Αφηρημένο

Ένα CpG φαινότυπο νησί methylator (CIMP) εμφανίζεται με ένα ξεχωριστό υποσύνολο του παχέος εντέρου, με υψηλή συχνότητα του DNA υπερμεθυλίωση σε μια συγκεκριμένη ομάδα των CpG νησίδων. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι μια μετάλλαξη ενεργοποίησης του

BRAF

(BRAF

V600E) είναι στενά συνδεδεμένο με CIMP, θέτοντας το ερώτημα του κατά πόσον BRAF

V600E παίζει ένα αιτιώδη ρόλο στην ανάπτυξη της CIMP ή αν CIMP παρέχει ένα ευνοϊκό περιβάλλον για την απόκτηση του BRAF

V600E. Εμείς που απασχολούνται τεχνολογία μεθυλίωση Illumina GoldenGate DNA, το οποίο ανακρίνει 1505 CpG θέσεων σε 807 διαφορετικά γονίδια, για να μελετήσει περαιτέρω αυτή τη συσχέτιση. Εξετάσαμε πρώτα εάν η έκφραση της BRAF

V600E προκαλεί DNA υπερμεθυλίωση από σταθερώς εκφράζουν BRAF

V600E στο CIMP-αρνητικό,

BRAF

άγριου τύπου COLO 320DM καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή. Έχουμε καθορίζεται 100 CIMP που σχετίζονται με CpG θέσεις και εξετάζονται οι αλλαγές στη μεθυλίωση του DNA σε οκτώ σταθερά επιμολυσμένων κλώνων σε πολλαπλά περάσματα. Βρήκαμε ότι BRAF

V600E δεν είναι επαρκής για να προκαλέσει CIMP στο σύστημά μας. Δεύτερον, λαμβάνοντας υπόψη την εναλλακτική δυνατότητα, προσδιορίσαμε γονίδια των οποίων το DNA υπερμεθυλίωση ήταν στενά συνδεδεμένη με BRAF

V600E και CIMP σε 235 πρωτογενείς όγκους παχέος εντέρου. Είναι ενδιαφέρον, τα γονίδια που έδειξε την πιο σημαντική σύνδεσμο περιλαμβάνουν εκείνα που μεσολαβούν διάφορες οδούς σηματοδότησης που εμπλέκονται στην ογκογένεση του παχέος εντέρου, όπως

ΒΜΡ3

και

ΒΜΡ6

(BMP σηματοδότησης),

EPHA3

,

KIT

, και

FLT1

(κινάσες τυροσίνης) και

ΠΕΑ

(σκαντζόχοιρος σηματοδοσίας). Επιπλέον, προσδιορίσαμε CIMP εξαρτώμενη DNA υπερμεθυλίωση

IGFBP7

, η οποία έχει αποδειχθεί ότι μεσολαβεί BRAF

V600E επαγόμενη κυτταρική γήρανση και την απόπτωση. Υποστηρικτής DNA υπερμεθυλίωση

IGFBP7

συνδέθηκε με αποσιώπηση του γονιδίου. CIMP-ειδική απενεργοποίηση του BRAF

V600E που προκαλείται από τη γήρανση και την απόπτωση μονοπάτια από

IGFBP7

DNA υπερμεθυλίωση θα μπορούσε να δημιουργήσει ένα ευνοϊκό πλαίσιο για την απόκτηση του BRAF

V600E στο CIMP + καρκίνο του παχέος εντέρου. Τα στοιχεία μας θα είναι χρήσιμο για μελλοντικές έρευνες προς την κατανόηση CIMP σε καρκίνο του παχέος εντέρου και να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με το ρόλο της ανώμαλης υπερμεθυλίωση του DNA σε ορθοκολικό ογκογένεση

Παράθεση:. Hinoue Τ, Weisenberger DJ, Pan F, Campan Μ, Kim M , Νέοι J, et al. (2009) Ανάλυση της σύνδεσης μεταξύ CIMP και BRAF

V600E στον Καρκίνο του παχέος εντέρου με μεθυλίωση του DNA Profiling. PLoS ONE 4 (12): e8357. doi: 10.1371 /journal.pone.0008357

Επιμέλεια: Chun Ming Wong, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 6 του Σεπτέμβρη του 2009? Αποδεκτές: 20 Νοέμβρη, 2009? Δημοσιεύθηκε: 21 Δεκ 2009

Copyright: © 2009 Hinoue et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (ΝΙΗ) επιχορηγήσεις R01 CA118699-02 (PW Laird), R01 CA075090-09 (PW Laird). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Peter Laird είναι σύμβουλος για Epigenomics AG και για Celgene Corporation. Οι άλλοι συγγραφείς δεν προέκυψε κανένα δυναμικό ανταγωνιστικών συμφερόντων. Η εργασία αυτή δεν υποστηρίχθηκε ούτε από Epigenomics AG ή Celgene Corporation. Αυτές οι εταιρείες δεν είχαν ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Εισαγωγή

Η ανώμαλη μεθυλίωση του DNA σε CpG νησίδες έχει ευρέως παρατηρηθεί σε καρκίνο. Ο υποστηρικτής νησί CpG υπερμεθυλίωση που σχετίζονται με την αδρανοποίηση των επιλεγμένων ογκοκατασταλτικών γονιδίων φαίνεται να είναι κρίσιμη σε όγκους από την έναρξη έως τη διατήρηση του φαινοτύπου του όγκου [1]. έχουν διακριτούς υποομάδες διάφορους τύπους ανθρώπινων καρκίνων έχουν προταθεί για να έχουν ένα CpG φαινότυπο νησί methylator (CIMP), στην οποία βρίσκεται μια εξαιρετικά υψηλή συχνότητα καρκίνου-ειδικών DNA υπερμεθυλίωση [2], [3]. Αν και αυτή η έννοια είναι αμφιλεγόμενη [4], έχουμε επιβεβαιώσει την ύπαρξη CIMP στον καρκίνο του παχέος εντέρου σε μια ολοκληρωμένη μελέτη μεγάλης κλίμακας [5].

