Αφηρημένο

Φαινυλβουτύλ isoselenocyanate (ISC-4) είναι ένας αναστολέας Akt με αποδεδειγμένη προκλινική αποτελεσματικότητα έναντι του μελανώματος και του καρκίνου του παχέος εντέρου . Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να βελτιώσει την κλινική χρησιμότητα της ISC-4 με τον προσδιορισμό ένα συνεργιστικό συνδυασμό με εγκεκριμένη από την FDA αντικαρκινικές θεραπείες, σχετική και κατάλληλη ρύθμιση της νόσου για τη δοκιμή, και βιοδείκτες της απόκρισης. Δοκιμάσαμε την δραστικότητα της ISC-4 και 19 FDA-εγκριθεί αντικαρκινικούς παράγοντες, μόνοι ή σε συνδυασμό, έναντι των καρκινικών κυτταρικών σειρών ανθρώπινου κόλον SW480 και RKO. Μια συνεργική αλληλεπίδραση με cetuximab ταυτοποιήθηκε και επικυρωθεί σε ένα πάνελ επιπλέον καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, καθώς επίσης και την κινητική της συνέργειας. ISC-4 σε συνδυασμό με cetuximab μειωμένη συνεργιστικά τη βιωσιμότητα των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου με άγριου τύπου αλλά όχι μεταλλαγμένη

KRAS

γονίδια. Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε ότι η θεραπεία συνδυασμού μειώθηκε συνεργατικά εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, αυξημένη κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση, και μειωμένη φωσφο-Akt σε αποκριτικά κύτταρα όγκου. Η συνέργεια μεταξύ ISC-4 και cetuximab διατηρήθηκε ανεξαρτήτως της επίκτητης αντίστασης σε 5-FU σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Ο συνδυασμός απέδειξε συνεργιστικές επιδράσεις κατά του όγκου

in vivo

χωρίς τοξικότητα και στο πρόσωπο της αντοχής σε 5-FU. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ο συνδυασμός ISC-4 και cetuximab θα πρέπει να διερευνηθεί σε ασθενείς με 5-FU-ανθεκτικό καρκίνο του παχέος εντέρου που φιλοξενούν άγριου τύπου

KRAS

Η

Παράθεση:. Allen JE, Gallant JN, Dicker DT, Αμίν S, Irby RB, Sharma ΑΚ, et al. (2013) Οι Akt αναστολέα ISC-4 συνεργεί με cetuximab σε 5-FU-Resistant του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (3): e59380. doi: 10.1371 /journal.pone.0059380

Επιμέλεια: Abbes Belkhiri, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Νοεμ του 2012? Αποδεκτές: 13 του Φλεβάρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 12, Μάρ 2013

Copyright: © 2013 Allen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις σε WSE-D. και τα κονδύλια από το Ινστιτούτο Penn State Hershey Καρκίνου, ΝΙΗ Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου επιχορήγηση R03-CA143999 να A.K.S., και τη χορήγηση Καρκίνο του Πνεύμονα Ίδρυμα Ερευνών για A.K.S. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν την ανταγωνιστικών συμφερόντων που δρ Ελ-Diery είναι σχετικά με τη συντακτική για PLoS και, όπως ζητήθηκε, να επιβεβαιώσει ότι αυτό δεν μεταβάλλει την προσκόλλησή τους σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Φαινυλαλκυλο isoselenocyanates (διυπηρεσιακών διαβουλεύσεων), οι ισοστερικό ανάλογα σελήνιο του φυσικά ισοθειοκυανικού κατηγορία ενώσεων [1], [2], αναπτύχθηκαν προσφάτως στα εργαστήριά μας και έχουν αποδειχθεί ότι αναστέλλουν δραστικότητα Akt [3], [4], [5], [6]. Μεταξύ των διερευνώνται διυπηρεσιακών διαβουλεύσεων, ISC-4 έχει δείξει την καλύτερη δράση κατά των όγκων σε προκλινικά μοντέλα, τόσο

in vitro

και

in vivo

, με ελπιδοφόρα ασφάλεια [4]. ISC-4 έδειξε μέτρια προκλινική αποτελεσματικότητα εναντίον πολλών τύπων όγκων

in vitro

, και έχουν αποτελέσματα κατά του όγκου έχουν αναφερθεί στο πλαίσιο της μελανώματος όταν ISC-4 χρησιμοποιείται ένα μονο-παράγοντα

in vivo

[4], [5], [6]. ISC-4 έχει επίσης εμφάνισαν σημαντικές επιπτώσεις κατά του όγκου, μέσω της αναστολής της Akt, στο παχύ έντερο ξενομοσχεύματα καρκίνου όταν χρησιμοποιείται ως μονο-παράγοντα και όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) -αν και την κλινική χρησιμότητα των συνδυασμός ήταν ασαφές [5].

