Αφηρημένο

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η σηματοδότηση Notch εμπλέκεται σε πολλούς τύπους καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων του στόματος ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα ( OSCCs). Ωστόσο, ο ρόλος της σηματοδότησης Notch στο μικροπεριβάλλον του όγκου δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε τους ρόλους των NOTCH3 σηματοδότησης στον καρκίνο σχετίζεται ινοβλάστες (CAFS) σε OSCCs. Ανοσοϊστοχημική μελέτη των 93 περιπτώσεων OSCC ανθρώπινη γλώσσα έδειξε ότι περίπου το ένα τρίτο των OSCCs έδειξαν έκφραση NOTCH3 στην CAFS και ότι η έκφραση αυτή συσχετίστηκε σημαντικά με τον όγκο μεγέθους. In vitro μελέτη έδειξε ότι κυτταρικές σειρές OSCC, ειδικά κύτταρα HO1-Ν-1 διεγείρεται έκφραση NOTCH3 σε κανονικούς ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες (NHDFs) μέσω της άμεσης επαφής κυττάρου-προς-κύτταρο. Ανοσοϊστοχημική και μορφομετρική ανάλυση με τη χρήση ανθρώπινων δειγμάτων OSCC έδειξαν ότι η έκφραση NOTCH3 σε CAFS συσχετίζεται σημαντικά με την πυκνότητα μικρο-σκάφος στο στρώμα του καρκίνου. Ιη vitro δοκιμασίες αγγειογένεσης που περιλαμβάνουν συν-καλλιέργεια των NHDFs με HO1-Ν-1 και ανθρώπινα ομφαλικά ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVECs) και NOTCH3 knockdown στο NHDFs χρησιμοποιώντας siRNA, απέδειξαν ότι τα κύτταρα HO1-Ν-1 προωθείται σημαντικά το σχηματισμό σωλήνα που εξαρτώνται από την NOTCH3-έκφραση σε NHDFs. Επιπλέον, η έκφραση NOTCH3 σε CAFS σχετιζόταν με κακή πρόγνωση των ασθενών OSCC. Το έργο αυτό παρέχει μια νέα εικόνα για το ρόλο της σηματοδότησης Notch σε CAFS που σχετίζονται με την αγγειογένεση του όγκου και τη δυνατότητα NOTCH3 στοχευμένη μοριακή θεραπεία σε OSCCs

Παράθεση:. Kayamori K, Katsube Ki, Sakamoto Κ, Ohyama Υ, Hirai Η, Yukimori A, et al. (2016) NOTCH3 επάγεται στον Καρκίνο-Associated ινοβλάστες και προάγει την αγγειογένεση στο Προφορική πλακώδες καρκίνωμα. PLoS ONE 11 (4): e0154112. doi: 10.1371 /journal.pone.0154112

Επιμέλεια: Αμπντελιλάχ Aboussekhra, βασιλιά Faisal Specialist Νοσοκομείο & amp? Ερευνητικό κέντρο, ΣΑΟΥΔΙΚΗ ΑΡΑΒΙΑ

Ελήφθη: 28η Δεκεμβρίου 2015? Αποδεκτές: 9, Απρ 2016? Δημοσιεύθηκε: 28 Απριλίου, 2016

Copyright: © 2016 Kayamori et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι μέσα στο χαρτί και υποστήριξη αρχείο πληροφοριών της

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης: Grant-in-βοήθειας για Νέους επιστήμονες (Β) (KAKENHI 26861543 έως Κου Kayamori ) και την επιστημονική Έρευνα (C) (20.233.760 στον Ken-ichi Katsube). Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης: Grant-in-Ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (Α) (KAKENHI 25.253.098 σε Akira Yamaguchi)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνίζονται υπάρχουν συμφέροντα.

Εισαγωγή

Καρκίνος κεφαλής και τραχήλου προέρχεται από την ανώτερης αναπνευστικής οδού συμπεριλαμβανομένων της ρινικής κοιλότητας, παραρρινίων κόλπων, της στοματικής κοιλότητας, του φάρυγγα και του λάρυγγα. Ιστοπαθολογικά, η κυρίαρχη κακοήθεια σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου είναι πλακώδες καρκίνωμα (SCC).

Στοματική SCC (OSCC) είναι ο πιο κοινός τύπος καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. Σύμφωνα με τις πρόσφατες εκτιμήσεις GLOBOCAN, περίπου 300.000 νέοι ασθενείς χείλος /τον καρκίνο του στόματος κοιλότητα διαγνώστηκαν το 2012 σε όλο τον κόσμο [1]. Το ποσοστό επιβίωσης 5-χρόνια των ασθενών OSCC ακόμη κυμαίνεται από 40 έως 60% [2, 3]. Διερεύνηση σχετικά με το μοριακό μηχανισμό που ρυθμίζει θα χρειαστούν κακοήθεις συμπεριφορές OSCC για την ανάπτυξη θεραπευτικών προσεγγίσεων και τη βελτίωση του φτωχή πρόγνωση.

στρώμα Καρκίνος αποτελείται από διάφορους τύπους κυττάρων συμπεριλαμβανομένων των ινοβλαστών, κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, περικύτταρα και ενδοθηλιακά κύτταρα. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι αυτά τα κύτταρα και τα προϊόντα τους να ορίζει κατάλληλα μικροπεριβάλλοντα για πολλαπλασιασμό του καρκίνου, εισβολή, αγγειογένεση, μετάσταση, και χημειοαντίσταση [4, 5]. Συγκεκριμένα, ο καρκίνος σχετίζεται με ινοβλάστες (CAFS), που είναι τα κύρια συστατικά του καρκίνου στρώμα, παίζουν κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη του όγκου σε διάφορους τύπους καρκίνου [6]. Οι προέλευσή τους πιστεύεται ότι είναι είτε ιστό-κάτοικος ινοβλάστες, μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα που προσλαμβάνονται από το μυελό των οστών, ή καρκινικά κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση [7]. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι CAFS διεγείρουν καρκινικών κυττάρων εισβολή [8-10] ή πολλαπλασιασμό [11] και συσχετίζονται με κακή πρόγνωση σε OSCCs [12, 13].