CIMP στον καρκίνο του παχέος εντέρου μπορεί να προκύψει μέσα από μια ξεχωριστή πορεία, καταγωγής ορισμένων υποτύπων οδοντωτή πολυπόδων [6] και παρατηρείται σε περίπου 15% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του παχέος [5], [7]. Χαρακτηριστικά που σχετίζονται με CIMP σε καρκίνο του παχέος εντέρου περιλαμβάνουν το φύλο (θηλυκό), εγγύς θέση, και κακώς διαφοροποιημένο ή βλεννώδες ιστολογία [3], [5], [7], [8]. Η μελέτη μας χρησιμοποιώντας ένα πρόσφατα αναπτυγμένο πίνακα δείκτη CIMP σε καρκίνους του παχέος εντέρου έδειξε ότι σποραδικές μικροδορυφορικού αστάθεια (MSI +) εμφανίζεται ως συνέπεια της CIMP που σχετίζονται με

MLH1

DNA υπερμεθυλίωση [5]. Επιπλέον, βρήκαμε μια ισχυρή συσχέτιση της CIMP με την παρουσία ενός ενεργοποιημένου μεταλλαγμένη μορφή του

BRAF

(BRAF

V600E) [5]. Τόσο CIMP και

έχουν BRAF

μεταλλάξεις έχουν αναφερθεί στα πρώτα στάδια του παχέος νεοπλασίας: CIMP στο φαινομενικά φυσιολογικό βλεννογόνο των ασθενών με προδιάθεση για πολλαπλές οδοντωτή πολύποδες [9] και

BRAF

μεταλλάξεις σε παρεκκλίνουσα κρύπτη εστίες [10].

Το μονοπάτι σηματοδότησης RAS-RAF-ΜΕΚ-ΕΚΚ συχνά υπερδραστηριοποιημένο σε καρκίνο του παχέος εντέρου.

KRAS

μεταλλάξεις συμβαίνουν πιο συχνά σε 30-40% όλων των καρκίνων του παχέος εντέρου [11] και

BRAF

μεταλλάξεις είναι παρούσες σε συχνότητα 5-22%, με την οποία το μόνιμα ενεργοποιημένη BRAF

παραλλαγή V600E αντιπροσωπεύει περίπου 90% του συνόλου των

BRAF

μεταλλάξεις [12]. Μεταλλάξεις στο

KRAS

και

BRAF

είναι γενικά αμοιβαία αποκλειόμενες, υπονοώντας ισοδύναμα προς τα κάτω επιδράσεις στην ογκογένεση [13]. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι μεταλλάξεις των γονιδίων αυτών μπορεί να παίζουν διακριτούς ρόλους στην έναρξη ή /και τη συντήρηση [10] όγκου [14].

Η εξαιρετικά σφιχτή σύνδεση μεταξύ BRAF

V600E και CIMP θέτει η ερώτημα εάν BRAF

V600E παίζει ένα αιτιώδη ρόλο στην ανάπτυξη της CIMP ή αν CIMP που σχετίζονται με υπερμεθυλίωση υποστηρικτής παρέχει ένα ευνοϊκό περιβάλλον για την απόκτηση του BRAF

V600E. Σε αυτή τη μελέτη, ψάξαμε για πιθανές μοριακές εξηγήσεις για τη σχέση μεταξύ BRAF

V600E και CIMP χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα της μεθυλίωσης του DNA Illumina GoldenGate, η οποία εξετάζει την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των 1.505 CpG χώρους που βρίσκονται σε 807 γονίδια. Η δοκιμασία μεθυλίωσης GoldenGate DNA έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σε διάφορες μελέτες και είναι τώρα μια τυποποιημένη μέθοδος για ανάλυση μεθυλίωσης του DNA [15] – [24]. Ευρήματα που λαμβάνεται από το εμπορικά διαθέσιμο «GoldenGate μεθυλίωση Cancer Panel Ι», ειδικότερα, έχουν επικυρωθεί χρησιμοποιώντας διάφορες άλλες τεχνικές [15] – [17], [22], [23], καθιστώντας το ένα αξιόπιστη πηγή για μετρήσεις μεθυλίωσης του DNA σε όλη 1.505 θέσεις. Εμείς δεν ήταν σε θέση να αποδείξει την ύπαρξη αιτιώδους συμβολή του BRAF

V600E να CIMP στο σύστημα καλλιέργειας κυττάρων μας. Ωστόσο, εντοπίσαμε τα γονίδια των οποίων το DNA υπερμεθυλίωση ήταν σημαντικά συνδεδεμένη με BRAF

V600E σε πρωτογενείς όγκους παχέος εντέρου. Η αδρανοποίηση αυτών των συγκεκριμένων γονιδίων στο πλαίσιο της CIMP θα μπορούσε να οδηγήσει την απόκτηση του BRAF

V600E στο CIMP + παχέος όγκους.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός της 21ης ​​Ανθρωπίνων ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικών γραμμών

Πρέπει πρώτα φρόντισε να διαπιστώσει αν η έκφραση της BRAF

V600E θα προκαλέσουν DNA υπερμεθυλίωση σε θέσεις CpG σχετίζεται με CIMP σε ένα

in vitro

σύστημα καλλιέργειας κυττάρων. Από πρωτογενή επιθηλιακά κύτταρα του κόλου δεν ήταν άμεσα διαθέσιμα, εμείς διαλογή για ορθοκολικό κυτταρικές γραμμές καρκίνου που δεν έχουν ουσιαστική μεθυλίωσης του DNA στο CIMP που ορίζει loci και να φέρουν τις μορφές άγριου τύπου και των δύο

BRAF

και

KRAS

. Τέτοιες κυτταρικές σειρές θα χρησιμεύσει ως κατάλληλα συστήματα για την εισαγωγή του BRAF

V600E. Έχουμε επιλέξει 21 ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές σειρές, που χαρακτηρίζεται προφίλ μεθυλίωσης του DNA τους, και προσδιορίζεται