ο ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι είναι πάνω-ενεργοποιηθεί ή τροποποιηθεί κατά το μεγαλύτερο μέρος του παχέος εντέρου, η οποία είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται και θανατηφόρο καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες [7]. Το πρότυπο-of-care χημειοθεραπεία για την προχωρημένη νόσο περιλαμβάνει την FOLFOX, ή αγωγές FOLFIRI, οι οποίες αποτελούνται από 5-FU, leucovorin, οξαλιπλατίνη και ιρινοτεκάνη εκτός από άλλες επιλογές θεραπείας, συμπεριλαμβανομένης μονοκλωνικού αντισώματος bevacizumab αντι-VEGF και του αντι -EGFR μονοκλωνικού αντισώματος cetuximab. Αν και αυτές οι επιλογές θεραπείας συνδυασμού έχουν βελτιώσει την επιβίωση των ασθενών, οι επιπλέον μη-τοξικά επιλογές στοχευμένη θεραπεία που απαιτείται στη θεραπεία πυρίμαχα ρύθμιση του προχωρημένου καρκίνου του παχέος εντέρου.

Αν και η προκλινική δραστηριότητα μονο-πράκτορας της ISC-4 είναι σημαντική, η συνδυασμένη θεραπεία δεν έχει πλήρως διερευνηθεί. Ως εκ τούτου, αναζήτησαν συνεργιστικοί συνδυασμοί με ISC-4 χρησιμοποιώντας ένα πάνελ FDA-εγκεκριμένα φάρμακα. Εδώ, αναφέρουμε την ταυτοποίηση ISC-4 και cetuximab ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπεία συνδυασμού που έχει συνεργιστική αντικαρκινική δραστικότητα

in vitro

και

in vivo

κατά ανθρώπινους καρκίνους του παχέος εντέρου που φιλοξενούν ένα άγριου τύπου

KRAS

γονίδιο.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργεια κυττάρων, δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας, και αντιδραστήρια

οι κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την ATCC και καλλιεργήθηκαν σε ATCC- συνιστώμενα μέσα σε υγροποιημένο επωαστή σε 5% CO

2 και 37 ° C. Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη δεν είχαν πιστοποιηθεί. Για δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων με μαύρα τοιχώματα και πλάκες σε συγκέντρωση 1 × 10

5 κυττάρων ανά ml σε φρέσκο ​​μέσο και σε όγκο 100 μL ανά φρεάτιο. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία την επόμενη ημέρα, όπως υποδεικνύεται. Στο τελικό σημείο, CellTiter-Glo (Promega) δοκιμασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και η βιοφωταύγειας ανάγνωσης καταγράφηκε σε ένα σύστημα απεικόνισης IVIS (Xenogen). Για τον συγχρονισμό των κυττάρων, τα κύτταρα επωάστηκαν με 200 ng /mL νοκοδαζόλη για 16 ώρες πριν από τη θεραπεία. Χλωροκίνη ελήφθη από την Sigma. -ίτηκ ελήφθη από την Promega και χρησιμοποιήθηκε σε μία συγκέντρωση εργασίας 25 μΜ. ISC-4 συντέθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6].

Η κυτταρομετρία ροής

Για υπο-G1 ανάλυση περιεχομένου DNA, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία και σταθεροποιήθηκαν σε 80% αιθανόλη στους 4 ° C για τουλάχιστον 30 λεπτά. Σταθερή κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο σε παρουσία ΚΝάσης και αναλύθηκαν σε μία ροή Epics Elite κυτταρόμετρο (Beckman Coulter). Για την έκφραση Ki-67, τα κύτταρα αιθανόλη σταθερό, όπως περιγράφεται παραπάνω, και ανοσοχρώση με αντι-Ki-67 αντίσωμα (Sigma) σε 1:500 για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με Alexafluor 488-συζευγμένο αντίσωμα σε 1:500 σε PBS για 30 λεπτά και επαναιωρήθηκαν σε PBS για ανάλυση.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης, συλλέχθηκαν με απόξεση των κυττάρων, φυγοκεντρήθηκε, και λύθηκαν σε πάγο για 2 ώρες με ρυθμιστικό διάλυμα κυττάρων-λύσεως. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε μετά από φυγοκέντρηση, και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories). Δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν υπό αναγωγικές συνθήκες σε NuPAGE 4-12% γέλες Bis-Tris (Invitrogen), μεταφέρθηκε σε PVDF, και αποκλείστηκε σε 10% άπαχο γάλα σε TBST για 1 ώρα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα που λαμβάνονται από τη Cell Signaling στο 1:1000 σε 2% άπαχο γάλα σε TBST όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι μεμβράνες πλύθηκαν σε TBST, επωάστηκαν με το κατάλληλο συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα (Thermo-Scientific) για 1 ώρα, πλύθηκαν σε TBST, και οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ECL-Plus (Amersham) και φιλμ ακτίνων Χ (Thermo-Scientific).