σηματοδότηση Notch είναι μια εξελικτικά συντηρημένη μονοπάτι που ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό , απόπτωση και διαφοροποίηση [14]. σηματοδότηση Notch αρχίζει με πρόσδεση του Notch-προσδέματος με τον υποδοχέα της, η οποία διαμεσολαβείται από κύτταρο-προς-κύτταρο επικοινωνία. Στους ανθρώπους, υπάρχουν τέσσερις υποδοχείς (NOTCH1-4), και πέντε συνδέτες (Jagged1, 2 και DLL1, 3 και 4). Η δέσμευση του συνδέτη στον υποδοχέα της οδηγεί σε διάσπαση και απελευθέρωση του ενδοκυτταρικού τομέα του υποδοχέα Notch (NICD). NICD μετατοπίζεται από την μεμβράνη πλάσματος προς τον πυρήνα, η οποία εκκινεί μεταγραφή των γονιδίων στόχων NOTCH [15]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η κακή ρύθμιση της σηματοδότησης Notch εμπλέκεται σε ποικίλες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένων διαφόρων τύπων καρκίνων [16, 17]. Αλλοιώσεις του Notch σηματοδότηση σε καρκινικά κύτταρα περιλαμβάνουν κέρδος ή απώλεια μεταλλάξεων λειτουργίας, και του υποδοχέα /συνδέτη υπερέκφραση [18]. Έχουμε ήδη αποδειχθεί Notch1 ρύθμιση προς τα κάτω στα καρκινικά κύτταρα σε OSCC από μικροσυστοιχιών και ανοσοϊστοχημικές μελέτες που χρησιμοποιούν ανθρώπινα δείγματα OSCC [19], και οι πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι Notch1 δρα ως καταστολέας των όγκων σε OSCC παθογένεια [20-22].

Αν και οι δύο CAFS και Notch παίζουν σηματοδότηση σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου, σηματοδότηση Notch σε CAFS, σε αντίθεση με τα καρκινικά κύτταρα, και η συμβολή του στην κακοήθη συμπεριφορά δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί. NOTCH3 είναι φυσιολογικά εκφράζεται στα λεία μυϊκά κύτταρα των μικρών αρτηριών και ρυθμίζει τη διαφοροποίηση και ωρίμανση αυτών των κυττάρων. Απώλεια του κύκλου λειτουργίας μετάλλαξης NOTCH3 έχει δειχθεί ότι προκαλεί εγκεφαλική αυτοσωματικό κυρίαρχο αρτηριοπάθεια με υποφλοιώδη έμφρακτα και λευκοεγκεφαλοπάθεια (CADSIL) που χαρακτηρίζεται από την εκφύλιση ή η απώλεια των αγγειακών λείων μυϊκών κυττάρων των μέσων ενημέρωσης, πάχυνση των τοιχωμάτων των αιμοφόρων και οι καταθέσεις του κοκκώδη osmiophilic υλικά (ΔΑΜ) κοντά στην κυτταρική επιφάνεια των κυττάρων λείου μυός ή περικύτταρα [23]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι NOTCH3 επάγεται σε ινοβλάστες από την άμεση επαφή κυττάρου-προς-κύτταρο με HUVECs και προάγει σχηματισμό αγγείων [24, 25]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι NOTCH3 έχει ουσιαστικό ρόλο στη ρύθμιση της αγγειογένεσης.

Σε αυτή τη μελέτη, επικεντρώνεται στην ανάλυση των NOTCH3 σε CAFS να διερευνήσει τη συμβολή του στην εξέλιξη της OSCC. Δείξαμε έκφραση NOTCH3 σε CAFS με ανοσοϊστοχημική μελέτη των δειγμάτων 93 περιπτώσεις ανθρώπινης OSCC γλώσσας και διαπίστωσε ότι NOTCH3-θετικά CAFS προάγουν την αγγειογένεση όγκου παρουσία διαφόρων καρκινικών κυτταρικών σειρών

in vitro

. Επιπλέον, αυτή η επαγωγή NOTCH3 σε CAFS συσχετίστηκε με κακή επιβίωση των ασθενών OSCC. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν τη χρησιμότητα της μοριακής θεραπείας NOTCH3 στοχευμένες σε OSCCs.

Υλικό και Μέθοδοι

κλινικά δείγματα

δείγματα καρκίνωμα Δημοτικής γλώσσας πλακωδών κυττάρων συλλέχθηκαν από 93 ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία στο Οδοντιατρικό Νοσοκομείο του Τόκιο Ιατρική και Οδοντιατρική του Πανεπιστημίου. Εννέα πρωτοβάθμια κλώνοι ενός κυττάρου ούλων, 10 στοματικής ΤΣΡ και 9 κλώνοι ενός κυττάρου του εδάφους του στόματος συλλέχθηκαν επίσης. Όλες οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν με 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη, σύμφωνα με συνήθεις εργαστηριακές πρωτόκολλα. Όλες οι πειραματικές διαδικασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με την τροποποιημένη Διακήρυξη του Ελσίνκι και έχει εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας του Τόκιο Ιατρική και Οδοντιατρική του Πανεπιστημίου (Registry Νο 1063). Χρησιμοποιήσαμε χειρουργικά, μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη και εγκλεισμένοι σε παραφίνη ανθρώπινοι ιστοί OSCC για ανοσοϊστοχημική μελέτη. Αν και γραπτή συγκατάθεση δεν ελήφθη από τους ασθενείς, η επιτροπή δεοντολογίας ενέκρινε παραίτηση των ειδικών εν επιγνώσει συναίνεση, σύμφωνα με την τροποποιημένη Ηθικές οδηγίες για κλινικές μελέτες που παρέχονται από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας της Ιαπωνίας (31 Ιουλίου, 2008). Αυτό το σχέδιο έρευνας αποκαλύφθηκε σε μορφή αφίσας στο εξωτερικό ιατρείο της στοματικής τμήματος χειρουργική επέμβαση για να διασφαλιστεί ότι οι ασθενείς είχαν την ευκαιρία να μειωθεί η ερευνητική χρήση των παθολογικών δειγμάτων τους, η οποία θα αντικαθιστούσε γραπτή συναίνεση κατόπιν ενημέρωσης, και η επιτροπή δεοντολογίας ενέκρινε την εν λόγω διαδικασία συναίνεσης.