BRAF

τους και

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης (Σχήμα 1). Χρησιμοποιήσαμε MethyLight να εκτιμήσει την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των πέντε CIMP-καθορισμό δεικτών προηγουμένως ταυτοποιηθεί στο εργαστήριο μας [5]. Χρησιμοποιώντας ένα PMR (επί τοις εκατό του μεθυλιωμένου αναφοράς) του ≥10 ως κατώφλι για τη θετική μεθυλίωση, εντοπίσαμε έξι κυτταρικές σειρές που στερούνταν μεθυλίωσης του DNA και για τις πέντε CIMP-ειδικούς δείκτες (Σχήμα 1). Για να ελέγξετε την υπόθεσή μας, επιλέξαμε αρχικά το

BRAF

και

KRAS

άγριου τύπου Caco-2 και COLO 320DM κυτταρικές σειρές για την ευκολία τους στην καλλιέργεια και επιμόλυνση. Ωστόσο, η μελέτη που περιγράφεται παρακάτω περιορίζεται στα κύτταρα COLO 320DM, δεδομένου ότι δεν ήταν σε θέση να απομονώσουν τυχόν σταθερώς επιμολυσμένα Caco-2 κλώνοι που έδειξαν ανιχνεύσιμο επίπεδο BRAF

έκφραση V600E (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

MethyLight χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των πέντε CIMP που ορίζει δείκτες. Μια PMR της ≥10 χρησιμοποιήθηκε ως όριο για τη θετική μεθυλίωση. Μαύρα κουτιά δείχνουν PMR ≥10 και λευκά κουτιά δείχνουν PMR & lt? 10. Οι συχνότητες μεθυλίωση του DNA των πέντε δεικτών CIMP αυξηθεί από πάνω προς τα κάτω. Μικροδορυφόρων κατάσταση αστάθειας για κάθε κυτταρική σειρά αναφέρεται ως μικροδορυφορικού σταθερό (MSS) ή υποθάλπουν την αστάθεια (MSI). Η κατάσταση μετάλλαξης του

BRAF

εξόνιο 15 και

KRAS

εξόνιο 2 παρατίθενται.

Η

Σταθερή επιμόλυνση των BRAF

V600E σε COLO 320DM κύτταρα

επιμολυσμένα κύτταρα COLO 320DM με ένα ΗΑ-tagged BRAF

V600E cDNA και απομονωμένες G418-ανθεκτικών κλώνων. Το επίπεδο έκφρασης του BRAF

V600E προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα έναντι του επιτόπου ΗΑ (Σχήμα 2Α). Η δραστηριότητα της BRAF

V600E επιβεβαιώθηκε με την εξέταση της ενεργοποίησης του ERK1 /2 με τη χρήση ενός αντισώματος έναντι φωσφορυλιωμένης ERK1 /2 (Σχήμα 2Α). Οκτώ σταθερά επιμολυσμένων κλώνων που εμφανίζουν υψηλή έκφραση του BRAF

V600E, καθώς και η ισχυρή ενεργοποίηση των ERK1 /2, μεμονωμένα αναπτύχθηκαν σε καλλιέργεια, και γενωμικό DNA απομονώθηκε σε διάφορα περάσματα (μεταξύ 2 και 27) από αυτούς τους κλώνους. Τέσσερις κενός-φορέα επιμολυσμένων κλώνων (EVCs) αναπτύχθηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες και χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

(Α) Εκφραση του BRAF

V600E και /2 φωσφορυλίωση ERK1 σε σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα COLO 320DM. Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν με τα αντισώματα αντι-ΗΑ για το ΗΑ-BRAF

V600E, αντι-φωσφο-ERK1 /2, και αντι-ERK1. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν τις οκτώ BRAF

V600E επιμολυσμένοι κλώνοι που υποβλήθηκαν σε ανάλυση μεθυλίωσης του DNA σε διάφορα περάσματα κυττάρων. προφίλ (Β) μεθυλίωση του DNA του μη επιμολυσμένα κύτταρα COLO 320DM, κενό φορέα και BRAF

V600E επιμολυσμένα COLO 320DM κλώνους, όπως προσδιορίζεται από την δοκιμασία μεθυλίωσης Illumina GoldenGate DNA. Τα δεδομένα μεθυλίωση του DNA βαθμολογήθηκαν ως β-τιμές όπως ορίστηκε προηγουμένως [16]. Κάθε σειρά αντιστοιχεί σε ένα άτομο τόπο CpG και τα δεδομένα ταξινομούνται κατά μέσο όρο β-τιμή σε όλη όλα τα δείγματα. Κάθε κλώνος διατάσσεται από αριστερά προς τα δεξιά σε αύξηση του αριθμού των διόδων. EVC: κενός-φορέα επιμολυσμένων κλώνων

Η

Η μεθυλίωση του DNA Ανάλυση του BRAF

V600E επιυολυσυένα COLO 320DM κλώνοι

Είμαστε δίπλα καθόρισαν την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των 1.505 CpG χώρους που βρίσκονται σε. 807 διαφορετικά γονίδια σε καθένα από τα οκτώ BRAF

κλώνους V600E και τέσσερα EVCs χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Illumina GoldenGate Panel Cancer Μεθυλίωση 1 (Σχήμα 2Β). Βρήκαμε ότι οι β-τιμές μεθυλίωσης του DNA σε όλες τις 1505 θέσεις CpG στις BRAF

V600E επιμολυσμένων κλώνων (ανεξάρτητα από το

επίπεδο έκφρασης V600E τους BRAF) ήταν πολύ παρόμοια με αυτά των κλώνων ελέγχου κενών-φορέα και σχετικά σταθερή κατά χρόνος. Αυτό δείχνει ότι δεν υπήρχε συνολική αύξηση στο DNA υπερμεθυλίωση στο BRAF

V600E επιμολυσμένων κλώνων στο CpG στόχους που αναλύθηκαν (Σχήμα 2Β).

