Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα επιθηλιακά κύτταρα σε κακοήθεις συνθήκες DNA απελευθέρωση στον εξωκυττάριο διαμέρισμα. Κυττάρων ελεύθερο DNA προέλευσης όγκου μπορεί να δράσει ως συνδέτης των μηχανισμών ανίχνευσης DNA και μεσολαβούν αλλαγές στις αλληλεπιδράσεις επιθηλιακά-στρωματικά.

Στόχοι

Για την αξιολόγηση και τη σύγκριση του δυναμικού αυτοκρινή και παρακρινή ρυθμιστική επίδραση της κανονικής και κακοηθών επιθηλιακών κυττάρων που σχετίζονται με το DNA για TLR9 και μεσολάβηση STING οδών σε ΗΤ-29 ανθρώπινου ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος κύτταρα και φυσιολογικών ινοβλαστών.

Υλικά και Μέθοδοι

DNA που απομονώθηκε από φυσιολογικούς και ογκογόνους κολονική επιθήλια των νωπών Τα κατεψυγμένα δείγματα ιστού αφαιρέθηκαν χειρουργικά χρησιμοποιήθηκε για 24 και 6 ώρα θεραπεία του ΗΤ-29 καρκινώματος κόλου και HDF-α κύτταρα ινοβλαστών. ανάλυση έκφρασης mRNA ολόκληρου του γονιδιώματος και qRT-PCR για τα στοιχεία /μέλη TLR9 μονοπατιού σηματοδότησης. Η ανοσοκυτταροχημεία εκτελέστηκε για επιθηλιακών δεικτών (δηλαδή ΟΚ20 και E-cadherin), μεθυλτρανσφεράση DNA 3α (Dnmt3a) και NFκB (για τα επεξεργασμένα κύτταρα HDFα).

Αποτελέσματα

Διοίκηση του όγκου προέρχεται DNA σε ΗΤ29 κύτταρα οδήγησε σε σημαντική (ρ & lt? 0,05) επίπεδο του mRNA μεταβολή σε 118 γονίδια (logFc≥1, p ≤ 0,05), συμπεριλαμβανομένης υπερέκφραση γονίδια μεταλλοθειονεΐνης (δηλαδή

MT1H

,

MT1X

,

MT1P2

,

MT2A

), γονίδια μετάστασης που σχετίζονται με (δηλαδή

TACSTD2

,

MACC1

,

MALAT1

), βιολογικός δείκτης όγκου (CEACAM5 ), μεταβολικά γονίδια (π.χ.

INSIG1

,

LIPG

), γονίδια μόριο αγγελιοφόρος (δηλαδή

Dapp

,

CREB3L2

).

Αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης

του ΟΚ20, Ε-καδερίνης, και Dnmt3a παρατηρήθηκε μετά την αγωγή του DNA του όγκου σε κύτταρα ΗΤ-29. επεξεργασία υγιή DNA επηρεάζεται η έκφραση του mRNA των 613 γονιδίων (logFc≥1, p ≤ 0,05), συμπεριλαμβανομένης της αυξημένης έκφρασης των βασικών μορίων προσαρμογέα του TLR9 οδού (π.χ.

MyD88

,

IRAK2

,

NFκB

,

IL8

,

IL-1β

), οδός STING (ADAR, IRF7, CXCL10, CASP1) και το

FGF2

γονίδιο.

Συμπεράσματα

DNA από νεοπλασματική επιθήλιο του παχέος εντέρου, αλλά όχι από τα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα δρα ως προ-μεταστατικό παράγοντας για κύτταρα ΗΤ-29 μέσω της υπερέκφρασης των προ-μεταστατικό γονιδίων μέσω TLR9 /MyD88 ανεξάρτητο μονοπάτι. Σε αντίθεση, το DNA που προέρχεται από υγιή επιθήλιο του κόλου που προκαλείται από μονοπάτι σηματοδότησης TLR9 και STING σε φυσιολογικούς ινοβλάστες

Παράθεση:. Furi μου, Καλμάρ Α, Β Wichmann, Spisak S, Schöller Α, Β Bartak, et al. (2015) τηλέφωνα Δωρεάν DNA των όγκων Προέλευσης Προκαλεί μια «μεταστατικός» Έκφραση Προφίλ στο ΗΤ-29 Γραμμή Cancer Cell. PLoS ONE 10 (7): e0131699. doi: 10.1371 /journal.pone.0131699

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 8 Απριλίου 2015? Αποδεκτές: 5 του Ιούνη 2015? Δημοσιεύθηκε: 2 Ιούλ 2015

Copyright: © 2015 furi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι διαθέσιμα μέσω του Gene Expression Omnibus (GEO) υπό τον αριθμό πρόσβασης GSE67557

Χρηματοδότηση:. η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Ταμείο Έρευνας και Τεχνολογίας καινοτομία, την Ουγγαρία, KMR_12-1-2012-0216 να ΒΜ και η ουγγρική Επιστημονικής Έρευνας Ταμείο (επιχορήγηση OTKA-K111743) για να ZT. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Altered επιθηλιακά-στρωματικά αλληλεπιδράσεις είναι θεμελιώδες στο σχηματισμό του καρκίνου. Μεταξύ των γνωστών ρυθμιστικών συνδέτες (π.χ. παράγοντες ανάπτυξης, κυτοκίνες, χημειοκίνες, ορμόνες φύλου) όγκο ιστό προερχόμενο DNA εμπλέκεται επίσης σε αυτή την επικοινωνία μέσω κυτταρικών υποδοχέων αίσθησης DNA [1] Σύμφωνα με αρκετές μελέτες [2-4] των θραυσμάτων DNA προέλευσης όγκου (δηλαδή 21 να 500 βάσεις βραχείες αλληλουχίες ανθρώπινης προέλευσης) παίζουν ένα ρόλο στον σχηματισμό ενός όγκου υποστηρικτικό μικροπεριβάλλον (δηλαδή προώθηση εισβολή όγκου και διαφυγή του ανοσοποιητικού επιτήρησης) [5-8] Η ελεύθερη κύτταρο DNA προέρχεται από νεκρωτική /αποπτωτικά κύτταρα όγκου, και μπορεί να απελευθερωθεί ενεργά από τα ζωντανά κύτταρα με την μεσοκυττάριο διαμέρισμα [9-12]. Αυτός ο ιστός του όγκου προήλθε DNA είναι ανιχνεύσιμο στο πλάσμα και στον ορό και θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν βιοδείκτη για την ανίχνευση του καρκίνου [11]. Περιέχει μια σειρά από καρκίνο συγκεκριμένες οντότητες, συμπεριλαμβανομένων ογκογονίδια, ογκοκατασταλτικά γονίδια, παρεκκλίνουσα μικροδορυφόρων, παρεκκλίνουσα γονίδια μεθυλίωση του DNA, και αναδιατάσσονται χρωμοσωμικό DNA [12]. Πρόσφατες μελέτες επιβεβαίωσαν την πρόσληψη και τη διατήρηση των ογκογονιδίων διέγερση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε μη-κακοήθη κύτταρα μετά την ολοκλήρωση (oncometastasis) στο γονιδίωμα των δικαιούχων cell’s [13].