ανοσοχρώση

για ανοσοϊστοχημική χρώση, χρησιμοποιήθηκαν

, ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές σταθεροποιημένο με φορμαλίνη ανθρώπινο OSCC ιστό. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως εξής: αντι-NOTCH3, κουνελιού πολυκλωνικό, 1: 200 (ab23426, Abcam, CA, USA)? αντι-SMA, μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, 1: 100 (M0851, Dako, Glostrup, Σουηδία). Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. EnVision + διπλής σύνδεσης (Dako) χρησιμοποιήθηκε για δευτερογενές αντίσωμα, και χρωματισμός πραγματοποιήθηκε με διαμινο-βενζιδίνης υπόστρωμα. Για ανοσοφθορισμού διπλή χρώση, αντι-NOTCH3, 1: 200 (Abcam), SMA, 1: 100 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, M0851, Dako ή μονοκλωνικά κουνέλι, Clone Εθνική Οδός Σ.Π. 171, Άνοιξη Bioscinece, CA, USA), CD34, 1: 100 ( μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, NCL-L-END, Leica Biosystems, Wetzlar, Γερμανία) και Cytokeratin, 1: 100 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, κλώνος AE1 /AE3, M3515, Dako) χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτογενές αντίσωμα. Για ανάκτηση αντιγόνου, οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ρυθμιστικό διάλυμα Tris (ρΗ = 7,4) που περιέχει 0,1 mg /ml θρυψίνη για 30 λεπτά στους 37 ° C για CD34 αντίσωμα. Alexa Fluor 488 κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (A11008, Invitrogen, CA, USA) και Alexa Fluor 594 αντι-ποντικού κατσίκας IgG (A11005, Invitrogen) χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερο αντίσωμα. DAPI χρησιμοποιήθηκε για την πυρηνική χρώση. Οι immunofluoroscent εικόνες συλλήφθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Axioskop2 συν μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Jena, Germany).

Αξιολόγηση των Ανοσοϊστοχημική Αναλύσεις

Οι ανοσοϊστοχημικές αποτελέσματα για NOTCH3 και α-SMA αξιολογήθηκαν με βάση την ένταση χρώσης και το ποσοστό των θετικών ινοβλαστικών κυττάρων στο στρώμα του καρκίνου από δύο παθολόγους χωρίς προηγούμενη γνώση των κλινικοπαθολογοανατομικών δεδομένων του ασθενούς. Ένταση χρώσης ήταν χωρισμένη σε τέσσερις ομάδες: αρνητική, αδύναμη, μέτρια και ισχυρή. Περιπτώσεις με μέτρια ή ισχυρή ένταση σε περισσότερες από 30% των ινοβλαστών στο στρώμα του καρκίνου θεωρήθηκαν ως θετικά για την έκφραση της κάθε πρωτεΐνης.

Cell Culture

Το παρακάτω οκτώ κεφαλής και λαιμού πλακώδους χρησιμοποιήθηκαν κυτταρικές σειρές καρκίνωμα, HO1-Ν-1, SAS, BHY, Ca9-22, HSC3, HSC4, HSC5 και SKN3. Αυτές οι γραμμές προήλθαν από τη στοματική κοιλότητα, εκτός από HSC5 που προήλθε από το ιγμόρειο. Έξι κυτταρικές γραμμές καρκίνου προήλθαν από μη-στοματικές βλάβες, HeLa από τραχήλου της μήτρας SCC, Α549 από αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, MCF-7 από αδενοκαρκίνωμα του μαστού, ΜΚΝ74 από γαστρικό αδενοκαρκίνωμα, ΗΟΤ-15 από αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου και Panc-1 από παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα, ήταν χρησιμοποιούνται επίσης. Όλες οι καρκινικές κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. HO1-Ν-1, SAS, Ca9-22, HSC3 και HSC5, και SKN3 αγοράστηκαν από την ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources (Osaka, Japan). BHY παρεσχέθη από τον Dr. Masato Okamoto (Tella Inc, Tokyo, Japan). HSC4 ιδρύθηκε από τον Δρ Momose στο τμήμα της Στοματικής και Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής στο Τόκιο Ιατρική και Οδοντιατρική πανεπιστημίου, όπως περιγράφεται στην προηγούμενη έκθεση [27]. Panc-1 αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC). HeLa, Α549, ΜΚΝ74 και ΗΟΤ-15 αγοράστηκαν από RIKEN Bioresource Center (Tsukuba, Japan). MCF-7 που παρέχονται από τον τηλέφωνα Resource Center Ιατροβιολογικών Ερευνών (Πανεπιστήμιο Tohoku, Miyagi, Ιαπωνία). Πρωτογενής κανονική ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες (NHDFs) από έναν ενήλικο δότη αγοράστηκαν από Promocell (C-12302, Heidelberg, Germany) και πρωτογενή ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) αγοράστηκαν από την Lonza (CC-2517, Tokyo, Japan).

αναλύσεις συγκαλλιέργεια τα καρκινικά κύτταρα και NHDFs

NHDFs (5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων, επωάστηκαν σε Μέσο Ανάπτυξης ινοβλαστών 2 Kit (C-23120 , Promocell) για 48 ώρες, και στη συνέχεια συν-καλλιεργήθηκαν με διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές (5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) με επώαση σε α-ΜΕΜ για 72 ώρες. Στη συνέχεια, οι NHDFs απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας την ακόλουθη μέθοδο και αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR. Για ανάλυση κηλίδος western, NHDFs (20 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) και κυτταρικές σειρές καρκίνου (2 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) συν-καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας τρυβλία 6 φρεατίων.

