Αφηρημένο

Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι μια διαδεδομένη ασθένεια σε όλο τον κόσμο, και η πλειονότητα των HCC που σχετίζονται με θανάτους να οφείλονται σε τοπική εισβολή και μακρινή μετάσταση. Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) είναι μια μικρή υποπληθυσμός καρκινικά κύτταρα που έχουν διατυπωθεί η υπόθεση ότι είναι υπεύθυνη για μεταστατική νόσο. Πρόσφατα, εμείς και άλλοι έχουν προσδιορίσει έναν πληθυσμό CSC από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές HCC και όγκους ξενομοσχεύματος που χαρακτηρίζονται από έκφραση του CD133 τους. Ωστόσο, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους CD133

+ καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με μεσολαβήσει HCC μετάσταση δεν έχουν αναλυθεί επαρκώς. Εδώ, έχουμε ταξινομημένα κύτταρα HCC χρησιμοποιώντας CD133 ως τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων (CSC) δείκτη από μαγνητικά ενεργοποιημένης διαλογής κυττάρων (MACS) και απέδειξε ότι το CD133

+ κύτταρα HCC διαθέτουν όχι μόνο μεγαλύτερες μεταναστευτικές και επεμβατική ικανότητα

στο vitro

αλλά είναι επίσης προικισμένο με αυξημένη μεταστατική ικανότητα

in vivo

και σε δείγματα ανθρώπινου HCC σε σύγκριση με CD133

– κύτταρα HCC. Ανάλυση γονιδιακής έκφρασης του CD133

+ και CD133

– κυττάρων της γραμμής HCC SMMC-7721 αποκάλυψε ότι συζευγμένου με πρωτεΐνη υποδοχέα 87 (GPR87) εκφράζεται έντονα στο CD133

+ κυττάρων HCC. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο της GPR87 στην ρύθμιση της έκφρασης CD133. Δείξαμε ότι η υπερέκφραση της GPR87 επάνω ρυθμισμένη έκφραση CD133, προωθείται CSC που σχετίζονται με τα μεταναστευτικά και επεμβατική ιδιότητες

in vitro

, και την αύξηση της έναρξης του όγκου

in vivo

. Αντιστρόφως, αποσιώπηση της έκφρασης GPR87 μείωσε τα επίπεδα έκφρασης CD133. Συμπέρασμα: GPR87 προωθεί την ανάπτυξη και μετάσταση του CD133

+ καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν και τα ευρήματά μας μπορεί να αποκαλύψει νέους στόχους για την πρόληψη ή τη θεραπεία HCC

Παράθεση:. Γιαν Μ, Li H, Zhu Μ, Zhao F, Zhang L, Chen T, et al. (2013) συζευγμένο με πρωτεΐνη Ο Υποδοχέα 87 (GPR87) προωθεί την ανάπτυξη και μετάσταση του CD133

+ καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. PLoS ONE 8 (4): e61056. doi: 10.1371 /journal.pone.0061056

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 19, Δεκεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 5 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: 10, Απριλίου, 2013

Copyright: © 2013 Yan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το Εθνικό Πρόγραμμα Κλειδί για την Βασική Έρευνα της Κίνας (973) (2009CB521803), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81.272.438), το Εθνικό Key Sci-Tech Ειδικό Πρόγραμμα της Κίνας (2013ZX10002-11), το Πρόγραμμα της Σαγκάης Θέμα Διευθύνων Επιστήμης (Α) (09XD1403600) και κορυφαία ακαδημαϊκά Πειθαρχία Έργο Δημοτική Επιτροπή Παιδείας της Σαγκάης (J50208). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι ένας από τους πιο κοινούς καρκίνους του ανθρώπου, και η πλειονότητα των HCC σχετίζεται θάνατοι συμβαίνουν λόγω της τοπικής εισβολή και απομακρυσμένη μετάσταση [1]. Παρά τη σημαντική πρόοδο, οι περισσότερες θεραπευτικές προσεγγίσεις αποτυγχάνουν να εξαλειφθούν όλα τα καρκινικά κύτταρα, και τα υπολειμματικά καρκινικά κύτταρα συχνά καταλήγουν σε επανεμφάνιση του όγκου και την μετάσταση. Αύξηση στοιχεία έχουν δείξει ότι τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) μπορεί να είναι υπεύθυνη για αντοχή στη συμβατική θεραπεία και μεταστατική νόσο [2], [3], [4], [5]. Πάντως, οι μοριακοί μηχανισμοί της μετάστασης δεν είναι επαρκώς κατανοητές.

CD133, ένα 5-διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, είναι μία σημαντική πρωτεΐνη κυτταρικής επιφάνειας που έχει ταυτοποιηθεί ως ένας δείκτης του καρκίνου βλαστικών κυττάρων σε διάφορους στερεούς όγκους [6], [7], [8], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του ήπατος [5], [9], [10]. προηγούμενη μελέτη μας, εντοπίστηκε για πρώτη φορά και επιβεβαίωσε την ύπαρξη ενός μικρού υποπληθυσμό CD133

+ κύτταρα HCC μέσα σε κυτταρικές σειρές HCC που παρουσίασαν αυξημένη κλωνογενοποιήσεως

in vitro

και ισχυρό ογκογενετικότητας

in vivo

[11 ]. Άλλες ομάδες έχουν επίσης αποδείξει ότι CD133

+ κυττάρων HCC κατέχουν κύτταρο-όπως ιδιότητες καρκινικά βλαστικά, συμπεριλαμβανομένης της αυτο-ανανέωσης, διαφοροποίηση,

in vivo

την έναρξη του όγκου και την αντίσταση χημειοθεραπεία [12], [13], [ ,,,0],14], [15]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για το ρόλο του CD133

+ HCC κύτταρα σε μετάσταση όγκου.