Στο βαθμό που είναι κατανοητό, η ανίχνευση DNA μηχανισμοί στα κύτταρα-στόχους περιλαμβάνουν δύο κύριες οδοί προσαρμογέα, δηλαδή υποδοχέα ΤοΙΙ (TLR9) και το διεγέρτη των γονιδίων ιντερφερόνης (STING) οδούς. [14] Κυτταροπλασματικά TLR9 αναγνωρίζει ενδογενείς συνδέτες, όπως μοριακά μοτίβα κίνδυνος που σχετίζεται (αποσβένει) όπως μη μεθυλιωμένες ακολουθίες DNA [7, 8, 15] Η συνολική ποσότητα του μη-μεθυλιωμένου DNA αυξάνει παράλληλα με την παγκόσμια υπομεθυλίωσης DNA στον ιστό του όγκου σε σύγκριση με τον φυσιολογικό ιστό [16]. Η αυξημένη έκφραση του TLR9 ανιχνεύθηκε σε διάφορους τύπους όγκων. [1, 17-20] Αυξημένη έκφραση TLR9 σε κύτταρα καρκινώματος σχετίστηκε με υψηλότερο μεταστατικό δυναμικό, ενώ υψηλότερη έκφραση TLR9 από ινοβλάστες όπως κύτταρα συνδέθηκε με μια χαμηλή πιθανότητα μετάστασης [ ,,,0],21]

Η STING μονοπάτι σηματοδότησης είναι ένας προσαρμογέας για το DNA μέσω της δέσμευσης των κυκλικών δινουκλεοτίδια που παράγεται από το ένζυμο κυκλικό GMP-ΑΜΡ (cGAMP) συνθάσης (cGAS). [22-24]

Strong συνέργεια έχει παρατηρηθεί μεταξύ των συνεργαζόμενων STING και σηματοδότηση TLR9. Αυτές οι δύο οδών σηματοδότησης ρυθμίζονται διαφορικά με κρίσιμο μόρια προσαρμογέα (IRF3 /7, κεντρί, και MyD88) [25]. Επιπλέον Deng et al. (2014) και Woo et al. (2014) παρείχε στοιχεία υποδηλώνουν δενδριτικά κύτταρα ανιχνεύουν DNA από τα καρκινικά κύτταρα μέσω του STING μεσολάβηση, του κυτταροπλάσματος μονοπάτι ανίχνευσης DNA. [22, 26, 27]

Με βάση τα προηγούμενα αποτελέσματα μας, ΗΤ-29 ανθρώπινα κύτταρα του παχέος εντέρου αδενοκαρκινώματος αντανακλάται μεταβολή του επιπέδου μεθυλίωσης του DNA (μέσω δραστηριότητας methyltranferase αυξημένα Dnmt3a) και η έκφραση επιθηλιακών δεικτών ΟΚ20 μετά την εκ νέου χορήγηση του εαυτού του DNA [28]. στην παρούσα μελέτη αναλύσαμε τις αυτοκρινείς και παρακρινείς επιδράσεις του DNA από τον όγκο και υγιή ιστό επί ΗΤ-29 τα καρκινικά κύτταρα και ινοβλάστες από ολόκληρο ανάλυση έκφρασης mRNA γονιδιωματικό, και qRT PCR για την επικύρωση των γονιδίων από TLR9 οδό. Επιπλέον ανοσοκυτταροχημική ανάλυση πραγματοποιήθηκε για επιλεγμένες δεικτών διαφοροποίησης, σε κύτταρα τα μόρια προσκόλλησης, και μεθυλτρανσφεράσες, για επιβεβαίωση σε επίπεδο πρωτεΐνης μετά από αγωγή με DNA από υγιή και καρκινικών ιστών.

Υλικά και Μέθοδοι

HT -29 κυτταρικής καλλιέργειας

ΗΤ-29 κύτταρα αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου κόλον αγοράστηκαν από LGC ΠΡΟΤΥΠΑ (cat. Νο ATCC ΗΤΒ-38) και καλλιεργήθηκαν σε ένα ειδικό άνευ παθογόνου εργαστήριο καλλιέργειας κυττάρων στους 37 ° C σε 5% CO

2. ΗΤ-29 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy 5a τροποποιημένο μέσο (Cat Νο M8403-500 mL Sigma-Aldrich, St Louis, USA) συμπληρωμένο με 10% (ο /ο) ορό εμβρύου μόσχου (FBS? Πρότυπο ποιότητας? ΡΑΑ Laboratories GmbH, Pasching, Αυστρία), 160 μg /ml γενταμυκίνη (Sandoz, Sandoz GmbH, Αυστρία), και 125 μg /ml αμφοτερικίνη Β (Sigma-Aldrich, St Louis, USA).

πολιτισμό

HDFα κυττάρων

HDFα κύτταρα αγοράστηκαν από τεχνολογίες ζωής (cat. Νο C0135C) και καλλιεργήθηκαν σε ένα ειδικό άνευ παθογόνου εργαστήριο καλλιέργειας κυττάρων στους 37 ° C σε 5% CO2. κύτταρα HDFα διατηρήθηκαν σε Μέσο 106 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, USA) συμπληρωμένο με LSGS (Life Technologies Corporation, Carlsbad, USA) και αμφοτερικίνη Β (Sigma). 160 μg /ml γενταμυκίνη (Sandoz, Sandoz GmbH, Αυστρία).