NHDF Απομόνωση από συγκαλλιέργειες

NHDFs απομονώθηκαν από συγκαλλιέργειες με τη χρήση ενός συστήματος διαχωρισμού μαγνητικό ενεργοποιημένων κυττάρων (MACS) με αντι-ινοβλάστης μικροσφαιρίδια (130-050-601, Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) και μια στήλη MS ( 130-042-201, Miltenyi Biotec) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

siRNA Επιμόλυνση

Πριν από την συγκαλλιέργεια, NHDFs επιμολύνθηκαν με siRNA για ανθρώπινη NOTCH3 χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Stealth siRNA για την ανθρώπινη NOTCH3 αγοράστηκε από την Invitrogen. Η αλληλουχία του κλώνου συν του dsRNA ήταν 5′-UCAAUGCUGUGGAUGAGCUUGGGAA-3 ‘.

μικροαγγείων Αξιολόγηση

Η πυκνότητα μικροαγγείων (MVD) του ανθρώπινου δειγμάτων OSCC υπολογίστηκε για δύο ομάδες, το SMA (+) NOTCH3 (-) CAFS ομάδα και η SMA (+) NOTCH3 (+) ομάδα CAFS. Με τη χρήση διπλού ανοσοφθορισμού χρώση για SMA ή NOTCH3 και CD34, ο αριθμός των CD34-θετικών μικρά σκάφη σε SMA (+) ινοβλαστικά στρώμα του καρκίνου αξιολογήθηκε στην πρώτη ομάδα, και τον αριθμό των CD34-θετικών μικρά σκάφη σε NOTCH3 (+) fibroblastic στρώμα του καρκίνου μετρήθηκε στην τελευταία ομάδα. Πριν από την καταμέτρηση του αριθμού των μικροαγγείων, εξετάσαμε πρώτα κάθε τμήμα σε χαμηλή μεγέθυνση εξουσία να προσδιορίσει την περιοχή με την υψηλότερη πυκνότητα μικροαγγείων, και επιλέγονται τρία πεδία σε κάθε περίπτωση. Ελήφθησαν τρεις μικρογραφήματα σε υψηλή μεγέθυνση (χ 200). Ο αριθμός των CD34-θετικών μικρά σκάφη μετρήθηκε και το SMA (+) /NOTCH3 (+) ινοβλαστικά περιοχή αναλύθηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα Axioskop2 συν μικροσκόπιο και AxioVsion rel 4,8 λογισμικού (Zeiss). Οι συνολικές μετρήσεις του CD34-θετικών μικροαγγείων ανά συνολικό ποσοτικοποιηθεί SMA (+) /NOTCH3 (+) fibroblastic περιοχή τρεις εικόνες ήταν υπολογίζονται και ορίζεται ως η MVD της κάθε περίπτωσης.

In Vitro Δοκιμασία αγγειογένεση

η

in vitro

ενδοθηλιακά-ινοβλαστών δοκιμασία οργανοτυπική συγκαλλιέργεια τροποποιήθηκε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [28]. Πρώτο (Ημέρα 0), NHDFs σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων (5.0 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) και καλλιεργήθηκαν σε Μέσο Ανάπτυξης Ινοβλαστών για 48 ώρες. Στη συνέχεια, siRNA για ανθρώπινη NOTCH3 επιμολύνθηκε στα NHDFs σύμφωνα με την ανωτέρω περιγραφείσα μέθοδο. Την επόμενη ημέρα (Ημέρα 3), HO1-Ν-1 ή καρκίνο Α549 κύτταρα (6.0 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) και HUVECs (3,0 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) συν-καλλιεργήθηκαν με τα siRNA αγωγή NHDFs σε ενδοθηλιακά μέσο κυτταρικής ανάπτυξης. Το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε κάθε δεύτερη μέρα. Την Ημέρα 9, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και ανοσοϊστοχημικά αγωγή με το αντίσωμα αντι-CD31 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, 1: 100, NCL-CD31-1A10, Leica Biosystems, Newcastle, UK) και δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση (WP20006, Invitrogen) και το σήμα οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα ΒΟΙΡ /ΝΒΤ (11-681-45-001, Roche). Πέντε εικόνες φωτογραφιών με την υψηλότερη CD31-θετικά τριχοειδούς δικτύου σε κάθε φρεάτιο συλλήφθηκαν με τη χρήση ενός ανεστραμμένου μικροσκοπίου (ECLIPSE TS100, Nikon, Tokyo, Japan). Η περιοχή τριχοειδές δίκτυο CD31-θετικά αναλύθηκε ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού ΝΙΗ εικόνα J.

Επίδραση των NOTCH3 επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Για να εξεταστεί η επίδραση της NOTCH3 για OSCC πολλαπλασιασμό των κυττάρων της γραμμής, HO1-Ν- 1 σπάρθηκαν (2.0 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) σε μία πλάκα 96 φρεατίων επικαλυμμένη με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη NOTCH3 Fc χίμαιρα (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με τη χρήση της μέτρησης κυττάρων Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Western Blotting

κηλίδος Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας πρότυπη μέθοδο όπως περιγράφηκε πριν από την [ ,,,0],19]. Anti-Notch3 (D11B8, κυτταρική σηματοδότηση, MA, USA), άλφα λείου μυός ακτίνη (ab32575, Abcam) και GAPDH (D16H11, Cell Signaling) χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτογενές αντίσωμα.

Real-Time PCR Ποσοτική Ανάλυση

RNA εξήχθη από NHDFs, και μεταγραφεί αντίστροφα σε cDNA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Real-Time PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα Σύστημα Cycler Light (Roche Diagnostics). Σχετική έκφραση υπολογίστηκε με τη συγκριτική C

μέθοδος T χρησιμοποιώντας ΟΑΡϋΗ ως εσωτερικός έλεγχος. Οι αλληλουχίες των εκκινητών PCR περιγράφηκαν σε προηγούμενες μελέτες (

Notch1

και

NOTCH3

[29],

Notch2

,

NOTCH4

και

HEY1

[19],

α-SMA

[25], και

GAPDH

[30]).

