράσινα σήματα είναι αρκετά κοντά ώστε να εμφανίζονται ως ένα ενιαίο κίτρινο σήμα. Η κατάσταση αυτή θα μπορούσε να προκύψει αν οι γονιδιώματα HBoV προκύψει ως ομοιοπολικά κλειστό κυκλικό DNA, όπως περιγράφεται από τους Kapoor και συνεργάτες [9]. Σε αντίθεση, η οποία διακρίνεται σήματα διαχωρίζονται από τουλάχιστον δύο μήκη σήματος υποδεικνύουν ότι οι ανιχνευτές υβριδοποιήθηκαν σε διαφορετικές θέσεις, όπως σε μια γραμμική μορφή του γονιδιώματος bocavirus.

Οι ανιχνευτές παρατίθενται στον πίνακα 1. FISH διεξήχθη ως εξής : ιστοί FFPE όγκου, γύρω όγκου χωρίς ιστούς, και οι ιστοί ελέγχου κόπηκαν σε 3-μπι-φέτες πάχους και τοποθετημένα σε διαφάνειες. Ως έλεγχοι, τα ανθρώπινα κύτταρα HepG2 καλλιεργήθηκαν σε πλακίδια θαλάμου όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33] και επιμολύνονται με τα πλασμίδια ανθρώπινο bocavirus p5TRHBoV [34] και το πλασμίδιο ΡΤΑ-RSV pCR II-ΤΟΡΟ περιέχει μια μερική αλληλουχία γονιδίου RSV Ν) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη (Invitrogen, . Καρλσρούη, Γερμανία)

στόχος

Fluorochrome

εκπομπών

Ακολουθία

Τ

Μ

Τροποποίηση

GAPDH StartRhodamine GreengreenTCTACGAGCCTTGCGGGCTCCGGGTCTTTGCAGTCGTATG (40) & gt? 75 ° C5′-RGR , 3′-RGRGAPDH StopRhodamine RedredCTGGGGACTGGCTTTCCCATAATTTCCTTTCAAGGTGGGG (40) 74,6 ° C5′-ΚΚΕ, 3′-RREBoca Head SRhodamine GreengreenTCAGACTGCATCCGGTCTCCGGCGAGTGAACATCTCTGGG (40) & gt? 75 ° C5′-RGR, 3′-RGRBoca ουρά SRhodamine RedredGTTCCTCTCCAATGGACAAGWGGAAAGAAAAGGGTGACTG (40) 72,5 ° C5 ‘ -RRE, 3’-RRETable ανιχνευτές 1. FISH χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των HBoV και GAPDH γονίδια σε διαφάνειες FFPE του παχέος εντέρου και του πνεύμονα όγκους.

Όλες οι ανιχνευτές συζεύχθηκαν για να φθοροχρώματα στο 3′- και 5′-άκρα τους να ενισχύσουν τα σήματα φθορισμού. CSV Λήψη CSV

Διαφάνειες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με την ZytoLight SPEC ALK /EML4 TriCheck

πρωτόκολλο ανιχνευτή TM (ZytoVision, Bremerhaven, Γερμανία) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Οι ανιχνευτές χρησιμοποιήθηκαν σε συγκεντρώσεις 2 ΜΠ κάθε. Μικροσκοπική αναλύσεις και τεκμηρίωση πραγματοποιήθηκαν σε ένα μικροσκόπιο Zeiss Axioplan χρησιμοποιώντας το λογισμικό AxioVision 4.8 (Zeiss, Jena, Germany). Όλα τα θετικά δείγματα όγκων HBoV υποβλήθηκαν σε αναλύσεις FISH (n = 20).

