Αφηρημένο

Το γαλακτικό οξύ είναι μπαλάκι μεταξύ και στο εσωτερικό των κυττάρων, παίζει μεταβολικές και ρόλους σε υγιείς ιστούς σηματοδότησης. Το γαλακτικό είναι επίσης ένας προάγγελος αλλοιωμένης μεταβολισμό και συμμετέχει στην παθογένεση της φλεγμονής, υποξία /ισχαιμία, νευροεκφυλισμού και τον καρκίνο. Πολλά καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν υψηλά ποσοστά παραγωγής γαλακτικού οξέος με την παρουσία οξυγόνου, ένα φαινόμενο γνωστό ως αποτέλεσμα Warburg, η οποία έχει διαγνωστικές και θεραπευτικές συνέπειες, ενδεχομένως. Σε αυτό το άρθρο θα παρουσιάσουμε Λακωνικής, ένα γενετικά κωδικοποιημένο Μεταφορά Forster Ενέργειας Συντονισμού (FRET) -με βάση αισθητήρα γαλακτικό σχεδιασμένο από τον παράγοντα μεταγραφής LldR βακτηριακή. Λακωνικός ποσοτικοποιηθεί γαλακτικό από 1 μΜ έως 10 mM και δεν επηρεάστηκε από τη γλυκόζη, πυροσταφυλικό, οξικό, betahydroxybutyrate, γλουταμικό, κιτρικό, α-κετογλουταρικό, ηλεκτρικό, μηλικό ή οξαλοξικό σε συγκεντρώσεις βρέθηκαν σε κυτοσόλιο θηλαστικών. Εκφράζεται σε αστροκύτταρα, κύτταρα ΗΕΚ και κύτταρα γλοιώματος T98G, ο αισθητήρας επέτρεψε δυναμική εκτίμηση των επιπέδων γαλακτικού σε μονά κύτταρα. Χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με ένα αναστολέα του μεταφορέα MCT μονοκαρβοξυλικό, ο αισθητήρας ήταν ικανό να διακρίνει κατά πόσον ένα κύτταρο είναι ένα δίχτυ παραγωγός γαλακτικό ή ένα δίχτυ γαλακτικό καταναλωτή. Η εφαρμογή του πρωτοκόλλου MCT-block έδειξε ότι το βασικό ρυθμό παραγωγής γαλακτικού οξέος είναι 3-5 φορές υψηλότερη σε κύτταρα γλοιώματος T98G από ότι στα φυσιολογικά αστροκύτταρα. Αντίθετα, ο ρυθμός συσσώρευσης γαλακτικού σε απόκριση σε μιτοχονδριακή αναστολή με αζίδιο του νατρίου ήταν 10 φορές χαμηλότερη σε σχέση με το γλοίωμα αστροκύτταρα, συνεπής με διαταραχές στο μεταβολισμό του όγκου. Μία αναλογία μεταξύ της ταχύτητας παραγωγής γαλακτικού οξέος και του ρυθμού συσσώρευσης γαλακτικού προκαλούμενη από αζίδιο, η οποία μπορεί να εκτιμηθεί αναστρέψιμα και σε μεμονωμένα κύτταρα, αναγνωρίστηκε ως ένα εξαιρετικά ευαίσθητο παράμετρος της επίδρασης Warburg, με τιμές από 4,1 ± 0,5 για τα κύτταρα γλοιώματος T98G και 0.07 ± 0.007 για αστροκύτταρα. Εν ολίγοις, αυτό το άρθρο περιγράφει ένα γενετικά κωδικοποιημένο αισθητήρα για το γαλακτικό και η χρήση του για τη μέτρηση γαλακτικού οξέος συγκέντρωσης, γαλακτικό ροή, και το αποτέλεσμα Warburg σε μονά κύτταρα θηλαστικών

Παράθεση:. Σαν Μαρτίν Α, Ceballo S, Ruminot μου , Lerchundi R, Frommer WB, Barros LF (2013) Ένα γενετικά κωδικοποιημένα FRET αισθητήρα του γαλακτικού οξέος και χρήση της για να εντοπίσει το Φαινόμενο Warburg σε κύτταρα Ενιαία Καρκίνο. PLoS ONE 8 (2): e57712. doi: 10.1371 /journal.pone.0057712

Επιμέλεια: Μίκα Jekabsons, Πανεπιστήμιο του Μισισιπή, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 24, Σεπτεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 24 Γενάρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 26 του Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Σαν Μαρτίν et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Μερικώς υποστηρίζεται από Fondecyt επιχορήγηση 1100936. το Centro de Estudios CientÍficos (ΧΚΕ) χρηματοδοτείται από την κυβέρνηση της Χιλής, μέσω των Κέντρων αριστείας Βασικό Χρηματοδότηση Πρόγραμμα CONICYT και το Gobierno Regional de Los Rios. WBF υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (ΝΙϋϋΚ? 1RO1DK079109). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαλακτικό είναι ένα οργανικό ανιόν που συμμετέχει στην ενδιάμεση μεταβολισμό των ευκαρυωτικών και προκαρυωτικών κυττάρων. Στα κύτταρα των θηλαστικών, γαλακτικό παράγεται από πυροσταφυλικό από το κυτοσολικό ένζυμο γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) και ανταλλάσσεται με τον διάμεσο χώρο και μεταξύ υποκυτταρικά διαμερίσματα μέσω μεταφορέων μονοκαρβοξυλικό (MCTs). Υποξική ιστών και όγκων απελευθερώνουν μεγάλες ποσότητες γαλακτικού, και ήταν κάποτε πίστευαν ότι το γαλακτικό απελευθέρωση ήταν πάντοτε παθολογική, αλλά γίνεται τώρα φανερό ότι εκτός από το ρόλο του στην υποξία, το γαλακτικό έχει σημαντικές λειτουργίες σε υγιείς οξυγονωμένο ιστούς. Intercellular και υποκυτταρικών ανταλλαγές γαλακτικό, ονομάζονται λεωφορεία γαλακτικό, αποτελούν αναπόσπαστο μέρος της κανονικής ενεργειακό μεταβολισμό των μυών και του εγκεφάλου [1], [2]. Σε εγκεφαλικό ιστό, παρά τα κανονικά ή αυξημένα επίπεδα ιστού σε οξυγόνο, νευρική δραστηριότητα συνοδεύεται από μία οξεία αύξηση στο γαλακτικό οξύ του ιστού. Εάν και όταν οι νευρώνες παράγουν ή καταναλώνουν γαλακτικού κατά τη διάρκεια της νευρωνικής δραστηριότητας παραμένει ένα αμφιλεγόμενο ζήτημα [3] – [7], η οποία θα ωφελήσει σε μεγάλο βαθμό από τις μετρήσεις γαλακτικό σε μεμονωμένα κύτταρα. Επιπλέον, γαλακτικό υποστηρίζει η διαδικασία μυελίνωση [8], μπορούν να συμπεριφέρονται σαν ένα ενδοκυτταρικό σήμα σε νευροαγγειακή σύζευξης και νατρίου ανίχνευσης [9], [10], ελέγχει τη δική της παραγωγή [11] και είναι απαραίτητη για το σχηματισμό μακροχρόνιας μνήμης [12 ], [13]. Παθοφυσιολογικές ρόλους για γαλακτικό περιλαμβάνουν φλεγμονή, την επούλωση των πληγών, μικροβιακή μόλυνση, νευροεκφυλισμός και του καρκίνου [14] -. Οι [18]