Στατιστικές αναλύσεις

Συσχέτιση μεταξύ NOTCH3 έκφραση σε CAFS και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το chi-square ή exact test Fischer. Στις

in vitro

προσδιορισμούς, οι διαφορές στις μέσες τιμές μεταξύ δύο ομάδων συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student, ενώ, οι διαφορές στις μέσες τιμές μεταξύ πολλαπλών ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από πολλαπλών σύγκριση με τις μεθόδους του Tukey. Συνολικό ποσοστό επιβίωσης υπολογίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο Kaplan-Meier μέθοδος και η στατιστική σημαντικότητα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank. Συνολικά χρόνοι επιβίωσης υπολογίστηκαν από την ημερομηνία της αρχικής παθολογική διάγνωση μέχρι την ημερομηνία του θανάτου.

P

-τιμές μικρότερες του 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Ekuseru-Toukei 2015 (Κοινωνική Έρευνα Έρευνα πληροφορίες, Tokyo, Japan).

Αποτελέσματα

NOTCH3 Έκφραση σε CAFS στο μικροπεριβάλλον του όγκου και της OSCC

Για να διερευνηθεί η κατανομή των NOTCH3 κυττάρων που εκφράζουν στο μικροπεριβάλλον του όγκου, εξετάσαμε ανοσοϊστοχημικά έκφραση NOTCH3 σε χειρουργικά δείγματα από 93 περιπτώσεις OSCC γλώσσας. Οι ινοβλάστες σε στρώμα του καρκίνου, ιδιαίτερα εκείνων που γειτνιάζουν με την περιφέρεια του όγκου, έδειξε θετική χρώση για NOTCH3 (31 από 93 περιπτώσεις, 33,3%, Σχήμα 1Α και 1Β). Περίπου το 90% (82 από 93 περιπτώσεις, 88,2%) των περιπτώσεων παρουσίασαν αρνητική ή περιστασιακή έκφραση αδύναμη NOTCH3 στα καρκινικά κύτταρα. Το τελευταίο αποτέλεσμα ήταν συμβατό με προηγούμενη μελέτη cDNA μικροσυστοιχιών μας χρησιμοποιώντας ανθρώπινα δείγματα OSCC [19]. Για να χαρακτηριστούν περαιτέρω οι NOTCH3 θετικά ινοβλάστες, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική χρώση για α-SMA, το οποίο είναι ένας δείκτης του καρκίνου που συνδέεται ινοβλαστών (CAFS). Διαδοχικές τομές των όγκων έδειξε ότι οι NOTCH3 θετικοί ινοβλάστες εκφράζεται α-SMA (Σχήμα 1 C). Διπλό immunofluorecent stainig έδειξαν την συν-εντοπισμό των NOTCH3 και α-SMA σε ινοβλάστες (Σχήμα 1 D-1 F). Όπως συνοψίζεται στον Πίνακα 1, α-SMA θετικών ινοβλάστες, τα οποία θα μπορούσαν να θεωρηθούν ως CAFS, παρατηρήθηκαν στο στρώμα του καρκίνου σε 64 από 93 δείγματα (68,8%). Οι υπόλοιπες 29 περιπτώσεις δεν έδειξε ινοβλαστική αντίδραση γύρω από επεμβατικές φωλιές καρκίνο και ήταν αρνητικά για την α-SMA, αν και παρατηρήθηκε ένας εξέχων φλεγμονώδη αντίδραση. NOTCH3 θετικά ινοβλάστες τα οποία ήταν αρνητικά για την α-SMA δεν παρατηρήθηκαν σε καμία περίπτωση

Η

Α:. Ιστολογία του όγκου επεμβατική μπροστά. H & amp? Χρώση Ε. μπαρ κλίμακα, 100 μm. Β: Κατανομή των ινοβλαστικών κυττάρων NOTCH3-θετική. Γ: Κατανομή των α-SMA-θετικά ινοβλαστικά κύτταρα. Τα κύτταρα βάφονται καφέ Β και Γ αντιπροσωπεύουν θετικά κύτταρα για κάθε αντίσωμα. Τα βέλη στο Α, Β και Γ δείχνουν στρώμα των αιμοφόρων αγγείων, η οποία είναι θετικός εσωτερικός έλεγχος του κάθε αντισώματος. D, E, F: διπλή ανοσοϊστοχημική ανάλυση για α-SMA (κόκκινο) και NOTCH3 (Green). Συν-εντοπισμό των α-SMA και NOTCH3 σε ινοβλάστες παρατηρήθηκε σε στρώμα του καρκίνου. μπαρ κλίμακα, 50μm. Ca, τα καρκινικά κύτταρα. Διακεκομμένες γραμμές στο Α-ΣΤ δείχνουν τη διασύνδεση των φωλιών καρκίνου και στρώμα. G: Καμπύλη Kaplan-Meier για ολική επιβίωση σε σχέση με την έκφραση NOTCH3 στο CAFS χρησιμοποιώντας 93 ανθρώπινα κρούσματα OSCC. δοκιμασία log-rank χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό σημασία.

Η

Αν και η πιο συχνή περιοχή συμμετοχή για OSCC είναι η γλώσσα, έχουμε περαιτέρω ανοσοϊστοχημικά διερευνήθηκε η έκφραση NOTCH3 σε CAFS χρησιμοποιώντας περιπτώσεις OSCC συνέβη σε ανθρώπινα ούλα, στοματικό βλεννογόνο , και το δάπεδο του στόματος. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι NOTCH3-θετικά CAFS εμφανίστηκε σε κλώνοι ενός κυττάρου ούλων (4 από 9 περιπτώσεις, 44,4%), στοματική κλώνοι ενός κυττάρου (3 από 10cases, 30%), και κλώνοι ενός κυττάρου από το δάπεδο του στόματος (3 από 9 περιπτώσεις, 33.3 %) (S1 Εικ). Δεν υπήρχε μεγάλη διαφορά στη συχνότητα των NOTCH3 θετικών CAFS στο στρώμα του όγκου μεταξύ της γλώσσας ΤΣΡ και άλλα ΤΣΡ.

Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπάρχουν OSCCs με NOTCH3 θετικά CAFS και OSCCs με NOTCH3 αρνητικά CAFS στο έδαφός τους στρώματος του όγκου.

κλινικοπαθολογοανατομικών σημασία της έκφρασης NOTCH3 σε CAFS σε OSCCs

Για να χαρακτηρίζουν τη σημασία της παρουσίας της NOTCH3 θετικών CAFS στο OSCC, διερευνήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης NOTCH3 στην CAFS και κλινικο -pathological χαρακτηριστικά στις παραπάνω περιπτώσεις γλώσσας OSCC. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, οι OSCCs με NOTCH3 θετικά CAFS συνδέεται με σημαντικά μεγαλύτερο μέγεθος του όγκου (Ρ = 0,0292) και λεμφαδένα μετάσταση (Ρ = 0,0023) σε σύγκριση με OSCCs χωρίς NOTCH3-θετικά CAFS. Δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης NOTCH3 στην CAFS και την ηλικία, το φύλο ή την ιστολογική διαφοροποίηση του SCC. Αξιολογήσαμε επίσης τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης NOTCH3 στην CAFS και την πρόγνωση των ασθενών OSCC 93 γλώσσα. Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε ότι οι ασθενείς με NOTCH3 θετικά CAFS είχαν χειρότερη πρόγνωση από εκείνους που δεν NOTCH3 θετικά CAFS (Σχήμα 1G).

Η

Ανθρώπινο OSCCs Τόνωση NOTCH3 έκφραση σε ινοβλάστες

Για να επιβεβαιώσει αυτές τις ανοσοϊστοχημικές αποτελέσματα, πραγματοποιήσαμε

in vitro

πειράματα χρησιμοποιώντας συνκαλλιεργημένα κυτταρικές σειρές OSCC και πρωτογενών κανονική ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες (NHDFs). Μετά συν-καλλιέργεια, τα NHDFs διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας αντι-ινοβλάστες Μικροσφαιρίδια όπως περιγράφεται σε προηγούμενη έκθεση [31]. Η ανάλυση στυπώματος Western των εν λόγω NHDFs έδειξαν ότι συγκαλλιέργεια τους με OSCCs, ειδικά με τα κύτταρα HO1-N-1, διεγείρονται έκφραση NOTCH3 στις NHDFs σε σύγκριση με την βασική έκφραση όταν οι NHDFs καλλιεργήθηκαν μόνο (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, τα επίπεδα της πρωτεΐνης α-SMA ήταν επίσης υψηλότερη σε NHDFs συν-καλλιεργήθηκαν με OSCCs σύγκριση με NHDFs ελέγχου (Σχήμα 2Α). Στη συνέχεια αναλύονται περαιτέρω NHDF /OSCC συν-καλλιέργεια χρησιμοποιώντας HO1-Ν-1 κύτταρα και NHDFs. Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού NOTCH3 και κερατίνη σε αυτό το μοντέλο συγκαλλιέργειας έδειξαν ότι δέσμες NOTCH3-θετικών NHDFs περιβάλλεται κερατίνη-θετικών HO1-Ν-1 καρκίνος φωλιές (Σχήμα 2Β), που έμοιαζε με τη διανομή των NOTCH3 θετικών ινοβλάστες γύρω από τις φωλιές του καρκίνου στην ανθρώπινα δείγματα OSCC. Επιπλέον, διπλή χρώση ανοσοφθορισμού για NOTCH3 και α-SMA έδειξαν ότι αυτές οι NOTCH3-θετικά NHDFs επίσης συν-εκφράζεται α-SMA (Σχήμα 2C). Western blotting και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση των NHDFs διαχωρίζεται από αυτήν την συγκαλλιέργεια έδειξαν ότι η έκφραση NOTCH3 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω τόσο σε πρωτεΐνη και το επίπεδο mRNA στο NHDFs συν-καλλιεργήθηκαν με HO1-Ν-1, σε σύγκριση με τις NHDFs καλλιεργήθηκαν μόνο (Σχ 2D και 2Ε? siCtrl). Η έκφραση του mRNA του HEY1, ένας προς τα κάτω στόχος του Notch, ήταν επίσης σημαντικά αυξημένη σε NHDFs συν-καλλιεργήθηκαν με HO1-Ν-1 σε σύγκριση με την έκφραση του εν απουσία HO1-Ν-1 (Σχ 2F? SiCtrl). Επιπλέον, η έκφραση α-SMA σε NHDFs συν-καλλιεργήθηκαν με HO1-Ν-1 αυξήθηκε επίσης τόσο σε πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA σε σύγκριση με καλλιέργεια σε απουσία HO1-Ν-1 (Εικ 2Δ-2F? SiCtrl). Η επαγωγή HEY1 και α-SMA με συγκαλλιέργεια ανεστάλη σημαντικά σε NHDFs επιμολυσμένα με siRNA για NOTCH3 (Sin3) σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA (siCtrl) (Εικ 2Δ, 2F και 2G). Αυτό Sin3 κατέστειλε σημαντικά την έκφραση NOTCH3 σύγκριση με siCtrl (Εικ 2Δ και 2Ε). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι OSCCs έχουν τη δυνατότητα να προκαλέσουν δραστηριότητα ΕΓΚΟΠΗ διεγείροντας την έκφραση των NOTCH3 στην NHDFs, και ότι η έκφραση NOTCH3 ρυθμίζει την έκφραση α-SMA. Η παραπάνω επαγωγή NOTCH3 στο NHDFs παρατηρήθηκε όταν HO1-Ν-1 και NHDFs καλλιεργήθηκαν σε ένα σύστημα άμεσης επαφής. Διαχωρισμός συν-καλλιέργεια χρησιμοποιώντας ένα πορώδες φρεατίων δεν προκάλεσε αυξητική ρύθμιση του

