Αφηρημένο

Αυξημένα επίπεδα CCL5 είναι δείκτες της δυσμενούς έκβασης σε ασθενείς με μελάνωμα, του μαστού, του τραχήλου της μήτρας, του προστάτη, του στομάχου ή του καρκίνου του παγκρέατος. Εδώ, έχουμε αξιολόγησε το ρόλο που διαδραματίζουν οι αλληλεπιδράσεις CCL5 /CCR5 στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Για να γίνει αυτό, έχουμε εξετάσει μια σειρά από κλινικά δείγματα ανθρώπινου καρκινώματος του παχέος εντέρου και βρήκε CCL5 και οι υποδοχείς της υπερ-εκφράζεται στα πλαίσια της πρωτοβάθμιας καθώς και το ήπαρ και πνευμονικές μεταστάσεις των ασθενών σε σύγκριση με τους υγιείς ιστούς. In vitro, CCL5 αύξησε την ανάπτυξη και μεταναστευτικές αποκρίσεις των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου και από τα δύο ανθρώπινα και ποντικού προέλευσης. Επιπλέον, η συστηματική αγωγή των ποντικών με CCL5 κατευθυνόμενη αντισωμάτων μείωσε την έκταση της ανάπτυξης των υποδόριων όγκων του παχέος εντέρου, του ήπατος και μεταστάσεων περιτοναϊκών carcinosis. Σταθερά βρήκαμε αύξηση του αριθμού των CD45-ανοσοαντιδραστικών κυττάρων εντός του στρώματος των υπόλοιπων βλαβών, καθώς και στη διεπαφή με τον υγιή ιστό. Σε αντίθεση, η επιλεκτική στόχευση των CCR5 μέσω χορήγησης ΤΑΚ-779, ένας ανταγωνιστής CCR5, μόνο σε κίνδυνο μερικώς εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου. Επιπλέον, CCL5 εξουδετέρωση παρέχονται οι όγκοι πιο ευαίσθητα σε PDGFRβ-κατευθυνόμενη στρατηγική σε ποντίκια, αυτή η θεραπευτική αγωγή σε συνδυασμό προσφέρει τη μεγαλύτερη προστασία έναντι ηπατικές μεταστάσεις και καταστολή μακροσκοπική περιτοναϊκή carcinosis. Συλλογικά, τα στοιχεία μας αποδεικνύουν την εμπλοκή του CCL5 στην παθογένεια του ορθοκολικού καρκινώματος και το σημείο με πιθανή αξία της ως θεραπευτικό στόχο

Παράθεση:. Cambien Β, Richard-Fiardo P, Karimdjee BF, Martini V, Ferrua Β , Pitard Β, et al. (2011) CCL5 Εξουδετέρωση Περιορίζει τον καρκίνο ανάπτυξη και ενισχύει τη στοχοθέτηση των PDGFRβ σε ορθοκολικό καρκίνωμα. PLoS ONE 6 (12): e28842. doi: 10.1371 /journal.pone.0028842

Επιμέλεια: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Ιουνίου, 2011? Αποδεκτές: 16 Νοεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 20η Δεκεμβρίου του 2011

Copyright: © 2011 Cambien et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale και από την Ένωση pour la Recherche sur le Καρκίνο (Grant 3707). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Bruno Pitard κατέχει απόθεμα Σε-Cell-Art Co, η οποία αναπτύσσει 704 για εφαρμογές εμβολίου. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Τα Εισαγωγή

αλληλεπιδράσεις όγκου-στρώματος αναγνωρίζεται ως κρίσιμα στοιχεία της εισβολής του όγκου και το μεταστατικό δυναμικό του παχέος εντέρου καρκίνωμα [1]. Στρωματικά, φλεγμονώδη και τα καρκινικά κύτταρα να επικοινωνούν μεταξύ τους απευθείας μέσω επαφής των κυττάρων, αλλά και έμμεσα, μέσω παρακρινούς σήματα [2], [3]. Τέτοια σήματα ευνοούν την ανάπτυξη του όγκου σε πολλαπλούς τρόπους: δρουν ως παράγοντες ανάπτυξης, διεγείρουν την αγγειογένεση, διαμορφώνουν την εξωκυττάρια μήτρα, επάγουν την πρόσληψη πρόσθετων στρωματικών κυττάρων και λαμβάνει μέρος σε ανοσολογικούς μηχανισμούς φοροδιαφυγής του καρκίνου. Κατά συνέπεια, ο προσδιορισμός των παραγόντων που προάγουν όγκο για θεραπευτική του καρκίνου έχει γίνει μεγάλο ενδιαφέρον να αναπτύξει στρατηγικές κατά του όγκου που πρέπει να εφαρμοστούν είτε ως θεραπεία μονοθεραπεία είτε ως συνδυαστική θεραπεία σε περίπτωση που οι όγκοι αποτυγχάνουν να ανταποκριθούν στις μονοθεραπεία. Οι διάφοροι παράγοντες έχουν ταυτοποιηθεί μέχρι τώρα ως προωθητές της εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου, πιο κοινά από τα οποία είναι ο VEGF (αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας) οικογένεια, ο (αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών) οικογένεια FGF και ο PDGF (προερχόμενος από αιμοπετάλια αυξητικός παράγοντας) οικογένεια, τους παραγωγής κατά την νεόπλασμα συσχετίζοντας με το βαθμό του όγκου και μικρότερη επιβίωση των ασθενών [4] – [8]. Πιο πρόσφατα, υπήρξε αύξηση αποδεικτικά στοιχεία από διάφορες μελέτες, συμπεριλαμβανομένων δικό μας ότι οι χημειοκίνες παράγονται στην μικροπεριβάλλον του όγκου μπορεί επίσης να διαδραματίσει έναν κρίσιμο ρόλο στην παθογένεια της CRC (ορθοκολικό καρκίνωμα) [9] – [12].