In vivo

μελέτες

αθυμικά θηλυκά γυμνά ποντίκια (Charles River Laboratories) εμβολιάστηκαν με 1 × 10

6 5-FU, ανθεκτικά RKO ή ΗΤ-29 κύτταρα σε κάθε πίσω πλευρό ως ένα εναιώρημα 200 μι 1:01 Matrigel (BD): PBS. Η θεραπεία άρχισε μόλις οι όγκοι έφθασαν ένα μέσο όγκο ~1650 mm

3, ενδοπεριτοναϊκή ή ενδοφλέβιες ενέσεις δόθηκαν σε έναν συνολικό όγκο 200 μL σε DMSO. Για την ανάλυση του ιστού, ο ιστός συλλέχθηκε από ευθανασία ποντικών και σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 48 ώρες. Ιστός ενσωματωμένες σε παραφίνη και χωρισμένο από το Μηχανισμό Ιστολογίας πυρήνα στο Penn State Ιατρικό Κέντρο Hershey. Η &? Ε χρώση (Daiko) και χρώση TUNEL (Millipore) διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Για τις δοκιμασίες χημεία ορού, 1 ml αίματος συλλέχθηκαν από αναισθητοποιημένα ποντίκια με καρδιακή παρακέντηση τερματικό της αριστερής κοιλίας. Για χημεία ορού, 500 μL τοποθετήθηκε σε ένα σωλήνα μικροφυγοκέντρου και αφέθηκε να πήξει για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και ακολούθησε φυγοκέντρηση. Ο ορός αφαιρέθηκε, φυγοκεντρήθηκε και πάλι για να αφαιρέσετε τυχόν επιπλέον συντρίμμια, και υποβλήθηκαν για ανάλυση από το Διαγνωστικό Εργαστήριο Συγκριτικής Ιατρικής στο Penn State Ιατρικό Κέντρο Hershey. Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Animal Care and Use (IACUC) στο Penn State Hershey Medical Center.

Στατιστικά

συγκρίσεις κατά ζεύγη αξιολογήθηκαν από την Φοιτητών δύο -ουράς t-test στο Microsoft Excel. δείκτες συνδυασμό υπολογίστηκαν με λογισμικό CalcuSyn (Biosoft) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Chou-Talalay [8].

Αποτελέσματα

Ορισμός η ISC-4

in vitro

προφίλ δραστηριότητα

Δοκιμάσαμε το μονο-παράγοντα

in vitro

δραστικότητα της ISC-4 σε μία ομάδα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών για να χαρακτηρίσει το φάσμα της δραστηριότητάς της. Μεταξύ των δοκιμασμένων κυτταρικών γραμμών, οι ανθρώπινου λεμφώματος κυτταρικές γραμμές Daudi και Granta ήταν το πιο ευαίσθητο, και ο ανθρώπινος καρκίνος του προστάτη κυτταρικές γραμμές PC3 και DU145 ήταν η λιγότερο ευαίσθητη από την άποψη του ΕΚ

50 τιμές (Σχ. 1Α). Με την εξαίρεση των ΗΤ-29, ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου ήταν μετρίως ευαίσθητα σε ISC-4 θεραπεία. Οι ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές HCT116 δείχνουν ότι η ISC-4 δραστηριότητα είναι πιθανό ρ53- και Bax-ανεξάρτητη. Προκειμένου να χαρακτηρίσει καλύτερα τις θεραπευτικές επιδράσεις της ISC-4 και, ενδεχομένως, τη βελτίωση της συνδυαστικής δράσης της, επικεντρωθήκαμε στη μελέτη της ISC-4 στον καρκίνο του παχέος εντέρου, λόγω της δραστηριότητας μέτριας μονο-agent [5].

( Α) κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασίες και υπολογίστηκε ΕΚ

50 τιμές για ενδεικνυόμενη κυτταρικές γραμμές που έλαβαν θεραπεία με ISC-4 ή DMSO (72 ώρες, η = 3). Επίδραση της ISC-4 μεταχείριση προφίλ του κυτταρικού κύκλου της σύγχρονης και ασύγχρονης (Β) HCT116 και (C) ΗΤ-29 κυτταρικές σειρές. Τα Ασύγχρονης κύτταρα υποδεικνύονται με Α στο σχήμα. (D) περιεκτικότητα Sub-G1 του υποδεικνύεται κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου εξής ISC-4 θεραπεία (0, 1, 2, 4, 8, ή 16 μΜ).

Η ανάλυση

κυτταρικού κύκλου του ISC-4 κατεργασμένους συγχρονισμένη ΗΤ-29 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου HCT116 και απεκάλυψε μία μέτρια αύξηση στην περιεκτικότητα υπο-G1 και μείωση στο ρυθμό της προόδου του κυτταρικού κύκλου (σχ. 1Β-C). ISC-4-επαγόμενη περιεχόμενο υπο-G1 είναι δοσοεξαρτώμενη και γενικά γίνεται εμφανής στο & gt? 8 μΜ (Εικ. 1 D). Έτσι, ISC-4 έχει μέτρια μόνο δράση παράγοντα έναντι ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου προκαλώντας κυτταρικό θάνατο και μια μείωση στον πολλαπλασιασμό.

Αναγνώριση συνεργιστική συνδυασμό με την ISC-4

Ψάξαμε για συνεργιστική συνδυασμούς του ISC-4 με εγκεκριμένη από την FDA θεραπείες για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας της ISC-4 έναντι του καρκίνου του παχέος εντέρου. Έχουμε επιλέξει τα ανθρώπινα κόλον καρκινικές κυτταρικές σειρές SW480 και RKO για την αρχική προφίλ βασίζεται σε ετερογενή ογκογόνο γενετικές αλλοιώσεις τους. SW480 έχει μεταλλαγμένο