NOTCH3

έκφραση σε NHDFs (Σχήμα 2Η). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι juxtacrine σηματοδότηση μέσω επαφής κυττάρου-προς-κύτταρο μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και ινοβλαστών είναι απαραίτητη για την επαγωγή της έκφρασης NOTCH3 σε ινοβλάστες. Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης του mRNA της Notch 1 ή Notch2 σε NHDFs καλλιεργήθηκαν σε ένα σύστημα άμεσης επαφής με τα κύτταρα HO1-Ν-1 δεν παρουσίασε καμία σημαντική αλλαγή σε σχέση με τις NHDFs καλλιεργηθεί μόνο. έκφραση NOTCH4 δεν ανιχνεύθηκε σε αυτό το σύστημα (Σχήμα 2I). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι OSCCs διεγείρουν συγκεκριμένα την έκφραση NOTCH3 σε ινοβλάστες

Α: NHDFs καλλιεργήθηκαν μόνο (CTL? Έλεγχος) ή καλλιεργήθηκαν με εκπροσωπείται από του στόματος και της άνω γνάθου SCC κυτταρικές σειρές.. 3 ημέρες μετά την συγκαλλιέργεια, NHDFs απομονώθηκαν από αυτή την συγκαλλιέργεια με τη χρήση αντι-ινοβλάστης μικροσφαιρίδια για ανάλυση στυπώματος Western. Β και C: Immunofluorostainig χρησιμοποιώντας συγκαλλιέργεια με HO1-Ν-1 και NHDFs. Πολιτισμού NHDFs μόνος χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Οι δέσμες του NOTCH3-θετικών NHDFs (πράσινο) παρατηρήθηκαν γύρω από τα ΑΕ1 /ΑΕ3-positve φωλιές HO1-Ν-1 καρκίνος (κόκκινο) (Β). Διπλό NOTCH3 και α-SMA-θετικά NHDFs είχαν παρέμβει μεταξύ φωλιές HO1-Ν-1 καρκίνου. Ca, φωλιές HO1-Ν-1 καρκίνου. Διακεκομμένες γραμμές καταδεικνύουν τη διασύνδεση των HO1-Ν-1 φωλιές καρκίνου και NHDFs. (ΝΤΟ). μπαρ κλίμακα, 100 μm. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI. D-G: NHDFs επιμολυσμένα με αρνητικό μάρτυρα siRNA (siCtrl) ή siRNA για NOTCH3 (Sin3) καλλιεργήθηκε μόνος του ή συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα HO1-Ν-1. 3 ημέρες μετά την συγκαλλιέργεια, NHDFs απομονώθηκαν από αυτή την συγκαλλιέργεια και υποβλήθηκε σε στύπωμα Western (D) και qPCR αναλύσεις για τη μέτρηση της NOTCH3 (Ε), HEY1 (F), α-SMA (G). H: NHDFs καλλιεργήθηκαν μόνο (έλεγχος), ή συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα άμεσα HO1-Ν-1, ή συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα transwell διαχωρισμένων HO1-Ν-1. 3 ημέρες μετά την καλλιέργεια, NHDFs απομονώθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση qPCR. Ι: qPCR να μετρήσει κάθε έκφραση του mRNA Notch σε NHDFs απομονωθεί από συγκαλλιέργεια με τα κύτταρα HO1-Ν-1. ΝΔ, δεν ανιχνεύεται. *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0.01.

Η

NOTCH3 Εκφράζεται σε CAFS ελέγχει την αγγειογένεση

Η ανοσοϊστοχημική μελέτη χρησιμοποιώντας ανθρώπινα δείγματα OSCC έδειξε ότι η έκφραση NOTCH3 σε CAFS συσχετίστηκε σημαντικά με την T-στάδιο (το μέγεθος του όγκου). Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι NOTCH3 θετικά CAFS την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου με διέγερση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου ή /και με την ενίσχυση της αγγειογένεσης. Για να διερευνήσουν τις δυνατότητες αυτές, πραγματοποιήσαμε μια πρώτη

in vitro

δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων χρησιμοποιώντας κύτταρα HO1-Ν-1, που εκφράζει την JAG1 συνδέτη NOTCH όπως προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western (Σχήμα 3Α). Η αγωγή με ανασυνδυασμένο ανθρώπινο NOTCH3-Fc /χίμαιρα, η οποία μπορεί να συνδεθεί με το πρόσδεμά του, JAG1, δεν επηρέασε HO1-Ν-1 πολλαπλασιασμού (Σχήμα 3Β)

Α:. Jagged1 έκφραση σε διάφορες προφορικές καρκινικές κυτταρικές γραμμές αναλύθηκε με στύπωμα Western. Β: Η επίδραση της NOTCH3 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Ο πολλαπλασιασμός των HO1 Ν-1-κύτταρα με ή χωρίς ανασυνδυασμένη ανθρώπινη θεραπεία χίμαιρα NOTCH3-Fc παρακολουθήθηκε για 72 ώρες.