Πρότυπες μέθοδοι για τη μέτρηση γαλακτικού βασίζονται σε ενζυμικές αντιδράσεις που ακολουθούνται από φωτομετρική ή αμπερομετρικός διαδικασίες. Αυτές οι μέθοδοι περιορίζονται επειδή πρέπει να καταναλώνουν υπόστρωμα ή /και απαιτούν την καταστροφή του δείγματος? κανένας από αυτούς είναι ικανή να ανιχνεύσει ενδοκυτταρικής γαλακτικού μη διεισδυτικά σε πραγματικό χρόνο ή με ανάλυση απλού κυττάρου. Το παρόν άρθρο περιγράφει μια γενετικά κωδικοποιημένη δημοσιογράφος για το γαλακτικό, η χρήση αυτού του ρεπόρτερ για τον προσδιορισμό του γαλακτικού μεταφορών και μεταβολικής ροής με βελτιωμένη χωροχρονική ανάλυση και το σχεδιασμό ενός ευαίσθητου παράμετρος του μεταβολισμού του καρκίνου.

Αποτελέσματα

LldR Πλαισιώνεται από την FRET Ζεύγος mTFP-Αφροδίτης Αναφορές [Γαλακτικό]

Γενετικά κωδικοποιημένα Μεταφορά Förster Ενέργειας Συντονισμού έχουν (FRET) νανοαισθητήρες έχουν αναπτυχθεί για τη μέτρηση των δυναμικών αλλαγών στη συγκέντρωση αρκετών μορίων βιολογικού ενδιαφέροντος με βελτιωμένη χωροχρονική ανάλυση. FRET αισθητήρες είναι πρωτεΐνες σύντηξης που αποτελείται από ένα τμήμα σύνδεσης συνδετήρα, το στοιχείο αναγνώρισης, και μια φθορίζουσα ζευγάρι με επικαλυπτόμενες εκπομπών και φάσματα διέγερσης, συνήθως ΚΑΠ και YFP. Η σύνδεση του υπό εξέταση μορίου προκαλεί μία διαμορφωτική μεταβολή που επηρεάζει τη σχετική απόσταση ή /και τον προσανατολισμό μεταξύ των φθορίζουσες πρωτεΐνες, προκαλώντας μια αύξηση ή μια μείωση στην αποδοτικότητα FRET. Η nanosensor περιγράφεται εδώ βασίζεται στην LldR, ένα βακτηριακό ρυθμιστής μεταγραφής που αποτελείται από δύο ενότητες, ένα γαλακτικό δέσμευσης /ρυθμιστικό πεδίο και ένα πεδίο σύνδεσης ϋΝΑ [19], [20]. Για να δημιουργήσετε έναν αισθητήρα γαλακτικό, επιλέξαμε γονίδια LldR από

Corynebacterium glutamicum

και από το

Escherichia coli

ως πιθανά στοιχεία αναγνώρισης. Η τρισδιάστατη δομή των δύο πρωτεϊνών σύνδεσης γαλακτικό είναι σχεδόν υπερτιθέμενες (Εικ. 1Α), ωστόσο είναι μόνο 19,4% ταυτόσημες, διαφέρουν σε πολλά φορτισμένα κατάλοιπα που μπορεί να μεταβάλει τη σάρωση επιφάνεια επιβάρυνσης και πιθανώς την αλλαγή στην αποδοτικότητα FRET [21] . Ως ζεύγος FRET επιλέξαμε mTFP [22] και της Αφροδίτης [23], η οποία, σε σύγκριση με την ΚΑΠ και YFP, είναι πιο φωτεινή και λιγότερο ευαίσθητη στο ρΗ. Η γενική αρχιτεκτονική των αισθητήρων απεικονίζεται στο Σχ. 1Β, με mTFP βρίσκεται στο Ν-τελικό άκρο, το LldR πλαισιώνεται από συνδετήρες, και της Αφροδίτης που βρίσκεται στο C-άκρο. Οκτώ παραλλαγές κατασκευάστηκαν για κάθε ένα από τα δύο γονίδια χρησιμοποιώντας τοπο-ειδικό ανασυνδυασμό. Οι παραλλαγές διαφέρουν ως προς την παρουσία του τομέα δέσμευσης DNA-και τον συνδέτη μήκος /σύνθεση (αλληλουχίες είναι διαθέσιμες στο Σχ. S1). Μια συγκριτική ανάλυση έδειξε ότι σε απάντηση σε γαλακτικό

Ε. coli

και

C. χίμαιρες glutamicum

αλλάξει αναλογία φθορισμού τους σε αντίθετη κατεύθυνση, και ότι τα κατασκευάσματα από

E. coli

ήταν να ανταποκρίνονται περισσότερο στις γαλακτικό. Παραδόξως, η περιοχή δέσμευσης DNA ήταν σημαντικό για την αλλαγή FRET. Όπως φαίνεται προηγουμένως για νανοαισθητήρες γλυκόζη [21], γαλακτικό αισθητήρες λείπει τεχνητή συνδετήρες διεξάγεται καλύτερα (Εικ. 1 C). Η παραλλαγή με την υψηλότερη μεταβολή απόλυτη αναλογία επελέγη για περαιτέρω χαρακτηρισμό. Αυτό nanosensor ονομάζεται Λακωνικό (γαλακτικό οπτικών νανο Δείκτης από ΧΚΕ) περιέχει το LldR πλήρους μήκους από το