p53

, μεταλλαγμένο

KRAS

και άγριου τύπου

BRAF

ενώ RKO έχει άγριου τύπου

p53

, άγριου τύπου

KRAS

, και μεταλλαγμένα

BRAF

γονίδια [9]. Μεταξύ δοκιμίου του χημειοθεραπείες και παράγοντες στόχοι, συνδυαστικές δραστικότητα παρατηρήθηκε σε τουλάχιστον μία κυτταρική σειρά όταν ISC-4 συνδυάστηκε με sorafenib, gefitinib, γεμκιταβίνη, σισπλατίνη, bortezomib, imatinib, ή cetuximab (Σχήμα 2? Πίνακες S1, S2) . Ωστόσο, ο συνδυασμός του ISC-4 και cetuximab ήταν το μόνο συνεργιστική συνδυαστική θεραπεία που παρατηρήθηκε κάτω από τις εξετασθείσες συνθήκες. Επιπλέον, αυτή η συνέργια παρατηρήθηκε μόνο στην κυτταρική σειρά RKO, που φιλοξενεί άγριου τύπου

KRAS

, και όχι στην κυτταρική σειρά SW480 που φιλοξενεί

KRAS

G12V

. Αυτή η παρατήρηση είναι σύμφωνη με την απαίτηση του άγριου τύπου

KRAS

για την κλινική αποτελεσματικότητα του cetuximab στον καρκίνο του παχέος εντέρου [10], [11].

δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας σε SW480 και RKO του παχέος εντέρου καρκινικές κυτταρικές γραμμές που έλαβαν θεραπεία με ISC-4 (1, 2, ή 4 μΜ) και υποδεικνύεται θεραπείες σε υποθετικές ΕΚ

12,5, ΕΚ

25, και ΕΚ

50 μεμονωμένα και σε συνδυασμό (n = 3). Οι δόσεις παρέχονται στον Πίνακα S1.

Η

ISC-4 και cetuximab αναστέλλει συνεργικά άγριου τύπου KRAS πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

Είμαστε αξιολόγησε την συνεργιστική δράση της ISC-4 και cetuximab σε διάφορα ανθρώπινα κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. Σύμφωνα με την προηγούμενη παρατήρηση μας, συνεργική δράση παρατηρήθηκε μόνο σε ΗΤ-29 και κυτταρικές σειρές RKO, τα οποία έχουν άγριου-τύπου

KRAS

γονίδια, και όχι σε HCT116, άλλες κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου DLD-1, και με μεταλλαγμένο

KRAS

γονίδια (Σχήμα 3Α?. Πίνακας S3? δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι ενδιαφέρον ότι η συνεργιστική αλληλεπίδραση μεταξύ ISC-4 και cetuximab φαίνεται να είναι δοσο-εξαρτώμενη σχέση με τη συγκέντρωση ISC-4, αλλά ανεξάρτητη από τη συγκέντρωση cetuximab. Για την αξιολόγηση αυτή συνδυαστική δράση σε μια κλινικά σχετική ρύθμιση, ελέγξαμε την συνεργική αποτελεσματικότητα της ISC-4 και cetuximab σε RKO κλώνων με εξελιγμένη αντοχή σε 5-FU. Επειδή 5-FU είναι μια θεραπεία πρότυπο-of-care για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου, θεραπείες που προσφέρουν όφελος σε 5-FU ανθεκτικό καρκίνο του παχέος εντέρου είναι απαραίτητα στην κλινική. Η συνεργιστική δράση της ISC-4 και cetuximab διατηρήθηκε παρά αποκτήθηκε 5-FU-αντίσταση στα δοκιμάστηκαν καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα (Σχ. 3Β-C). Μαζί, αυτά τα δεδομένα προσδιορίζουν 5-FU-ανθεκτικό καρκίνο του παχέος εντέρου με άγριου τύπου

KRAS

γονίδια ως κατάλληλο κλινικό περιβάλλον που μπορούν να επωφεληθούν από την ISC-4 και cetuximab συνδυαστική θεραπεία.

(Α) δοκιμές βιωσιμότητας των κυττάρων των ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών καρκίνου του κόλου σε επεξεργασία με ISC-4 και cetuximab στην υποδεικνυόμενη δόσεις για 72 ώρες (η = 3). (Β) κυτταρική ανάλυση βιωσιμότητας του αγρίου τύπου και 5-FU-ανθεκτικά κύτταρα RKO επεξεργάστηκε με 5-FU, όπως υποδεικνύεται για 24 ώρες (η = 3). (Γ) 5-FU-ανθεκτικά κύτταρα RKO σε επεξεργασία με ISC-4 (2 μΜ) και cetuximab (1 μg /mL) για 24 ώρες (η = 3).