απομόνωση DNA

Το γονιδιακό DNA απομονώθηκε από μακροσκοπικά φυσιολογικό περιοχές κοντά του παχέος εντέρου (CRC) και από τις νεοπλασματικές περιοχές ιστού χειρουργικά αφαιρεθεί macrodissected κατεψυγμένα δείγματα CRC (στάδιο ΙΙ, μετρίως διαφοροποιημένων όγκων από σιγμοειδές κόλον και του ορθού (25-50 mg ιστού) από υψηλής καθαρότητας PCR kit προετοιμασία πρότυπο (Roche GmbH, Γερμανία). Αυτά τα CRC ασθενείς ήταν όλα επιβεβαιώνονται από την οριστική ιστολογική διάγνωση και δεν έλαβαν προεγχειρητική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Η απομονωμένη, χωρίς πρωτεΐνες DNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 20 μΙ RNase Α /Τ1 Mix στους 37 ° C για 1 ώρα (Thermo Scientific, Γερμανία). Η συγκέντρωση του απομονωμένου και καθαρισμένου DNA προσδιορίστηκε με Nanodrop- 1000 φασματοφωτόμετρο (Thermo Scientific, Γερμανία).

Ηθική δήλωση

Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι και έχει εγκριθεί από το Πανεπιστήμιο Semmelweis Επιτροπή Δεοντολογίας και την κυβερνητική περιφερειακό και θεσμικό Επιτροπή Επιστήμης και έρευνα Ηθικής (TUKEB), Nr: 23970-2 /2011). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη.

θεραπεία του DNA των ΗΤ-29 και κύτταρα HDFα

HT-29 και HDFα κύτταρα σπάρθηκαν (σε πυκνότητα 0.5×10

6 και 0.1×10

6) σε 6 καλά κυτταρική καλλιέργεια Corning Cellbind πλάκες με πολλές εκβαθύνσεις σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με γενταμυκίνη, αμφοτερικίνη Β και FBS. Όταν μονοστοιβάδες έφθασε 80-90% συρροής, 15 μα του φυσιολογικού ή του όγκου του DNA (διαλυμένο σε 200 μΐ στείρου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS) προστέθηκαν στα φρεάτια. Ο αρνητικός έλεγχος αποτελείται κατάλληλους όγκους PBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO2 και 95% υγρασία.

Απομόνωση ολικού RNA για Affymetrix HGU133 Plus 2.0 μικροσυστοιχιών και γονιδιακή έκφραση qRT-PCR αναλύσεις

Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε 5 ml αποστειρωμένου PBS. Μετά τη δεύτερη πλύση, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 5 ml PBS. 2.5 ml του κυτταρικού αιωρήματος χρησιμοποιήθηκε για την ολική απομόνωση του RNA. Ολικό RNA από τα απομονωμένα κύτταρα ΗΤ-29 εκχυλίσθηκε με το κιτ RNeasy Mini (Qiagen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. το απομονωμένο RNA φυλάχθηκε στους -80 ° C.

έκφραση mRNA microarray ανάλυση

Η ποσότητα και η ποιότητα του απομονωμένου RNA δοκιμάστηκαν με μέτρηση της απορρόφησης και με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα χρησιμοποιώντας το 2100 Bioanalyzer και RNA 6000 Pico Kit (Agilent Inc, Santa Clara, ΗΠΑ). Βιοτινυλιωμένα cRNA ανιχνευτές συντέθηκαν από 4,82 ± 0,60 μg ολικού RNA και κατακερματισμένη χρησιμοποιώντας το One-Cycle Target επισήμανση και τον έλεγχο Κιτ σύμφωνα με την περιγραφή Affymetrix. Δέκα μα εκάστου δείγματος κατακερματισμένων cRNA υβριδοποιήθηκαν σε HGU133 Plus2.0 array (Affymetrix) στους 45 ° C για 16 ώρες. Μικροσυστοιχίες πλύθηκαν και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το σταθμό ρευστών 450 (Affymetrix) και μία μέθοδο χρώσης ενίσχυσης αντίσωμα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα φθορίζοντα σήματα ανιχνεύονται από ένα GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix).

Στατιστική αξιολόγηση της έκφρασης του mRNA προφίλ αναλύσεις

Προ-επεξεργασία και τον έλεγχο της ποιότητας πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις υποδείξεις του όγκου Ανάλυση Best Ομάδα εργασίας πρακτικές (Tumor Ανάλυση Ομάδα εργασίας Βέλτιστων πρακτικών, 2004). Σαρωμένες εικόνες ελέγχθηκαν για αντικείμενα? το ποσοστό των σημερινών κλήσεις (& gt? 25%) και του βαθμού υποβάθμισης RNA αξιολογήθηκαν. Βάσει των κριτηρίων αξιολόγησης, όλες οι μετρήσεις που πληρούσε τις ελάχιστες απαιτήσεις ποιότητας. Στην περίπτωση των πειραμάτων κυττάρων ΗΤ29 και HDFα, η ομοιότητα των 2-2 βιολογικών επαναλήψεις δηλώθηκε με τη μέθοδο της Ευκλείδειας απόστασης. συστοιχίες έκφρασης Affymetrix προ-επεξεργασία με gcRMA με quantile εξομάλυνση και μεσαίο βερνίκι περιλήψεων.

Περαιτέρω αναλύσεις για τον εντοπισμό διαφορικά εκφρασμένων χαρακτηριστικά έγινε με ανάλυση σημασία των μικροσυστοιχιών (SAM). Το πλησιέστερο μέθοδος συρρικνωμένο κέντρο βάρους (ανάλυση πρόβλεψης των μικροσυστοιχιών = ΡΑΜ) εφαρμόστηκε για την ταξινόμηση του δείγματος από τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης. ανάλυση Πρόβλεψη των μικροσυστοιχιών χρησιμοποιεί μαλακό κατωφλίου για την παραγωγή ενός συρρικνωμένο κεντροειδές, το οποίο επιτρέπει την επιλογή των χαρακτηριστικών γονιδίων με υψηλή προγνωστική δυναμικό (Tibshirani κ.ά., 2002). Προ-επεξεργασίας, εξόρυξης δεδομένων και στατιστικών βήματα έγιναν με τη χρήση βιβλιοθηκών Bioconductor στο R-περιβάλλον. Σχολιασμός και λειτουργική ταξινόμηση των γονιδίων διακρίσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του συστήματος Affymetrix NetAffx.