Ε. coli

χωρίς τεχνητά συνδετήρες. Το φάσμα εκπομπής του Λακωνικού χαρακτηρίστηκε από τις αναμενόμενες κορυφές mTFP και της Αφροδίτης φθορισμού στα 492 nm και 526 nm, αντίστοιχα, και μια μείωση της απόδοσης κατά την FRET γαλακτικό δέσμευσης (Σχ. 2Α). Η κινητική της LldR για L-γαλακτικού δεν είναι γνωστές. Το Σχήμα 2Β δείχνει ότι Λακωνικό ανιχνεύεται γαλακτικό πάνω από τέσσερις τάξεις μεγέθους (από 1 μΜ έως 10 mM), αντί των δύο εντολών που παρέχεται από τους αισθητήρες μίας θέσεως όπως τα νανοαισθητήρες γλυκόζη [24]. Όταν αναλύθηκαν

in vitro

, Λακωνικό είναι τουλάχιστον εξίσου ευαίσθητη ως το καλύτερο εμπορικά διαθέσιμο kit με βάση ένζυμο. καμπύλες απόκρισης Lactate δόσης προσδιορίστηκαν σε διαφορετικές τιμές ρΗ (Σχ. 2C), που δείχνει ένα μικρό αποτέλεσμα σε όξινες τιμές και μια πιο σημαντική επίδραση σε αλκαλικό αξίες. Η ειδικότητα διερευνήθηκε με έκθεση του αισθητήρα σε ένα πάνελ των μεταβολιτών και κάποια παρεμβολή ανιχνεύθηκε για πυροσταφυλικό και κιτρικό άλας (Σχ. 2D-I). Πυροσταφυλικό δεν άλλαξε την αναλογία FRET (Σχ. 2D), αλλά σε υψηλές συγκεντρώσεις, πυροσταφυλική μπλοκάρει την επίδραση της χαμηλής γαλακτικού (Σχ. 2G). Η φυσιολογική συγκέντρωση πυροσταφυλικού στα κύτταρα των θηλαστικών είναι χαμηλότερη από 100 μΜ και 10-50 φορές χαμηλότερη από εκείνη του γαλακτικού [1], και ως εκ τούτου ενδογενούς πυροσταφυλικού δεν πρέπει να παρεμβαίνει με γαλακτικό αίσθησης κάτω από φυσιολογικές συνθήκες. Κιτρικό σε 1 mM αύξησε την αναλογία FRET κατά 6% (Σχ. 2D) και μείωσε την απόκριση του αισθητήρα σε υψηλή γαλακτικό (Σχ. 2Η). Δεν παρατηρήθηκαν επιδράσεις στα 10 μΜ ή 100 μΜ κιτρικού (Σχ. 2D και 2Η). Κυτοσολίου κιτρικό είναι χαμηλότερη από 100 μΜ [25] – [27] και επομένως δεν αναμένεται να επηρεάσει την γαλακτικό αίσθησης στο κυτταρόπλασμα. Ωστόσο, μιτοχονδριακή ανίχνευσης μπορεί να επηρεαστεί ως μιτοχονδριακό κιτρικού είναι 10 φορές υψηλότερο. Extreme αναλογίες οξειδοαναγωγής επιτυγχάνεται με συνδυασμούς των NADH και NAD

+ [28], ήταν χωρίς εμφανή επίδραση στην γαλακτικό ανίχνευσης (Εικ. 2Θ).

(Α) κρυσταλλογραφική δομή του LldR από

Corynebacterium glutamicum

[19], και 3D-δομής των LldR από

Escherichia coli

προβλεφθεί χρησιμοποιώντας LldR από

C. glutamicum

και FadR από

Ε. coli

ως πρότυπα (M4T Server 3.0 από το Εργαστήριο Fiser https://www.fiserlab.org/servers_table.htm). (Β) Γενική σχεδιασμό: η μεταγραφική ρυθμιστική LldR στριμώχνεται μεταξύ φθορίζουσες πρωτεΐνες mTFP και η Αφροδίτη, με τεχνητά πεπτίδια διαχωρισμό των πρωτεϊνών (μπλε και πορτοκαλί συνδετήρες). (Γ) η επίδραση των 10 mM γαλακτικού από την αναλογία φθορισμού από 8 παραλλαγές του αισθητήρα γαλακτικού με βάση LldR είτε από

Ε. coli

ή

C. glutamicum

. Η πιο δεκτικά των κατασκευασμάτων, που υποδεικνύεται από το βέλος, χρησιμοποιήθηκε στο υπόλοιπο της μελέτης.

Η

(Α) Τα φάσματα εκπομπής υπό την απουσία και παρουσία 10 mM γαλακτικό. (Β) Η αναλογία μεταξύ mTFP και της Αφροδίτης φθορισμού (στα 430 nm διέγερση) μετρήθηκε σε 0, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5 και 10 mM γαλακτικό. Η συνεχής γραμμή αντιστοιχεί στην καλύτερη προσαρμογή ενός διπλού ορθογώνια υπερβολή με τα δεδομένα, με σταθερή (Κ

D) τιμές εμφανής διάσπαση του 8 ± 2 μΜ και 830 ± 160 μΜ, και οι αντίστοιχες μέγιστες τιμές ΔR 8 ± 0,4% και 11 ± 0,4%. (Γ) καμπύλες Lactate δόσης-απόκρισης μετρήθηκαν στις υποδεικνυόμενες τιμές ρΗ. Η συνεχής γραμμή αντιστοιχεί στην καλύτερη προσαρμογή ενός διπλού ορθογώνια υπερβολή με τα δεδομένα σε ρΗ 0,4. (D) απόκρισης του αισθητήρα σε 5 mM γαλακτικού, πυροσταφυλικού, οξικό, γλουταμινικό, β-υδροξυ-βουτυρικό και γλυκόζη, 1 mM από α-κετογλουταρικό, ηλεκτρικό, μηλικό ή οξαλοξικό, ή αυξανόμενες συγκεντρώσεις κιτρικού (0,01, 0,1 και 1 mM). Σε πάνελ Ε έως Ι, καμπύλες γαλακτικό δόσης-απόκρισης μετρήθηκαν παρουσία οξικού 1 mM, γλουταμινικό, β-υδροξυ-βουτυρικό ή γλυκόζη (Ε), σε 1 mM του α-κετογλουταρικό, ηλεκτρικό, μηλικό ή οξαλοξικό (F) , σε 0.25, 1 mM ή 10 mM πυροσταφυλικό (G), σε 0,01, 0,1 mM ή 1 mM κιτρικό (H), και 0.2 μΜ NADH, 100 μΜ NAD +, ή 0.2 μΜ NADH συν 100 μΜ NAD + (Ι). Οι συνεχείς γραμμές αντιστοιχούν στην καλύτερη εφαρμογή ενός διπλού ορθογώνια υπερβολή για τον έλεγχο των δεδομένων.