Η

Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε διπλή χρώση ανοσοφθορισμού NOTCH3 και CD34 (δείκτης ενδοθηλιακών κυττάρων ) για να καθοριστεί εάν η έκφραση NOTCH3 σε CAFS σχετίζεται με την πυκνότητα των αιμοφόρων αγγείων σε ανθρώπινη γλώσσα δείγματα OSCC. πυκνότητα Micro-σκάφους κατά την επεμβατική περιοχή του όγκου ήταν σημαντικά αυξημένη στην ομάδα που CAFS NOTCH3 (+) σε σύγκριση με την NOTCH3 (-) CAFS ομάδα (Σχ 4Α και 4Β). Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι NOTCH3 (+) CAFS προάγουν την αγγειογένεση. Για να διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός της εν λόγω αγγειογένεσης, πραγματοποιήσαμε μια οργανοτυπική δοκιμασία αγγειογένεσης με τη συγκαλλιέργεια κυττάρων HO1-N-1, HUVEC και NHDFs να προσδιοριστεί αν OSCC επαγόμενη NOTCH3 σε NHDFs διευκολύνει το σχηματισμό σκάφος. Ανοσοφθορισμού χρώσης αυτής της συγκαλλιέργειας έδειξαν CD31-θετικό πλέγμα που σχηματίζεται από HUVECs και NOTCH3 θετικών NHDFs γύρω από τις φωλιές των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 4C). ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι NHDFs συν-καλλιεργήθηκαν με HUVECs και μόνο, με την απουσία των κυττάρων HO1-Ν-1 έδειξε επαγωγή NOTCH3 σε σύγκριση με τα NHDFs ελέγχου. Πολύ υψηλότερα επίπεδα έκφρασης NOTCH3 παρατηρήθηκαν σε NHDFs που συνκαλλιεργήθηκαν με HUVECs μαζί με HO1-Ν-1 κύτταρα (Σχήμα 4D). Για την αξιολόγηση του σχηματισμού σωλήνα σε αυτή τη δοκιμασία, θα απεικονιστεί CD31-θετικών κυττάρων με ανοσοχρώση. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, CD31-θετικά σχηματισμός σωλήνα με HUVECs παρουσία NHDFs και τον έλεγχο siRNA αυξήθηκε σημαντικά με συν-καλλιέργεια με HO1-N-1. Αυτός ο σχηματισμός σωλήνας κατεστάλη σημαντικά όταν οι NHDFs επιμολύνθηκαν με Sin3 (Σχ 4Ε και 4ΣΤ). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι OSCCs προάγουν την αγγειογένεση με διέγερση έκφρασης NOTCH3 σε CAFS

Α και Β: Σύγκριση της πυκνότητας μικροαγγείων (MVD) μεταξύ NOTCH3 (-) CAFS και NOTCH3 (+) CAFS περιπτώσεις.. Immunofluorostaining για την α-SMA (πράσινο), NOTCH3 (πράσινο) και CD34 (κόκκινο) χρησιμοποιώντας ανθρώπινη γλώσσα δείγματα OSCC. Ca, φωλιές καρκίνο. Διακεκομμένες γραμμές έδειξε την διασύνδεση των φωλιών καρκίνου και στρώμα. Βέλη απέδειξε την CD34-θετικό μικροαγγείων. μπαρ κλίμακα, 50μm. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (Α). Ποσοτική αξιολόγηση των MVD μεταξύ αυτών των δύο ομάδων (Β). C-F:

In vitro

αγγειογένεση δοκιμασία συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα HO1-Ν-1, HUVECs και siRNA επιμολυσμένα NHDFs. Immunofluorostaining για NOTCH3 (πράσινο) και CD31 (κόκκινο). Ca, φωλιές HO1-Ν-1 καρκίνου. Διακεκομμένες γραμμές δείχνουν το περιθώριο των φωλιών καρκίνου HO1-Ν-1. μπαρ κλίμακα, 100 μm. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (C). NHDFs απομονώθηκε από αυτό συγκαλλιέργεια υποβλήθηκαν σε στύπωμα Western (D). Αντιπροσωπευτική εικόνα του σχηματισμού σωλήνα με HUVECs σε κάθε κατάσταση. μπαρ κλίμακα, 100 μm (Ε). Ποσοτική αξιολόγηση της περιοχής σχηματισμού σωλήνα (CD31-θετικά περιοχής) σε κάθε συνθήκη (F). siCtrl, αρνητικό siRNA ελέγχου. Sin3, siRNA για NOTCH3. **

P

& lt? 0.01.

Η

Για να διερευνηθεί αν η επαγωγή NOTCH3 σε ινοβλάστες είναι ένα μοναδικό ιδιότητα του OSCCs, έχουμε συγκαλλιεργούνται NHDFs με κυτταρικές σειρές που προέρχονται από καρκίνους διαφόρων οργάνων, συμπεριλαμβανομένων τραχήλου της μήτρας, του πνεύμονα, του μαστού, του στομάχου, του παχέος εντέρου, και παγκρέας. Ανάλυση Western blotting έδειξε ότι τα κύτταρα Α549, τα οποία είναι ένας πνεύμονας κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος, διέγειρε την έκφραση του NOTCH3 σε NHDFs σε ένα επίπεδο που ήταν παρόμοια με εκείνη που προκαλείται από HO1-Ν-1 (Σχήμα 5Α). Ένα

in vitro

αγγειογένεσης προσδιορισμού έδειξαν ότι τα κύτταρα Α549 που επάγεται σημαντικά το σχηματισμό σωλήνα σε HUVECs όταν συν-καλλιεργήθηκαν με NHDFs και ότι αυτό το πλέγμα μειώθηκε σημαντικά από NOTCH3 knockdown σε NHDFs (Σχήμα 5Β και 5Γ). Η ανάλυση στυπώματος Western των NHDFs απομονώνονται από την δοκιμασία αγγειογένεσης αποκάλυψε παρόμοια αποτελέσματα με αυτά που λαμβάνονται όταν NHDFs συν-καλλιεργήθηκαν με HUVECs και HO1-Ν-1 αναλύθηκαν (Εικόνα 5D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα εκτός από OSCC μπορεί να επάγει NOTCH3 σε CAFS και προάγουν την αγγειογένεση

Α:. NHDFs συνκαλλιεργήθηκαν με διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από μη-στοματικές βλάβες. 3 ημέρες μετά την συγκαλλιέργεια, NHDFS απομονώθηκαν από αυτή την συγκαλλιέργεια και υποβλήθηκε σε ανάλυση στυπώματος Western για την ανίχνευση NOTCH3 και α-SMA. B-D: Ιη vitro δοκιμασία αγγειογένεσης συν-καλλιεργήθηκαν με Α549, HUVECs και siRNA επιμολυσμένα NHDFs. Εκπρόσωπος εικόνες του σχηματισμού σωλήνα (Β) και ποσοτική αξιολόγηση του (C) σε κάθε κατάσταση.