επόμενο καθοριστεί αν η σταθερή έκφραση του BRAF

V600E αυξημένη συγκεκριμένα η μεθυλίωση του DNA μόνο CIMP που σχετίζονται με δείκτες στις 1.505 ανακρίθηκαν CpG θέσεις. Αυτές οι περιοχές καθορίστηκαν με διαλογή 58 στοιχειώδη δείγματα ορθοκολικού όγκου χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα της μεθυλίωσης του DNA Illumina GoldenGate (Σύνολο δεδομένων S1). Η κατάσταση μετάλλαξης του

BRAF

και

KRAS

στα δείγματα αυτά είχαν καθοριστεί προηγουμένως [5] (Πίνακας S1). Ανεξέλεγκτη δισδιάστατη ανάλυση σύμπλεγμα των β-τιμές μεθυλίωσης του DNA αποκάλυψε ένα διακριτό σύμπλεγμα από 11 δείγματα όγκων, η πλειοψηφία των οποίων περιείχε BRAF

V600E και έδειξε συχνή μεθυλίωσης του DNA γνωστών CIMP που σχετίζονται δείκτες, συμπεριλαμβανομένων των

CDKN2A, IGF2

, και

MLH1

(τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ορίσαμε αυτήν την υποομάδα, όπως CIMP-θετικούς όγκους (Σχήμα 3). Στη συνέχεια, εντόπισε συνολικά 100 CpG περιοχές που έχουν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA στο CIMP-θετικό (+ CIMP) έναντι CIMP αρνητικά (CIMP-) όγκους (

P

& lt? 0.001 μετά από διόρθωση για πολλαπλές συγκρίσεις, δείτε την ενότητα Υλικά και Μέθοδοι) (Πίνακας S2). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι αντιδράσεις για τρεις από τους δείκτες CIMP MethyLight-based (

CACNA1G

,

NEUROG1

, και

SOCS1

) έχουν αναγνωρισθεί προηγουμένως στο εργαστήριο μας που δεν περιλαμβάνονται στο η πλατφόρμα Illumina GoldenGate μεθυλίωση Panel Καρκίνο 1. Η

RUNX3

Illumina GoldenGate αντιδράσεις δεν αποδεικνύουν CIMP-συγκεκριμένη συμπεριφορά. Μια πιθανή εξήγηση για αυτήν τη διαφορά μπορεί να είναι ότι οι αντιδράσεις αυτές έχουν σχεδιαστεί γύρω από τη θέση έναρξης μεταγραφής του

RUNX3

ισομορφή 1, ενώ μας CIMP ειδικές

RUNX3

αντίδραση MethyLight σχεδιάζεται στον υποκινητή CpG νησίδα του

RUNX3

ισομορφή 2 [5]. Είδαμε καμία εμφανή διαφορά στη μεθυλίωση του DNA μεταξύ BRAF

V600E επιμολυσμένων κλώνων και EVCs σε αυτές CIMP που σχετίζονται με περιοχές CpG (Σχήμα 3). Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ότι η μέση μεθυλίωσης του DNA β-τιμή του 100 CIMP-ειδικό loci αυξήθηκε σαν συνάρτηση της διόδου κυττάρων (Σχήμα 4Α και 4Β). Ωστόσο, αυτή η αύξηση δεν συσχετίζονται με τα επίπεδα του BRAF

έκφραση V600E και επίσης παρατηρήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον φορέα ελέγχου (Σχήμα 4Β). Αυτή η γενική αύξηση της μέσης β-τιμή είναι ειδική για CIMP σχετιζόμενη τόπους, αφού η μέση β-τιμής από διάφορα σύνολα 100 τυχαία επιλεγμένες θέσεις CpG δεν έδειξε παρόμοια τάση (Σχήμα 4C και 4D). Ως εκ τούτου, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι, αν και CIMP που σχετίζονται με νησίδες CpG μπορεί να είναι επιρρεπείς να αποκτήσουν μεθυλίωση του DNA σε ορισμένες συνθήκες καλλιέργειας, BRAF

V600E δεν επάγει ειδικά CIMP στα κύτταρα COLO 320DM.

CIMP + όγκους και η CIMP -associated τόποι σε 58 δείγματα πρωτογενούς όγκου ορίστηκαν όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. Κάθε σειρά αντιστοιχεί σε ένα άτομο τόπο του πάνελ 100 τόπο, και τα δεδομένα ταξινομήθηκαν με τη μέση β-τιμή κάθε γενετικό τόπο για όλα τα δείγματα 58 πρωτογενούς όγκου. Κάθε BRAF

V600E επιμολυσμένα κλώνο και EVC διατάσσεται από αριστερά προς τα δεξιά στην αύξηση του αριθμού των αποσπασμάτων. Όγκους με

BRAF

και

Οι KRAS μεταλλάξεις

υποδεικνύεται από έναν κύκλο και ένα τρίγωνο, αντίστοιχα. Χ: Η κατάσταση μετάλλαξης δεν είναι διαθέσιμη. Κάθε BRAF

V600E επιμολυσμένα κλώνο και EVC διατάσσεται από αριστερά προς τα δεξιά στην αύξηση του αριθμού των αποσπασμάτων. «P» δείχνει τα προφίλ μεθυλίωσης του DNA του γονέα μη επιμολυσμένα κύτταρα COLO 320DM.

Η

Μαύρες γραμμές δείχνουν BRAF

V600E κλώνους έκφρασης και γκρι γραμμές αντιπροσωπεύουν άδειο-φορέα επιμολυσμένων κλώνων ελέγχου. Κάθε σημείο γραφικά αντιπροσωπεύει σημαίνει β-τιμές σε όλη υποδεικνύεται CpG περιοχές από την ανάλυση μεθυλίωσης Illumina GoldenGate DNA σε διάφορα περάσματα για κάθε κλώνο. (Α) Όλα τα 1.505 CpG θέσεις από τη δοκιμασία Illumina GoldenGate. (Β) Μόνο 100 CIMP που σχετίζονται με τόποι προφίλ. (Γ) Εκατό τυχαία επιλεγμένο CpG θέσεις. (D) Εκατό μη CIMP τόπους, τα οποία δείχνουν σημαίνει β-τιμές παρόμοιο με το 100 CIMP που σχετίζονται με τόπους.