Η

Λακωνικό Εκθέσεις Κυτοσολικά γαλακτικού οξέος σε κύτταρα θηλαστικών

Ο αισθητήρας εμφανίζεται το αναμενόμενο του κυτταροπλάσματος διανομής με πυρηνικό αποκλεισμό όταν που εκφράζεται σε ΗΕΚ293 κύτταρα (Σχ. 3Α). Παρά το γεγονός ότι το μεγαλύτερο μέρος του αισθητήρα βρέθηκε στο κυτοσόλιο, η πιθανότητα ότι ένα μικρό κλάσμα εντοπίζεται στον πυρήνα δεν μπορεί να αποκλειστεί. Ωστόσο, δεν φαίνεται πιθανό ότι ο αισθητήρας συνδέεται με το DNA των θηλαστικών, καθώς αυτός ο τύπος έλικα-στροφή-έλικα ρυθμιστής της μεταγραφής δεν εκφράζεται σε κύτταρα θηλαστικών. Πιο άμεσα, η σύνδεση LldR να prokariotic DNA απαιτεί την 17-αλληλουχία νουκλεοτιδίων AATTGGCCCTACCAATT [20], η οποία σύμφωνα με μια ανάλυση έκρηξη είναι απούσα στο γονιδίωμα των θηλαστικών. Η σειρά είναι επίσης απούσα σε ευκαρυωτικά υποκινητές (EPD, ευκαρυωτικοί προαγωγοί Database, ExPASy). Η δυνατότητα παρεμβολής του αισθητήρα με τη μεταγραφή, οι οποίες δεν ευνοούν, μπορεί να αντιμετωπιστεί με την υποκατάσταση Ile 23 με σερίνη, ανέφερε πρόσφατα για την εξάλειψη της δραστηριότητας δέσμευσης του DNA της LldR [29].

(Α) ΗΕΚ293 κύτταρα εκφράζοντας Λακωνικός απεικονίζεται στα 440 διέγερση /535 εκπομπή). μπαρ κλίμακα είναι 20 μm. αναλογία (Β) Ο φθορισμός μετρήθηκε σε 0,01, 0,1, 1 και 10 mM εξωκυτταρικό γαλακτικό σε κύτταρα ΗΕΚ293 που έλαβαν θεραπεία με αναστολείς του μεταβολισμού και διαπερατά σε Η

+ όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. (Γ) Η χρονική πορεία της mTFP και της Αφροδίτης φθορίζοντες μετρήθηκαν με την παρουσία 2 mM γλυκόζης /1 mM γαλακτικό ή 10 mM πυροσταφυλικό, όπως υποδεικνύεται. Ένα κύτταρο με χαμηλή έκφραση του αισθητήρα που απαιτούν ισχυρός φωτισμός επιλέχτηκε για να αποδειχθεί η μη ευαισθησία του δείκτη φθορισμού να φωτολεύκανση. Η αναλογία φθορισμού μετατράπηκε σε γαλακτικό συγκέντρωση χρησιμοποιώντας την αναλογία σε πυροσταφυλικού (μηδέν γαλακτικό) όπως περιγράφεται στο κείμενο.

Η

Για τη βαθμονόμηση, γλυκόλυση μπλοκαρίστηκε με ιωδοοξικό οξύ και μιτοχονδριακό μεταβολισμό μπλοκαρίστηκε με ροτενόνη, σε η απουσία της γλυκόζης, και το κύτταρο ρΗ συσφίγγεται με την nigericine πρωτόνιο ιονοφόρου σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα καλίου-πλούσια. Με γαλακτικό ροή διακόπτεται και χωρίς βαθμίδα ρΗ, ο MCT χρησιμοποιήθηκε για να ισορροπήσει το γαλακτικό κατά μήκος της μεμβράνης του πλάσματος. Η προκύπτουσα καμπύλη βαθμονόμησης (Εικ. 3Β) ήταν παρόμοια σε σχήμα με αυτό που παρατηρήθηκε με καθαρισμένη πρωτεΐνη, υποδηλώνοντας ότι ο αισθητήρας

in situ

συμπεριφέρεται σαν

in vitro

. Ωστόσο, η αλλαγή στην αναλογία mTFP /Αφροδίτη σε όλες τις συγκεντρώσεις γαλακτικού οξέος ήταν περίπου δύο φορές που παρατηρούνται

in vitro

. Δεν ξέρω γιατί το δυναμικό εύρος του αισθητήρα είναι μεγαλύτερη στα κύτταρα. Πιθανές εξηγήσεις περιλαμβάνουν αρνητική παρεμβολή από την ετικέτα ιστιδίνης που χρησιμοποιείται για

in vitro

καθαρισμού και /ή καλύτερη σταθεροποίηση της πρωτεΐνης στο ενδοκυτταρικό περιβάλλον. Ο αισθητήρας δεν μπορεί να βαθμονομηθεί σε αστροκύτταρα επειδή σε αυτά τα κύτταρα στέρηση γλυκόζης απέτυχε να καταστρέφουν γαλακτικό, όπως φαίνεται από μια ισχυρή απάντηση σε πυροσταφυλικό (βλέπε παρακάτω) και έλλειψη ανταπόκρισης σε χαμηλές συγκεντρώσεις γαλακτικού (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), ενδεχομένως εξηγείται από παρατεταμένη γαλακτικό παραγωγή από γλυκογόνο ή /και διαφορετικές συγγένεια MCT. Ακόμη και σε ΗΕΚ κύτταρα, διαπερατότητα MCT δεν είναι γραμμική και η σοβαρή βλάβη των κυττάρων που προκαλείται από τη διαδικασία βαθμονόμησης μπορεί να αλλάξει την πρωτεΐνη αισθητήρα. Για το λόγο αυτό, μια λιγότερο επεμβατική πρωτόκολλο βαθμονόμησης ενός σημείου επινοήθηκε που μπορούν να εφαρμοστούν κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, χωρίς καταστροφή των κυττάρων. Για να καταστρέφουν τα κύτταρα του γαλακτικού οξέος, πήραμε πλεονέκτημα ενός ακινήτου των MCT και άλλων facilitative μεταφορείς ονομάζεται trans-επιτάχυνση ή επιτάχυνση της ανταλλαγής [30]. Θερμοδυναμική ισορροπία για την MCT εξαρτάται από τις κλίσεις του γαλακτικού και ρΗ αλλά επηρεάζεται επίσης από την κλίση του οποιουδήποτε άλλου υποστρώματος. Μια αναγκαστική προς τα μέσα κλίση πυροσταφυλικό εφαρμόστηκε για την αύξηση του αριθμού των προς τα έσω στραμμένες άδειο θέσεις δέσμευσης και μειώνουν τον αριθμό των προς τα έξω όψη άδειο θέσεις σύνδεσης, αυξάνοντας γαλακτικό εκροή και μειώνοντας γαλακτικό εισροή. Μια νέα θερμοδυναμική ισορροπία μπορεί να επιτευχθεί μόνο όταν η ενδο: εξωκυττάριο αναλογία γαλακτικού οξέος ισούται με το ενδοκοινοτικό εμπόριο: extracelullar αναλογία πυροσταφυλικού. Όπως εξωκυτταρικό γαλακτικό κρατήθηκε κοντά στο μηδέν με υπερσύντηξης ενός γαλακτικού-ελεύθερο διάλυμα, ενδοκυτταρική γαλακτικό προβλέπεται να πέσει, όπως παρατηρείται στο σχ. 3C. Μονοχλωροξειδίου (MCA), ένα υπόστρωμα MCT μείωσε την αναλογία φθορισμού σε παρόμοια έκταση, όπως πυροσταφυλικό (Εικ. S2), υποδεικνύοντας ότι η παραγωγή γαλακτικού από πυροσταφυλικό είναι αμελητέα σε σύγκριση με το γαλακτικό εξώθηση μέσω του MCT. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από το γεγονός ότι ο συνδυασμός υψηλής πυροσταφυλικού και χωρίς γλυκόζη μειώνει σοβαρά NADH [28], [31], περιορίζοντας την αντίδραση LDH. Μέτρηση με ενζυματική κιτ επιβεβαίωσε ότι MCA μειώνει αστροκυτταρικό γαλακτικό (Εικ. S2). Με την τιμή για την αναλογία φθορισμού σε γαλακτικό «μηδέν», οι κινητικές σταθερές προσδιορίζονται