Η

Προσδιορίσαμε την κινητική της η παρατηρηθείσα συνεργική αποτελεσματικότητα και βρήκε τέτοια δραστηριότητα ήδη 8 ώρες μετά τη θεραπεία, με μεγαλύτερη συνέργεια στις 12 ώρες (Σχ. 4Α). Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι η συνεργιστική δράση της ISC-4 και cetuximab είναι ίσως κυτταροτοξική παρά κυτταροστατική. Αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων, καθώς επίσης και φθορίζουσα επισήμανση του DNA, των επεξεργασμένων καρκινικών κυττάρων αποκάλυψε ότι η ISC-4 και συνδυασμός cetuximab κατεργασία προκαλεί εμφανή κατάτμησης DNA (Σχήμα 4Β?. Εικ. S1 Α). Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε ότι ο συνδυασμός του ISC-4 και cetuximab συνεργατικά και να αυξήσουν σημαντικά το περιεχόμενο υπο-G1 σε σύγκριση με τα μονο-παράγοντες, αλλά η συνδυαστική περιεχόμενο υπο-G1 δεν ήταν επαρκής για να εξηγήσει πλήρως την παρατηρούμενη συνεργία (Εικ. 4C). ISC-4-επαγόμενη περιεχόμενο υπο-G1 ανεστάλη σημαντικά με συν-επώαση με τον αναστολέα κασπάσης-pan-ίτηκ, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο συνδυασμός επάγει κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση. Στην υποστήριξη αυτής της παρατήρησης, ο συνδυασμός της ISC-4 και cetuximab συνεργικά επάγεται κασπάσης-3 ενεργοποίησης (Εικ. 4D).

(Α) προσδιορισμοί κυττάρων βιωσιμότητα των κυττάρων RKO σε επεξεργασία με ISC-4 (2 μΜ ) και cetuximab (1 μg /mL) μόνη ή σε συνδυασμό για την αναφερόμενη χρονική περίοδο (n = 3). (Β) χρώση ϋΑΡΙ των κυττάρων RKO επεξεργασία όπως στο (Α) για 12 ώρες. Λευκά βέλη δείχνουν κυττάρων με κατακερματισμένο DNA. (Γ) Περιεκτικότητα σε Υπο-G1 κυττάρων RKO σε επεξεργασία με ISC-4 (2 μΜ) και cetuximab (1 μg /mL) μόνη ή σε συνδυασμό για 12 ώρες (η = 3). *

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με όλες τις ομάδες θεραπείας με αμφίπλευρη

t

test του Student. (D) κασπάση-Glo δοκιμασία των κυττάρων RKO σε επεξεργασία με ISC-4 (2 μΜ) σε συνδυασμό με cetuximab (0, 0,25, 0,5, ή 1 μg /mL) σε 24 ώρες μετά τη θεραπεία. Κάτω πάνελ δείχνει ποσοτικοποίηση της ISC-4 (2 μΜ) και cetuximab (1 μg /mL) (η = 3).

Η

ανάλυση κηλίδος Western αποκάλυψε ότι ISC-4 σε συνδυασμό με cetuximab μειώνει συνεργατικά φωσφο -Akt επίπεδα, αλλά όχι φωσφο-ΕΚΚ, σε ένα πολύ μέτριο επίπεδο στις 24 ώρες μετά τη θεραπεία (Εικ. 5Α). Ωστόσο, μια ανάλυση χρονικής πορείας έδειξε ότι ο συνδυασμός συνεργατικά αποκόπτεται phosho-Ακί επίπεδο το ταχύτερο 4 ώρες μετά τη θεραπεία (Εικ. 5Β). Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου που έδειξαν μια συνεργιστική απόκριση προς ISC-4 και cetuximab απάντησε επίσης με σημαντική μείωση του φωσφο-Ακί (Εικ. 5C). Ωστόσο, οι ανθρώπινες καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν μεταλλαγμένο KRAS που δεν ανταποκρίνονται σε συνέργεια για τη θεραπεία συνδυασμού επίσης δεν εμφανίζουν οποιεσδήποτε αλλαγές στη φωσφο-Akt επίπεδα σε απόκριση στη θεραπεία. Έτσι, φωσφο-Akt επίπεδα φαίνεται να συσχετίζονται με την αντικαρκινική απόκριση προς ISC-4 και cetuximab. Καμία επίδραση επί Ki-67 έκφραση ή διάσπασης LC3B, ένας δείκτης της αυτοφαγία, παρατηρήθηκε με το συνδυασμό (Εικ. S1B-D). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι το χτένισμα ISC-4 με cetuximab οδηγεί σε μια συνεργατική μείωση στα φωσφο-Ακί και τη βιωσιμότητα των κυττάρων, οι οποίες συνοδεύονται από αυξημένη απόπτωση.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των κυττάρων RKO σε επεξεργασία με ISC-4 (2 μΜ) και cetuximab (1 μg /mL) μόνη ή σε συνδυασμό για 24 ώρες. Πυκνομετρία φωσφο-Ακί επίπεδα φαίνονται πάνω από την κηλίδα ως κανονικοποιημένη προς Ran ως σχέση με τον έλεγχο της θεραπείας. (Β) ανάλυση κηλίδας Western των κυττάρων RKO σε επεξεργασία με ISC-4 (2 μΜ) και cetuximab (1 μg /mL) μόνη ή σε συνδυασμό για συγκεκριμένες χρονικές περιόδους. Ran παρουσιάζεται ως έλεγχος φόρτωσης. (C) Ανάλυση Western blot των υποδεικνύεται καρκινικών κυτταρικών σειρών ανθρώπινου κόλον μετά από αγωγή με το συνδυασμό (Rx) του ISC-4 (2 μΜ) και cetuximab (1 μg /mL) για 8 ώρες. *