Η αντίστροφη μεταγραφή και ποσοτική πραγματικό χρόνο

αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Μετά την ποσοτική (Nanodrop) και ποιοτική ανάλυση (BioAnalyzer RNA 6000 Pico Kit τσιπ πρόγραμμα κιτ RNA? RIN & gt? 8 σε όλες τις περιπτώσεις), αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση 1 μg ολικού RNA (High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems, USA)

Ποσοτική πραγματικού χρόνου (qRT. ) PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ανιχνευτές πλοίαρχος και SYBR πράσινο (Roche GmbH, Germany). επίπεδα έκφρασης γονιδίων για κάθε επιμέρους δείγμα ομαλοποιήθηκαν με την έκφραση GAPDH. Mean έκφρασης σε σχέση γονιδίου προσδιορίσθηκε και διαφορές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-ΔΟ (t). Ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές του TLR 9 (εξαρτώμενη από MyD88) μονοπατιού σηματοδότησης παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Η

προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας

0.1×10

6 ΗΤ-29 κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα πυκνότητα 0.1×10

6 σε πλάκες με πολλές εκβαθύνσεις καλλιέργειας κυττάρων Corning Cellbind σε RPMI 1640, συμπληρωμένο με γενταμυκίνη και FCS. Μετά από 24 ώρες, το μέσο αλλάχθηκε? και 15 μg του όγκου και φυσιολογικών DNA [διαλυθεί σε 200 μΐ στείρου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS)] προστέθηκε στα φρεάτια. Ο αρνητικός έλεγχος αποτελείται από έναν κατάλληλο όγκο PBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε μια ατμόσφαιρα 5% CO2 και 95% υγρασία για 72 ώρες.

Μετά την επεξεργασία 72 ωρών, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές σε 0,5 ml στείρου PBS, επαναιωρήθηκαν σε 1,0 ml παγωμένης αιθανόλης 70% και αποθηκεύεται στους -20 ° C. Η μέτρηση διεξήχθη εις τριπλούν για κάθε ομάδα θεραπείας.

Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν για 3 λεπτά στις 1300 rpm. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 300 μ1 ρυθμιστικού εκχύλισης? και, προστέθηκε 3 μλ RNAse (RNase Α /Τ1 Mix, Thermo Fisher Scientific Βαλτική UAB, Βίλνιους, Λιθουανία). Μετά από 15 λεπτά επώασης σε θερμοκρασία δωματίου, 3 μΐ προπιδίου jodide (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA? Cat Νο 81845.) Προστέθηκε. Η μέτρηση FACS εκτελέστηκε σε BD FACScalibur (New Jersey, USA).

δοκιμές αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης διεξήχθησαν για να αξιολογηθεί η κυτταρική βιωσιμότητα μετά από έκθεση σε όγκο και φυσιολογικό κύτταρο ελεύθερο DNA. Η ΗΤ-29 cell’s βιωσιμότητα κατόπιν ποσοτικά με μέτρηση του αριθμού των ζωντανών και νεκρών κυττάρων χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο στο χρονικό σημείο 72 ώρες μετά όγκου και φυσιολογικών χορήγηση DNA.

Η ανοσοκυτταροχημική ανάλυση

Από οι ΗΤ-29 κυτταρικό αιώρημα 2,5 ml χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοκυτταροχημική (ICC) αναλύσεις. ΗΤ-29 κύτταρα ήταν CYTO-φυγοκεντρείται επί ενός καλυπτρίδα και στερεώθηκαν σε μεθανόλη στους -20 ° C για 10 λεπτά, και στη συνέχεια επωάστηκαν σε TBS που περιέχει 1% αλβουμίνη βόειου ορού, 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας, 0,3 Μ γλυκίνη και 0.1% Tween 20 , για 1 ώρα για να καταστούν διαπερατά τα κύτταρα και να μπλοκάρουν μη ειδικές αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης.

2×10

5 HDFα ινοβλάστες σπάρθηκαν σε ένα εργαστήριο-Tek διαφάνειες 8 φρεατίων θάλαμο σε 500 μΙ μέσου (Thermo Scientific, Rochester, ΝΥ) και καλλιεργήθηκαν μέχρι 80-90% συρροή. Μετά την επεξεργασία του DNA τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε παγωμένο μεθανόλη στους -20 ° C για 10 λεπτά, και στη συνέχεια επωάστηκαν σε PBS που περιέχει 1% αλβουμίνη βόειου ορού, /10% φυσιολογικό ορό κατσίκας, /0.3 Μ γλυκίνη και 0.1% Tween 20, . TBS-Tween για 1 ώρα για να καταστούν διαπερατά τα κύτταρα και να μπλοκάρουν μη ειδικές αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης

για ανοσοκηλίδωση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με αντι-ανθρώπινο μονοκλωνικό αντι-TLR9 IgG (1: 300? ab85860, Abcam, Cambridge, ΜΑ, USA), και αντι-Dnmt3a IgG (1: 300? ab13888, Abcam, Cambridge, MA, USA) στους 4 ° C όλη τη νύχτα, χρησιμοποιώντας κύτταρα HeLa ως θετικός έλεγχος? αντι-κυτοκερατίνης 20 (1: 200, κλώνος: PCK-26, Dako, Glostrup, Denmark), Ε-καδερίνης (1: 2, κλώνος: ECH6, ιστοπαθολογία Ltd, Pecs, Ουγγαρία) χρησιμοποιώντας ανθρώπινο κολονικό βλεννογόνο ως θετικός έλεγχος? και κουνελιού αντι-IgG ΝΡκΒ (1: 100, GTX102090, Genetex, San Antonio, Texas, USA) χρησιμοποιώντας κύτταρα HepG2 ως θετικός έλεγχος

Οι τομές επωάστηκαν για 30 λεπτά με σημασμένη με υπεροξειδάση πολυμερές-υπεροξειδάση αρμορακίας. (HRP) συζευγμένη σε αντι-ποντικού κατσίκας /ανοσοσφαιρινών κουνελιού (Envision + System-HRP-DAB? Dako, Glostrup, Δανία). Χρώση ολοκληρώθηκε με επώαση με 3,3’diaminobenzidine διαλύματος χρωμογόνου (διάλυμα χρωμογόνου είναι μέρος του κιτ Envision). Οι τομές με αιματοξυλίνη.