in vitro

, και υποθέτοντας μέγιστο αλλαγή αναλογία φθορισμού από 38% (από την καμπύλη δόσης-απόκρισης που τοποθετούνται σε δεδομένα κύτταρο ΗΕΚ) , τα δεδομένα φθορισμού μετατράπηκαν σε συγκεντρώσεις γαλακτικού όπως απεικονίζεται στο Σχ. 3C. Περαιτέρω επικύρωση του πρωτοκόλλου μηδενικής γαλακτικό παρεσχέθη από την παρατήρηση ότι μετά από παρατεταμένη γλυκόζη /γαλακτικό στέρηση σε κύτταρα ΗΕΚ, πυροσταφυλικό δεν επηρέασε την αναλογία φθορισμού (τα δεδομένα δεν φαίνονται), σε συνέπεια με την πλήρη εξάντληση του γαλακτικού οξέος και μια πολύ χαμηλή NADH: NAD

+ λόγος που υπάρχει στα κύτταρα γλυκόζης-στερηθεί [28], [31]. Η ανωτέρω απόδειξη συν το

in vitro

παρατήρηση ότι ο αισθητήρας δεν ανταποκρίνεται στην χαμηλή γαλακτικό παρουσία υψηλών πυροσταφυλικού (Σχ. 2G), υποδηλώνει ότι η αναλογία φθορισμού στην παρουσία υψηλών πυροσταφυλικού είναι μια καλή εκτίμηση μηδενικής γαλακτικό. Παρόλα αυτά, ακόμη και ένα μικρό υπόλοιπο σήμα μπορεί να εισάγει μια σημαντική προκατάληψη και συνιστάται προσοχή κατά τη χρήση του αισθητήρα για την ποσοτικοποίηση γαλακτικό, ιδιαίτερα σε αστροκύτταρα.

Με τον έλεγχο της ανταλλαγής των γαλακτικών μεταξύ των κυττάρων και στο διάμεσο χώρο, MCTS είναι κομβικό σημεία του μεταβολισμού των ιστών. Η πρόσληψη 5 mM γαλακτικό από αστροκύτταρα αναστάλθηκε κατά 65 ± 3% και 62 ± 7% παρουσία των αναστολέων MCT φλορετίνη και parachloromercurybenzoate (pCMBS? Παράσταση ράβδου στο Σχ S3.). Ο μετασχηματισμός του γαλακτικού σε πυροσταφυλικό με LDH θα μειώσει το ποσοστό του γαλακτικού συσσώρευσης, αλλά επειδή οι συγκεντρώσεις πυροσταφυλικού είναι μία τάξη μεγέθους χαμηλότερες από εκείνες του γαλακτικού, αυτό το αποτέλεσμα θα πρέπει να είναι μικρό. Δεν περιμένουμε γαλακτικό buffering από LDH ή από τον ίδιο τον αισθητήρα να είναι ένας σημαντικός παράγοντας, διότι ενδοκυτταρική γαλακτικό, συνήθως σε εύρος εκατοντάδων micromolar να χιλιοστομοριακό, είναι πιο πλούσια από ό, τι είτε [32], [33].

Μέτρηση γαλακτικού παραγωγή και κατανάλωση

Η ροή διάγραμμα στο Σχ. 4Α δείχνει πώς η ενδοκυτταρική συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος επηρεάζεται από γλυκολυτικό παραγωγή, μιτοχονδριακή κατανάλωσης και των εξαγωγών /εισαγωγών μέσω του MCT. Ο ρυθμός γλυκόλυσης στο σημείο εισόδου του έχει εκτιμηθεί με έναν αισθητήρα γλυκόζης FRET αναστέλλοντας τη μεταφορέα γλυκόζης GLUT ενώ παρακολουθείται η ταχύτητα με την οποία η εξοκινάση εξαντλεί την ενδοκυτταρική πισίνα της γλυκόζης [34], μια τεχνική που έχει υπηρετήσει για την ανίχνευση γρήγορες αλλαγές σε αστροκυτταρικές γλυκόλυση σε απόκριση σε νευρωνικό σήματα [11], [35], [36]. Μετά από μια παρόμοια αρχή, γαλακτικό ανταλλαγή διερευνήθηκε σε ΗΕΚ293 κύτταρα διαταράσσοντας τη σταθερή κατάσταση με ένα blocker MCT, ενώ μέτρηση του κυτταροπλάσματος γαλακτικό με Λακωνικής. Με την παρουσία της γλυκόζης ως αποκλειστικό καύσιμο, φλορετίνη προκάλεσε συσσώρευση ενδοκυτταρικού γαλακτικού, ενδεικτικό της καθαρής παραγωγής γαλακτικού, αλλά εάν η γλυκόζη αντικαταστάθηκε από το γαλακτικό, το αποτέλεσμα ήταν γαλακτικό εξάντληση (Εικ. 4Β), ενδεικτικό του καθαρού γαλακτικού εισαγωγής. Σε ΗΕΚ κύτταρα Φλορετίνη αναστέλλεται μόνο το 57 ± 5% της δραστηριότητας MCT (Εικ. S3), και ως εκ τούτου υποτιμά τα πραγματικά ποσοστά παραγωγής ή κατανάλωσης κατά περίπου 40%. pCMBS ήταν πιο αποτελεσματικό από ό, τι MCT blocker phloretin σε κύτταρα ΗΕΚ με το 96 ± 1% αναστολή (σχ. S3), δίνοντας μια πιο ακριβή εκτίμηση της παραγωγής γαλακτικού οξέος (Σχ. 4C). Σε αστροκύτταρα, ο ρυθμός παραγωγής γαλακτικού οξέος που υπολογίζεται με τη διαδικασία βαθμονόμησης περιγράφεται στο Σχ. 3C ήταν 2 ± 0,5 m /s (n = 22 κυττάρων σε τρία πειράματα), η οποία εμπίπτει στη σωστή τάξη μεγέθους θεωρώντας ότι υπό τις ίδιες πολιτισμό και πειραματικές συνθήκες αστροκύτταρα καταναλώνεται γλυκόζη σε 2 m /s [34] και ότι κάποια γλυκόζη οξειδώνεται σε CO