Αποτελέσματα

Συνολικά, 11 από τα 60 (18,3%), των πνευμόνων και 9 του 44 (20,5%) όγκων του παχέος ήταν θετικοί για το DNA HBoV με συμβατική τελικού σημείου PCR ακολουθούμενη από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) και με qPCR (πίνακας 2). Το τελικό σημείο και τα αποτελέσματα qPCR ήταν σε συμφωνία, δηλαδή, τα δείγματα που βρέθηκαν θετικά με τελικό σημείο PCR ήταν επίσης θετικά με PCR πραγματικού χρόνου και αντίστροφα, ενώ τα δείγματα που ήταν αρνητικά κατά μία μέθοδο παρέμεινε αρνητική από την άλλη δοκιμασία. Επιπλέον, HBoV DNA δεν ανιχνεύθηκε σε οποιοδήποτε από τα δείγματα ελέγχου ομάδας (όγκοι 10 του μαστού, του τραχήλου της μήτρας 10 όγκους HPV-θετικά, και 10 του τραχήλου της μήτρας όγκους HPV-αρνητικό). Αλληλουχίας των προϊόντων PCR και η επακόλουθη ευθυγραμμίσεις επιβεβαίωσε ότι HBoV ϋΝΑ ενισχύθηκε από τα δείγματα όγκου (Σχήμα 1α). Ωστόσο, δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ του HBoV αντιγράψετε τον αριθμό και το στάδιο του όγκου.

Ασθενής Νο

Η Tumor προέλευσης

HBoV τελικό σημείο PCR

HBoV τελικό σημείο PCR Σεξ από το περιβάλλον του όγκου

HBoV FISH

HBoV αντίγραφα /μg ολικού DNA

Ευθυγράμμιση-αριθ. (Εικόνα 1)

CR1femaleappendixpositivenegativepositive120656CR2Malecaecumpositivenegativepositive284915CR3femalecaecumpositivenegativepositive885failed sequencingCR4Malecolonpositivenegativepositive125CR5Malecolonpositivenegativepositive14182CR6femalecolonpositivenegativepositive70failed sequencingCR7femalerectumpositivenegativepositive1710failed sequencingCR8Malerectumpositivenegativepositive65failed sequencingCR9femalerectumpositivenegativepositive1failed sequencingL1femalelungpositivenegativepositive9480413L2femalelungpositivenegativepositive156314L3Malelungpositivenegativepositive37L4Malelungpositivenegativepositive119594L5femalelungpositivenegativepositive33L6Malelungpositivenegativepositive3361L7femalelungpositivenegativepositive17285712L8femalelungpositivenegativepositive619012L9femalelungpositivenegativepositive25400011L10Malelungpositivenegativepositive163008L11femalelungpositivenegativepositive110379Table 2. Οι ασθενείς, τύπους όγκων και qPCR αποτελέσματα από ιστούς όγκων

CR = παχέος? L = πνεύμονα CSV Λήψη CSV

Όπως ακολουθίες αναφοράς, χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αριθμός GenBank με:. HBoV-1 = FJ858259 (Βόννη-1 ) α. ευθυγραμμισμένων αλληλουχιών PCR προϊόν που λαμβάνεται από δείγματα ιστού όγκου. Συνολικά, 15 δείγματα είχαν αρκετό DNA που υπάρχει μετά την ενίσχυση με PCR για άμεση αλληλούχιση. οι αλληλουχίες καταραμένος και ευθυγραμμίζεται με το στέλεχος αναφοράς Βόννη-1. είναι προφανές ότι όλες οι αλληλουχίες ήταν εξαιρετικά συντηρημένες και πλήρως συμφωνημένα στην αλληλουχία αναφοράς. τρεις ακολουθίες είχε επιπλέον μη HBoV αλληλουχία ανοδικά των ευθυγραμμισμένων περιοχών (φαίνεται στο Σχήμα 1β). β. η ευθυγράμμιση της ανοδικής αλληλουχίας παρούσα σε τρία γονιδιώματα HBoV απομονώνονται από ιστούς όγκων. η ανάντη εισαχθεί αλληλουχία ήταν παρατηρήθηκαν σε τρία δείγματα τα οποία ήταν ανεξάρτητα DNA εκχυλίζεται και αναλύεται με PCR και αλληλούχιση σε τρία ανεξάρτητα πειράματα, αποκλείοντας έτσι ένα ενιαίο τεχνούργημα ή διασταυρούμενη συμβάν μόλυνσης. Απροσδόκητα, οι υπογραμμισμένες αλληλουχίες αντιστοιχούν πλήρως την ανθρώπινη αλληλουχία DNA από το χρωμόσωμα 5, αλληλουχίες αναφοράς AC008698.6 (

Homo sapiens

χρωμόσωμα 5 κλώνος CTB-70H11, βάσεις 76.065 με 76026) και AC025156.2 (

Homo sapiens

3 BAC RP11-494C5 από Roswell Park Cancer Institute, βασίζει 130245 έως 130284), υποδεικνύοντας ότι HBoV είναι σε θέση να ανασυνδυάζεται με τον οικοδεσπότη του.