αξιολόγηση ICC

Διαφάνειες ήταν ψηφιακά, χρησιμοποιώντας υψηλής ανάλυσης Πανοραμική όργανο σάρωσης (3DHistech Ltd., Ουγγαρία) και αναλύονται με το λογισμικό Πανοραμική Viewer Histoquant Module (3DHistech Ltd ., Ουγγαρία). 1000 κύτταρα /πλακίδιο αξιολογήθηκαν. Στην περίπτωση της Ε-καδερίνης, ΟΚ20, κυτταροπλασματική ανοσοαντιδράσεις βαθμολογήθηκαν ως αρνητικά (-), ασθενές (+), μέτρια (++) και ισχυρή (+++). ΝΡκΒ, Dnmt3a πυρηνικής /κυτταροπλασματικής εκφράσεις βαθμολογήθηκαν ως αρνητικά (-), ασθενές (+), μέτρια (++) και ισχυρή (+++) ανοσοαντιδράσεις. Η πυκνότητα των αρνητικών (-)., Ασθενές (+), μέτρια (++) και ισχυρό θετικό (+++) εικονοστοιχείων σε ανοσοδραστικά κύτταρα αξιολογήθηκε

Αποτελέσματα

Επίδραση της κανονικής και κακοήθων επιθηλιακών DNA για κύτταρα ΗΤ-29

Πρώτα, κατεργασία των ΗΤ-29 κυττάρων με DNA που απομονώθηκε από φυσιολογικό ή του όγκου του ιστού. Και οι δύο θεραπείες επαγόμενη υπερέκφραση του mRNA γονίδια μεταλλοθειονεΐνης (δηλ MT1H, MT1G, MT1X, MT1P2 και MT2A) (μεταλλοθειονεΐνη 1Η, -1G, -1X, -1P2, -2a) (Εικ 1Α και 1Β). Ιστός όγκου που προέρχεται θεραπεία DNA οδήγησε σε σημαντική υπερέκφραση του n = 118 γονίδια (σε επίπεδο mRNA). Μεταξύ αυτών των γονιδίων, παρατηρήσαμε μετάσταση συνδέεται γονίδια π.χ. βιοδεικτών όγκου CEACAM5 (καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο που σχετίζονται με κυτταρικό μόριο προσκόλλησης 5), μεταβολικές γονίδια π.χ. INSIG1 (επαγόμενη από ινσουλίνη γονίδιο 1) LIPG (ενδοθηλιακά λιπάση) και γονίδια μόριο αγγελιοφόρος DAPP1 (διπλή προσαρμογέα φωσφοτυροσίνης και 3-φωσφοϊνοσιτίδια), CREB3L2 (cAMP πρωτεΐνη σύνδεσης στοιχείου απόκρισης 3-σαν 2) (Πίνακας 2)

χάρτης θερμότητας αλλαγές έκφραση που αντιπροσωπεύει RNA σε ΗΤ-29 κύτταρα ελέγχου και ΗΤ-29 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με DNA που απομονώθηκε από υγιείς (Α) και οιδηματώδης (Β) επιθήλιο του κόλου.

Η

Ένας πλήρης κατάλογος των ρυθμιζόμενη γονίδια είναι διαθέσιμο σε (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) με αριθμό πρόσβασης GSE67557.

Ανάλυση της 12ης στοιχείων του TLR9 οδό σε κύτταρα ΗΤ-29 με qRT-PCR

σε κύτταρα ΗΤ-29 είτε όγκου και υγιή ιστό του παχέος εντέρου προέρχονται DNA επηρεάζεται σημαντικά την έκφραση του γονιδίου της IL-1β συνδέονται με PBS αγωγή ελέγχους. Η υπερέκφραση αυτού του γονιδίου ήταν μεγαλύτερη μετά ιστό όγκου που προέρχεται θεραπεία DNA (log Ρο 2,33? P ≤ 0,05), από ό, τι σε δείγματα που κατεργάζονται με φυσιολογικό DNA (log Ρο 1,59? P ≤ 0,05) που σχετίζονται με μη κατεργασμένους ελέγχους (Σχ 2Α και 2Β).

μεταβολές Έκφραση TLR9 MyD88 γονιδίων οδού που εξαρτάται επί Affymetrix U 133 2.0 μικροσυστοιχιών στον έλεγχο, φυσιολογικούς και ογκογόνους δείγματα επεξεργασμένα DNA (A) Σχήμα και q RT-PCR ανάλυση των εξαρτώμενων TLR9 MyD88 οδός του ΗΤ-29 κύτταρα ( Β).

η

δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας

Τα αποτελέσματα της trypan μπλε δοκιμασία αποκλεισμού αντανακλάται ότι καρκινικών κυττάρων χωρίς θεραπεία DNA αυξήθηκε σημαντικά ζουν τον αριθμό των κυττάρων σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (av. 54.22 ± 3,03 έναντι 42,00 ± 3,78? p ≤ 0,05). Μπορούμε επίσης ανιχνεύθηκε μειώθηκε σημαντικά τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων σε φυσιολογικά ομάδα που λάμβανε DNA που σχετίζονται με την ομάδα ελέγχου (av 28,67 ± 3,08 έναντι 42,00 ± 3,78?. P ≤ 0,05)? (Σχήμα 3Α και 3Β)

Αριθμός διαβίωσης (Α) και νεκρά (Β) ΗΤ-29 κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμή αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης.? PI ανάλυση του κυτταρικού κύκλου των ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου (C).

Η

Η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου ΡΙ έδειξε σημαντικά υψηλότερο πληθυσμό των ζωντανών κυττάρων (G1 + S + G2 + Μ φάση) στο DNA του όγκου αντιμετωπίζονται ομάδα εναντίον ομάδας ελέγχου (av 39,11 ± 0,57 έναντι 32,00 ± 2,50?. p ≤ 0,05). Κανονική κατεργασία DNA δεν επηρεάζεται τον κυτταρικό κύκλο των καταμετρηθέντων κυττάρων, αλλά παρατηρήσαμε ένα χαμηλότερο αριθμό των κυττάρων σε φυσιολογικά δείγματα αντιμετωπίζονται DNA (Σχήμα 3C).