2. Οξεία αναστολή της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης (OXPHOS) με αζίδιο διεγείρεται παραγωγή γαλακτικών από αρκετές φορές (Εικ. 4D), που ταιριάζει την παρατηρούμενη διέγερση της κατανάλωσης γλυκόζης [34]. Μετρήσεις ρΗ Control με BCECF έδειξε ότι αζίδιο προκάλεσε μια μικρή αύξηση της οξύτητας που σε αστροκύτταρα έφθασε 0,1 μονάδες ρΗ κατά την περίοδο κατά την οποία προσδιορίσθηκε το γαλακτικό συσσώρευση (Σχ. S4). Με 2 λεπτά αζιδίου έκθεσης, οι τρεις τύποι κυττάρων είχε σταθεροποιηθεί σε ένα ρΗ περίπου 0,2 μονάδες ρΗ χαμηλότερη από τις τιμές ελέγχου. Τα αποτελέσματα της phloretin και pCMBS επί ενδοκυτταρικού ρΗ ήταν μικρότερα. Λαμβάνοντας υπόψη την περιορισμένη ευαισθησία του αισθητήρα γαλακτικού σε ένα μικρό οξίνιση (Σχ. 2C), ρΗ δεν φαίνεται να είναι ένας σημαντικός παράγοντας για τις διαφορετικές επιδράσεις των αναστολέων σε γαλακτικό αίσθησης σε αστροκύτταρα, ΗΕΚ293 και T98G κύτταρα.

(Α) Διάγραμμα γαλακτικού μεταβολισμό. Η κυτοσολική συγκέντρωση του γαλακτικού εξαρτάται από την ισορροπία μεταξύ γλυκολυτικό παραγωγή, μιτοχονδριακή κατανάλωση του πυροσταφυλικού και του γαλακτικού, και την ανταλλαγή με το εξωκυτταρικό πισίνα γαλακτικό μέσω MCTs. (Β) Η ενδοκυτταρική γαλακτικό παρακολουθούνταν σε μεμονωμένες ΗΕΚ293 κύτταρα κατά τη διάρκεια παροδικών ανοιγμάτων σε Φλορετίνη (50 μΜ), υπό την παρουσία 25 mM γλυκόζης (άνω πάνελ) ή 1 mM γαλακτικό (κάτω πίνακας). (Γ) Οι απαντήσεις των ενδοκυτταρικών γαλακτικού σε παροδική αναστολές του MCT με phloretin (50 μΜ) ή pCMBS (500 μΜ) διαδοχικά μετράται στο ίδιο κύτταρο ΗΕΚ293 σε παρουσία 25 mM γλυκόζης. Οι ευθείες γραμμές παριστάνουν πλαγιές του γαλακτικού συσσώρευση τοποθετηθεί με γραμμική παλινδρόμηση κατά την διάρκεια του πρώτου λεπτού της έκθεσης. Το ραβδόγραμμα συνοψίζει τα δεδομένα από τρία πειράματα. (Δ) Η επίδραση των 5 mM αζίδιο του νατρίου μετρήθηκε σε αστροκύτταρα κατά την έκθεση σε 50 μΜ φλωρητίνη.

Η

Single-Cell Real Time-διάγνωση του καρκίνου του μεταβολισμού

Τα καρκινικά κύτταρα έχουν ελαττωματικά μιτοχόνδρια και ισχυρή γλυκόλυση, ένα φαινόμενο γνωστό ως αποτέλεσμα Warburg, η οποία είναι επίσης παρούσα σε κυτταρικές γραμμές [15]. Συνεπής με ένα μικρό ρόλο για μιτοχόνδρια στην παραγωγή ΑΤΡ σε καρκινικά κύτταρα, σε πραγματικό χρόνο μέτρηση της γλυκόζης με τον αισθητήρα γλυκόζης FRET [37] έδειξε ότι γλυκόλυση στα κύτταρα γλοιώματος T98G είναι πολύ λιγότερο ανταποκρίνεται στην αναστολή OXPHOS από γλυκόλυση σε αστροκύτταρα (Εικ. S5) . Έτσι, μια ισχυρή γλυκολυτικό απάντηση αζίδιο μπορεί να ερμηνευθεί ως ένδειξη ότι τα μιτοχόνδρια έχουν ένα σημαντικό ρόλο στην κυτταρική παραγωγή ΑΤΡ. Η αναστρεψιμότητα των επιπτώσεων του αζιδίου και φλορετίνη αφέθηκε διαδοχικές εφαρμογές του αζιδίου, φλορετίνη και pCMBS στο ίδιο κύτταρο. Τα αποτελέσματα δείχνουν αστροκύτταρα και κύτταρα γλοιώματος που παρουσιάζουν απέναντι μοτίβα, με αστροκύτταρα ανταποκριθεί έντονα στην αζίδιο αλλά ασθενώς σε phloretin /pCMBS και κύτταρα T98G ανταποκρίνονται ασθενώς προς αζίδη και περισσότερο έντονα σε phloretin /pCMBS (Σχ. 5Α-Δ). Η ανάλυση της συχνότητας της απόκτησης απαιτούνται για ακριβή εκτίμηση της απόκρισης σε αζίδιο περιγράφεται στο Σχ. S6. Πειράματα ελέγχου έδειξαν ότι όπως παρατηρήθηκε στα κύτταρα ΗΕΚ, σε T98G κύτταρα γλοιώματος pCMBS είναι ένας καλύτερος αναστολέας της MCT από phloretin (95 ± 5% και 53 ± 3% αναστολή, αντίστοιχα? Εικ. S3). Μία αναλογία μεταξύ βασικής παραγωγής γαλακτικού και την ανταπόκριση σε αναστολή OXPHOS μετράται στο ίδιο εύρος αναλογία φθορισμού και στο ίδιο κύτταρο θα πρέπει να είναι ευαίσθητος σε γαλακτικό συγκέντρωση και ως εκ τούτου επηρεάζεται λιγότερο από τις πιθανές διαφορές σε κατάσταση ηρεμίας συγκέντρωση γαλακτικού ή τη συμπεριφορά του αισθητήρα μεταξύ των κυτταρικών τύπων. Μια τέτοια αναλογία, την οποία έχουμε ονομάζεται Warburg Index, ήταν εξαιρετικά ευαίσθητο στη μεταβολική διαφορά μεταξύ αστροκύτταρα και κύτταρα γλοιώματος. Υπολογίστηκε με phloretin, η οποία υποτιμά παραγωγή γαλακτικού περισσότερο σε κύτταρα γλοιώματος και κύτταρα ΗΕΚ ό, τι σε αστροκύτταρα (Εικ. S3), η Warburg δείκτης ήταν 0,07 ± 0,01 σε αστροκύτταρα, 0.74 ± 0.15 σε κύτταρα ΗΕΚ και 1,7 ± 0,2 σε κύτταρα γλοιώματος. Υπολογίστηκε με pCMBS, ο Warburg δείκτης ήταν 0,07 ± 0,01 σε αστροκύτταρα, 0.94 ± 0.08 σε κύτταρα ΗΕΚ και 4,1 ± 0,6 σε κύτταρα γλοιώματος (Σχ. 5Ε). Πιο συγκεκριμένοι αναστολείς MCT που εισήχθη στην έρευνα και σε κλινικές δοκιμές που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε μικρομοριακές συγκεντρώσεις ή χαμηλότερα. AR-C155858, ένας ειδικός αναστολέας της MCT1 και MCT2 [38], βρέθηκε ότι αναστέλλει την πρόσληψη 5 mM γαλακτικό σε αστροκύτταρα κατά 87% (Σχ. S7). Χρησιμοποιώντας AR-C155858 η Warburg Δείκτης υπολογίζεται σε αστροκύτταρα ήταν 0,07 ± 0,006 (Εικ. S7). Πειράματα ελέγχου έδειξαν ότι phloretin, αζίδιο και AR-C155858 ήταν χωρίς αποτέλεσμα επί γαλακτικό ανίχνευσης

in vitro

(Εικ. S8). pCMBS δεν αναμένεται να αλληλεπιδρά με τον αισθητήρα, καθώς δεν εισέρχονται σε κύτταρα θηλαστικών.

(α) ένα αστροκυττάρων εκφράζουν Λακωνικό διαδοχικά εκτίθεται σε 5 mM αζίδιο, 50 μΜ φλορετίνη και 500 μΜ pCMBS. Οι ευθείες γραμμές αντιπροσωπεύουν τις αρχικές κλίσεις των γαλακτικών συσσώρευσης τοποθετηθεί με γραμμική παλινδρόμηση εντός της ίδιας περιοχής τιμών λόγου. (Β) Ένα T98G κύτταρο γλοιώματος που εκφράζει Λακωνικό διαδοχικά εκτίθεται σε 5 mM αζίδιο, 50 μΜ φλορετίνη και 500 μΜ pCMBS. Οι ευθείες γραμμές αντιπροσωπεύουν τις αρχικές κλίσεις των γαλακτικών συσσώρευσης τοποθετηθεί με γραμμική παλινδρόμηση εντός της ίδιας περιοχής τιμών λόγου. (C) Σύνοψη των αρχικών κλίσεις (αναλογία Δ /min) που λαμβάνεται σε τρία πειράματα του τύπου που φαίνεται στα Α και Β οικόπεδο (D) Συσχέτιση μεταξύ των ποσοστών του γαλακτικού συσσώρευσης (αναλογία Δ /min) σε αζίδιο και σε pCMBS. Σύμβολα αντιπροσωπεύουν ενιαίο αστροκύτταρα (λευκό), κύτταρα ΗΕΚ293 (γκρι) ή κύτταρα T98G (μαύρο). (Ε) Η Warburg Δείκτης υπολογίστηκε ως ο λόγος μεταξύ των συντελεστών της παραγωγής γαλακτικού οξέος με pCMBS και γαλακτικό συσσώρευσης με αζίδιο, και χρησιμοποιείται για να χρωματίσει το περίγραμμα του κάθε στοιχείου σύμφωνα με την αναζητήσετε πίνακα με 16 χρώματα. Το ένθετο δείχνει ένα απομονωμένο κελί που βρισκόταν περίπου 100 μm από το σύμπλεγμα. Το ραβδόγραμμα συνοψίζει τα δεδομένα από 3 πειράματα σε κάθε τύπο κυττάρου. Κλίμακα μπαρ είναι 20 μm. *, P & lt? 0.05 ανάμεσα σε κάθε τύπο κυττάρου.

Η

Συζήτηση

Έχουμε χρησιμοποιήσει το βακτηριακό μεταγραφικό ρυθμιστή LldR ως στοιχείο αναγνώρισης για τη δημιουργία Λακωνικού, ένα γενετικά κωδικοποιημένο βιοαισθητήρα που ανιχνεύει το γαλακτικό στο φυσιολογικό εύρος. Που εκφράζεται σε κύτταρα θηλαστικών, ο αισθητήρας ήταν ικανό να ευαίσθητος εκτίμηση της δραστηριότητας της γαλακτικής μεταφορέα και γαλακτικό παραγωγής και χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργηθεί μία νέα παράμετρο μονοκύτταροι του αποτελέσματος Warburg, η μεταβολική σήμα κατατεθέν των καρκινικών κυττάρων. Η ανάπτυξη ενός αισθητήρα με βάση LldR παρέχει τη βάση για τη δημιουργία μιας ευρείας ποικιλίας νέων δεικτών επειδή η υπεροικογένεια GntR, εκ των οποίων LldR είναι μέλος, περιλαμβάνει τουλάχιστον 270 άλλους παράγοντες μεταγραφής που προσδένονται πυροσταφυλικό, λιπαρά οξέα, αμινοξέα, κύκλος TCA ενδιάμεσα προϊόντα, κλπ [19], [39], τα οποία είναι πιθανά στοιχεία αναγνώρισης για τα γενετικώς κωδικοποιημένα νανοαισθητήρες.

Ο αισθητήρας ήταν ικανή να προσδιορίζει τα επίπεδα γαλακτικού στο εύρος μεταξύ 1 μm και 10 mm. Η εκτεταμένη γκάμα της ανίχνευσης ήταν απρόσμενη, όπως προηγουμένως αναπτυχθεί μεταβολίτης αισθητήρες καλύπτουν μόνο δύο τάξεις μεγέθους [40] – [43]. Affinity είναι κυρίως καθορίζεται από τις ιδιότητες του στοιχείου αναγνώρισης και όχι από τις φθορίζουσες εταίρων, έτσι ώστε η χαρακτηριστική κινητική συμπεριφορά αυτού του αισθητήρα LldR με βάση και την ευαισθησία της σε επίπεδα mM πυροσταφυλικού μπορεί να παρουσιάζουν ενδιαφέρον για τους ερευνητές που εργάζονται σε μεταγραφική ρύθμιση. Λακωνικός προσφέρει πλεονεκτήματα σε σχέση με τις εναλλακτικές μεθόδους, το πρώτο ψήφισμα ον. Ενζυματικές δοκιμασίες και HPLC απαιτούν ένα μεγάλο αριθμό των κυττάρων, καθιστώντας ουσιαστικά δεδομένα μόνο εάν υπάρχει μεταβολικό ομοιογένεια. Πραγματικό ιστούς και ακόμη και πρωτογενείς καλλιέργειες ιστών είναι πολύπλοκα μίγματα των κυττάρων που αναπτύσσονται και διαφοροποιούνται καλύτερα με την παρουσία του άλλου, ένα δημοφιλές παράδειγμα είναι συν-καλλιέργειες νευρώνων και αστροκυττάρων. Όπως και με άλλα γενετικά κωδικοποιημένα νανοαισθητήρες, Λακωνικό μπορεί να εκφράζεται

in vivo

σε προσδιορισμένες κυτταρικούς τύπους χρησιμοποιώντας διαγονιδίωση ή ιική μεταγωγή και μπορούν να στοχεύσουν σε υποκυτταρικά οργανίδια. Ένα άλλο συν οπτικών μετρήσεων είναι ότι δεν απαιτούν την καταστροφή του δείγματος, που επιτρέπει τον σχεδιασμό των στατιστικώς ισχυρές πειραμάτων πριν και μετά τον τύπο. Εκτός από το ότι μεταφέρονται από MCTs, η δραστηριότητα των οποίων μπορεί να εκτιμηθεί χρησιμοποιώντας μια ευαίσθητη στο ρΗ βαφή, γαλακτικό μεταφέρεται επίσης ανεξάρτητα των πρωτονίων μέσω κόμβων χάσμα [44] και πιθανώς μέσω ημικανάλια συνδετίνης και τα κανάλια pannexin, ροές που είναι αόρατα με τις μετρήσεις του ρΗ και ότι μπορεί τώρα να προσεγγιστεί.

Αν και το παρόμοιο σχήμα των καμπυλών βαθμονόμησης που λαμβάνονται

in vitro

και στα κύτταρα ΗΕΚ είναι ενθαρρυντικά, η απαραίτητη σκληρότητα του πρωτοκόλλου πλήρους βαθμονόμησης είναι ένα θέμα ανησυχίας και δεν είναι δυνατόν στο στάδιο αυτό να εξασφαλιστεί ότι οι κινητικές παράμετροι που λαμβάνονται

in vitro

αντιπροσωπεύουν τη συμπεριφορά του αισθητήρα στα κύτταρα. Τα δεδομένα μπορούν επομένως να θεωρηθούν ως ημι-ποσοτική και εκφράζεται σε όρους αναλογίας Δ χρησιμοποιώντας το σημείο μηδέν γαλακτικό ως αναφορά, ιδανικά σε πριν και μετά τα πειράματα με τα ποσοστά σε σύγκριση με παρόμοιες τιμές αναλογία. Ένας άλλος περιορισμός του Λακωνικού είναι η ευαισθησία του ρΗ του στην αλκαλική περιοχή. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, η κυτοσολικό ρΗ των περισσοτέρων κυττάρων κυμαίνεται μεταξύ 7,0 και 7,4, εύρος στο οποίο ο αισθητήρας έδειξε μικρή αλλαγή, αλλά λόγω του ευρέος φάσματος των συγκεντρώσεων που καλύπτεται, ακόμη και μια σχετικά μικρή αλλαγή του ρΗ μπορεί να εισάγει ένα σφάλμα στο γαλακτικό προσδιορισμού. Εάν ένας ισχυρός μεταβολή του ρΗ είναι παρόν, μια διόρθωση μπορεί να επιτευχθεί με ευαίσθητων πρωτεϊνών ή βαφές κόκκινου ρΗ, συν-φορτωμένο στα ίδια κύτταρα ή με παράλληλα πειράματα BCECF. Μια στέκεται θέμα στο μεταβολισμό των κυττάρων είναι ο βαθμός στον οποίο τα μιτοχόνδρια μεταβολίζουν το γαλακτικό αντί του πυροσταφυλικού [45] – [47], ένα φαινόμενο που μπορεί να αντιμετωπιστεί με τον αισθητήρα γαλακτικό εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα. Γαλακτική μετρήσεις στη μιτοχονδριακή μήτρα μπορεί να αποδειχθεί πιο δύσκολη λόγω της μειωμένης ευαισθησίας του Λακωνικού στο ρΗ 7.8-8.0 περιβάλλον στο διαμέρισμα και την πιθανή παρεμβολή με κιτρικό. Οι περιορισμοί αυτοί μπορεί ίσως να ξεπεραστεί με μεταλλαξογένεση, όπως αποδεικνύεται για την ευαισθησία στο ρΗ του αισθητήρα NADH Peredox [28].

Το πρωτόκολλο για την εκτίμηση της παραγωγής γαλακτικού οξέος /κατανάλωση πρέπει ιδανικά να χρησιμοποιήσετε ένα αναστρέψιμο αναστολέα ικανή να μπλοκάρει διαπερατότητας γαλακτικού χωρίς επηρεάζουν άλλες πρωτεΐνες μεμβράνης ή ενδοκυτταρικές διεργασίες. Ούτε pCMBS ούτε φλωρητίνη εκπληρώσει τέτοια περιγραφή, αλλά αλληλοσυμπληρώνονται. pCMBS δεν εισέρχεται στο κύτταρο, αλλά στοχεύει πολλές επιφανειακές πρωτεΐνες και η επίδρασή του είναι μη αναστρέψιμη, αποκλείοντας το σχεδιασμό του πριν και μετά από πειράματα. Δεν ξέρω γιατί αστροκύτταρα ήταν πιο ανθεκτικά στην pCMBS. Διαφορική ευαισθησία των ισομορφών MCT είναι δυνατόν, αλλά δεν μπορέσαμε να βρούμε αποδείξεις ότι στην βιβλιογραφία. Η μερική αναστολή από pCMBS αναμένεται να υποτιμούν παραγωγής γαλακτικού οξέος σε αστροκύτταρα κατά περίπου 35%, με μια παρόμοια προκατάληψη εισαχθεί στο ευρετήριο Warburg. Η επίδραση της φλωρητίνη είναι αναστρέψιμη, αλλά λιγότερο αποτελεσματικά και δεν είναι συγκεκριμένες, είτε. τιμές P & lt?