η

σε όλες τις HBoV-θετικούς όγκους των ασθενών (πίνακας 2), τα υγιείς ιστούς που περιβάλλουν αυτά όγκοι ελέγχθηκαν επίσης για HBoV DNA με PCR (n = 30? 2 χωρίς όγκο τετράγωνα FFPE από την περιοχή που περιβάλλει κάθε HBoV-θετικών όγκων). HBoV DNA δεν ανιχνεύθηκε σε οποιοδήποτε από τα δείγματα ιστού όγκου ελεύθερου διερευνηθεί (δύο γειτονικά FFPE μπλοκ ανά ασθενή, μία σε κάθε πλευρά του μπλοκ όγκου). Επιπλέον, δεν HBoV DNA ανιχνεύθηκε σε FFPE ιστούς από ασθενείς χωρίς πνεύμονα ή του παχέος όγκους (10 υγιείς πνεύμονες ελέγχου και 10 υγιείς ιστούς παχέος ελέγχου). Δεκαπέντε απομονώσεις πέρασε Sanger ελέγχου ποιότητας προσδιορισμού αλληλουχίας και αποκάλυψε άκρως συντηρημένες αλληλουχίες του γονιδίου NP1 HBoV-1.

Παραδόξως, σε τρεις περιπτώσεις, η αλληλουχία NP1 ΟΝΑ περιστοιχίζεται από ένα ανάντη αλληλουχία που περιείχε ένα διατηρημένο τμήμα του ανθρώπινου χρωμοσώματος 5 ( 1β). Δεδομένου ότι αυτά τα τρία δείγματα υποβλήθηκαν σε ανεξάρτητους εκχύλιση του DNA, η PCR, και τρέχει αλληλουχίας, η πιθανότητα ότι αυτή η παρατήρηση προέκυψε από διασταυρούμενη μόλυνση μεταξύ των τριών δειγμάτων μπορεί να αποκλειστεί.

Όπως προηγουμένως δείχθηκε ότι HBoV μπορεί να παραμείνουν σε μια μορφή επισωματικό DNA που είναι χημικά ορίζεται ως ομοιοπολικά κλειστό κυκλικό (CCC) DNA, ερευνήσαμε την μορφή με την οποία HBoV DNA επιμένει σε αυτά τα δείγματα όγκων.

Για να απαντήσουμε στο ερώτημα αυτό, μια φθορισμού in situ υβριδισμού (FISH αναπτύχθηκε) δοκιμασία. Η HepG2 ανθρώπινη κυτταρική σειρά επιμολύνθηκε με το p5TRHBoV [34] πλασμίδιο, το οποίο περιέχει ένα αντίγραφο σχεδόν πλήρους μήκους του γονιδιώματος HBoV. Ως έλεγχοι, επιμολύναμε κύτταρα HepG2 με ένα πλασμίδιο που περιέχει ένα μερικό ανθρώπινο ιό αναπνευστικού συγκυτίου αλληλουχία (RSV) και ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα δείχνονται στο σχήμα 2α.

α. Σειρές 1-3 δείχνουν ιστοί βάφονται με HBoV-ειδικούς ανιχνευτές και DAPI? σειρές 4-6 δείχνουν θετικά και αρνητικά δείγματα αναφοράς. LEH και REH αντιστοιχούν στο αριστερό άκρο (5′-άκρο) και του δεξιού άκρου (3′-άκρο) του ιικού γονιδιώματος ή του γονιδίου GAPDH. Ανθρώπινα κύτταρα επιμολυσμένα με πλασμίδια με ή χωρίς ανθρώπινη γονιδιώματα bocavirus καθώς και ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Σειρά 7 δείχνει κύτταρα HepG2 χρώστηκαν με ανιχνευτές ειδικούς για τερματικές αλληλουχίες του γονιδίου GAPDH. σι. Η διεύρυνση της συγχωνευμένη εικόνα του HepG2 κυττάρων διπλό χρωματίζονται με ανιχνευτές ειδικούς για το ανθρώπινο γονίδιο GAPDH. Αυτό το σχήμα δείχνει ότι η απόσταση μεταξύ των δύο διαφορετικών ιχνηλατών στο 5′-άκρο και το 3′-άκρο είναι αρκετά μεγάλο ώστε να οδηγήσει σε ξεχωριστά σήματα (σήμα split). ντο. Συγχωνευθείσας εικόνες HBoV DNA θετικά ιστούς, συμπεριλαμβανομένου ενός αρνητικού ιστό ελέγχου.

Η

χρησιμοποιήθηκαν ανιχνευτές FISH με στόχο τις περιοχές κοντά στο αριστερό άκρο φουρκέτα (LEH) και το δεξιό άκρο φουρκέτα (REH). Ένας ανιχνευτής σημάνθηκε με μια πράσινη φθορίζουσα χρωστική, και η άλλη σημάνθηκε με ένα κόκκινο φθορίζον χρώμα (πίνακας 1).

Τα επιμολυσμένα καλλιέργειες κυττάρων αναλύθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού έδειξε ότι οι ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση του γονιδιωματικού DNA HBoV ήταν εξαιρετικά συγκεκριμένες? μόνο εκείνα τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο p5TRHBoV και ούτε οι ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα, ούτε κύτταρα επιμολυσμένα με το πλασμίδιο ελέγχου εμφάνισε σήματα (Εικόνα 2α, κυτταρική καλλιέργεια). Αυτά τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Σε όλα τα δείγματα όγκων που βρέθηκαν θετικά με PCR, HBoV ανιχνεύθηκε επίσης με ανάλυση FISH (n = 20, πίνακας 2). Πολλαπλά σήματα ανά κύτταρο ανιχνεύθηκαν σε 3 όγκους του παχέος εντέρου και 4 όγκους του πνεύμονα, και μονά σήματα ανιχνεύθηκαν στα υπόλοιπα δείγματα όγκου 6 και 7 του παχέος πνεύμονα. Το σχήμα 2α δείχνει εικόνες που αντιπροσωπεύουν κάθε τύπο όγκου που παρατηρείται στις αναλύσεις FISH. HBoV DNA δεν ανιχνεύθηκε στα αρνητικά δείγματα ελέγχου. ανιχνεύτηκαν σήματα HBoV-FISH τόσο από την LEH και REH. Παραδόξως, πρότυπο χρώσης τους δεν ήταν ομοιογενής: ορισμένα δείγματα έδειξε ένα μονό σήμα REH και LEH ανά κύτταρο μολυσμένο, και πολλαπλά σήματα ανιχνεύθηκαν σε άλλα δείγματα. Πολλαπλά σήματα ανά κύτταρο παρατηρήθηκαν σε ορισμένες πνεύμονα και του παχέος ιστούς (πνεύμονας: n = 4, του παχέος εντέρου: η = 3), υποδεικνύοντας ότι πολλαπλά αντίγραφα HBoV DNA είναι παρούσες στα κύτταρα λόγω της αντιγραφής ή πολλαπλής γονιδιώματα επίμονα ως επισώματα ή ενσωματώνονται στο DNA του ξενιστή. Οι παρατηρήσεις αυτές είναι σύμφωνες με το γεγονός ότι HBoV αντιγράφεται σε ένα εστιακό τρόπο. Επιπλέον, αυτά τα σήματα δεν είχαν πάντοτε βρίσκεται στον πυρήνα? μερικοί φάνηκε να είναι στο κυτταρόπλασμα, όπως υποδεικνύεται από τη συγχώνευση των διαφόρων κανάλια χρώματος.

Επιπλέον, μικροσκοπική FISH αναλύσεις του γονιδίου GAPDH δείχνει ότι η απόσταση μεταξύ των σημάτων της κεφαλής και της ουράς του γονιδίου GAPDH είναι αρκετά μεγάλο για να διαχωρίζουν σαφώς τα δύο σήματα (Εικόνα 2α, τελευταία γραμμή? Σχήμα 2b, διευρυμένη από το Σχήμα 2α). Η συγχώνευση των φθορίζουσες εικόνες από HBoV θετικούς όγκους δείχνει ότι οι τερματικό σήματα HBoV βρίσκεται κοντά μεταξύ τους, σε ορισμένες περιπτώσεις, όπως υποδεικνύεται από το πράσινο /κόκκινο σήματα με ένα μικρό κίτρινο ενδιάμεση περιοχή, ενώ τα κόκκινα και πράσινα σήματα ήταν σαφώς χωρίζονται σε άλλους (διάσπαση σήματα), υποδεικνύοντας ότι το γονιδίωμα συμβαίνει σε ένα μη-κυκλική μορφή. Τα κίτρινα σήματα υποστηρίζουν την προηγούμενη παρατήρηση από Kapoor και οι συνεργάτες του ότι HBoV γονιδιώματα επιμένουν ως cccDNA [9]. Αντιπροσωπευτικά φθορίζουσες εικόνες φαίνεται στο Σχήμα 2γ.

Συζήτηση

Στην πιλοτική μελέτη μας, η οποία περιελάμβανε 60 όγκους του πνεύμονα και 44 όγκων παχέος εντέρου, εντοπίσαμε HBoV DNA σε 18,3% (n = 11) των όλοι οι όγκοι του πνεύμονα και 20,5% (n = 9) όλων των ορθοκολικών όγκων. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται δείχνουν ότι HBoV συνδέεται με κάποια πνεύμονα και του παχέος όγκους και επιβεβαιώνουν την υπόθεση ότι HBoV επιμονή είναι αυξημένη σε ασθενείς με καρκίνο [35]. Η εμφάνιση των πολλαπλών σημάτων FISH εντός μεμονωμένων κυττάρων είναι συμβατή με την υπόθεση ότι HBoV αντιγράφεται από το τροχαίο κύκλο ή το εναλλακτικό κυλιόμενο μηχανισμό φουρκέτα της αντιγραφής. Για να διερευνήσουν το θέμα, περαιτέρω μελέτες χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία, μια μέθοδο που δεν έχει ακόμη καθοριστεί στο εργαστήριό μας, μπορεί να είναι χρήσιμη.

Τα στελέχη HBoV εντοπίστηκαν σε δείγματα όγκων στην παρούσα μελέτη όλες ανήκαν στον γονότυπο 1, η οποία είναι η πιο συχνή γονότυπο στην Ευρώπη? δεν είναι ασυνήθιστο ότι δεν άλλους υποτύπους εντοπίστηκαν, όπως με τους άλλους υπότυπους είναι γενικά σπάνιες και συνδέονται με οξεία γαστρεντερίτιδα, μία κλινική διαταραχή που δεν ερευνήθηκε στη μελέτη μας.

Είτε HBoV DNA παραμένει σε όγκους ως επισώματα ή αν έχει ενσωματωθεί στο ανθρώπινο γονιδίωμα παραμένει να διερευνηθεί. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι το γονιδίωμα HBoV μπορεί να βρεθεί σε μια γραμμική μορφή (σήματα split) ή σε ένα «head-to-ουρά» μορφή (κίτρινο συγχωνευθείσας σήματος ή σε άμεση γειτνίαση πράσινο και κόκκινο σήματα). Η παρατήρηση αυτή πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή, χωρίς περαιτέρω αναλύσεις. Οι μη διαχωρισμένων σημάτων θα μπορούσε να αποτελέσει ενδιάμεσα αντιγραφής «head-to-ουρά», cccDNA, όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως [9,10,36], ή πολλαπλά αντίγραφα του γονιδιώματος εμμονή σε μολυσμένα κύτταρα. Τα σήματα διάσπαση θα μπορούσε να ερμηνευθεί ως υποθετικά κυλιόμενο ενδιάμεσα αντιγραφής φουρκέτας ή ως γραμμικό ϋΝΑ γονιδιώματος. Επιπλέον, DNA που δεν υπάρχει στον πυρήνα θα μπορούσε να βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα ή συσκευάζεται σε εξωκυτταρικό ιικά σωματίδια.

Το εύρημα ότι HBoV μπορεί να παραμείνουν σε ορισμένους μολυσμένους ιστούς με τη μορφή cccDNA, παρόμοια με άλλες καρκινογόνες ιούς, θα μπορούσε να ερμηνευθούν με διάφορους τρόπους. Πρώτον, HBoV μπορούσαν να συμβάλουν στην ανάπτυξη ορισμένων πνεύμονα και του παχέος όγκους, αναγνωρίζοντας ότι παραμένει ασαφές εάν HBoV έχει ενεργό ή παθητικό ρόλο στην ανάπτυξη αυτών των όγκων. Αυτή η υπόθεση παραμένει ένα θέμα της κερδοσκοπίας αλλά υποστηρίζεται από τα ανθρώπινα θραύσματα DNA από το χρωμόσωμα 5 βρέθηκαν σε τρεις πλήρως ανεξάρτητη περιπτώσεις, υποδεικνύοντας μία συμβάν ανασυνδυασμού με DNA του ξενιστή (Σχήμα 1β). Αν και είναι απίθανο, υπάρχει ελάχιστος κίνδυνος ότι αυτό το αποτέλεσμα είναι μια PCR τεχνούργημα. Είτε HBoV είναι σε θέση να ενταχθούν στο ανθρώπινο χρωμοσωμικό DNA ή ανασυνδυάζεται με το ανθρώπινο γονιδίωμα μένει να διερευνηθεί. Σε μια μελέτη παρακολούθησης, αυτή η υπόθεση θα μπορούσε να διερευνηθεί με τη χρήση φρέσκο ​​ιστό του όγκου και ανάλυση RFLP ακολουθούμενη από κηλίδωση Southern, γεγονός που θα οδηγήσει σε μια μετατόπιση ζώνης στην περίπτωση της ενσωμάτωσης στο γονιδίωμα του ξενιστή. Δυστυχώς, αυτό ήταν τεχνικά αδύνατο στη μελέτη μας, επειδή ο ιστός FFPE χρησιμοποιήθηκε αναδρομικά. Επιπλέον, είναι απαραίτητο να αναλυθεί η έκφραση ιικών πρωτεϊνών στις αντίστοιχες όγκους και η αλληλεπίδρασή τους με κυτταρικές πρωτεΐνες, μια μέθοδο η οποία δεν μπορεί να εκτελεστεί εν απουσία ευρέως διαθέσιμα αντισώματα.

Δεύτερον, ορισμένοι πνεύμονα και του παχέος όγκους θα μπορούσε να παρέχει ένα βέλτιστο περιβάλλον για HBoV και υποστηρίζουν την αντιγραφή HBoV. Η δεύτερη υπόθεση σε πρώτο βαθμό φαίνεται να είναι πιο πιθανό, επειδή άλλα παρβοϊούς προτιμούν τη διαίρεση και πολλαπλασιασμό των κυττάρων [37,38].

Οι ρόλοι των ανθρωπίνων παρβοϊούς ως αιτιολογικοί παράγοντες του καρκίνου ή συνεισφέροντες στην καρκινογένεση έχουν συζητηθεί εκτενώς για το πρώτο γνωστό ανθρώπινου παρβοϊού Β19. Το 2007, μια κινεζική ομάδα ανιχνεύεται παρβοϊό Β19 στο 81,1% των αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου με in situ υβριδισμού και επιβεβαίωσε αυτό το αποτέλεσμα σε 78,4% από αυτούς με ανοσοϊστοχημεία ανίχνευση ιικών πρωτεϊνών στα ISH-θετικούς ιστούς [39]. Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται μια προηγούμενη κλινική παρατήρηση στην οποία Β19 συσχετίστηκε με καρκίνο του πνεύμονα σε ένα ιαπωνικό ασθενή [40]. Επιπλέον, όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή, παρβοϊού Β19 ήταν ύποπτος να είναι ένας αιτιολογικός παράγοντας άλλων καρκίνων και μπορεί να προκαλέσει χρόνιες φλεγμονώδεις διεργασίες σε ένα μολυσμένο ιστό [19-24]. Παρόμοιοι μηχανισμοί μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην HBoV μολυσμένους ιστούς? μελλοντικές μελέτες θα πρέπει ως εκ τούτου να επικεντρωθεί στις φλεγμονώδεις διαδικασίες που συνδέονται με HBoV. Στο σύνολό τους, αυτές οι παρατηρήσεις οδηγούν στην υπόθεση ότι τα ανθρώπινα παρβοϊούς, ιδιαίτερα HBoV και παρβοϊό Β19, μπορεί να παίζει ενεργό ρόλο σε ανθρώπινους καρκίνους. Ως εκ τούτου, η περαιτέρω μελέτες που βασίζονται σε προοπτικές μελέτες χρησιμοποιώντας φρέσκα ιστούς όγκου ή την νέα CUFI-8 σύστημα καλλιέργειας κυττάρων [7] είναι πολύ επιθυμητές και θα μπορούσε να διευκρινιστεί ο ρόλος αυτών των ιών σε ανθρώπινους καρκίνους.