P

& lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

ISC-4 και cetuximab ασκούν συνεργιστικά αποτελέσματα αντι-όγκου χωρίς τοξικότητα

in vivo

Η

με σκοπό να μιμηθεί πιθανό κλινικό περιβάλλον και τη χρησιμότητά του, δοκιμάσαμε την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου της ISC-4 σε συνδυασμό με cetuximab σε προχωρημένο 5-FU ανθεκτικά RKO υποδόρια ξενομοσχεύματα. Σε αυτή τη ρύθμιση, βρήκαμε ότι η θεραπεία συνδυασμού έχει μία συνεργιστική επίδραση στην αρχική της προόδου όγκου και προκάλεσε στάση όγκου για την πρώτη εβδομάδα της θεραπείας (Εικ. 6Α). ανάλυση ιστού αποκάλυψε ότι ξενομοσχεύματα που λαμβάνουν τη θεραπεία συνδυασμού είχαν υψηλότερα επίπεδα νέκρωση με ιστολογία και την απόπτωση με χρώση TUNEL από ξενομοσχεύματα που λαμβάνει κάθε παράγοντα ξεχωριστά (Σχήμα 6Β?. Εικ. S2A). Η θεραπευτική δοσολογία που χρησιμοποιείται σε αυτές τις μελέτες ήταν καλά ανεκτή και δεν μετέβαλε ποντίκι σωματικό βάρος ή μεταβολή της ιστολογίας του ήπατος (Εικ. S2B-C).

(Α) τα σχετικά μεγέθη του όγκου της 5-FU ανθεκτικά RKO ξενομοσχεύματα σε 4 ημέρες μετά την αγωγή με μια μονή δόση του ISC-4 (3 mg /kg, ip), cetuximab (10 mg /kg, ίν), ή ο συνδυασμός (n≥5). Ατομική όγκοι ρυθμίζεται σύμφωνα με τους μέγεθος βάσης μετράται κατά την ημέρα 0. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με όλες τις ομάδες που έλαβαν αγωγή με τη χρήση του Student δύο ουρών

t

τεστ. (Β) με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση και TUNEL χρώση των όγκων ξενομοσχεύματος συγκομίζονται 24 ώρες μετά τη θεραπεία. (Γ) προσβεβλημένους από αθυμία θηλυκούς γυμνούς ποντικούς που φέρουν εγκατεστημένος ΗΤ-29 όγκους ξενομοσχεύματος υποβλήθηκαν σε αγωγή με ISC-4 (3 mg /kg, iv), το cetuximab (10 mg /kg, iv), ο συνδυασμός, ή cetuximab και 5-FU (25 mg /kg, iv) μία φορά την εβδομάδα ξεκινώντας από την ημέρα 0 (n≥8). Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν SEM των αντιγράφων. *

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

επόμενο διερευνηθεί ο συνδυασμός της ISC-4 και cetuximab σε ΗΤ-29 ξενομοσχεύματα σε ποντικούς σε σύγκριση με monoagents και ο συνδυασμός των. cetuximab και 5-FU. Βρήκαμε ότι η ISC-4 και cetuximab μείωσε έντονα την εξέλιξη του όγκου, σε αντίθεση με τις monoagents, όταν χορηγείται ως εβδομαδιαίως ενδοφλέβιες δόσεις που ήταν κατάφωρα προφανές από τον όγκο του όγκου και οι μετρήσεις βάρους του όγκου (Σχήμα 6C?. Σχ. S2D). Επιπλέον, ο συνδυασμός επέδειξε υπέρτερα αντικαρκινική δραστικότητα σε σύγκριση με το συνδυασμό 5-FU και cetuximab υπό αυτές τις πειραματικές συνθήκες. Ο συνδυασμός αυτός πάλι καλά ανεκτή (Εικ. S2E) και επιπλέον, η ανάλυση της χημείας του ορού δεν αποκάλυψε σημαντικές αλλαγές σε ηλεκτρολύτες, η ηπατική λειτουργία, ή άλλων μοριακών δεικτών που σχετίζονται με τα νεφρά ή καρδιακή τοξικότητα με χρόνια χορήγηση (Πίνακας S4). Αθροιστικά, αυτά τα δεδομένα αποτελεσματικότητας και ασφάλειας δείχνουν ότι η συνδυαστική δράση του cetuximab και ISC-4 θα πρέπει να αξιολογηθεί σε μελλοντικές κλινικές δοκιμές με 5-FU-ανθεκτικό καρκίνο του παχέος εντέρου που φιλοξενούν άγριου τύπου

KRAS

γονίδια.

Συζήτηση

ISC-4 είναι ένας πολλά υποσχόμενος αναστολέας Akt που έχει επιδείξει δραστικότητα κατά του όγκου σε διάφορες προκλινικές μελέτες [3], [4], [5]. Η παρατηρούμενη συνεργία μεταξύ ISC-4 και cetuximab ως θεραπεία συνδυασμού επιτρέπει ISC-4 να ασκήσουν κυτταροτοξικότητα σε χαμηλές μικρομοριακές δόσεις έναντι ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, η οποία μπορεί να είναι μια πιο επιτεύξιμη δόση

in vivo

. Ο συνδυασμός φαίνεται να επάγει αυξημένα επίπεδα απόπτωσης τόσο

in vitro

και

in vivo

, αν και άλλοι μηχανισμοί κατά του όγκου μπορεί να συμβάλει στη συνέργεια. Αυτή η παρατήρηση είναι σύμφωνη με την προηγούμενη διαπίστωση που perifosine, ενός αναστολέα της PI3K /Akt, συνεργεί με παράγοντες που αναστέλλουν EGFR, όπως το cetuximab [12]. Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να συγκρίνετε ISC-4 μόνο με perifosine και σε συνδυασμό με cetuximab να προσδιοριστεί η σχετική ισχύς και το δυναμικό τους ως νέες θεραπείες για τον καρκίνο του ανθρώπου.

Οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να εξετάσει υποκείμενων μηχανισμών της συνέργειας μεταξύ των δύο παραγόντων. Ειδική προσοχή πρέπει να δοθεί στην συνδυαστική επίδραση επί φωσφο-Akt, η οποία χρησιμεύει ως δείκτης θεραπευτική απόκριση στον συνδυασμό και μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε μελλοντικές κλινικές δοκιμές. Είναι ενδιαφέρον ότι, η συνέργεια μεταξύ των δύο αυτών παραγόντων παρατηρήθηκε σε ΗΤ29 και RKO κύτταρα, τα οποία έχουν μεταλλαγμένα γονίδια BRAF και PIK3CA που θα επιδράσει θετικά στην Akt δραστηριότητα. Συνδυαστική

in vitro

δραστηριότητα παρατηρήθηκε για ISC-4 με πολλές άλλες εγκεκριμένες στοχευμένων παραγόντων και χημειοθεραπείες, αν και δεν είναι συνεργιστική, και χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. Η δραστηριότητα της ISC-4 εναντίον λέμφωμα θα πρέπει να διερευνήθηκε περαιτέρω λόγω του σχετικά ισχυρό

in vitro

δραστηριότητας για μονοθεραπεία ISC-4 που παρατηρήσαμε κατά κυτταρικών σειρών λεμφώματος. Το p53-ανεξάρτητη δραστηριότητα της ISC-4 και η διατήρηση της συνέργιας με cetuximab σε 5-FU-ανθεκτική νόσο είναι ευοίωνες για την κλινική χρησιμότητα της ISC-4. Αρκετές χημειοθεραπείες, συμπεριλαμβανομένων των 5-FU, έχουν ρ53-εξαρτώμενη κυτταροτοξικά αποτελέσματα επί των κυττάρων του όγκου, και, ως εκ τούτου, η χημειοθεραπεία ανθεκτική ασθένεια συνήθως προκύπτει κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου λόγω της συχνής αδρανοποίηση του καταστολέα όγκου ρ53 [13].

Εκτός από την στάση του όγκου που επάγεται από τη θεραπεία συνδυασμού ISC-4 και cetuximab σε 5-FU-ανθεκτικών όγκων, θα πρέπει να σημειωθεί ότι η θεραπευτική αγωγή δοσολόγησης ήταν πολύ καλά ανεκτή. Αυτό αποτελεί καλό οιωνό για τη χρήση του σε ασθενείς με προχωρημένη νόσο, πολλοί από τους οποίους δεν είναι σε θέση να ανεχθεί σκληρές θεραπείες. Η θεραπευτική δραστικότητα σε 5-FU ανθεκτικά προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου είναι πολλά υποσχόμενη και μπορεί να ωφεληθούν από την προσθήκη άλλων που χρησιμοποιούνται συνήθως θεραπείες στο πλαίσιο της διαχείρισης καρκίνου του παχέος εντέρου, όπως η οξαλιπλατίνη. Το cetuximab έχει δειχθεί να αποκαταστήσει οξαλιπλατίνη ευαισθησία σε πυρίμαχα καρκινικά κύτταρα κόλου και μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική ευκαιρία [14]. Κλινικά δεδομένα υποστηρίζουν επίσης το συνδυασμό του cetuximab με ιρινοτεκάνη σε ιρινοτεκάνη-ανθεκτική νόσο [15].

Με δεδομένη την αποδεδειγμένη αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια αυτού του συνδυασμού, κλινική έρευνα της ISC-4 σε συνδυασμό με cetuximab δικαιολογείται σε ασθενείς με άγριου τύπου

KRAS

γονίδια, όπως απαιτείται για την τυπική θεραπεία με cetuximab [11]. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η βιοψία θα πρέπει να λαμβάνονται αμέσως πριν από την έναρξη της θεραπείας για να εξασφαλιστεί KRAS είναι άγριου τύπου, όπως ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου μπορεί να εξελιχθεί μεταλλάξεις KRAS κατά τη διάρκεια της θεραπείας με cetuximab που προκαλεί αντίσταση [16]. Περαιτέρω εφαρμογή της φωσφο-Ακί, ως βιοδείκτη της απόκρισης μπορεί να αποδειχθεί χρήσιμη στο μέλλον δοκιμή μέσω βιοψίες ή ανάλυση των κυκλοφορούντων κυττάρων του όγκου [17], [18] του όγκου. Αυτή η προκλινική μελέτη υποστηρίζει ότι ο συνδυασμός μπορεί να προσφέρει ένα ασφαλές θεραπευτικό όφελος για την αντιμετώπιση της αντίστασης 5-FU για ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου που χρειάζονται περισσότερες επιλογές θεραπείας.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