μεταξύ των χημειοκινών πιστεύεται ότι προάγει έντονα την καρκινογένεση και stromagenesis είναι CCL5 /RANTES (CC χημειοκινικού συνδέτη 5 /Ρυθμιζόμενη κατά την ενεργοποίηση, φυσιολογικά Τ-κυττάρων-εκφράζεται και εκκρίνεται), η οποία περιγράφηκε αρχικά για τον καθοριστικό ρόλο στις φλεγμονώδεις νόσους. Πράγματι, κλινικές ενδείξεις αποκάλυψε ότι τα αυξημένα επίπεδα του ιστού ή CCL5 πλάσματος είναι δείκτες του δυσμενούς αποτελέσματος σε ασθενείς με μελάνωμα, μαστού, του τραχήλου της μήτρας, του προστάτη, του στομάχου ή του καρκίνου του παγκρέατος [13] – [20]. Στον καρκίνο του μαστού,

in vivo

CCL5 εξουδετέρωση ή CCR5 ανταγωνισμός δείχθηκαν να καταργήσει την MSC επαγόμενη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων ενοχοποιώντας έτσι CCL5 /CCR5 ως βασικό άξονα σε αυτή την κακοήθεια [21]. Η επιλεκτική στόχευση της σηματοδότησης CCR5 /CCL5 οδήγησε επίσης σε μειωμένη ανάπτυξη του όγκου σε πειραματικά παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα μέσω διακοπής της CCR5-εξαρτώμενη πρόσληψη ρυθμιστικών Τ κυττάρων σε όγκους [22]. Anibamine, ένας νέος ανταγωνιστής CCR5 κατέστειλε επίσης τις επεμβατικές και μεταστατικές ιδιότητες των κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε ποντίκια [23]. Τέλος, ο αποκλεισμός CCL5 σημαντικά σε κίνδυνο γαστρικού εξέλιξης του καρκίνου [20]. Είναι ενδιαφέρον, CCL5 έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι εκφράζεται σε ορθοκολικό καρκίνωμα, κυρίως στο μεταναστευτικό μέτωπο των πρωτογενών όγκων [24]. Με βάση τις προαναφερθείσες κλινικές παρατηρήσεις σε διάφορες μορφές καρκίνου, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι CCL5 και των υποδοχέων της μπορεί να έχει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της CRC και μπορεί έτσι να αντιπροσωπεύουν ένα ενδιαφέροντα στόχο για τη θεραπεία αυτής της κακοήθειας. Μέχρι σήμερα, όμως, καμία από αυτές τις πτυχές έχουν αντιμετωπιστεί

in vivo

.

Η μελέτη που περιγράφεται στο παρόν αποσκοπεί ακριβώς στο να πάρει νέες ιδέες για το ρόλο που διαδραματίζουν οι αλληλεπιδράσεις CCL5 /CCR5 στην ανάπτυξη της ορθοκολικό καρκίνωμα. Για να γίνει αυτό, έχουμε εξετάσει μια σειρά από κλινικά δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου και βρήκε CCL5 και οι υποδοχείς της υπερ-εκφράζεται στα πλαίσια της πρωτοβάθμιας καθώς και το ήπαρ και πνευμονικές μεταστάσεις των ασθενών CRC σε σύγκριση με τους υγιείς ιστούς. Για να αξιολογηθεί η σκοπιμότητα της CCL5 /CCR5 εξουδετέρωση σε καρκίνωμα του παχέος εντέρου, έχουμε χρησιμοποιήσει συγγενικά πειραματικά μοντέλα ορθοτοπική (συκώτι) και έκτοπη (υποδόριο) καρκίνο του παχέος εντέρου σε ποντίκια με φυσιολογικό ανοσοποιητικό σύστημα. Εξετάσαμε την επίδραση της CCL5- ή CCR5-αναστολείς χορηγούνται ως μονοί παράγοντες ή σε συνδυασμό με ένα PDGFRβ κατευθυνόμενη θεραπεία ποντικού, η στρατηγική αυτή είναι επί του παρόντος υπό κλινική αξιολόγηση για την θεραπεία των καρκίνων CRC. Αυτή η έκθεση παρέχει την πρώτη προκλινικές αποδείξεις για έναν ρόλο της CCL5 σε καρκίνωμα του παχέος εντέρου και καταδεικνύει ότι αποκλεισμός CCL5 έχει τη δυνατότητα να μειώσει την πρόοδο του καρκίνου του παχέος εντέρου και για τη βελτίωση της θεραπευτικής απόκρισης σε αγωγή πολυφαρμάκου.

Υλικά και Μέθοδοι

αντιδραστήριο

το ακόλουθο αντιδραστήριο (ΤΑΚ-779) λήφθηκε μέσα από το ΝΙΗ AIDS Έρευνας και Αναφορά Πρόγραμμα αντιδραστηρίων, Division του AIDS, Εθνικό Ινστιτούτο Αλλεργιών και Λοιμωδών Νοσημάτων, ΝΙΗ.

Tumor οι κυτταρικές σειρές και σε πειραματόζωα

κύτταρα καρκινώματος ΗΤ29 Ανθρώπινου και CT26 ποντικού κόλον αγοράστηκαν από το ATCC και διατηρήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Θηλυκά SCID και BALB /c ποντίκια, ηλικίας 6 έως 8 εβδομάδων, αγοράστηκαν από την Harlan (Gannat, France).

Ηθική

Δέκα σύνολα πρωτογενών όγκων καρκίνου του παχέος εντέρου και του μεταστατικού ιστών από το ίδιο ασθενείς καθώς και σε συνδυασμό «υγιών» παχέος βιοψίες συλλέχθηκαν από ασθενείς με διηθητικό αδενοκαρκίνωμα, ο οποίος υποβλήθηκε σε χειρουργική βιοψία ή την αρχική χειρουργική επέμβαση στο Institut Paoli-Calmettes (IPC, Μασσαλία, Γαλλία) μεταξύ του 1987 και του 2007. Κάθε ασθενής έδωσαν γραπτή συγκατάθεση και η μελέτη εγκρίθηκε από την IPC «Comité d’Προσανατολισμός stratégique». Όλες οι διαδικασίες που αφορούν εργαστηριακά ζώα και τη φροντίδα τους, εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας (αριθμός αδείας # A06-088-14).