Η

ταυτοποίηση των γονιδίων που είναι σημαντικά μεθυλιώνεται όγκους παχέος εντέρου υπόθαλψη BRAF

V600E

Θεωρήσαμε επίσης την εναλλακτική υπόθεση ότι υποστηρικτής μεθυλίωσης των συγκεκριμένων στόχων γονίδιο παρέχει ένα ευνοϊκό περιβάλλον για την απόκτηση του

BRAF

μετάλλαξη στο CIMP + παχέος εντέρου. Έχουμε ήδη επισημάνει την κατάσταση CIMP και

BRAF

κατάσταση μετάλλαξης του 235 στοιχειώδη δείγματα ορθοκολικού όγκου [5]. Βρήκαμε BRAF

V600E σε 33 όγκους (14,0%)? 31 από αυτούς είχαν ταξινομηθεί ως CIMP + και μόνο 2 ως CIMP-. Πραγματοποιήσαμε την δοκιμασία μεθυλίωσης Illumina GoldenGate DNA σε αυτά τα δείγματα, και εντόπισε 60 γονίδια, εκπροσωπούμενη από 89 CpG θέσεις, οι οποίες μεθυλιώνονται σημαντικά (

P

& lt? 0.001) στις 33 BRAF

όγκων V600E θετικών (Πίνακας S3). Αυτά τα γονίδια είναι υποψήφιοι για CIMP-ειδική απενεργοποίηση, η οποία μπορεί να συνεργούν στενά με την BRAF

V600E για την προώθηση της ογκογένεσης.

Για την επικύρωση των δεδομένων που παράγονται χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα της μεθυλίωσης του DNA GoldenGate, αναλύσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA του τέσσερις CIMP-ειδικά γονίδια (

Calca

,

EPHA3

,

KIT

, και

SLC5A8

) σε ένα υποσύνολο των τεσσάρων CIMP-θετικά και 16 CIMP -αρνητικοί όγκοι στην πλατφόρμα μεθυλίωση Illumina Infinium DNA. Αυτά τα τέσσερα γονίδια επιλέχθηκαν επειδή και οι δύο αναλυτικές πλατφόρμες ανακρίνουν την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA του πανομοιότυπες δινουκλεοτιδίου CpG. Στη συνέχεια εξετάστηκε η συμφωνία της μεθυλίωσης του DNA σε κάθε ένα από αυτούς τους τόπους ανάμεσα στις δύο πλατφόρμες, και βρήκε ένα υψηλό συντελεστή συσχέτισης σε όλες τις περιπτώσεις (

Calca

: 0.94,

EPHA3

: 0.95,

KIT

: 0.95,

SLC5A8

:. 0,86), προσδίδοντας περαιτέρω υποστήριξη στην αρχική οθόνη της μεθυλίωσης του DNA GoldenGate μας που βασίζονται

Εμείς επιβεβαίωσε τα πρόσφατα παρατηρήθηκαν συσχετίσεις μεταξύ DNA υπερμεθυλίωση em

ΒΜΡ3

και

MCC

με CIMP + και BRAF

V600E σε καρκίνο του παχέος εντέρου [25], [26]. Βρήκαμε επίσης CIMP ειδικές DNA υπερμεθυλίωση

ΒΜΡ6.

Η ταυτόχρονη επιγενετική αδρανοποίηση του

ΒΜΡ3

και

ΒΜΡ6

φάνηκε να σχετίζεται με την ενεργοποίηση του RAS-RAF -MEK-ΕΚΚ μονοπάτι σηματοδότησης στον καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου [27]. Επιπλέον, βρήκαμε μια ένωση του

SLC5A8

και

Timp3

μεθυλίωσης του DNA με BRAF

V600E σε παχέος δείγματα όγκων μας, όπως είχε προηγουμένως αναφερθεί στο θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς [28]. Το λειτουργικό αποτέλεσμα του DNA υπερμεθυλίωση αυτών των ογκοκατασταλτικών γονιδίων που συνδέονται με CIMP + και BRAF

V600E παραμένει κερδοσκοπικές [25] – [28].

Επιπλέον, βρήκαμε ότι η μεθυλίωση του DNA των

ΠΕΑ

, ένα συστατικό του Hedgehog (Hh) σηματοδότησης, ήταν στενά συνδεδεμένη με όγκους παχέος εντέρου με BRAF

V600E (Πίνακας S3). Περιέργως, έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι η αυξημένη έκφραση του

ΠΕΑ

συμβάλλει στην παχέος ογκογένεση [29]. Ωστόσο, Arimura et al. επίσης έδειξαν ότι ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν BRAF

V600E, συμπεριλαμβανομένων COLO 205, ΗΤ-29 και RKO, δεν φαίνεται να δείχνουν έκφραση του

SMO

[29]. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι CIMP ειδικά υπερμεθυλίωση προαγωγέα DNA μπορεί να εμπλέκεται στην καταστολή των

ΠΕΑ

σε όγκους παχέος εντέρου που μεταφέρουν BRAF

V600E (Πίνακας S3).

Ανάδοχος DNA υπερμεθυλίωση και μεταγραφική κατασιγάσει του

IGFBP7

στο

BRAF

Μεταλλαγμένα CIMP + καρκίνο του παχέος εντέρου

Έχουμε εντοπίσει το

IGFBP7

υποστηρικτής CpG νησί ως στόχο για μεθυλίωσης του DNA σε όγκους παχέος εντέρου υπόθαλψη BRAF

V600E (

P

value = 3.1 × 10

-9, Αποδόσεις αναλογία = 12). BRAF

V600E έχει δειχθεί ότι επάγει κυτταρική γήρανση [30] – [32]. Ογκογονίδιο που προκαλείται από τη γήρανση (OIS) έχει αναγνωριστεί ως ένας σημαντικός μηχανισμός καταστολής του όγκου [33]. Ο υποκείμενος μοριακός μηχανισμός της BRAF

V600E που προκαλείται από τη γήρανση και την απόπτωση έχει διευκρινιστεί σε μια πρόσφατη μελέτη [34]. Έχει αποδειχθεί ότι η έκφραση του

IGFBP7

είναι τόσο αναγκαία και επαρκής για να προκαλέσει γήρανση και την απόπτωση που διαμεσολαβείται από BRAF

V600E. Περιέργως,

IGFBP7

φάνηκε να σιωπήσουν επιγενετικώς από CpG υπερμεθυλίωση νησί υποστηρικτής ειδικά σε δείγματα πρωτογενούς μελανώματος που μεταφέρουν BRAF

V600E, υποδεικνύοντας ότι η απώλεια του

IGFBP7

έκφρασης είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη της BRAF

V600E θετικά μελάνωμα [34].