ISC-4 και ο συνδυασμός θεραπείας με cetuximab δεν μειώνεται Ki-67 έκφρασης ή επάγουν αυτοφαγία. (Α) μικροσκοπία αντίθεσης φάσης των κυττάρων RKO σε επεξεργασία με ISC-4 (2 μΜ) και cetuximab (1 μg /mL) μόνη ή σε συνδυασμό για 12 ώρες. (Β) (Β) Η κυτταρομετρία ροής και (Γ) ανάλυση Western bot του Ki-67 έκφραση σε κύτταρα RKO σε επεξεργασία με ISC-4 (2 μΜ) και cetuximab (1 μg /mL) μόνο ή σε συνδυασμό όπως προσδιορίζεται με. (D) ανάλυση κηλίδας Western των κυττάρων RKO σε επεξεργασία με ISC-4 (2 μΜ) και cetuximab (1 μg /mL) μόνη ή σε συνδυασμό για 24 ώρες. Η χλωροκίνη (C? 10 μΜ) περιλαμβάνεται ως θετικός μάρτυρας για αυτοφαγία. Βήτα ακτίνης παρουσιάζεται ως έλεγχος φόρτωσης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0059380.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

ISC-4 και το συνδυασμό cetuximab θεραπεία είναι ασφαλής και ασκεί συνεταιριστική δράση κατά των όγκων. (Α) Ποσοτικοποίηση της χρώσης TUNEL σε ξενομοσχεύματα όγκου που περιγράφεται στο Σχήμα 6Β (n = 10). (Β) Μεταβολή του σωματικού βάρους των ποντικών που έλαβαν ISC-4 (3 mg /kg, ε.π.), cetuximab (10 mg /kg, ενδοφλεβίως), ή τον συνδυασμό (n≥5) δύο φορές την εβδομάδα για 2 εβδομάδες. Οι μεταβολές βάρους σώματος εκφράζεται σε σχέση με το σωματικό βάρος του κάθε επιμέρους ποντικό πριν από την αγωγή την ημέρα 0 (n≥3). (Γ) Η &? Ε χρώση του ιστού του ήπατος που συλλέχθηκαν από ποντικούς σε 24 ώρες μετά τη θεραπεία με ISC-4 (3 mg /kg, ε.π.), cetuximab (10 mg /kg, ενδοφλεβίως), ή τον συνδυασμό. (D) Terminal όγκο του όγκου και του βάρους του όγκου για ΗΤ-29 ξενομοσχεύματος περιγράφεται στο Σχήμα 6C. κοόρτεις Θεραπεία περιλαμβάνεται ISC-4 (3 mg /kg, iv), το cetuximab (10 mg /kg, iv), ο συνδυασμός, ή cetuximab και 5-FU (25 mg /kg, iv) μία φορά την εβδομάδα (n≥8) . (Ε) Ποντίκι του σωματικού βάρους κατά το τελικό σημείο, η οποία ήταν τρεις ημέρες μετά την τελευταία δόση (n≥8). Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν SEM των αντιγράφων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0059380.s002

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1.

δόσεις επιλέγονται για τις εγκεκριμένες αντικαρκινικών παραγόντων σε συνδυασμό με την ISC-4. ΕΚ

12,5, ΕΚ

25, και ΕΚ

50 τιμές υπολογίστηκαν από τη βιβλιογραφία και οι δόσεις που χρησιμοποιούνται σε πειράματα που περιγράφονται στο σχήμα. 2.

doi: 10.1371 /journal.pone.0059380.s003

(XLSX)

Πίνακας S2.

Περίληψη της συνδυαστικής επιπτώσεις της TIC10 με εγκεκριμένα αντικαρκινικών παραγόντων. Συνδυαστική δραστηριότητα συγκρίθηκαν με τις δραστηριότητες monoagent με προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας και προσδιορίσθηκε να είναι συνεργάσιμα (-) (?), Συνεργατική (+), συνεργιστική (*), ή διφορούμενη. Οι συνδυασμοί εκτίθενται συνεταιριστική δραστηριότητα σε τουλάχιστον μία κυτταρική σειρά επισημαίνονται με κίτρινο χρώμα, ενώ η πράσινη επισήμανση υποδεικνύει συνέργεια

doi:. 10.1371 /journal.pone.0059380.s004

(XLSX)

Πίνακα S3.

δείκτες συνδυασμός για την ISC-4 και cetuximab σε άγριου τύπου κυτταρικές σειρές καρκίνου του ανθρώπινου παχέος εντέρου KRAS. Συνδυαστική δράση στην RKO και ΗΤ-29 κυτταρικές σειρές ποσοτικά στο Σχήμα 3Α εκτιμήθηκε με τη μέθοδο Chou-Talalay

doi:. 10.1371 /journal.pone.0059380.s005

(XLSX)

Πίνακας S4.

προφίλ χημεία του ορού των ποντικών που έλαβαν ISC-4 και ο συνδυασμός θεραπείας με cetuximab. Τα αθυμικά, γυναίκα ηλικίας 8 εβδομάδων γυμνά ποντίκια έλαβαν ISC-4 (3 mg /kg, ε.π.), cetuximab (10 mg /kg, ενδοφλεβίως), ή τον συνδυασμό (n≥5) δύο φορές την εβδομάδα για 2 εβδομάδες. Ορός συλλέχθηκε 2 ημέρες μετά την τελευταία δόση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0059380.s006

(XLSX)

Ευχαριστίες

W.S. El-Deiry είναι μια αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία Έρευνας καθηγητής.