Επίδραση των φυσιολογικών και κακοηθών επιθηλιακών DNA σε κύτταρα ινοβλαστών

Θεραπεία της HDFα ινοβλαστών με φυσιολογικό DNA είχε ως αποτέλεσμα υπερέκφραση πολλών γονιδίων στο μονοπάτι TLR9 MyD88, κυτοκίνες, χημειοκίνες, αυξητικοί παράγοντες, γονίδια που σχετίζονται απόπτωση, και προσταγλανδίνες. Συνολικά, το DNA από φυσιολογικό ιστό κόλου οδήγησε σε σημαντική μεταβολή έκφρασης για n = 613 γονίδια (Σχήμα 4Α). Σε αντίθεση, η αγωγή με όγκο ιστό προερχόμενο DNA επηρέασε την έκφραση του μόνο n = 12 γονίδια (Σχήμα 4Β).

χάρτη θερμότητας που αντιπροσωπεύουν μεταβολές έκφραση RNA σε κύτταρα HDFα έλεγχο και HDF-α κύτταρα κατεργασμένα με DNA που απομονώθηκε από υγιής (Α) και οιδηματώδης (Β) κολονικό επιθήλιο.

Η

Σημαντικές αλλαγές γονιδιακής έκφρασης που προκαλείται από τον υγιή ιστό προέρχεται θεραπεία DNA σε κύτταρα HDFα συνοψίζονται στον πίνακα 3. το ελεύθερο DNA των κυττάρων που προκαλείται από την προς τα πάνω ρύθμιση της χημειοκίνης συνδετήρες ως χημειοτακτικοί παράγοντες, προσταγλανδίνες και υποδοχείς για προσταγλανδίνες επιπλέον των οδών αίσθησης DNA.

η

Μετά τη θεραπεία όγκων DNA του HDFα ινοβλαστών, παρατηρήσαμε καμία υπερέκφραση των στοιχείων του TLR9 οδό, χημειοκίνες, αυξητικοί παράγοντες , γονίδια που σχετίζονται με την απόπτωση, προσταγλανδίνες και υποδοχείς για προσταγλανδίνες.

Ένας πλήρης κατάλογος των ρυθμιζόμενων γονιδίων είναι διαθέσιμο σε (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) με αριθμό ένταξης GSE67557.

Ανάλυση της 12ης στοιχείων του TLR9 οδό σε ινοβλάστες από qRT-PCR

Πέντε γονίδια του κανονικού μονοπατιού TLR9 (IRAK2, MyD88, NFKB, IL-8, IL-1β) έδειξαν σημαντική υπερέκφραση μετά την αγωγή με φυσιολογικό ιστό προερχόμενο κύτταρο ελεύθερο DNA που σχετίζονται με κύτταρα μάρτυρες. μεταχείριση που απορρέει DNA καρκινικών ιστών δεν επηρεάζονται τα γονίδια του TLR9 MyD88 οδού. (Log Ρο ≥1? P ≤ 0,05)? (Σχήμα 5Α και 5Β).

μεταβολές Έκφραση TLR9 MyD88 γονιδίων οδού που εξαρτάται επί Affymetrix U 133 2.0 μικροσυστοιχιών στον έλεγχο, φυσιολογικούς και ογκογόνους δείγματα επεξεργασμένα DNA (Α) και q RT-PCR ανάλυση των εξαρτώμενων TLR9 MyD88 οδού για HDF άλφα κύτταρα (Β).

Η

ανάλυση ΔΠΔ των επιθηλιακών δεικτών διαφοροποίησης, πρόσφυση και μεθυλίωση

Εδώ επιλέξαμε τρεις επιθηλιακών δεικτών, δηλαδή ΟΚ20. E-cadherin, Dnmt3a βάση τα προηγούμενα αποτελέσματά μας. [28] PBS αγωγή κύτταρα ΗΤ-29 έδειξαν ασθενή μεμβράνη ΟΚ20 (Σχήμα 6Α), Ε-καδερίνης (Εικ 6D) και ασθενή /μέτρια κυτταροπλασματική Dnmt3a (Σχήμα 6G) έκφραση πρωτεΐνης. θεραπεία DNA Tumor προκαλούμενη αύξηση στην έκφραση του ΟΚ20 ισχυρό θετικό (+++) pixels, (Σχήμα 6C) Ε-καδερίνης ασθενές (+) και μέτρια (++) θετική pixels (Εικ 6F) και Dnmt3a ασθενής (+) θετική pixels ( Σχήμα 6Η). (P ≤ 0,05). Tumor DNA προωθείται έκφραση ΟΚ20 και Ε-καδερίνης στα μη διαφοροποιημένα, ΗΤ-29 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου τόσο σε mRNA και επίπεδο πρωτεΐνης (Πίνακας 4, Σχήμα 6C και 6F) (p ≤ 0,05). Dnmt3a υπερέκφραση πρωτεΐνης συσχετίζεται με τα προηγούμενα αποτελέσματα [28].

έκφραση ΟΚ20 σε ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου κόλου μετά την αγωγή με στείρο PBS (A), με το DNA από φυσιολογικό επιθήλιο κόλου (Β), με DNA από οιδηματώδης επιθήλιο του παχέος εντέρου (C) έκφραση Ε-καδερίνης μετά την αγωγή με στείρο PBS (D), με DNA από φυσιολογικό επιθήλιο κόλου (Ε), με DNA από οιδηματώδης επιθήλιο του παχέος εντέρου (F) έκφραση Dnmt3a μετά την επεξεργασία με στείρο PBS (G) , με DNA από φυσιολογικό επιθήλιο του παχέος εντέρου (h), με DNA από νεοπλασματική επιθήλιο του παχέος εντέρου (Ι).

Η

ανάλυση ΔΠΔ των μεταγραφικών παραγόντων και των δεικτών μεθυλίωσης σε ινοβλάστες

Η ΝΡ-κΒ (ρ65 υπομονάδα) αντανακλάται ασθενές κυτταροπλασματική /nucleolic έκφραση σε αγωγή με PBS ινοβλάστες ελέγχου (Εικ 7D). Με την επίδραση του φυσιολογικού DNA ιστού (Σχήμα 7Ε), αλλά όχι ιστό όγκου προέρχεται το DNA, (Σχήμα 7F) οι ινοβλάστες αντανακλάται αύξηση στην έκφραση του ΝΡκΒ ασθενώς θετικός pixels (+).