Η Illumina GoldenGate μεθυλίωση Panel Καρκίνο 1 πλατφόρμα περιλαμβάνει δύο

IGFBP7

ανιχνευτές (IGFBP7_P297_F και IGFBP7_P371_F) που ανακρίνει την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των δύο διακριτές CpG δινουκλεοτίδια στο

υποστηρικτής IGFBP7

νησί CpG (Σχήμα 5Α). Βρήκαμε ότι αυτές οι δύο περιοχές CpG στο

IGFBP7

υποκινητής είναι ο καρκίνος, ειδικά μεθυλιωμένη (Εικόνα 5Β) και συνδέονται στενά τόσο με BRAF

V600E (Wilcoxon τεστ rank-sum,

P

value = 2,0 × 10

-10) και CIMP (

P

value = 3.6 × 10

-9) (Σχήμα 5C). Έχει αναφερθεί ότι ορθοκολικούς όγκους με

KRAS

μεταλλάξεις δείχνουν επίσης υπερμεθυλίωση του DNA σε CIMP σχετιζόμενη δείκτες, αν και σε χαμηλή συχνότητα, και έχουν υψηλά επίπεδα μεθυλίωσης του DNA των γονιδίων που υποβάλλονται σε σχετιζόμενη με την ηλικία υπερμεθυλίωση DNA. Οι όγκοι αυτοί έχουν περιγραφεί ως CIMP χαμηλές ή CIMP2 [35], [36]. Δεν βρήκαμε σύνδεσης μεταξύ

IGFBP7

DNA υπερμεθυλίωση και

KRAS

μεταλλάξεις, όταν αποκλείσαμε όγκους με μεταλλαγμένο

BRAF

(

P

value = 0,85) . Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις, βρήκαμε ότι το DNA υπερμεθυλίωση

IGFBP7

είναι κυρίως παρούσα σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν BRAF

V600E και δείχνουν συχνές μεθυλίωσης του DNA του CIMP συγκεκριμένες πέντε-γονίδιο πίνακα δείκτη στο παρελθόν περιγράφεται (Σχήμα 6). Σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR του καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές έδειξε ότι

IGFBP7

έκφραση του mRNA ήταν αντιστρόφως ανάλογη με το DNA υπερμεθυλίωση, όπως κυτταρικές σειρές με

IGFBP7

υπερμεθυλίωση έδειξε μικρή ή καθόλου

IGFBP7

γονιδιακής έκφρασης (Σχήμα 6). Μεταξύ των CIMP- κύτταρα που εξετάστηκαν, μόνο COLO 320DM έδειξε DNA υπερμεθυλίωση του

IGFBP7

CpG νησί υποκινητή με ελάχιστο επίπεδο έκφρασης. Εκ των υστέρων, αυτό το μοναδικό χαρακτηριστικό των κυττάρων COLO 320DM σε σύγκριση με τις άλλες κυτταρικές σειρές CIMP- να έχετε ενεργοποιημένη αυτά τα κύτταρα να ανεχθεί μεταλλαγμένο

BRAF

υπερέκφραση, και μπορεί να εξηγήσει τις δυσκολίες μας στην απόκτηση BRAF V600E

κλώνων που εκφράζουν το άλλα ορθοκολικού καρκίνου κυτταρική γραμμή όπως Caco-2.

(Α) Genomic χάρτης του

υποκινητή που σχετίζεται με CpG νησί IGFBP7

, θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS) και το εξώνιο 1 με βάση το γονιδίωμα UCSC πρόγραμμα περιήγησης (Μάρτιος 2006 συναρμολόγηση). Η τοποθεσία των θέσεων CpG ανακρίνεται από την δοκιμασία μεθυλίωσης Illumina GoldenGate DNA δεικνύεται με κατακόρυφα βέλη. επίπεδα (Β) μεθυλίωση του DNA των δύο dinucelotides CpG στο

IGFBP7

προαγωγού CpG νησίδα. β-αξίες του κάθε τόπου CpG σε 10 όγκους (πέντε CIMP- όγκων με άγριου τύπου

BRAF

και πέντε CIMP + όγκους με μεταλλαγμένο

BRAF

, μαύρες μπάρες) και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου ( οι γκρι ράβδοι) που παρατίθενται. (C)

IGFBP7

κουτί υποστηρικτής μεθυλίωσης του DNA οικόπεδα των 235 ανθρώπινου παχέος όγκους στρωματοποιημένη από

BRAF

κατάσταση μετάλλαξης (αριστερά) και CIMP + κατάστασης (δεξιά) στο

IGFBP7

P371 τόπος. Στα οικόπεδα κουτί, τα άκρα του κουτιού είναι οι 25η και 75η τεταρτημόρια. Η γραμμή μέσα στο κουτί προσδιορίζει τη μέση β-αξίας. Τα μουστάκια πάνω και κάτω από το πλαίσιο εκτείνονται προς το πολύ 1,5 φορές το IQR. Η κατάσταση CIMP κάθε παχέος δείγμα όγκου προσδιορίζεται όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση των

IGFBP7

έκφρασης.

Οι IGFBP7

επίπεδα έκφρασης που παρουσιάζονται σε σχέση με το

PCNA

έκφρασης. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση των μετρήσεων τεχνικών τριπλούν. Ο αριθμός των μετουσιωμένο loci μεταξύ των πέντε CIMP δείκτες και μετάλλαξης κατάσταση του

BRAF

και

KRAS

παρατίθενται στο Σχήμα 1 παρέχονται.