υποδοχέα συζευγμένου με πρωτεΐνη G 87 (GPR87), επίσης γνωστή ως GPR95, είναι ένα κυτταρικής επιφάνειας GPR που υπερεκφράζεται σε ποικίλες καρκίνους και παίζει ουσιαστικό ρόλο στην επιβίωση των κυττάρων του όγκου [16], [17]. Αν και πολλά στοιχεία δείχνουν ότι το GPRS παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής μορφολογίας, πολικότητα και τη μετανάστευση [18], [19], [20], υπάρχουν λίγες αναφορές σχετικά με τη λειτουργία του GPR87. Μόνο δύο εκθέσεις έχουν δείξει ότι GPR87 νοκ ντάουν ευαισθητοποιημένα καρκινικά κύτταρα σε καταστολή της ανάπτυξης βλάβη που προκαλείται από το DNA μέσω ενισχυμένης σταθεροποίηση p53 και την ενεργοποίηση [16], [21].

Στην παρούσα μελέτη, απομονώσαμε ένα CD133

+ CSC-όπως υποπληθυσμός από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές HCC και απέδειξε ότι το CD133

+ κύτταρα HCC εμφανίζεται μεταναστευτικών και επεμβατική ιδιότητες

in vitro

και διέθετε μεταστατικό δυναμικό

in vivo

. Επιπλέον, διερευνήσαμε το ρόλο του GPR87 στη ρύθμιση της έκφρασης του CD133, το οποίο με τη σειρά του προωθεί την ανάπτυξη και τη μετάσταση του καρκίνου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν σε HCC.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

Οι κυτταρικές σειρές HCC Hep3B, SNU475 και PLC /PRF /5 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA). Η κυτταρική σειρά SMMC-7721 αποκτήθηκε από την Τράπεζα Κυττάρων του Ινστιτούτου Βιοχημείας και Βιολογίας Κυττάρου, την Κίνα Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Η γραμμή MHCC-97L που παρέχονται από τον καρκίνο του ήπατος Ινστιτούτο Zhongshan Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Fudan (Σαγκάη, Κίνα). Η κυτταρική σειρά HCC-Ly5 ιδρύθηκε το εργαστήριο μας με απομόνωση από ένα δείγμα HCC από έναν ασθενή ο οποίος είχε υποβληθεί σε εκτομή καρκίνο του ήπατος στο ήπαρ Cancer Institute του Zhongshan Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Fudan (Σαγκάη, Κίνα). Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο κατά Dulbecco Eagle του Dulbecco (DMEM? Sigma-Aldrich, USA) που περιέχει 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS (Biowest, Γαλλία) συμπληρωμένο με 100 IU /ml πενικιλλίνη G και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Sigma-Aldrich, USA), και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2.

κελί απομόνωσης by Magnetic-ενεργοποιούμενο κυτταρικό διαχωρισμό (MACS)

τα κύτταρα σημάνθηκαν με πρωτογενή CD133 /1 αντίσωμα (lgG1 ποντικού, Miltenyi Biotec, Γερμανία), και το CD133

+ και CD133

– κύτταρα στη συνέχεια μαγνητικά απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ EasySep ΡΕ επιλογής (StemCell Technologies, Καναδάς), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η καθαρότητα των διαλεγμένων κυττάρων εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western. μπλε χρώση trypan χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η διαλογή βιωσιμότητα των κυττάρων, και περισσότερο από το 90% της βιωσιμότητας θεωρήθηκε αποδεκτή για τους μεταγενέστερους πειράματα.

Lentivirus Παραγωγής και κυττάρων Μεταγωγή

Η ακολουθία GPR87 ORF ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές (προς τα εμπρός: 5′-TCGACGCGTATGGGGTTCAACTTGACGCTTG-3 ‘, αντίστροφος: 5′-TTCCATATGGGCAAACATTACACGCAGACAA-3′) και κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα λεντοϊού έκφρασης pWPXL (Addgene, ΜΑ) με αντικατάσταση του θραύσματος GFP. Το CD133 cDNA κλώνος (Myc-DDK-tagged ORF κλώνο του Homo sapiens προμινίνη 1 (PROM1), παραλλαγή μεταγραφή 1 ως επιμόλυνση έτοιμα DNA NM_006017.1) με πλήρους μήκους ακολουθία ORF αγοράστηκε από ΟηΟεηε (ΟηΟεηε Technologies, Inc. Rockville) , η οποία κλωνοποιήθηκε στο φορέα έκφρασης λεντοϊού pWPXL (Addgene, ΜΑ) με αντικατάσταση του θραύσματος GFP. Οι φορείς pLVTHM-shGPR87 και pLVTHM-SHNC δομήθηκαν με εισαγωγή ανόπτηση ολιγονουκλεοτίδια (GPR87: 5’- CCGGUGCUUUAUCUCAUUATT-3 ‘ή 5′-GGACCUUGGUACUUCAAGUTT-3′, NC: 5’- TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘) εντός του φορέα βραδέος ιού pLVTHM ως περιγράφεται στην ιστοσελίδα Addgene.

το ιικό συσκευασία πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ 293Τ μετά συν-επιμόλυνση του φορέα pWPXL-GPR87 ή pLVTHM-shGPR87 με το πλασμίδιο πακεταρίσματος psPAX2 και το πλασμίδιο του φακέλου pMD2.G (Addgene, ΜΑ) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Canada). Οι ιοί συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, και καθορίστηκαν οι ιικοί τίτλοι. Τα κύτταρα στόχοι (1 χ 10

5), συμπεριλαμβανομένων των SMMC-7721, HCC-Ly5, MHCC-97L, PLC /PRF /5 και Hep3B κύτταρα, μολύνθηκαν με 1 χ 10

6 ανασυνδυασμένη μονάδες φακοϊό μεταγωγής σε η παρουσία των 6 μg /ml polybrene (Sigma-Aldrich, USA).

Ανοσοϊστοχημική (IHC) χρώση ανθρώπινων HCC ιστών

διακόσια τριάντα έξι δείγματα ιστού ανθρωπίνων HCC ελήφθησαν από ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργική θεραπεία στο Guangxi Cancer Institute (Νανίνγκ, Κίνα), το Qidong καρκίνο του ήπατος Ινστιτούτο (Qidong, Κίνα) ή το πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Zhejiang (Hangzhou, Κίνα). Οι 236 ασθενείς HCC περιλαμβάνονται 190 άνδρες και 46 γυναίκες (μέση ηλικία: 50,9 χρόνια, που κυμαίνονται 21-83 ετών). Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν στο πλαίσιο των συμφωνιών συναίνεση και σύμφωνα με την επιτροπή Ηθικής κριτική Κίνα. Όλα τα δείγματα ιστού σταθεροποιήθηκαν σε 4% ουδέτερη φορμαλίνη ρυθμισμένο με φωσφορικό για τουλάχιστον 72 ώρες και συνήθως ενσωματωμένα σε παραφίνη. Οι μικροσυστοιχίες ιστού κατασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [22].

ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές ιστού array (5 μm σε πάχος) παρασκευάστηκαν, και οι ανοσοσυζυγείς ανιχνεύθηκαν με ανοσοφθορισμό σύμφωνα με τις διαδικασίες που περιγράφηκαν προηγουμένως [11]. Για τις βέλτιστες αραιώσεις αντισωμάτων, συνιστάται οι συγκεντρώσεις των κατασκευαστών απασχολήθηκαν. Τα αποτελέσματα έγιναν ορατά και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Axioskop 2 μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Γερμανία) με ένα σύστημα DP70 CCD (Όλυμπος, Ιαπωνία).

σε πραγματικό χρόνο Αντίστροφη Μεταγραφή-πολυμεράσης

Αλυσιδωτή Αντίδραση

Σύνολο RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Καναδάς) και μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίου RT PrimeScript ™ (Perfect Real Time) (Takara Biotechnology, Ιαπωνία). Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (PCR) στη συνέχεια διεξάγεται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Τα επίπεδα έκφρασης κανονικοποιήθηκαν έναντι εκείνων της εσωτερικής γονιδίου αναφοράς αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH).

Western Blot

Ο κυτταρική λύση, προετοιμασία του δείγματος, SDS-PAGE διαχωρισμού και electrotransferation να μεμβράνες νιτροκυτταρίνης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τυπικά πρωτόκολλα. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με τη χρήση αντι-CD133 /1 IgG1 ποντικού (Miltenyi Biotec) και οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SuperSignal West Femto μέγιστη ευαισθησία Υπόστρωμα (Pierce). β-ακτίνη επανακαθετηριάστηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

In Vivo

Ανάλυση ανάπτυξη και μετάσταση όγκου

Όλα τα πρωτόκολλα πείραμα ζώων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη εγκρίθηκε από την Σαγκάη Ιατρική πειραματική Επιτροπή Animal Care στη Σαγκάη Jiaotong Πανεπιστήμιο (ID έγκριση. ShCI-12-023). Έξι έως οκτώ εβδομάδων εκ γενετής ανοσοανεπάρκεια μη παχύσαρκους διαβητικούς /σοβαρή συνδυασμένη ανοσολογική ανεπάρκεια (NOD /SCID) αρσενικά ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες και να διατηρείται υπό κανονικές συνθήκες σύμφωνα με τις οδηγίες του οργάνου.

Για ορθοτοπική εμβολιασμό, μια εγκάρσια τομή 8 mm έγινε στην άνω κοιλιακή χώρα υπό αναισθησία. Δέκα χιλιάδες CD133

+ ή CD133

– κύτταρα ταξινομούνται από SMMC-7721 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 50 μΙ ϋΜΕΜ άνευ ορού /Matrigel (1:01) και εγχύεται στον αριστερό ηπατικό λοβό των ποντικών χρησιμοποιώντας μια μικροσύριγγα. σχηματισμός όγκων παρακολουθήθηκε ξεκινώντας 1 εβδομάδα μετά τον εμβολιασμό. Η

in vivo

σήμα λουσιφεράσης οπτικοποιήθηκε και μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα

in vivo

σύστημα απεικόνισης (LB983 NC320, Berthold Technologies GmbH & amp?. Co KG, Γερμανία). Μετά από 12 εβδομάδες, όλα τα ποντίκια θανατώθηκαν, και οι μάζες του όγκου και εμβολιάσθηκαν δείγματα ηπατικού ιστού ποντικού αποκόπηκαν και μικροσκοπικά εξετάσθηκαν.

Για τη δημιουργία ενός όγκου-παλιννόστησης ζωικό μοντέλο, NOD /SCID ποντικοί πρώτα πλένονται με 20 mg /kg 2-acetaminofluorene (2-AAF) ή 0,2% DMSO για μία εβδομάδα. Στη συνέχεια, τα 2/3 του αριστερού ηπατικού λοβού ήταν χειρουργικά, και 10.000 CD133

+ κύτταρα ή CD133

– κύτταρα τα οποία είχαν πρόσφατα απομονωθεί από το SMMC-7721 κυτταρική γραμμή με MACS ενέθηκαν στην σπλήνα. Η σπλήνα εκτομή 5 λεπτά μετά την ένεση, και πλένονται με 2-AAF ή DMSO συνεχίστηκε μέχρι και 9 εβδομάδες. Στο τέλος της ένατης εβδομάδας, όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν, σχηματισμό όγκων ξενομοσχεύματος και παρατηρήθηκαν μεταστάσεις και το ήπαρ και ο πνεύμονας ιστοί αποκόπηκαν και υποβλήθηκαν σε μικροσκοπική εξέταση [23], [24], [25].

Η στατιστική ανάλυση

το στατιστικό πακέτο λογισμικού Κοινωνικών Επιστημών (έκδοση 18.0) (SPSS) χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση. t-test ή ANOVA του ανεξάρτητου Student χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις συνεχείς μεταβλητές μεταξύ των ομάδων, ενώ χ2 ανάλυση εφαρμόστηκε για συγκρίσεις των διχοτομικών μεταβλητών.

P

τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Οι αστερίσκοι χρησιμοποιούνται για να αντιπροσωπεύουν στατιστική σημαντικότητα του

τιμές P σε ορισμένα αριθμητικά στοιχεία, π.χ. * P ≤ 0,05, ** p≤0.01.

Αποτελέσματα

CD133

+ HCC κύτταρα Εμφάνιση High επεμβατική και μεταστατικό δυναμικό

In Vitro

Η

ΚΕΠ είναι γνωστό ότι εμφανίζουν ενισχυμένη μεταναστευτικών και επεμβατική δυναμικό. Για να διερευνήσουν περαιτέρω το μεταστατικό δυναμικό του CD133

+ κύτταρα HCC

in vitro

, ταξινομήσαμε SMMC-7721, SNU475, PLC /PRF /5 και πρωτογενών ανθρώπινων κυττάρων HCC-Ly5 HCC με βάση την έκφραση CD133 από MACS . Η έκφραση CD133 των διαλεγμένων κυττάρων επιβεβαιώθηκε με στύπωμα Western (Σχήμα 1Α), και οι CSC που σχετίζονται με τα χαρακτηριστικά των απομονωμένων κυττάρων αναλύθηκαν. Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και το CD133

+ και CD133

– κύτταρα διαχωριστεί από τα SMMC-7721 και HCC-Ly5 κυτταρικές σειρές δεν εμφάνισαν σημαντικές διαφορές στην ανάπτυξη (Σχήμα 1Β), το CD133

+ κύτταρα μετανάστευσαν και εισέβαλαν στο σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι το CD133

– κυττάρων στο

in vitro

φρεατίων δοκιμασίες μετανάστευσης και matrigel εισβολή (Σχήμα 1C, D), δείχνοντας ότι CD133

+ κύτταρα είναι άκρως μεταναστευτικών και επεμβατική. Για να ελέγξετε το δυναμικό πολλαπλασιασμού τους, συγκρίναμε τις ικανότητες σχηματισμού αποικιών τους από τον πολλαπλασιασμό και μαλακό δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας agar. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο CD133

+ κύτταρα ήταν σε θέση να κινήσει μεγαλύτερες και πιο πολυάριθμες αποικίες από τα αντίστοιχα CD133

– κύτταρα (Σχήμα S1, S2), υποδεικνύοντας ότι η CD133

+ κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη ανάπτυξη

in vitro

. Εκτός από αυτό, ελέγξαμε επίσης την ικανότητα αυτο-ανανέωσης των διαλεγμένων κυττάρων CD133 με τη δοκιμασία σχηματισμού σφαιροειδές. Στην πρώτη γενιά, το CD133

+ κυττάρων ήταν ικανοί να παράγουν μεγαλύτερες και πιο σφαιροειδή από το αντίστοιχο CD133

– κυττάρων

in vitro

. Στη δεύτερη γενιά, το CD133

+ κύτταρα είχαν διατηρήσει τον πρωταρχικό τους χαρακτήρα (Σχήμα S3). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CD133

+ κύτταρα παρουσιάζουν ενεργό ικανότητα αυτο-ανανέωσης

in vitro

στην πρωτοβάθμια και τη διέλευση των πολιτισμών.

(Α) Απομόνωση του CD133

+ κύτταρα HCC ταξινομημένο με MACS και ανίχνευση της έκφρασης CD133 σε SMMC-7721, HCC-Ly5, SNU475, και PLC /PRF /5 κύτταρα με κηλίδα Western. καμπύλες (Β) Ανάπτυξη των ταξινομημένων CD133

+ και CD133

– SMMC-7721 και τα κύτταρα HCC-Ly5 ελήφθησαν από τη δοκιμασία CCK-8. δοκιμασία μετανάστευσης (C) Transwell του CD133

+ και CD133

– κύτταρα διαλέγεται από το SMMC-7721 και κυτταρικές σειρές HCC-Ly5. (D) δοκιμασία Transwell Matrigel εισβολής των CD133

+ και CD133

-. Κύτταρα διαχωριστεί από τα SMMC-7721 και HCC-Ly5 κυτταρικές σειρές

Η

CD133

+ HCC κύτταρα Manifest εξαιρετικά Μεταστατικό Χαρακτηριστικά

In Vivo

η

προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι CD133

+ κύτταρα HCC ήταν ευδιάκριτα ογκογόνο σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος [11]. Για να αξιολογηθεί περαιτέρω το μεταστατικό δυναμικό του CD133

+ κύτταρα HCC, ιδρύσαμε ένα πρότυπο ορθοτοπικής μεταμόσχευσης των ζώων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 10.000 CD133

+ SMMC-7721 κύτταρα ήταν αρκετή για να προκαλέσει το σχηματισμό όγκων σε 5/5 (100%) και ενδοηπατική μετάσταση σε 2/5 (40%) NOD /SCID ποντίκια μετά από 3 μήνες, ενώ μια ισοδύναμη αριθμός CD133

– κύτταρα μόνο επάγεται σχηματισμό όγκων σε ποντίκια 3/5 (60%) και δεν προκάλεσε μετάσταση όγκου (Σχήμα 2Α, Β, C). Αιματοξυλίνη-ηωσίνη (ΗΕ) χρώση αποκάλυψε παρόμοια ιστολογικά χαρακτηριστικά στις ορθοτοπική μεταμόσχευση του όγκου (Σχήμα 2Δ). Επιπλέον, για να αξιολογηθεί περαιτέρω η

in vivo

ικανότητα παλιννόστησης των καρκινικών κυττάρων, που θεωρείται ένα μεταστατικό χαρακτηριστικό ΚΕΠ, ένα ζωικό μοντέλο του κυττάρου όγκου παλιννόστησης ιδρύθηκε το NOD /SCID ποντίκια. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 9/9 NOD /SCID ποντίκια που εμβολιάστηκαν με 10.000 CD133

+ HCC κύτταρα ανέπτυξαν όγκους και μετάσταση, ενώ λιγότεροι όγκοι βρέθηκαν στο συκώτι των NOD /SCID ποντικών που υπέστησαν αγωγή με ισοδύναμο αριθμό CD133

– κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι οι όγκοι που παράγονται από το CD133

+ κύτταρα αναπτύχθηκαν και σχημάτισαν μάζας του όγκου στη θέση του εκτομή ήπατος λοβού, υποδεικνύοντας ότι η CD133

+ κυττάρων HCC είναι ιδιαίτερα κινητικά και επιδεικνύουν μία ικανότητα όγκου-homing (Σχήμα 2Ε , F), τα οποία επιβεβαιώθηκαν με ιστοπαθολογική εξέταση (Σχήμα 2G, η). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται παραπάνω σταθερά έδειξαν ότι CD133

+ κύτταρα κατείχε μια υψηλή ικανότητα για μετάσταση όγκου

in vivo

στο HCC.

(Α) Εκπρόσωπος

in vivo

βιοφωταύγεια απεικόνιση των μεταστάσεων όγκου σε NOD /SCID ποντίκια μετά από ορθοτοπική μεταμόσχευση με το απομονωμένο CD133

+ ή CD133

– SMMC-7721 κύτταρα (εικόνα που παρουσιάζεται είναι αντιπροσωπευτική της ομάδας μεταμοσχεύεται ορθοτοπικά με 10.000 κύτταρα) (η = 5 σε κάθε ομάδα ). (Β) Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα NOD /SCID ποντίκια μεταμοσχεύεται ορθοτοπικά με CD133

+ ή CD133

– κύτταρα που απομονώνονται από το HCC κυτταρική σειρά SMMC-7721. (γ) Ο αριθμός των ποντικών που εκδηλώνεται ογκογονικότητας και ηπατικές μεταστάσεις του CD133

+ SMMC-7721 κύτταρα στις ανιχνεύσεις μεταμόσχευση ορθοτοπική φαίνεται στον πίνακα. (Δ) η χρώση της εσοδείας όγκων επιβεβαίωσε πρωτογενή φαινότυπο HCC. (Ε) Αντιπροσωπευτική

in vivo

βιοφωτισμός απεικόνιση της μετάστασης όγκου στο NOD /SCID ποντίκια σε έναν όγκο-παλιννόστησης ζωικό μοντέλο μεταμοσχευμένο με CD133

+ ή CD133

– κύτταρα απομονώνονται από το SMMC-7721 κυτταρική σειρά (η = 9 σε κάθε ομάδα). (F) Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα του σχηματισμού ήπατος όγκου και των μεταστάσεων σε 2-AAF /ΡΗχ ζωικό μοντέλο μεταμοσχευμένο με CD133

+ ή CD133

– κύτταρα που απομονώνονται από το HCC κυτταρική σειρά SMMC-7721. (Ζ) χρώση τομών ιστού του ήπατος, μια μάζα όγκου από CD133

+ κύτταρα HCC σε 2-AAF /ΡΗχ ζωικό μοντέλο έδειξε. (H) Αριθμοί των ποντικών που εκδηλώνεται ηπατικές μεταστάσεις του CD133

+ ή CD133

-. Τα SMMC-7721 κύτταρα στον όγκο-παλιννόστησης ζωικό μοντέλο εμφανίζεται στη γραμμή gragh

Η

CD133

+ HCC κύτταρα επιδεικνύουν μοναδική έκφραση γονιδίων προφίλ

Για τη μελέτη του μοριακού μηχανισμού που διέπουν τη μετάσταση σε ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, συγκρίναμε τις παγκόσμιες προφίλ γονιδιακής έκφρασης του CD133

+ κύτταρα HCC και CD133 τους

– ομολόγους απομονωθεί από SMMC-7721 κύτταρα χρησιμοποιώντας το 2,0 Array Affymetrix GeneChip® Human Genome U133 Plus. Ταυτοποιήσαμε 454 κοινά διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια που εμφανίζεται μια πτυχή αλλαγή μεγαλύτερη από 1,5. Από αυτά τα 454 γονίδια, 312 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω και 142 είχαν ρυθμισμένα προς τα κάτω. Τα ταυτοποιημένα γονίδια υποβλήθηκαν περαιτέρω σε βιοπληροφορική ανάλυση. Οι λειτουργίες των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων συνδέθηκαν με την κυτταρική προσκόλληση, η μετανάστευση, κυτταροσκελετού, χημειοτακτική μετακίνηση και μετάσταση (Πίνακας S1, S2). Μεταξύ των γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ της CD133

+ και CD133

– πληθυσμούς, GPR87 βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά περίπου 8 φορές στο CD133

+ κυττάρων σε σύγκριση με το CD133

– κύτταρα. Να διευκρινιστεί ο ρόλος της GPR87 στην ανάπτυξη του όγκου και των μεταστάσεων του CD133

+ κύτταρα HCC, εξετάσαμε για πρώτη φορά την έκφραση της GPR87 στην ταξινομημένο κυτταρικές σειρές HCC και κύτταρα HCC πρωτογενών ανθρώπινων από qRT-PCR και Western blot. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης του GPR87 στο CD133

+ κυτταρικές σειρές HCC ήταν υψηλότερες από ό, τι τους CD133

– ομολόγους (Σχήμα 3Α, C). Στη συνέχεια εξετάσαμε την ικανότητα των διαφόρων HCC κυτταρικές σειρές και ανθρώπινα πρωτογενή κύτταρα να εκφράσουν GPR87. GPR87 ανιχνεύθηκε στις κυτταρικές σειρές HCC και κυττάρων πρωτευόντων ανθρωπίνων HCC με ανάλυση κηλίδος Western, αν και σε διαφορετικές ποσότητες (Εικόνα 3Β). Για την καλύτερη κατανόηση της λειτουργίας του GPR87 στο HCC μετάσταση, ιδρύσαμε δύο πρώτες σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν εκτοπικά GPR87, SMMC-7721-lenti-GPR87 και HCC-Ly5-lenti-GPR87, χρησιμοποιώντας φορέας λεντοϊού. Στη συνέχεια εξετάστηκε η έκφραση CD133 και CSC που σχετίζονται με ακίνητα σε αυτές τις σταθερές κυτταρικές σειρές. Βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του GPR87 σε SMMC-7721 και τα κύτταρα HCC-Ly5 είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης του CD133 (Σχήμα 3Δ, E). Για να κατανοήσουμε καλύτερα τη συσχέτιση μεταξύ CD133 και της έκφρασης GPR87 στους ιστούς HCC, ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε. έκφραση CD133 και GPR87 ανιχνεύθηκε σε δείγματα όγκων, η έκφραση του CD133 συσχετίστηκε με την έκφραση του GPR87 σε ιστούς HCC (R = 0,168, Ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 3F? Πίνακας S3).

(Α) Σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA της GPR87 και CD133 προσδιορίσθηκαν με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης στο CD133

+ και CD133

– πληθυσμούς διαλέγεται από το SMMC-7721, κυτταρικές γραμμές MHCC-97L HCC-Ly5 και. (Β) στυπώματος Western GPR87 στις κυτταρικές σειρές HCC και πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα. (C) κηλίδα Western του GPR87 στο CD133

+ και CD133

– πληθυσμούς διαλέγεται από το SMMC-7721, HCC-Ly5, SNU475 και PLC /RFP /5 κύτταρα. (Δ) Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης της GPR87 και CD133 προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western στο και HCC-Ly5-lenti-GPR87 κύτταρα-lenti-GPR87 SMMC-7721. (Ε) Η σχετική έκφραση του mRNA της GPR87 και CD133 προσδιορίστηκαν με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης στο SMMC-7721-lenti-GPR87 και HCC-Ly5-lenti-GPR87 κύτταρα. (F) Ο πίνακας έδειξε την συσχέτιση μεταξύ CD133 και της έκφρασης GPR87 στους ιστούς HCC.

Η

Η υπερέκφραση του GPR87 Up-ρυθμίζει CD133 Έκφραση και CSC που σχετίζονται με ακίνητα

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της GPR87 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, αναλύσαμε το ρόλο του GPR87 στο σχηματισμό αποικιών. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 4Α, η υπερέκφραση του GPR87 σε SMMC-7721 και τα κύτταρα HCC-Ly5 αύξησε την ικανότητα σχηματισμού αποικιών σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κενά κύτταρα μολυσμένα με φορέα (Ρ & lt? 0,05). Να εξετάσει αν η υπερέκφραση της GPR87 θα μπορούσε επίσης να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου και των μεταστάσεων

in vivo

, εμείς ορθοτοπικώς εμβολιάστηκαν 2 × 10

6 SMMC-7721-lenti-GPR87 ή SMMC-7721-lenti-έλεγχος των κυττάρων σε το αριστερό ηπατικό λοβό του NOD /SCID ποντίκια με μια μικροσύριγγα. Gross εξέταση αποκάλυψε ότι 6/6 ποντίκια ορθοτοπικώς εμβολιάζονται με κύτταρα SMMC-7721-lenti-GPR87 ανέπτυξαν όγκους μετά από 6 εβδομάδες, ενώ την ανάπτυξη των όγκων ανιχνεύθηκε μόνο σε 3/6 ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ισοδύναμο αριθμό κυττάρων SMMC-7721-lenti-ελέγχου (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, το μέσο μέγεθος του όγκου στα ποντίκια που εμβολιάσθηκαν με κύτταρα SMMC-7721-lenti-GPR87 ήταν 1,6 φορές μεγαλύτερη από ότι σε ποντίκια που εμβολιάστηκαν με SMMC-7721-lenti-pWPXL κύτταρα.

In vitro

φρεατίων δοκιμασίες μετανάστευσης και matrigel εισβολή έδειξε ότι SMMC-7721-lenti-GPR87 και HCC-Ly5-lenti-GPR87 κύτταρα μετανάστευσαν και εισέβαλε σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι τα κενά κελιά φορέα μολυσμένα (P & lt? 0,05 ) (Σχήμα 4C, D). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η GPR87 μπορούν να ρυθμίζουν την έκφραση CD133 και την προώθηση της μετάστασης

in vitro

και την ανάπτυξη

in vivo

. Αν και τα επίπεδα πρωτεΐνης CD133 σε HCC ιστούς χωρίς ενδοηπατική μετάσταση δεν συσχετίστηκαν με την έκφραση GPR87 (R = 0,120, Ρ & gt? 0,05) (Πίνακας S4, S5), τα επίπεδα της πρωτεΐνης CD133 σε HCC ιστούς με ενδοηπατική μετάσταση συσχετίζεται θετικά με την έκφραση GPR87 (R = 0,267, Ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 4Ε, F?. Πίνακας 1), γεγονός που υποδηλώνει ότι CD133 μπορεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω από την έκφραση του GPR87 στο μεταστατικό HCC

(Α) Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα ανιχνεύσεων πολλαπλασιασμού εξετάζοντας το αποτέλεσμα της GPR87 υπερέκφραση σε SMMC-7721 και τα κύτταρα HCC-Ly5. (Β) Οι ακαθάριστες χαρακτηριστικά της NOD που φέρει τον όγκο /ποντίκια SCID μεταμοσχεύεται ορθοτοπικά με 2 × 10

6 SMMC-7721-lenti-GPR87 και SMMC-7721-lenti- κύτταρα pWPXL μετά από 6 εβδομάδες (n = 6 σε κάθε ομάδα ). (C) Transwell δοκιμασία μετανάστευσης στην SMMC-7721 και τα κύτταρα HCC-Ly5 υπερεκφράζουν GPR87. (D) Transwell δοκιμασία εισβολή matrigel σε SMMC-7721 και τα κύτταρα HCC-Ly5 υπερεκφράζουν GPR87. χρώση (Ε) Ανοσοϊστοχημική της GPR87 και CD133 στο HCC ιστούς με ενδοηπατική μετάσταση. (F) Ο πίνακας έδειξε την συσχέτιση μεταξύ CD133 και της έκφρασης GPR87 στους ιστούς HCC με ενδοηπατική μετάσταση.

Η

κατασιγάσει του GPR87 Αναστέλλει CD133 Έκφραση και CSC που σχετίζονται με ακίνητα

Για να διερευνηθεί ο λειτουργικός ρόλος του GPR87 σε CD133

+ κύτταρα HCC, εμείς ανέστειλε την έκφραση του GPR87 σε κύτταρα Huh-7 PLC /PRF /5, Hep3B, SNU475 και χρησιμοποιώντας siRNA διαμόλυνση. ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι η αποσιώπηση της GPR87 μείωσε τα επίπεδα του CD133 έκφρασης

+ κυττάρων από 31,4% σε 24,1% και 26,7% στο PLC /PRF /5 κύτταρα, από 51,3% σε 13,4% και 18,5% στα κύτταρα Hep3B, από 2,2% έως 1,5% και 1,0% σε SNU475 κύτταρα, αλλά χωρίς αλλαγή ανιχνεύθηκε στα κύτταρα Huh-7 (Σχήμα 5).

In vitro

, η αποσιώπηση του GPR87 εντός /κύτταρα PRF /5 και Hep3B PLC οδήγησε σε μείωση στο mRNA και την έκφραση της πρωτεΐνης του CD133 (Σχήμα S4). Επιπλέον, GPR87 shRNA οδήγησε σε μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων (P & lt? 0,05) (Σχήμα S5). Δοκιμάσαμε επίσης την ικανότητα των κυττάρων να εισβάλουν, μεταναστεύουν ικανότητα παρακάτω GPR87 νοκ ντάουν.

In vitro

transwell δοκιμασίες μετανάστευσης και matrigel εισβολή έδειξαν ότι υπήρχε μείωση στο PLC /PRF /5-shGPR87 κύτταρα από τα κενά κελιά φορέα μολυσμένα (Ρ & lt? 0,05) (Σχήμα S6). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι GPR87 παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης CD133.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των επιπέδων της έκφρασης CD133 σε GPR87 siRNA-επεξεργασμένα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των PLC /PRF /5, Hep3B, SNU475 και Huh- 7 κυτταρικές σειρές.

η

GPR87 Μεσολαβεί η έκφραση της CD133 στο HCC γραμμές κυττάρων

Όπως τα πειράματα φαίνεται από τα παραπάνω, θα είχε αποδειχθεί ότι η εξουδετέρωση της GPR87 θα μπορούσε να αναστείλει την έκφραση του CD133 και

in vitro

εξάπλωση, ενώ η υπερέκφραση του GPR87 θα μπορούσε να προωθήσει την έκφραση του CD133 και να αυξήσει τη μετάσταση των όγκων στο HCC. Για να διερευνήσουν περαιτέρω τη συσχέτιση της έκφρασης GPR87 και CD133, έχουμε καθιερώσει σταθερές CD133 που υπερεκφράζουν κυτταρικές σειρές, SMMC-7721-lenti-CD133, HCC-Ly5-lenti-CD133 και MHCC-97L-lenti-CD133, χρησιμοποιώντας ένα φακοϊό φορέα, στη συνέχεια, εξέτασε έκφραση GPR87. Τα αποτελέσματα έδειξαν σαφώς ότι η υπερέκφραση του CD133 δεν ήταν σε θέση να ρυθμίζουν την έκφραση της GPR87 με qRT-PCR (Σχήμα 6Α, Β) και κηλίδωση Western (Σχήμα 6C).

(Α) σχετική έκφραση του mRNA του CD133 στο SMMC-7721-lenti-CD133, HCC-Ly5-lenti-CD133 και MHCC-97L-lenti-CD133 κύτταρα. (Β) Σχετική έκφραση του mRNA της GPR87 στην SMMC-7721-lenti-CD133, HCC-Ly5-lenti-CD133 και MHCC-97L-lenti-CD133 κύτταρα. (C) κηλίδα Western της GPR87 και CD133 σε SMMC-7721-lenti-CD133, HCC-Ly5-lenti-CD133 και τα κύτταρα MHCC-97L-lenti-CD133.

Η

Συζήτηση

Ο καρκίνος είναι μια συστηματική νόσος, και μετάσταση αντιπροσωπεύει πάνω από το 90% των θνησιμότητα σε ασθενείς με καρκίνο [26]. Στο HCC, μετάσταση είναι ένα από τα πιο πολύτιμα προγνωστικούς παράγοντες και επηρεάζει σημαντικά την έκβαση των ασθενών [27]. Πρόσφατα, καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) έχουν αναγνωριστεί ως έναν υποπληθυσμό καρκινικών κυττάρων που είναι υπεύθυνα για την ογκογένεση, θεραπευτικές αντίσταση, υποτροπής και μετάσταση [28], [29], [30], [31]. Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός του CSC μετάστασης παραμένει ασαφής. Την περαιτέρω διερεύνηση αυτού του μηχανισμού μπορεί όχι μόνο να παρέχει νέα διορατικότητα HCC, αλλά επίσης να προσδιορίσει ένα χρήσιμο μοριακός στόχος για την αποτελεσματική αντιμετώπιση HCC.

Πρόσφατα, εμείς και οι άλλοι έχουν εντοπίσει έναν πληθυσμό CSC στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα που χαρακτηρίζεται από την έκφραση του CD133. Ωστόσο, οι λεπτομερείς μεταστατικό χαρακτηριστικά των κυττάρων HCC εκφράζουν CD133 παραμένουν ασαφείς. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η CD133

+ κύτταρα HCC διαθέτουν υψηλή επεμβατική και μεταστατικό δυναμικό

in vitro

. Σε αντίθεση με τους CD133

– ομολόγους, 10000 CD133

+ SMMC-7721 κύτταρα ήταν αρκετή για να προκαλέσει σχηματισμό όγκων ορθοτοπική και ενδοηπατική μετάσταση σε NOD /SCID ποντίκια μετά από 3 μήνες. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει ότι 10.000 CD133

+ κυττάρων ήταν επαρκής για να επάγει πειραματική μετάσταση κατά σπληνικών εμβολιασμό σε έναν όγκο-παλιννόστησης ζωικό μοντέλο, που δείχνει ότι CD133

+ κύτταρα έχουν την ικανότητα όγκου-homing

in vivo

.

Πρόσφατα, η αυξημένη έκφραση του CD133 έχει παρατηρηθεί στα καρκινικά βλαστικά κύτταρα από μια ποικιλία καρκίνων του ανθρώπου και του ποντικού. Οι αναδυόμενες στοιχεία έχουν καταδείξει ότι η έκφραση CD133 μπορεί να ρυθμιστεί με πολλούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων μετασχηματιστικό παράγοντα ανάπτυξης βητα 1 [32], ΒΜΡ4 [33], microRNA-150 [2] και της ιντερφερόνης-άλφα [4]. Ωστόσο, κανένα φυσικό συνδέτη για CD133 έχει ακόμη προσδιοριστεί, και λίγα είναι γνωστά για τη λειτουργία του. Στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε τις παγκόσμιες προφίλ γονιδιακής έκφρασης του CD133

+ HCC ΚΕΠ και CD133 τους

– ομολόγους απομονωθεί από SMMC-7721 κύτταρα χρησιμοποιώντας την ανάλυση GeneChip και διαπίστωσε ότι η έκφραση του GPR87 στο CD133

+ κυτταρικές σειρές HCC αυξήθηκε σε σύγκριση με εκείνη του CD133

– ομολόγους. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι μπορεί να υπάρχει μια σύνδεση μεταξύ της GPR87 και CD133 στη διαδικασία της μετάστασης σε HCC. Ωστόσο, δεν υπάρχουν στοιχεία επιβεβαίωσε τη συσχέτιση μεταξύ GPR87 και CD133. Εδώ, έχουμε αποδείξει για πρώτη φορά ότι η αποσιώπηση της GPR87 μείωσε τα επίπεδα έκφρασης CD133. Η υπερέκφραση του GPR87 ενίσχυσε σημαντικά τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων HCC, αυξημένη χωρητικότητα σχηματισμό αποικιών τους

in vitro

και προώθησε το σχηματισμό όγκων και την ανάπτυξη

in vivo

. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι GPR87 έχει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης CD133 και συμβάλλει στην ανάπτυξη και μετάσταση των κυττάρων HCC.

Ο μοριακός μηχανισμός υποκείμενες μετάστασης σε HCC ΚΕΠ απαιτεί περαιτέρω μελέτη. μελλοντικό έργο μας θα επικεντρωθεί στην αποσαφήνιση του μηχανισμού βασίζεται η GPR87 μεσολάβηση ρύθμιση του CD133 στο HCC ΚΕΠ και τον καθορισμό των μοριακών θεραπευτικών στόχων για HCC ΚΕΠ.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. δοκιμασία σχηματισμού

αποικία της CD133

+/- κύτταρα HCC σε 2D πολιτισμού. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα δοκιμασιών πολλαπλασιασμού του CD133

+ και CD133

– κύτταρα που απομονώθηκαν από SMMC-7721 και HCC-Ly5 κύτταρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0061056.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2. δοκιμασία σχηματισμού

αποικία της CD133

+/- κύτταρα HCC σε μαλακό άγαρ. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα δοκιμασιών πολλαπλασιασμού του CD133

+ και CD133

– κύτταρα που απομονώθηκαν από SMMC-7721 και HCC-Ly5 κύτταρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0061056.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3. δοκιμασία σχηματισμού

σφαιροειδές του CD133

+/- κύτταρα HCC

in vitro

. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα σφαιροειδές δοκιμασίες σχηματισμό CD133

+ και CD133

– κύτταρα που απομονώθηκαν από SMMC-7721 και HCC-Ly5 κύτταρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0061056.s003

(ΔΕΘ)