έκφραση Dnmt3a σε ινοβλάστες άλφα HDF μετά την αγωγή με στείρο PBS (A), με το DNA από φυσιολογικό επιθήλιο κόλου (Β), με DNA από οιδηματώδης επιθήλιο του παχέος εντέρου (C), η έκφραση ΝΡκΒ μετά την αγωγή με στείρο PBS (D), με DNA από φυσιολογικό επιθήλιο κόλου (Ε ), με DNA από οιδηματώδης επιθήλιο του παχέος εντέρου (F).

Η

Η κυτταροπλασματική έκφραση Dnmt3a ήταν σε ένα ασθενές (+), μέτρια (++) επίπεδο σε κανονικούς ινοβλάστες (Σχήμα 7Α). Η αναλογία της ασθενούς (+) θετική pixels αυξήθηκε ελαφρά μετά την κανονική και θεραπεία DNA των όγκων (Σχ 7Β και 7C).

Τα ανοσοκυτταροχημική αποτελέσματά μας επί ΗΤ-29 κυττάρων και των ινοβλαστών HDFα συνοψίζονται στο Σχ 8Α, 8Β , 8C, 8D και 8Ε.

αξιολόγηση ICC του ΟΚ20 (Α), Ε-καδερίνης (Β) και Dnmt3a (C) στο ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου κόλου και του ΝΡκΒ (D) και Dnmt3a (E) ινοβλάστες άλφα HDF.

Η

Συζήτηση

Ο κύριος σκοπός της εργασίας μας ήταν να εξετάσει τις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση μετά τη χορήγηση των κυττάρων χωρίς DNA που απομονώθηκε από υγιείς και οιδηματώδης κολικού ιστού για HT-29 επιθηλιακά κύτταρα και ινοβλάστες. Δεν είμαστε ενήμεροι για τυχόν μελέτες που έχουν εξετάσει τις αλλαγές έκφρασης στις δύο διαφορετικούς τύπους κυττάρων που συνεργάζονται κατά τη διάρκεια ογκογένεση ή την επίδραση των κυττάρων χωρίς DNA από διαφορετικές προελεύσεις. Σύμφωνα με πρόσφατες δημοσιευμένες μελέτες, βακτηριακό DNA ενεργοποιεί τους υποδοχείς αίσθησης DNA, πιθανώς λόγω της συχνότητας του μη-μεθυλιωμένου CpG αλληλουχίες σε βακτηριακό γονιδίωμα, το οποίο είναι 20 φορές υψηλότερη από ό, τι στο γονιδίωμά σπονδυλωτά ». [35] Από περαιτέρω μελέτες, ήταν σαφές ότι το DNA από παθογόνους βακτήρια ρυθμίζουν προς τα πάνω έκφραση TLR9 [15], στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε τις μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης που προκαλείται από το DNA της προέλευσης όγκου σε καρκινικά κύτταρα, από όλο το φάσμα του γονιδιώματος. Αυτή η προσέγγιση είναι παρόμοια με αυτή που αναφέρεται από τους Lee et. al. (2014), ο οποίος απέδειξε την πρόσληψη, την ενσωμάτωση και την επίδραση αυτού του ιστού του όγκου προήλθε DNA στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. [13]

γονιδίων Τα αποτελέσματα της έκφρασης επιβεβαιώνεται align μας με παρατηρήσεις σε πρόσφατες δημοσιεύσεις που απέδειξαν ότι ανέπαφο DNA του όγκου δεσμεύει ως ένας συνδετήρας προς TLR9 αλλά δεν οδηγεί σε κατάντη ενεργοποίηση της οδού TLR9 [36]. Στη μελέτη μας, ολόκληρο το γονιδίωμα αποτελέσματα σειρά μας στοιχεία που αποδεικνύουν ότι οιδηματώδης DNA λειτουργεί ως προ-μεταστατικό παράγοντα ανεξάρτητα από τις οδούς TLR9 και STING επάγοντας υπερέκφραση των γονιδίων μετάστασης που σχετίζονται με (MACC1, MALAT1, TACSTD2), ο δείκτης όγκου (CEA) , μεταβολικές γονίδια (INSIG1, LIPG) και γονίδια μόριο αγγελιοφόρος (Dapp, CREB3L2). MACC1 είναι μια σημαντική προ-μεταστατικό παράγοντας που έδειξε σημαντική υπερέκφραση μετά από θεραπεία με DNA του όγκου. Αυτό το γονίδιο συνδέεται στενά με τις μεταβολές των εκφράσεων του κυτταρικού κύκλου περίπου και πρωτεϊνών εισβολή που σχετίζονται με. [37] Τα αποτελέσματά μας αντανακλούν την υπερέκφραση άλλων σημαντικών προ-μεταστατικό γονίδια (MACC1, MALAT1, TACSTD2) επιβεβαιώνεται από τα προηγούμενα δεδομένα που αντικατοπτρίζουν τον κύριο ρόλο αυτών των γονιδίων σε μετάσταση και την ένωσή τους με κακή πρόγνωση σε διάφορους επιθηλιακούς καρκίνους του ανθρώπου. [29, 37, 38]

ιστός όγκου που προέρχεται DNA θεραπεία επηρεάζεται INSIG 1 και έκφραση LIPG. Αυτά τα δύο βασικά στοιχεία του μεταβολισμού των λιπιδίων των ενδοθηλιακών είναι επίσης γνωστό ότι σχετίζονται με την εξέλιξη του καρκίνου. [31, 32] Αυξημένη έκφραση LIPG αναφέρθηκε ως πιθανή ουροποιητικού βιοδείκτη καρκίνου. [32] Οι μελέτες που περιγράφονται αυξημένη έκφραση των δευτερογενών μορίων αγγελιαφόρου (Dapp, CREB3L2) σε καρκίνο του παχέος εντέρου με την ανάπτυξη και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου μέσω ΡΙ3Κ μονοπατιού /ΑΚΤ ενεργοποίηση. [33]

Παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία με το DNA του όγκου έχει επίσης ως αποτέλεσμα υπερέκφραση της κυτοκερατίνης 20 και Ε-καδερίνη οποία ελέγχθηκε τόσο σε RNA (Πίνακας 4) και το επίπεδο πρωτεΐνης (Εικ 6C και 6F ). E-cadherin ως πολύ σημαντικός παράγοντας που ρυθμίζει την αλληλεπίδραση κυττάρου-κυττάρου έδειξε επίσης υψηλότερη έκφραση σε ΗΤ-29 κύτταρα κατεργασμένα με DNA του όγκου. E-cadherin υπερέκφραση οδηγεί στην καταστολή της β-κατενίνης Tcf /Lef εξαρτώμενη μεταγραφή και πιθανόν αναστέλλει την κυτταρική απόπτωση. [39]

αλλαγές μεθυλίωσης του DNA που προκαλούνται από Dnmt3a είναι χαρακτηριστικές των καρκίνων του παχέος εντέρου. Re-έκφραση των παραγόντων που στοχεύουν έκφραση Dnmt3a μειώθηκαν σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου. Dnmt3a υπερέκφραση μετά τη θεραπεία με το DNA του όγκου συνάγει μια πιθανή σύνδεση μεταξύ της κατάστασης μεθυλίωσης του ιστού του όγκου που προέρχεται DNA και το μηχανισμό δράσης του όγκου αλληλουχιών DNA που προέρχονται ιστός που δρουν μέσω υποδοχέων αίσθησης DNA. Προηγούμενες μελέτες τονίζουν κρίσιμο ρόλο του ενζύμου αυτού σε σχηματισμό ορθοκολικού καρκίνου. [40]

ιστού Καρκίνο του παχέος εντέρου δεν είναι απομονωμένο, αλλά με κυτταρικό μέσο της μέσω σημάτων χημειοκίνες, κυτοκίνες, αυξητικούς και απόπτωση επικοινωνεί με άλλους ιστούς. Μελέτες έχουν εξετάσει το ρόλο των φυσιολογικών και καρκινικών συνδέονται ινοβλάστες (CAFS) σε καρκίνο του παχέος εντέρου και έδειξε ότι CAFS συν-καλλιεργήθηκαν με επιθηλιακά κύτταρα αυξάνει την ανάπτυξη του όγκου [41], αλλά δεν καθορίζουν το ρόλο των κανονικών ινοβλαστών χωριστά στην ογκογένεση. Ο στόχος μας ήταν να προσδιοριστεί η αντίδραση των κανονικών ινοβλαστών γύρω από τα επιθηλιακά κρύπτες στο απελευθερώνεται DNA και για τη διαλογή των οδών που περιλαμβάνονται σε αυτή τη διαδικασία.

Σε κανονική θεραπεία ινοβλαστών με DNA από φυσιολογικό ιστό που προκαλείται ενεργοποίηση του κανονικού μονοπατιού TLR9 , όπως qRT-PCR αποκάλυψε υπερέκφραση πολλών γονιδίων που εμπλέκονται στην εξαρτώμενη από TLR9 MyD88 οδού (MyD88, IRAK2, ΝΡκΒ, IL-8, IL-1β).

από τα αποτελέσματα ολόκληρη την ανάλυση του γονιδιώματος των μικροσυστοιχιών μπορούμε να συμπεράνουμε ότι το υγιές DNA σε ινοβλαστών όχι μόνο αναγνωρίζεται από TLR9 MYD 88 εξαρτώμενο μονοπάτι, αλλά βρήκαμε ότι τα στοιχεία του κυτοσολίου οδού STING εξαρτώμενη έδειξε επίσης σημαντική υπερέκφραση, η οποία εκκινεί την παραγωγή IFN. Χρησιμοποιώντας το χάρτη μονοπάτι KEGG (https://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa04623+340061) 4 γονίδια (ADAR, IRF7, CXCL10, CASP1) από την οδό STING έδειξαν σημαντική υπερέκφραση μετά την αγωγή με υγιή DNA σε ινοβλάστες HDF-α. Αυτό ενεργοποιείται cgas /STING-εξαρτώμενη ανίχνευσης DNA μονοπάτι που προκαλείται από την υπερέκφραση της ιντερφερόνης ρυθμιστικών παραγόντων IRF1, IRF2, IRF7, IRF9. και επαγόμενη αυξημένη έκφραση των γονιδίων υποδοχέα ιντερφερόνης (IFNAR2, IFNGR2). (Log FC≥1, p ≤ 0,05) η υπερέκφραση CASP1 και NLRC 5 προτείνουν NLRC5-εξαρτώμενη ενεργοποίηση του inflammasome. Davis et. al. δημοσιεύθηκε ότι NLRC5 συνεργάζεται με NLRP3and RNA παρεμβολής μεσολάβηση νοκ ντάουν της NLRC5 σχεδόν εξαλειφθεί δράση της κασπάσης 1. [42]

NFκB ως ρυθμιστικός παράγοντας μεταγραφής έδειξαν σημαντική υπερέκφραση στους ινοβλάστες αντιμετωπίζονται από την κανονική DNA. (Σχήμα 7Ε) Δείχνει ότι κύτταρο ελεύθερο DNA που επάγεται ΝΡκΒ μετατόπιση ρυθμίζουν την απελευθέρωση των προ-φλεγμονωδών κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων.

Ολόκληρο ανάλυση του γονιδιώματος μικροσυστοιχιών έδειξαν εντυπωσιακά διαφορετικό αριθμό γονιδίων που ρυθμίζουν υγιών και καρκινικών ιστών που προέρχονται χορήγηση DNA (613 και 12 γονιδίων, αντιστοίχως). Ενώ υγιής DNA ενεργοποιημένα συστήματα ανίχνευσης DNA και ρυθμίζεται αυξητικά πολλά γονίδια για κυτοκίνες, χημειοκίνες, αυξητικοί παράγοντες, γονίδια που σχετίζονται απόπτωση, προσταγλανδίνες, DNA των όγκων επηρεάζεται μόνο λίγα γονίδια, που δεν περιλαμβάνουν σε αυτό ρυθμίσεως διεργασίες. Νομίζουμε ότι η κανονική ινοβλάστες δεν αντιδρούν με το DNA του όγκου και μια μακροπρόθεσμη καρκίνο ινοβλαστών αλληλεπίδραση θα μπορούσε να ξεκινήσει μια μεταμόρφωση των φυσιολογικών ινοβλαστών σε ινοβλάστες καρκίνωμα που σχετίζονται με την υποστήριξη «μεταστατικό» φαινότυπο.

Η μελέτη μας δείχνει την πιθανή μετάσταση