Η

Συζήτηση

CIMP σε καρκίνο του παχέος εντέρου παρέχει μία μοναδική ευκαιρία να μελετήσει μοριακών μηχανισμών που οδηγούν σε επιγενετικές μεταβολές στον καρκίνο και τις συνεισφορές αυτών των αλλαγών στην εξέλιξη της νόσου [3], [37]. Τα διακριτά χαρακτηριστικά που βρέθηκαν σε CIMP είναι σημαντικά στοιχεία για την κατανόηση αυτής της φαινότυπο [3], [5], [7], [8]. Ιδιαίτερα εντυπωσιακό είναι το εξαιρετικά σφιχτή σύνδεση μεταξύ CIMP και BRAF

V600E [5]. Μηχανισμοί που συνδέουν επιγενετικής (CIMP) και γενετική (

BRAF

μετάλλαξη) εκδηλώσεις και η χρονική σειρά με την οποία λαμβάνουν χώρα αυτά τα δύο γεγονότα έχουν προσελκύσει το ενδιαφέρον [37].

Στη μελέτη αυτή, χρησιμοποιώντας το υψηλής απόδοσης Illumina GoldenGate πλατφόρμα μεθυλίωσης του DNA, ερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ CIMP και BRAF

V600E σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Πρέπει πρώτα δοκιμαστεί εάν η έκφραση της BRAF

V600E προκαλεί DNA υπερμεθυλίωση από σταθερώς εκφράζουν BRAF

V600E στο CIMP-αρνητικό,

BRAF

άγριου τύπου COLO 320DM καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή. Έχουμε εξετάσει αλλαγές μεθυλίωσης του DNA σε 100 CIMP που σχετίζονται με CpG θέσεις, και διαπίστωσε ότι BRAF

V600E δεν είναι επαρκής για να προκαλέσει DNA υπερμεθυλίωση σε αυτές τις θέσεις. Μια προειδοποίηση από το σύστημά μας είναι ότι BRAF

V600E θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο στην πρόκληση μεθυλίωσης του DNA μόνο στις αρχές του παχέος ογκογένεση, όπως

BRAF

μεταλλάξεις έχουν περιγραφεί στα αρχικά στάδια της ανάπτυξης του όγκου [10], [ ,,,0],38], [39]. Είναι πιθανό ότι ένα μοναδικό σύνολο των γενετικών ή /και επιγενετικών αλλαγών που έλαβαν χώρα στα κύτταρα COLO 320DM θα μπορούσε να δημιουργήσει ένα δυσμενές περιβάλλον για BRAF

V600E να προκαλέσει DNA υπερμεθυλίωση. Πειράματα παρόμοια με εκείνα που περιγράφονται παραπάνω χρησιμοποιώντας κύτταρα Caco-2, τα οποία δείχνουν επίσης CIMP- και να

BRAF

-wild τύπου, δεν ήταν επιτυχείς. Δεν μπορέσαμε να λάβει οποιαδήποτε σταθερά επιμολυσμένων κλώνων που έδειξαν ανιχνεύσιμα επίπεδα του BRAF

V600E (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Παρατεταμένη BRAF

έκφραση V600E θα μπορούσε να είναι ασυμβίβαστη με πολλαπλασιασμό Caco-2 κυττάρων οφείλεται σε κυτταρική γήρανση ή την απόπτωση που επάγεται από BRAF

V600E. Είναι αξιοσημείωτο ότι η ανάλυση RT-PCR μας έδειξαν την ισχυρή έκφραση του

IGFBP7

, ένας μεσολαβητής του BRAF

V600E επαγόμενη γηρασμό ή απόπτωση, σε κύτταρα Caco-2 σε αντίθεση με τα κύτταρα COLO 320DM.

Προηγουμένως, περιγράψαμε CIMP που σχετίζονται με μεθυλίωση του

MLH1

ως υποκείμενη βάση για την αναντιστοιχία ανεπάρκεια επιδιόρθωσης (MSI +) στο σποραδικό καρκίνο του παχέος εντέρου [5]. Minoo

et al.

Αναφερθεί

MLH1

μεθυλίωσης του DNA μετά από σταθερή επιμόλυνση του BRAF

V600E στην κυτταρική σειρά NCM460 [40]. Στο σύστημά μας, δεν είχαμε εντοπίσει μια τέτοια αύξηση σε ποσοστό

MLH1

μεθυλίωση του DNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, από τις 33 BRAF

V600E πρωτοπαθείς όγκους εξετάσαμε μόνο το 42% (14/33) έδειξε

MLH1

DNA υπερμεθυλίωση. Ως εκ τούτου, BRAF

V600E μπορεί να επηρεάσει το DNA υπερμεθυλίωση

MLH1

αλλά μόνο σε ορισμένες περιπτώσεις. Είναι ενδιαφέρον ότι, στην προτεινόμενη οδοντωτή πορεία προς CIMP + όγκους, τόσο

BRAF

μεταλλάξεις και CIMP + έχουν παρατηρηθεί στις αρχές του πρόδρομες βλάβες, ενώ MSI + δεν έχει [6], [10], [41]. Έτσι, η απενεργοποίηση του

MLH1

θα μπορούσε να συμβεί σε μεταγενέστερο στάδιο της ανάπτυξης του όγκου. Minoo και οι συνεργάτες της παρατήρησαν το DNA υπερμεθυλίωση

CDKN2A

και 15 άλλες CIMP που σχετίζονται με δείκτες (

IGFBP7

δεν εξετάστηκε) σε μητρικό NCM460 κύτταρα, τα οποία περιορίζεται η ικανότητά τους να μελετήσουν περαιτέρω το ρόλο της BRAF

V600E επαγωγή CIMP σε πειραματικό σύστημα τους [40].