TaqMan πραγματικού χρόνου PCR πειράματα

Το συνολικό RNA από ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο και υγιής παχέος εντέρου, από ποντικό υγιή και καρκινικών ιστών, καθώς και κυτταρικές γραμμές καρκινώματος κόλου εξήχθη χρησιμοποιώντας RNeasy κιτ (Qiagen, Courtaboeuf, Γαλλία) και μεταγράφηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας το ένζυμο Superscript III (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα ΑΒΙ PRISM 7900HT και διεξάγεται με τη χρήση δοκιμασιών έκφρασης γονιδίου TaqMan® για ανθρώπινα δείγματα (hCCR1: Hs 00174298m1, hCCR3: Hs 00356601m1, hCCR5 Hs 00152917m1, hCCL5: Hs 00174575m1) (Applied Biosystem, Courtaboeuf, Γαλλία ), ή προσδιορισμούς γονιδιακής έκφρασης SYBR® σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Applied Biosystem). Οι αλληλουχίες εκκινητών για CCL5 ποντίκι ήταν: προς τα εμπρός, 5′-TGCCCACGTCAAGGAGTATTTC-3 ‘? και να αντιστραφεί, 5’-AACCCACTTCTTCTCTGGGTTG-3 ‘, για CCR1 ποντίκι: προς τα εμπρός, 5′-AGGCCCAGTGGGAGTTCAC-3′? και να αντιστραφεί, 5’-TCTTCCACTGCTTCAGGCTCTT-3 ‘, για CCR3 ποντίκι: προς τα εμπρός, 5′-AAGCTTTGAGACCACACCCTATG-3′? και να αντιστραφεί, 5’-GACCCCAGCTCTTTGATTCTGA-3 ‘? για CCR5 ποντίκι, μπροστά 5’-TTATCTCTCAGTGTTCTTCCGAAAAC-3 ‘και να αντιστραφεί, 5′-TTCTCCTGTGGATCGGGTATAGA-3’. Σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA σε προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ΔΟ

τιμές Τ λαμβάνεται με αφαίρεση C

ελέγχου Τ (ανθρώπου ή ποντικού ακτίνη) από C

γονίδιο στόχο Τ μετρήθηκε με τον ίδιο παρασκεύασμα RNA. Συγκριτική επίπεδο έκφρασης του mRNA μεταξύ υγιών (

X

) και μεταστατικούς ιστούς (

Y

) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο Δ

C

Τ

Y

–

ΔΟ

Τ

X

και εκφράζονται ως φορές πάνω από υγιείς (2ΔΔ

C

T). Ποντικού υγιείς ιστούς κόλου χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των όγκων ποντικού και ανθρώπου δείγματα υγιών κόλον χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση ανθρώπινων όγκων και ΗΤ-29 δείγματα.

In vitro

πολλαπλασιασμό δοκιμασία

Εν συντομία , ο καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρα προκατεργάστηκαν ή όχι με ΤΑΚ-779 ή αντισώματα αντι-CCL5 (στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις) σπάρθηκαν σε πυκνότητα 10

4 κύτταρα /cm

2 και επωάστηκαν είτε σε μέσο άνευ ορού εμπλουτισμένο ή σε μέσου βάσης (που περιέχει 0,1% αλβουμίνη βόειου ορού) συμπληρωμένο ή όχι με διάφορες συγκεντρώσεις ανασυνδυασμένου CCL5 (Peprotech, Neuilly-sur-Seine, Γαλλία) για 5 ημέρες πριν από την θρυψίνη-ανεξάρτητο, συλλέγονται και απαριθμούνται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11].

In vitro

χημειοταξίας

δοκιμασία

Χημειοτακτική αποκρίσεις του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας θαλάμους χημειόταξης 24 φρεατίων και Τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο ένθετα με 8 μm πόρους (Becton Dickinson, San Jose, CA ) επικαλυμμένα με 6.5 μg /mL ινωδονεκτίνης (Sigma, Lyon, France) ή με 50 μg /mL κολλαγόνο (Becton Dickinson) για τα κύτταρα CT26 ή τα κύτταρα ΗΤ29, αντίστοιχα [11]. καρκινικά κύτταρα κόλου, προεπεξεργασμένα ή όχι με ΤΑΚ-779 ή αντισώματα αντι-CCL5 (στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις), τοποθετήθηκαν στο ανώτερο φρεάτιο (5 × 10

4 κύτταρα) και διάφορες συγκεντρώσεις του ανασυνδυασμένου CCL5 (Peprotech) προστέθηκαν στα κάτω φρεάτια. Μετά την επώαση των πλακών για 18 ώρες (κύτταρα CT26) ή για 40 ώρες (κύτταρα ΗΤ29) στους 37 ° C σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα, μη μεταναστεύσαντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την άνω φρεάτιο και τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν συλλέγονται η κάτω πλευρά του ενθέματος χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας κρυσταλλικό ιώδες χρώμα και απαριθμήθηκαν. δείκτης Μετανάστευση υπολογίστηκε ως ο λόγος του αριθμού των κυττάρων που μετανάστευσαν σε φρεάτια χημειοελκτικό περιέχουν διαιρείται με τον αριθμό των κυττάρων που μετανάστευσαν στο βασίσει μέσο μόνο. ​​

PDGFRβ γονίδιο φορέα έκφρασης

DNA που κωδικοποιεί mPDGFRβ κλωνοποιήθηκε και εισήχθη εντός του φορέα ευκαρυωτικής έκφρασης ρΤΟΡΟ-cDNA3 (Invitrogen). Ταυτότητες του έννοια (pcDNA3-PDGFRβ) και αντιπληροφοριακό (φορέας ελέγχου) προϊόντα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση.

παρασκεύασμα πλασμιδίου και τυποποίηση

Το πλασμιδιακό εμβόλιο DNA (pcDNA3-PDGFRβ) και το αντίστοιχο διάνυσμα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν ως αντιγόνα. Όλα τα πλασμίδια καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας στήλες πλασμιδίου EndoFree καθαρισμού (Qiagen) και επιβεβαιώθηκαν να είναι απαλλαγμένα από μόλυνση ενδοτοξίνης (ενδοτοξίνη & lt? 0.1 EU /μg πλασμιδίου DNA) με την δοκιμασία amoebocyte λύματος Limulus (Lonza, Le Perray en Yvelines, Γαλλία). Το συμπολυμερές tetrafunctionalized αμφιφιλικού μπλοκ 704 (MW 5500) παρασχέθηκε από Σε-Cell-Art (Νάντη, Γαλλία). Αποθεματικά διαλύματα παρασκευάστηκαν σε 20% (w /v) σε νερό και αποθηκεύθηκε στους 4 ° C. Σκευάσματα DNA με 704 (τελική συγκέντρωση 0,3%) παρασκευάστηκαν αμέσως πριν από την ενδομυϊκή ένεση με equivolumetric ανάμειξη των συμπολυμερών σε νερό με διάλυμα DNA πλασμιδίου, όπως περιγράφεται προηγουμένως [25], [26]. Οι δόσεις που χορηγούνται DNA υποδεικνύονται διάρκεια της μελέτης.

Η επιμόλυνση με φορέα έκφρασης γονιδίου PDGFRβ

Η σωστή έκφραση του mPDGFRβ επαληθεύτηκε με παροδική επιμόλυνση των κυττάρων CHO με τον φορέα ελέγχου και το πλασμίδιο εμβόλιο DNA ( pcDNA3-PDGFRβ) χρησιμοποιώντας AMAXA Biosystems (Lonza). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, λύματα κυττάρων από κύτταρα CHO παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27] πριν υποβληθεί σε SDS-PAGE. Κηλίδωση Western Διεξήχθη είτε με αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού PDGFRβ αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology, Le Perray-en-Yvelines, Γαλλία) ή με αραιωμένο ορό που λαμβάνεται από τα PDGFRβ-vaccinated- ποντικούς. Η ανίχνευση έγινε είτε με κουνελιού αντι-κατσίκας Abs- ή κατσίκας-αντι-ποντικού Abs- συζευγμένο με υπεροξειδάση κρένου (Dako, Trappes, France). Οι ζώνες οπτικοποιήθηκαν με χημειοφωταύγεια ενισχυμένη αντίδραση (Amersham, Les Ulis, Γαλλία).

μοντέλα ποντικιού

της μοντέλα

Υποδόρια, το ήπαρ και πνευμονική μετάσταση.

Για την επαγωγή της υποδόριας και ηπατική όγκων, κύτταρα CT26 (5 × 10

4) ή κύτταρα ΗΤ29 (3 χ 10

6) ενέθηκαν στο πλευρό ή κάτω από την κάψουλα του ήπατος του BALB /c ή SCID ποντίκια, αντίστοιχα. Για την επαγωγή των πνευμονικών μεταστάσεων, κύτταρα CT26 (3 χ 10

4) ή κύτταρα ΗΤ29 (2 × 10

6) παραδόθηκαν με ενδοφλέβια ένεση ουρά σε BALB /c ή SCID ποντίκια, αντίστοιχα. Σε θυσία, έγιναν πλήρη μεταθανάτιες εξετάσεις. Υποδόρια και ηπατικοί όγκοι αποκόπηκαν, ζυγίστηκαν και μετρήθηκαν με παχύμετρο σε δυο κάθετους άξονες (

ένα

και

b

). Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο

ab

2π /6.

ενδομυϊκή DNA εμβολιασμό.

Μετά από μια προφυλακτική ρύθμιση, αναισθησία ποντίκια εμβολιάστηκαν 3 φορές σε μεσοδιάστημα 3 εβδομάδων (ημέρα 0, 21 και 42) με ενδομυϊκές ενέσεις των σκευασμάτων DNA-πολυμερούς σε αμφότερα

πρόσθιο κνημιαίο

μύες, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25], [26]. Τρεις εβδομάδες μετά την τελευταία ώθηση (ημέρα 66), οι ποντικοί προκλήθηκαν με έγχυση 5 × 10

4 CT26 κύτταρα καρκινώματος του παχέος εντέρου ποντικών κάτω από την κάψα του ήπατος.

θεραπείες ποντίκι.

Anti -CCL5 ή ισοτυπικού ελέγχου IgG αντισώματα (32 μg ανά ποντικό, Peprotech) εγχύθηκαν στο περιτόναιο των ποντικών BALB /c 72 ώρες μετά την εμφύτευση του όγκου και δύο φορές την εβδομάδα για τη διάρκεια των πειραμάτων (από 69 ημέρα έως 87). ΤΑΚ-779, το μικρό μόριο CC χημειοκίνης υποδοχέα 5 (CCR5) αναστολέα [28], [29] εγχύθηκε σε ποντικούς (150 μg /ποντικό) 72 ώρες μετά την καρκινικά κύτταρα εμβολιασμό και ημερησίως στη συνέχεια μέχρι τη θυσία (από 69 ημέρα έως 87 ).

Στην θυσία (ημέρα 87), η ηπατική όγκοι αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν. Επίπτωση της περιτοναϊκής carcinosis σε ποντικούς εκφράστηκε ως επί τοις εκατό των ζώων carcinosis φέρουν σε κάθε ομάδα.

Προσδιορισμός των επιπέδων στον ορό του mPDGFRβ ειδικών Abs με ELISA

Ο ορός συλλέχθηκε με οπισθοκογχική αιμορραγίες σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά τον εμβολιασμό από ανοσοποιημένους ποντικούς. Πλάκες ELISA επιστρώθηκαν με 2 μg /ml αντι-ποντικού PDGFRβ αντισώματα (Santa Cruz) εντός 100 μΙ PBS όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Το επόμενο πρωί, οι πλάκες πλύθηκαν δύο φορές με PBS /Tween 20 (PBST), κορεσμένο επί 30 λεπτά με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 1% αποβουτυρωμένο γάλα και 0,12% Triton Χ-100 (ρυθμιστικό δοκιμασίας), πλύθηκε και πάλι δύο φορές πριν να επωάζονται για 18 h σε θερμοκρασία δωματίου με ανασυνδυασμένο PDGFRβ ποντίκι. Μετά από επανειλημμένες πλύσεις, σειριακές αραιώσεις δειγμάτων ορού από ανοσοποιημένους ποντικούς προστέθηκαν στο καλά εις διπλούν. Οι πλάκες περαιτέρω επωάστηκαν για 2 ώρες, πλύθηκαν τέσσερις φορές με PBST, και δεσμευμένη ενζυμική δραστικότητα αποκαλύφθηκε με χρωμογόνο διάλυμα υποστρώματος OPD και μετρήθηκε στα 490 nm.

Ιστολογία /Ανοσοϊστοχημεία

Φορμόλης στερεωμένου, εγκλεισμένα σε παραφίνη τμήματα του καρκίνου του παχέος εντέρου μεταστατικό ιστοί χρωματίσθηκαν με αιματοξυλίνη /ηωσίνη για αξιολόγηση μορφολογικά. Η ανοσοχρώση των CD45 διεξήχθη με αντι-ποντικού CD45 mAb (Βϋ Pharmingen, Le Pont de Claix, Γαλλία) με το σύμπλοκο μέθοδο ανοσοϋπεροξειδάσης αβιδίνης-βιοτίνης ακόλουθη ανάκτηση αντιγόνου μικροκυμάτων. Το πρωτογενές αντίσωμα αντικαταστάθηκε με ισότυπο αντισωμάτων σε παρακείμενες τομές ιστού ως αρνητικός έλεγχος. Η έκφραση του CD45 σε σπλήνα ποντικού χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος.

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± s.e.m. και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

δοκιμή του αταίριαστο Student ή τη δοκιμή Kruskal-Wallis για πολλαπλές συγκρίσεις.

Αποτελέσματα

Η έκφραση της CCL5 και συγγενείς υποδοχείς της στα δείγματα καρκίνωμα εκτομή του παχέος εντέρου

αναλύθηκε με ποσοτική RT-PCR (σε πραγματικό χρόνο-ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής) τα επίπεδα έκφρασης της ανθρώπινης CCL5 και των υποδοχέων του CCR1, CCR3 και CCR5 χειρουργικά τεμάχια εκτομή των ανθρώπινων πρωτογενών όγκων του παχέος εντέρου, του ζευγαρωμένα ηπατική και πνευμονική παχέος μεταστάσεις καρκίνου και των αντίστοιχων υγιών ιστών που συλλέγονται από τους ίδιους ασθενείς. Παρατηρήσαμε αυξημένα επίπεδα έκφρασης CCL5 σε όγκους παχέος εντέρου (6 φορές, Ρ & lt? 0,05), μεταστάσεις ήπατος (8,5 φορές, Ρ & lt? 0,05) και τις μεταστάσεις στους πνεύμονες (4 φορές, Ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με υγιή δείγματα (Σχήμα 1Α, S1 ). Επειδή CCL5 δρα μέσω ειδικών υποδοχέων, μπορούμε επίσης να εξεταστεί για αυτούς τους υποδοχείς που εκφράζονται στο εσωτερικό του όγκου και των μεταστατικών δείγματα. Διακριτή πρότυπα έκφρασης ΚΜΠ μετρήθηκαν σύμφωνα με το όργανο-στόχο. Ενώ CCR1 και CCR5 και οι δύο βρέθηκε να υπερεκφράζεται σημαντικά σε κακοήθη ήπαρ και πνεύμονα ιστούς σε σύγκριση με αντίστοιχες βιοψίες ελέγχου (Ρ & lt? 0.01 στο ήπαρ, Ρ & lt? 0,05 στους πνεύμονες), CCR3 βρέθηκε μόνο σημαντικά υπερεκφράζεται εντός πρωτογενών ορθοκολικών νεοπλασμάτων συγκριτικά με υγιή όργανα (Ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 1Α, S1)

Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του ανθρώπου (h) ή (m) στόχοι ποντικού διεξήχθη με ποσοτική RT-PCR σε χειρουργικές κομμάτια εκτομή του καρκινώματος ανθρώπινου ορθοκολικού. (n = 10) (Α), σε πειραματικά υποδόριων όγκων (n = 6), το ήπαρ (η = 6) και οι μεταστάσεις πνεύμονα (n = 6) που προέρχεται από ποντικό CT26 κύτταρα (Β) ή προέρχονται από ανθρώπινα κύτταρα ΗΤ29 (C) σε σύγκριση με το αντίστοιχο υγιείς ιστούς (κανονική ανθρώπινη, η = 10, και φυσιολογικό κόλον ποντικού, η = 6, αντίστοιχα). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπες καμπύλες και εκφράζεται ως 1 /ΔCt. τιμές ΔCt υπολογίστηκαν αφαιρώντας Ct του γονιδίου ομαλοποίηση από Ct του γονιδίου στόχου, μετρήθηκε με τον ίδιο παρασκεύασμα RNA. Συγκριτική επίπεδο έκφρασης του mRNA μεταξύ υγιών (

X

) και μεταστατικούς ιστούς (

Y

) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο Δ

C

Τ

Y

– Δ

C

Τ

X

και εκφράζονται ως φορές πάνω από υγιείς (2ΔΔ

C

T). Μαύρες γραμμές: πρωτοβάθμια ή υποδόρια όγκων του παχέος εντέρου? εκκολαφθεί μπαρ: ηπατικές μεταστάσεις? διακεκομμένη μπαρ: μεταστάσεις στους πνεύμονες. * P & lt? 0,05, ** p & lt?. 0.01

Η

Για την περαιτέρω αξιολόγηση του ρόλου της CCL5 /υποδοχείς άξονα στον καρκίνο του παχέος εντέρου, έχουμε κοίταξε για μια σχετική μοντέλο καρκινώματος του παχέος εντέρου ποντίκι. Για να γίνει αυτό, έχουμε αναλύσει με ποσοτική RT-PCR του επιπέδου έκφρασης CCL5 /ΚΜΠ στο ανθρώπινο ΗΤ29 και στις CT26 ποντικού καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα που αναπτύσσονται σε καλλιέργεια. Παρατηρήσαμε CCL5 και έκφραση CCR5 και από τις δύο κυτταρικές σειρές in vitro (Πίνακας S1). Κανένας από τους δύο άλλους υποδοχείς CCL5 (CCR1 και CCR3) ανιχνεύθηκαν στα κύτταρα ΗΤ29 ενώ η έκφραση CCR1 βρέθηκε στα κύτταρα CT26. Να αναλύσει κατά πόσον τα πρότυπα έκφρασης των CCL5 /υποδοχέων εντός κακοήθεις ιστούς ήταν σύμφωνες με εκείνες που παρατηρήθηκαν σε ανθρώπινα βιοψίες, είμαστε δίπλα αναπτύχθηκε πειραματικά μοντέλα ορθοτοπική (ήπαρ και μεταστάσεις στους πνεύμονες) και έκτοπη (υποδόριο) καρκίνο του παχέος εντέρου σε ανοσοεπαρκή και ανοσοανεπαρκή ποντίκια. καρκινικά κύτταρα κόλου του ποντικού (CT26) ή ανθρώπου (ΗΤ29) προελεύσεων εμβολιάστηκαν σε ποντικούς είτε υποδορίως, κάτω από την κάψουλα του ήπατος ή μέσω ουράς ένεση φλέβα για να δημιουργήσει πνευμονικές μεταστάσεις. Κατά την θυσία, τα επίπεδα των χημειοκινών /υποδοχέων εντός των διακριτών όργανα στόχους εκτιμήθηκαν με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές για ποντικού τα CT-26 που προέρχεται από tmors και ανθρώπινων εναύσματα για τις ΗΤ-29 ξενομοσχεύματα (Σχήμα 1 Β και C). Αυξημένα επίπεδα έκφρασης CCL5 ανιχνεύθηκαν σε όλα τα μοντέλα όγκων (υποδόρια, ηπατική και πνεύμονα) αναπτύχθηκε με κύτταρα CT26 ποντικού και με ανθρώπινα κύτταρα ΗΤ29 εκτός πνευμονικές βλάβες που προέρχονται από κύτταρα CT26. Σε αντίθεση, τα πρότυπα έκφρασης των υποδοχέων CCL5 ήταν πολύπλοκη και άλλαξε όταν τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε βιολογικό περιβάλλον σε σύγκριση με τις συνθήκες καλλιέργειας. Κανένα από τα δύο μοντέλα όγκων (CT26 και ΗΤ29) αντανακλούσε ακριβώς το μοτίβο της έκφρασης υποδοχέων χημειοκινών παρατηρήθηκε στα ανθρώπινα βιοψίες. Ως εκ τούτου, με βάση το γεγονός ότι και οι τρεις τύποι όγκων CT26 (υποδόρια, του ήπατος και του πνεύμονα) εκφράζεται τόσο CCL5 και CCR5 in vivo, ενώ ΗΤ29 ξενομοσχεύματα εμφάνισαν επίπεδα CCR5 κάτω από το όριο ανίχνευσης της τεχνικής PCR, βρήκαμε πιο ενδεδειγμένο να συνεργαστεί με τα μοντέλα CT26 για την αξιολόγηση του ρόλου που διαδραματίζουν οι αλληλεπίδραση CCL5 /CCR5 σε ορθοκολικό καρκίνωμα. Επιπλέον, το συγγενικό μοντέλο CT26 που έχει αναπτυχθεί σε ανοσοεπαρκή ποντίκια εμφανίστηκε επίσης το καταλληλότερο για να ληφθούν υπόψη CCL5 /ανοσολογικούς μηχανισμούς CCR5-εξαρτώμενη λαμβάνοντας ιδιαίτερα υπόψη ότι απώτερος στόχος μας ήταν να συνδυάσουμε αποκλεισμό CCL5 με μια στρατηγική εμβόλιο.

CCL5 ενισχύει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC και μετανάστευση

in vitro

Η

Η έκφραση των υποδοχέων CCL5 από κύτταρα ανθρώπου και ποντικού κόλου καρκινώματος μας οδήγησε να προσδιοριστεί η ικανότητα των κοινών CCL5 συνδέτη τους να διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό τους και τη μετανάστευση

in vitro

. Για το σκοπό αυτό, εξετάσαμε και ποσοτικοποιούνται κυτταρικής ανάπτυξης μετά την επίστρωση CT26 και ΗΤ29 κύτταρα για 5 ημέρες σε χαμηλή πυκνότητα σε μέσο βάσης μόνες ή συμπληρωμένο με διάφορες συγκεντρώσεις CCL5. Μέσα σε 5 ημέρες από την πείνα ορού, παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα CRC και των δύο προελεύσεων πολλαπλασιάζονται σε απόκριση σε θεραπεία CCL5 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Α και C). Η μέγιστη αύξηση παρατηρήθηκε σε απόκριση σε 50 ng /ml CCL5. Εμείς επόμενη αξιολόγησε την ικανότητα των κυττάρων να μεταναστεύουν CRC σε απόκριση CCL5. CT26 και ΗΤ29 κύτταρα συλλέχθηκαν, τοποθετήθηκαν σε τροποποιημένους θαλάμους Boyden και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν προς διάφορες συγκεντρώσεις CCL5. Σχήμα 2Β και D δείχνει ότι τα κύτταρα CRC μετανάστευσαν στην χημειοκινών σε σύγκριση με το μέσο βάσης και μόνο. Λαμβάνοντας υπόψη το σημαντικό ρόλο που διαδραματίζουν οι CCR5 στη διαμεσολάβηση δράσεις CCL5 σε διάφορα καρκινικά κύτταρα, έχουμε δίπλα προσπάθησε να διακόψει τη δράση CCL5 /CCR5 χρησιμοποιώντας ΤΑΚ-779, ένα μη-πεπτίδιο ανταγωνιστή CCR5 που περιγράφηκε προηγουμένως για να εμποδίσει την ανάπτυξη του όγκου σε καρκίνο του παγκρέατος [22]. Αυξανόμενες δόσεις του ΤΑΚ-779 (που κυμαίνεται από 10 έως 500 ηΜ) εξετάστηκαν επί των κυττάρων CT26 σύμφωνα με τιμές IC50 που περιγράφεται στο χαμηλό εύρος ηΜ [28], [29]. Παρατηρήσαμε μια δοσοεξαρτώμενη επίδραση της ΤΑΚ-779 τόσο για την ανάπτυξη και τα μεταναστευτικά αποκρίσεις των κυττάρων CRC, όπως απεικονίζεται στο σχήμα 2Ε και F. Η ισχυρότερη αναστολή αποκτήθηκε με 200 ηΜ ΤΑΚ-779, υψηλότερες δόσεις που οδηγούν σε κυτταροτοξικά αποτελέσματα επί των κυττάρων. Ωστόσο, μόνο το 28% των απαντήσεων CRC καταργήθηκαν με αποκλεισμό CCR5, υποδηλώνοντας έτσι την εμπλοκή μηχανισμών CCR5-ανεξάρτητη και στις δύο κυτταρικές διαδικασίες. Διάφορες συγκεντρώσεις των αντισωμάτων αντι-CCL5, που κυμαίνονται από 3 έως 30 μg /ml, στη συνέχεια εφαρμόστηκαν σε κύτταρα CT26. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2G και Η, CCL5 εξουδετέρωση λαμβάνεται με τη δόση 10 μg /ml αντισωμάτων εντελώς διαταραγμένη κυττάρων CRC μεταναστευτικών και αποκρίσεις ανάπτυξης στον χημειοκίνης. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση CCL5 /υποδοχείς εμφανίζεται ως κοινό χαρακτηριστικό των κυττάρων CRC από διακριτά προέλευση και ότι θα μπορούσε να μεσολαβήσει η κακοήθεια που σχετίζονται με τις ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου.

(A, C, E, G) ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων CT26 και ΗΤ29 αξιολογήθηκε σε απόκριση σε μία θεραπεία 5 ημερών με μέσο βάση μόνο (BSA, ανοικτές ράβδοι), με ορό μέσο εμπλουτισμένο (FBS, διαγραμμισμένες μπάρες) ή με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ανασυνδυασμένου CCL5 ( γεμάτες ράβδοι), με την παρουσία ή απουσία του ΤΑΚ-779 ή αντισώματα αντι-CCL5 (στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις). (Β, D, F, Η) κύτταρα CRC αναλύθηκαν για χημειοταξία σε ανταπόκριση να βασίσει μέσο μόνο (BSA, ανοικτές ράβδοι), σε μέσο χωρίς ορό εμπλουτισμένο (FBS, διαγραμμισμένες μπάρες) ή προς τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ανασυνδυασμένου CCL5 (γεμάτες μπάρες ), με την παρουσία ή απουσία του ΤΑΚ-779 ή αντι-CCL5 αντισώματα. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± s.e.m. έξη προσδιορισμών. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001

Η

Τα CCL5-ΚΜΠ αλληλεπιδράσεις που εμπλέκονται στον καρκίνο του παχέος εντέρου ανάπτυξη

Για να διερευνήσουν κατά πόσον η κακοήθεια που σχετίζονται. ιδιότητες των CCL5 που ασκείται επάνω σε καρκινικά κύτταρα κόλου

in vitro

έχουν επίσης ένα ενδιαφέρον

in vivo

, αξιολογήσαμε την επίδραση του CCL5 εξουδετέρωσης για την ανάπτυξη των όγκων του παχέος εντέρου CT26 εμφυτεύονται υποδορίως σε ανοσοϊκανά Balb /c ποντίκια. Την ημέρα 0, οι ποντικοί προκλήθηκαν με υποδόρια ένεση των κυττάρων CT26 κάτω από το δέρμα. Τα ζώα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή τις ημέρες 7, 10, 14 και 18 με ενδονεοπλασματική χορηγήσεις του αντι-CCL5 ή ισότυπου ελέγχου IgG αντισώματα. Κατά την θυσία, η έκταση της ανάπτυξης του όγκου εκτιμήθηκε με μέτρηση των βαρών του όγκου. CT26-αμφισβήτησε τα ποντίκια ανέπτυξαν μέσα σε 7 ημέρες ένα ψηλαφητό όγκο κατά μέσο όρο 20 χιλιοστά

3 που μεγάλωσε σε μέγεθος ~336 mm

3 έως την ημέρα 21 (Σχήμα 3Α). Σε αντίθεση, οι ποντικοί αντι-CCL5 αγωγή ανέπτυξαν όγκους που μεγάλωσε με μειωμένο συντελεστή σε σύγκριση με τον έλεγχο των όγκων, αυτή η μείωση είναι σαφώς ανιχνεύσιμη μετά την τρίτη αγωγή αντι-CCL5 (μείωση κατά 40%, Ρ & lt? 0,01). Κατά την θυσία, ο όγκος τους έφθασε μέσο μέγεθος 202 mm

3, που αντιστοιχεί σε μείωση 40% σε σύγκριση με τον έλεγχο φόρτου (Ρ & lt? 0,05).

(Α) Ποντίκια υποδορίως-προκλήθηκαν με κύτταρα CT26 ελήφθησαν τέσσερα ενδονεοπλασματική ενέσεις αντι-CCL5 (ανοιχτό κουκκίδες) ή αντισώματα ισότυπο (γεμάτο κουκκίδες) στους χρόνους που υποδεικνύονται. Κατά την θυσία, η έκταση της ανάπτυξης του όγκου εκτιμήθηκε με μέτρηση των βαρών του όγκου. (Β) την εμφάνιση και την έκταση της ανάπτυξης του όγκου εντός ήπατα CT26-προκλήθηκαν ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με αντι-CCL5- ή αντισώματα ισότυπο. (Γ) Επίπτωση της περιτοναϊκής carcinosis εκφράζεται ως επί τοις εκατό των ποντικών που φέρουν carcinosis. (N = 5 /ομάδα). * P & lt? 0,05, ** p & lt?. 0.01

Η

Δεδομένου ότι το ήπαρ είναι ένα σημαντικό όργανο-στόχο στην κακοήθεια CRC και ότι τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης της CCL5, CCR1 και CCR5 βρέθηκαν μέσα σε ηπατικές μεταστάσεις του ανθρώπους ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, εμείς δίπλα προσπάθησε να εκτιμήσει το προστατευτικό δυναμικό της θεραπείας αντι-CCL5 σχετικά με την ανάπτυξη των πειραματικών ηπατικών μεταστάσεων σε ανοσοϊκανά ποντίκια. Τα ζώα έτσι προκλήθηκαν με έγχυση κυττάρων CT26 κάτω από την κάψουλα του ήπατος πριν να αντιμετωπίζεται 72 ώρες μετά τον εμβολιασμό και δύο φορές την εβδομάδα για τη διάρκεια του πειράματος με ενδοπεριτοναϊκή διοικήσεων των αντισωμάτων αντι-CCL5 στη δόση δειχθεί προηγουμένως ότι είναι αποτελεσματική [20], [21]. Παρά το γεγονός ότι το 100% των ποντικών από τις δύο ομάδες ανέπτυξαν όγκους ήπατος, υπήρξε μια σημαντική μείωση (30%) του συνολικού φορτίου του όγκου στα ήπατα των ποντικών αντι-CCL5 αγωγή σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, όπως αξιολογείται με μέτρηση του βάρους του ήπατος (1,24 vs 1,78, P & lt? 0,05). (Εικόνα 3Β)

Εκτός από τους όγκους στο ήπαρ, παρατηρήσαμε επίσης διαφορές ως προς την έκταση της macrospcopic περιτοναϊκή carcinosis μεταξύ των δύο ομάδων θεραπείας (Σχήμα 3C). Ενώ περιτοναϊκή διάχυση βρέθηκε στο 100% των ποντικών ελέγχου, παρατηρήθηκε μόνο στο 40% των ασθενών που έλαβαν τα αντισώματα αντι-CCL5.

mPDGFRβ εμβολιασμός μειώνει την ανάπτυξη των μεταστάσεων καρκινώματος κόλου CT26

Δεδομένου ότι η στρατηγική αντι-CCL5 θα μπορούσε να οδηγήσει μόνο σε μια μέτρια θεραπευτική δράση κατά του καρκίνου του παχέος εντέρου, έχουμε δίπλα προσπάθησε να αξιολογήσει τις δυνατότητες του αποκλεισμού CCL5 χορηγείται σε συνδυασμό με μια στρατηγική για την καταπολέμηση PDGFRβ. Πράγματι, η αλληλεπίδραση /PDGFRβ PDGF είναι γνωστό ότι παίζει βασικό ρόλο στην προώθηση αρκετών κακοηθειών συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος του παχέος. Ειδικότερα, Wehler κ.ά. [30], έχουν δείξει ότι η έκφραση PDGFRβ συσχετίζεται με λεμφική διάδοση στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου. Δουλεύοντας σε 99 βιοψίες ανθρώπινου CRC, οι συγγραφείς ανέφεραν με ανοσοϊστοχημεία και RT-PCR που PDGFRβ έκφραση συνέβη στο 60% των ασθενών. Ομοίως, η έκφραση PDGFRβ ανιχνεύθηκε σε τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC: Caco-2, ΗΤ29, SW480 και SW620. Σε συμφωνία με αυτό, παρατηρήσαμε υψηλά επίπεδα έκφρασης του mPDGFRβ σε CT26 προέρχονται ηπατικές μεταστάσεις (Σχήμα 4Α). Κατά συνέπεια, έχουμε δημιουργήσει ένα εμβόλιο DNA που κωδικοποιεί mPDGFRβ και επαλήθευσε την σωστή έκφραση της mPDGFRβ με ανάλυση Western Blot μετά από παροδική επιμόλυνση των κυττάρων CHO (Σχήμα 4Β). Στη συνέχεια παρασκευάζονται σκευάσματα πλασμιδίων εμβολίου DNA με 704, ένα tetrafunctionalized αμφιφιλικό συμπολυμερές κατά συστάδες που έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι βελτιώνει την ενδομυϊκή εμβολιασμό DNA ταυτόχρονης αύξησης της έκφρασης του διαγονιδίου και ενεργοποίησης ανοσίας [25], [26]. Η ισχύς των 704-τυποποιούνται πλασμιδιακό εμβόλιο DNA να επιτρέπεται η παράδοση γονιδίου σε

πρόσθιο κνημιαίο

μυς 6 εβδομάδων ποντικών ηλικίας Balb /c εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western (Σχήμα 4C) και επιβεβαιώθηκε μυϊκή έκφραση της πρωτεΐνης μετά τη χορήγηση του DNA χαμηλής δόσης (25 μg). Σύμφωνα με μια προηγουμένως βελτιστοποιημένο πρωτόκολλο ανοσοποίησης [25], [26], οι ποντικοί προκλήθηκαν την ημέρα 0, και επαναδιεγέρθηκαν την ημέρα 21 και την ημέρα 42 με το εμβόλιο DNA (50 μg) ή τον φορέα ελέγχου τυποποιούνται με 0,3% πολυμερές 704. δύο εβδομάδες μετά την πρωταρχική ανοσοποίηση-ώθηση, οροί και από τις δύο ομάδες των ζώων αναλύθηκαν για την παρουσία ειδικών αντισωμάτων mPDGFRβ. Όπως απεικονίζεται στο σχήμα 4D, ανοσοποιημένοι ποντικοί παρουσίασαν μια χυμική απόκριση σε mPDGFRβ πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε με ELISA (Ρ = 0,005). Η παρουσία ειδικών αντισωμάτων mPDGFRβ στους ορούς τους επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με δοκιμή της ικανότητάς τους να αντιδρούν με το συγκρότημα του καθαρισμένου αντιγόνου από το mPDGFRβ-επιμολυσμένα κύτταρα CHO με ανάλυση κηλίδας Western (Εικόνα 4Ε) και με της ανιχνεύσεως του στυπώματος με ένα εμπορικό αντίσωμα ειδικό να mPDGFRβ. Η ικανότητα του DNA που βασίζονται εμβόλιο μας να επάγουν μία mPDGFRβ-ειδική προσαρμοστική ανοσοαπόκριση μας οδήγησε να εξετάσει εάν η προσέγγιση αυτή θα μπορούσε να προστατεύσει CT26 προκληθέντες ποντικούς. Μετά από μια προφυλακτική ρύθμιση, χορηγήσαμε το εμβόλιο mPDGFRβ σύμφωνα με το σχήμα διέγερσης-ενίσχυσης που περιγράφηκε παραπάνω πριν από την εμβολιασμό των κυττάρων CT26 κάτω από την κάψουλα του ήπατος (Σχήμα 5Α). Είκοσι μία ημέρες μετά την πρόκληση των κυττάρων του όγκου, συγκρίναμε την έκταση της ανάπτυξης του όγκου εντός ήπατα τόσο από το ανοσοποιημένο και τα ζώα ελέγχου.