Περιέργως, παρατηρήσαμε ότι το συνολικό επίπεδο μεθυλίωσης του DNA του CIMP ειδικής loci σε σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα μας αυξάνεται ως συνάρτηση της διόδου κυττάρου. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι ένα φάρμακο επιλογής σε καλλιεργημένα κύτταρα έχει περιγραφεί να οδηγήσει σε αλλαγές στην παγκόσμια δομή της χρωματίνης [42], και μια παρόμοια διαδικασία μπορεί να σχετίζεται με τις παρατηρήσεις μας εδώ.

Επιπλέον, βρήκαμε σχετικά μεγάλες δια-κλωνικών (μεταξύ των διαφορετικών κλώνων) διακύμανση των επιπέδων μεθυλίωσης ϋΝΑ σε πειράματα επιμόλυνσης μας (Σχήματα 2Β και 3), με μέσο όρο R

2 συσχετισμός υπολογίστηκε με βάση τέσσερα EVCs 0,88 ± 0,01 (± SD). κατά μέσο όρο εντός των κλώνων (σε ακτίνα κλώνους σε διαφορετικά περάσματα) μας R

2 συσχέτισης είναι 0,97 ± 0,01 και το R

2 συσχέτιση μεταξύ των τεχνικών αντίγραφα σε ανάλυση μεθυλίωσης Illumina GoldenGate DNA είναι 0,98 ± 0,02 [16]. Κατά συνέπεια, βρήκαμε κάποιες μεγάλες διαφορές στη μεθυλίωση του DNA σε διάφορες θέσεις, ακόμη και μεταξύ των κλώνων ελέγχου (Εικόνες 2Β και 3). Αυτό τονίζει τη σημασία της χρήσης πολλαπλών κλώνων για αυτό το είδος των σπουδών.

Εναλλακτικά, η ισχυρή συσχέτιση μεταξύ CIMP και BRAF

V600E θα μπορούσαν να προκύψουν αν CIMP παρέχει συγκεκριμένα ένα ευνοϊκό κυτταρικό περιβάλλον για BRAF

V600E να προώθηση της ογκογένεσης. Στη δεύτερη σειρά πειραμάτων, προσδιορίσαμε γονίδια των οποίων το DNA υπερμεθυλίωση ήταν στενά συνδεδεμένη με BRAF

V600E και CIMP + σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Περιέργως, παρατηρήσαμε CIMP εξαρτώμενη DNA υπερμεθυλίωση και μεταγραφική αδρανοποίηση των

IGFBP7

, η οποία έχει αποδειχθεί ότι μεσολαβεί BRAF

V600E επαγόμενη κυτταρική γήρανση και την απόπτωση [34]. BRAF

V600E έχει δειχθεί ότι επάγει κυτταρική γήρανση σε καλλιεργημένα και πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα [30], [31], καθώς και μοντέλο ποντικού [32]. Ογκογονίδιο που προκαλείται από τη γήρανση (OIS) έχει αναγνωριστεί ως ένας σημαντικός μηχανισμός καταστολής του όγκου [33]. Για BRAF

V600E να προωθήσει ογκογόνο αποτελέσματά της, οι πρόσθετες συνεταιρισμός γεγονότων που απαιτούνται για να παρακάμψει τη γήρανση [33]. Πρόσφατα, η μοριακή βάση της BRAF

V600E προκαλούμενη γήρανση και την απόπτωση έχει μελετηθεί λεπτομερώς. Wajapeyee et al. προσδιορίζονται

IGFBP7

ως μεσολαβητής της BRAF

V600E που προκαλείται από τη γήρανση σε ανθρώπινα πρωτογενή ινοβλάστες χρησιμοποιώντας ένα γονιδίωμα-ευρεία οθόνη shRNA. μετέπειτα Τα ευρήματά τους υποδηλώνουν ότι

IGFBP7

έκφραση είναι τόσο αναγκαία και επαρκής για να προκαλέσει γήρανση και την απόπτωση σε ανθρώπινα πρωτογενή μελανοκύτταρα και μελανώματος, αντίστοιχα. Επιπλέον, παρατηρείται απώλεια της

IGFBP7

στο BRAF

δείγματα πρωτογενούς V600E θετικά μελάνωμα και κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η αποσιώπηση του

IGFBP7

έκφρασης είναι ένα κρίσιμο βήμα για την ανάπτυξη ενός μελανώματος υπόθαλψη BRAF

V600E [34].

Ανάδοχος που σχετίζονται με CpG νησί DNA υπερμεθυλίωση

IGFBP7

έχει αναφερθεί σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, καθώς και. Ο αναστολέας μεθυλίωση του DNA 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης έχει δειχθεί να αποκαταστήσει

IGFBP7

έκφραση σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, που δείχνει ότι η υπερμεθυλίωση DNA διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο στη σίγηση του γονιδίου αυτού σε καρκίνο του παχέος εντέρου [43 ]. Ωστόσο, η σύνδεσή της με το

BRAF

μετάλλαξη και CIMP + κατάστασης στην ανθρώπινη παχέος εντέρου δεν έχει διερευνηθεί. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι

IGFBP7

DNA υπερμεθυλίωση είναι ογκο-ειδικό και σφιχτά που σχετίζονται με όγκους παχέος εντέρου που μεταφέρουν BRAF

V600E και παρουσιάζουν CIMP. Επιπλέον, βρήκαμε ότι

IGFBP7

DNA υπερμεθυλίωση συνδέεται με την απώλεια της έκφρασης σε CIMP + ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές. CIMP-ειδική απενεργοποίηση του BRAF

V600E που προκαλείται από τη γήρανση και την οδό της απόπτωσης από

IGFBP7

DNA υπερμεθυλίωση θα μπορούσε να δημιουργήσει ένα ευνοϊκό πλαίσιο για την απόκτηση του BRAF

V600E στο CIMP + καρκίνο του παχέος εντέρου.

Είναι σημαντικό,

IGFBP7

υπερμεθυλίωση του DNA δεν παρατηρήθηκε σε όλες τις

BRAF

μεταλλαγμένο παχέος όγκους. Lin

et al

. εξέτασε την αλληλουχία DNA του προαγωγού και εξονικές περιοχές του

IGFBP7

σε δέκα ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές.