Αφηρημένο

Η πολυφαρμακευτική αντίσταση καθοδηγείται από τους μεταφορείς μεμβράνης ABC είναι ένας από τους σημαντικότερους λόγους για την αποτυχία της θεραπείας στον άνθρωπο μοχθηρία. Μερικά περιορισμένα στοιχεία έχει ήδη αναφερθεί στην εξάρτηση του κυτταρικού κύκλου της έκφρασης ABC μεταφορέα. Ωστόσο, δεν έχει ποτέ αποδειχθεί ότι η λειτουργική δράση αυτών των μεταφορέων συσχετίζεται με τη θέση του κυτταρικού κύκλου. Εδώ, μελετήσαμε το ποσοστό της εγγενούς μεταφοράς ABC σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου σε καλλιεργημένα κύτταρα MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού. Ο ρυθμός χαρακτηρίζεται από την άποψη της κινητικής εκροής από κύτταρα φορτωμένα με ένα υπόστρωμα μεταφορέα ABC. Καθώς το μέσο όρο των κινητική πάνω από ένα κυτταρικό πληθυσμό θα μπορούσε να οδηγήσει σε λάθη, μελετήσαμε κινητική του ABC μεταφορών στο επίπεδο του ενός κυττάρου. Βρήκαμε ότι το ποσοστό των ABC μεταφοράς στα κύτταρα MCF-7 θα μπορούσε να περιγραφεί με κινητική Michaelis-Menten με δύο κλασικές παραμέτρους,

V

max και

K

M. Κάθε μία από αυτές τις παραμέτρους έδειξε παρόμοια μονότροπη κατανομές με διαφορετικές θέσεις των μέγιστων αριθμών κυττάρων υποπληθυσμών στις 2γ και 4γ κράτη. Σε σύγκριση με τα κύτταρα 2γ, τα κύτταρα 4γ παρουσίασαν μεγαλύτερη

V

max τιμές, υποδεικνύοντας υψηλότερο

δραστηριότητα

των μεταφορών. Θα εκτεθούν επίσης μεγαλύτερη

V

max /

K

αναλογία Μ, υποδεικνύοντας υψηλότερο

αποτελεσματικότητα

των μεταφορών. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι κυτταρικό κύκλο που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση των MDR μπορεί να χρειαστεί να ληφθούν υπόψη κατά το σχεδιασμό χημειοθεραπευτικά σχήματα που περιλαμβάνουν κυτταροστατικά μέσα

Παράθεση:. Koshkin V, Krylov SN (2012) Συσχέτιση μεταξύ Multi-Drug με αντοχή Associated μεμβράνης μεταφοράς στην Κλονική καρκινικά κύτταρα και η φάση του κυτταρικού κύκλου. PLoS ONE 7 (7): e41368. doi: 10.1371 /journal.pone.0041368

Επιμέλεια: Henning Ulrich, Πανεπιστήμιο του Σάο Πάολο, Βραζιλία

Ελήφθη: 12η Απριλίου 2012? Αποδεκτές: 20 Ιουν 2012? Δημοσιεύθηκε: 25, Ιουλ 2012

Copyright: © 2012 Koshkin, Krylov. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Πηγή χρηματοδότηση: Φυσικών Επιστημών και Μηχανικής Συμβούλιο Έρευνας του Καναδά (https://www.nserc-crsng.gc.ca/), αριθμός Grant: 238.990 έως 1011. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ένα από τα κύρια προβλήματα στη θεραπεία του καρκίνου είναι η μειωμένη ή καταργηθεί ανταπόκριση του όγκου σε χημειοθεραπείες, η οποία συνδέεται με το λεγόμενο πολυφαρμακευτική αντίσταση (MDR)

1, οδηγείται από μια υπεροικογένεια ΑΤΡ-σύνδεσης κασέτα (ABC) μεταφορείς μεμβράνης πλάσματος [1]. Αυτές οι μεταφορείς ABC εκτελούν ενεργειακά εξαρτώμενες προς τα έξω μεταφορά ενός ευρέος φάσματος ξενοαντιγόνων και ενδο-κά από κύτταρα? ειδικότερα, αντικαρκινικά φάρμακα από τα καρκινικά κύτταρα. Οι προσπάθειες για τον έλεγχο της MDR σε καρκινικά κύτταρα έχουν, μέχρι στιγμής, δεν παράγονται κλινικά αξιόλογα αποτελέσματα.

είχε προταθεί προηγουμένως ότι πολυφαρμακευτική αντίσταση συσχετίζεται με τη θέση ενός κυττάρου στον κυτταρικό κύκλο [2]. Η συσχέτιση αυτή μπορεί να είναι χρήσιμη για την τρέχουσα χημειοθεραπείες που συνδυάζουν τόσο κυτταροτοξικών και κυτταροστατικών παραγόντων [3], να ευνοούν την συσσώρευση των καρκινικών κυττάρων σε μία ή την άλλη φάση του κυτταρικού κύκλου. Η κατανόηση της σχέσης μεταξύ MDR και του κυτταρικού κύκλου είναι απαραίτητη για να διασφαλιστεί ότι τα κύτταρα δεν έχουν ζητηθεί σε μια κυτταροτοξίνη ανθεκτικό φάση του κυτταρικού κύκλου.

Η τρέχουσα στοιχεία που συνδέουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου με MDR είναι αποσπασματικά ή ελλιπή και παρουσίασε ως επί το πλείστον από στοιχεία συσχέτισης μεταξύ των φάσεων του κυτταρικού κύκλου και τα επίπεδα έκφρασης ορισμένων μεταφορείς ABC [2], [4], [5]. Τα δεδομένα έκφρασης μπορεί να μην είναι καθοριστική, όπως MDR ικανότητα σε καρκινικά κύτταρα δεν καθορίζεται μόνο από την έκφραση των μεταφορέων μεμβράνης πλάσματος της οικογένειας ABC, αλλά από ένα πλήθος άλλων παραγόντων, συμπεριλαμβανομένης της σύνθεσης και του ρευστού κατάσταση του πλασματικής μεμβράνης, η παρουσία σχετικής συμπαράγοντες, ρυθμιστές, κ.λ.π. Έτσι, η ευρέως χρησιμοποιούμενη αξιολόγηση της ικανότητας MDR μέσω της ανάλυσης έκφραση μεταφορέα βρέθηκε να είναι αναξιόπιστες σε ορισμένες περιπτώσεις [6] – [8]. Η δουλειά μας υποκινήθηκε από την αντίληψη ότι η άμεση κινητικές μετρήσεις της MDR μεταφορών θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως απόλυτη ένδειξη της κυτταρικής χημειοαντίσταση. Υποθέσαμε ότι η εξέλιξη των κυττάρων διαμέσου του κυτταρικού κύκλου μπορεί να συνοδεύεται με μια διαμόρφωση σε κινητική αποβολής του φαρμάκου – ένα καθαρό αποτέλεσμα του κυτταρικού κύκλου που σχετίζονται πρωτεομική, μεμβράνη, και μεταβολικές αλλαγές στο κύτταρο. Σε μια προσπάθεια να αποκαλύψουν λεπτές μεσοκυττάριο διακρίσεις σε δραστηριότητα MDR, αναπτύξαμε πρόσφατα μια προσέγγιση μονού κυττάρου-κινητική και απέδειξαν υψηλή ευαισθησία για την ανίχνευση του διακυτταρική παραλλαγή μεταφοράς μεμβράνης [9]. Εδώ παρουσιάζουμε μια λεπτομερή μελέτη της διαμόρφωσης του κυτταρικού κύκλου των MDR μεταφορών, χρησιμοποιώντας την προσέγγιση μονοκύτταρους-κινητικής (Εικ. 1). Παρέχει λειτουργικά μαρτυρία για τον κυτταρικό κύκλο που σχετίζονται με ρύθμιση της δραστικότητας MDR και υποδηλώνει ότι το αποτέλεσμα αυτό θα πρέπει ενδεχομένως να εξεταστούν στο σχεδιασμό των σχημάτων χημειοθεραπείας συνδυασμού.

Προσδιορισμός

V

max και

K

M για τον πληθυσμό των κυττάρων από το μέσο όρο: (i) μονοκύτταροι

V

max και

K

Μ (ενός προσέγγιση των κυττάρων) και (ii) των πρώτων σημάτων μονοκύτταροι (προσέγγιση του πληθυσμού).

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και Υλικά |

MCF-7 κύτταρα (ανθρώπινο καρκινικών κυττάρων του μαστού γραμμής [10], [11]) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA? ATCC # ΗΤΒ-22), που καλλιεργούνται στα συνιστώμενα μέσα και τα συμπληρώματα στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 το περιβάλλον και να χρησιμοποιηθεί μέσα σε χρονικό διάστημα 6 μηνών. Fluorescent MDR ιχνηλάτες ροδαμίνη 123, φλουορεσκεΐνη, mithoxantrone, καθώς και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich, Fluka AG Buchs (Ελβετία), και BDH Chemicals Ltd. (Poole, England).

Μέτρηση της συσσώρευσης και εκροής του φθορισμού MDR Probes σε κυτταρικούς πληθυσμούς με Κυτταρομετρία Ροής

κυτταρικών περιεχομένων των φθοριζόντων ανιχνευτών MDR προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής (ροή BD FACSCanto II κυτταρόμετρο, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) σε ένα μέσο αποτελούμενο από 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na

2HPO

4, 2 mM ΚΗ

2 ΡΟ

4 2 mM ΟαΟ

2, 1 mM MgCl

2, και 10 mM γλυκόζη. Αφού φορτωθεί με τον ανιχνευτή (1-5 μΜ, 30-45 λεπτά, 37 ° C), τα κύτταρα (περίπου 10

6 κύτταρα /mL) κατακρημνίσθηκαν, πλύθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο (που περιέχει 5 μΜ ΡΙ), και εξετάστηκαν για ενδοκυτταρική περιεκτικότητα ανιχνευτή χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο λέιζερ ιόντων αργού που εκπέμπει στα 488 nm-για διέγερση φθορισμού και ένα φίλτρο εκπομπής 530/30 nm ζωνοπερατού για την ανίχνευση φθορισμού της ροδαμίνης 123, καλσεϊνη, και φλουορεσκεΐνη και ένα συγκρότημα 585/42 περάσει φίλτρο εκπομπής για την ανίχνευση των PI. Για να αξιολογηθεί η συσσώρευση της μιτοξαντρόνης, τα δείγματα ήταν ενθουσιασμένος με ένα 635-nm laser κόκκινο δίοδος, και ένα φίλτρο εκπομπής 680/32 nm πάσα ζώνη χρησιμοποιήθηκε για ανίχνευση του φθορισμού. Για τον ποσοτικό κινητική μελέτη MDR, η εξέλιξη της χρωστικής εκροής παρακολουθήθηκε με κυτταρομετρία ροής επαναλαμβανόμενη δειγματοληψία κυτταρικών εναιωρημάτων σε κατάλληλα χρονικά σημεία.

Μέτρηση της MDR Μεταφορών σε μονά κύτταρα με φθορισμό Kinetic Μικροσκοπία

κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 50-60% συρροή συμπληρώθηκαν με 10 μΜ γλυβουρίδη (MDR αναστολέα) και φορτώθηκε με 5 μΜ φλουορεσκεϊνη για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν ελεύθερα εξωκυτταρικών φλουορεσκεϊνη και γλυβουρίδη και τοποθετούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα KRB. Η κινητική της φλουορεσκεΐνης εκροής παρακολουθήθηκε με διαλείμματα των 5 λεπτών χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ συνεστιακού φθορισμού (Fluoview FV300, η ​​Olympus, Japan), με μια διέγερση λέιζερ ιόντων αργού στα 488 nm και το φίλτρο σετ XF75 Omega (Omega Optical, Brattleboro Inc. , VT) μετά από μια προσέγγιση που περιγράφεται αλλού [12].

Προσδιορισμός Βιωσιμότητας κυττάρων και Κύκλου Κυττάρου θέση

Μετά την ολοκλήρωση της φλουορεσκεΐνης εκροής, τα κύτταρα φορτώθηκαν με ΡΙ (10 μΜ, 10 λεπτά ) για να ταυτοποιηθούν τα αποπτωτικά κύτταρα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με τη μεμβράνη-ειδικό απορρυπαντικό πλάσμα, σαπωνίνη (80 μg /mL) και ΚΝΑάση Α (0.02 mg /mL) για να επιτρέψει την παρεμβολή με PI πυρηνικό DNA. Ο φθορισμός από τα κύτταρα ΡΙ-αγωγή ήταν ενθουσιασμένος με ένα πράσινο λέιζερ Kr και ανιχνεύονται με το σετ φίλτρων XF35 Ωμέγα (Omega Optical, Inc. Brattleboro, VT). Η ένταση φθορισμού του ΡΙ χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η θέση των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο [12] – [14]

Κινητική Διαρρύθμιση και Μέθοδοι Προσομοίωσης

Κινητική της MDR μεταφοράς περιγράφηκε από καμπύλες προόδου φλουορεσκεΐνης. εκροής που τοποθετούνται στο ολοκληρωμένο εξίσωση Michaelis-Menten για ένα μόνο υπόστρωμα μη αντιστρεπτή αντίδραση: όπου [S]

0 και [S] είναι οι αρχικές και τις τρέχουσες συγκεντρώσεις υποστρώματος, αντίστοιχα [15], [16]. Η εξίσωση αυτή χρησιμοποιήθηκε επίσης για την κατασκευή των μοντέλων κινητικής πληθυσμού. Τοποθέτηση και το μοντέλο προσομοιώσεις πραγματοποιήθηκαν με KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) και Προέλευσης (Microcal Software, Northampton, ΜΑ) λογισμικού.

Αποτελέσματα

Γενική Χαρακτηρισμός της εγγενούς σε πολλαπλά Αντίσταση στην MCF -7 κύτταρα

αρχικές μελέτη σχετικά με την εγγενή χημειοαντίσταση των κυττάρων MCF-7 διεξήχθη χρησιμοποιώντας μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής της συσσώρευσης του υποστρώματος MDR σε κύτταρα και την εξάρτησή της από αναστολείς MDR. Τα κύτταρα φορτώθηκαν με συνδυασμούς κλασικό χρησιμοποιούνται φθορίζοντα υποστρώματα (ροδαμίνη 123, μιτοξαντρόνη, και φλουορεσκεΐνη) και αναστολείς (κυκλοσπορίνη Α, βεραπαμίλη, και γλυβουρίδη) ειδικά για διακριτές οικογένειες MDR μεταφορέων [17], [18]. Αυτές οι μετρήσεις έδειξαν ότι μόνο το ζεύγος φλουορεσκεϊνης /γλυβουρίδης εμφάνισαν αναστολέα (γλυβουρίδη) -dependence στην κυτταρική πρόσληψη του φθορίζοντος ανιχνευτή (φλουορεσκεΐνη) σε κύτταρα MCF-7 (Σχ. 2Α). την ικανότητα των κυττάρων να αποκλείουν φλουορεσκεΐνη (αλλά όχι ροδαμίνη 123 και μιτοξανθρόνη) είναι χαρακτηριστικό του MRP-μεταφορά τύπου [17], [19]. Αυτό συμφωνεί με πρώιμη εκθέσεις σχετικά με εγγενή δραστικότητα του φαρμάκου-εκροής σε κύτταρα MCF-7 [20] – [22] και σε καρκίνους του μαστού [23]. Έτσι, μόνο MRP είδος των μεταφορών και του κανονισμού της περαιτέρω μελετηθεί σε βάθος

Μια

, παρουσία των εγγενών δραστηριοτήτων MDR σε κύτταρα MCF-7 εκτιμήθηκε από συσσώρευση:. Ροδαμίνης 123 με ή χωρίς με κυκλοσπορίνη Α (- /+ INH) – για MDR οικογένεια μεταφορέων? φλουορεσκεΐνη χωρίς ή με γλυβουρίδη – για την οικογένεια MRP? mithoxantrone χωρίς ή με κυκλοσπορίνη Α – για την οικογένεια BCRP.

B

, αντιπροσωπευτική αλληλουχία της ροής κυτταρομετρίας ιστογράμματα, κατά τη διάρκεια της φλουορεσκεΐνης εκροής, που αποκτήθηκε 0, 30, 60 και 90 λεπτά μετά τη φόρτωση.

C

, κινητική της φλουορεσκεΐνης εκροή, αποτέλεσμα της εφαρμογής γλυβουρίδης (αναστολέας των μεταφορέων MRP-τύπου), την απόσυρση της γλυκόζης, και η εφαρμογή του αιθυλεστέρα της GSH.

D

, Michaelis ταιριάζει με την πρόοδο της φλουορεσκεΐνης εκροής σε κυτταρικό πληθυσμό.

Η

Για κινητικός χαρακτηρισμός των MDR σε MCF-7 κυτταρικών πληθυσμών, τα κύτταρα φορτώθηκαν αρχικά με φλουορεσκεΐνη στο παρουσία γλυβουρίδης και στη συνέχεια αφέθηκε να εξωθήσει μετά την απομάκρυνση των εξωκυτταρικών φλουορεσκεΐνη και γλυβουρίδη με επαναλαμβανόμενη φυγοκέντρηση και πλύσιμο. Κινητική της φλουορεσκεΐνης εκροής προήλθε από τις μέσες τιμές της έντασης φθορισμού που λαμβάνονται από μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής σε κατάλληλα χρονικά διαστήματα (Σχ. 2Β, 2C). Όλα κυτταρομετρία ροής ιστογράμματα που αποκτήθηκαν σε αυτήν την μελέτη που έδειξε μια σταδιακή αποβολή του φλουορεσκεΐνης από κύτταρα MCF-7 παρήγαγε μία μονότροπη πρότυπο (σχ. 2Β). Αυτό υποδηλώνει ότι οι παρατηρούμενες κινητικής φθορισμού αντανακλά κυρίως φλουορεσκεΐνη μεταφορών στον πληθυσμό μεγαλύτερο μέρος των κυττάρων που έχουν μια ομοιόμορφη κατανομή της δραστηριότητας MDR. Με τον τρόπο αυτό ορισμένες σημαντικές πτυχές της εγγενούς μεταφοράς MDR σε κύτταρα MCF-7 καθιερώθηκαν όπως περιγράφεται παρακάτω.

Κατ ‘αρχάς, θα προσδιορίζεται η σχέση μεταξύ του παρατηρούμενου συνολικού διαμεμβρανική ροή των φλουορεσκεΐνη και MDR μεταφορών. Η ισχυρή γλυβουρίδη επαγόμενη αναστολή της μεταφοράς, που φαίνεται στο Σχ. 2C, δείχνει ότι σχεδόν ολόκληρη η φθορεσκεΐνη ροή των κυττάρων MCF-7 οδηγήθηκε από MDR αντλίες (γλυβουρίδη-αναστελλόμενη μεταφορείς), όπως έχει βρεθεί σε ορισμένους άλλους τύπους κυττάρων [24], [25] θα μπορούσε να τοποθετηθεί Κινητική ίχνη φλουορεσκεΐνης εκροής χρησιμοποιώντας την ολοκληρωμένη εξίσωση Michaelis-Menten (Εικ. 2D) το οποίο είναι σε συμφωνία με προηγουμένως αναφερθεί Michaelis συμπεριφορά του ABC μεταφορέων [26], [27]. Έτσι, Michaelis κινητικές παράμετροι της φλουορεσκεΐνης εκροής,

V

max και

V

max /

K

M, μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης της δραστηριότητας και αποτελεσματικότητας MDR, αντίστοιχα.

Δεύτερον, θεωρήσαμε παράγοντες (εκτός από τις συγκεντρώσεις του μεταφορέα και του υποστρώματος) που ήταν δυνητικά ικανά να επηρεάσουν τη διάρκεια του χρόνου φλουορεσκεΐνη εκροής. Οι παράγοντες αυτοί είναι: παροχή ενέργειας (ATP) για την ενεργό μεταφορά και παράδοση ενός πιθανό συν-υπόστρωμα (ανηγμένη γλουταθειόνη, GSH) για MRP μεταφορείς. Για να αποκλειστεί αυτές τις δυνατότητες, έχουμε μεταβάλλεται το μέσο περιεχόμενο της γλυκόζης σε ΑΤΡ παραγωγή και τη μεμβράνη διαπερατή αιθυλεστέρα του GSH (Εικ. 2C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι παράγοντες αυτοί δεν περιορίζουν την μεταφορά των φλουορεσκεΐνης από κύτταρα MCF-7 υπό συνθήκες που χρησιμοποιούνται. Αυτά τα γεγονότα επιβεβαίωσαν περαιτέρω το κύρος της, χρησιμοποιώντας τις κινητικές παραμέτρους της φλουορεσκεΐνης εκροής σε αυτά τα κύτταρα για τον χαρακτηρισμό των δραστηριοτήτων MDR.

Πληθυσμός vs Single-cell Προσέγγιση στην Κινητικές μελέτες Αποκλειστικά κυτταρικών πληθυσμών

Κινητική MDR μεταφορών είναι συνήθως μελέτες που χρησιμοποιούν τους πληθυσμούς ολόκληρων κυττάρων [25], [28], [29], μια προσέγγιση που θεωρείται ότι είναι ακριβή για τον καθορισμό των βασικών τάσεων της μονότροπη σύνολα κυττάρων [30]. Ωστόσο, μια πρόσφατη εργασία από τους Wong και συν-συγγραφείς είχαν δείξει ότι μέσου όρου κύτταρο κινητική σε πληθυσμό κυττάρου μπορεί να διαταράξει σημαντικά προσδιορισμός προκειμένου αντίδραση, όταν η διακύμανση κύτταρο-προς-κύτταρο εντός ενός πληθυσμού είναι υψηλή (25-160 φορές στο ένζυμο δραστηριότητα ή /και υποστρώματος περιεχόμενο) [31]. Για το σύστημά μας, ήμασταν ενδιαφέρονται για το αν ή όχι του μέσου όρου του πληθυσμού θα μπορούσε να εισάγουν σημαντικά σφάλματα σε μετρήσεις των παραμέτρων Michaelis-Menten σε μέτριες (2-10 φορές) διακύμανση των κυττάρων-να-κυττάρων στη δραστηριότητα μεταφορέα. Για να απαντήσουμε στο ερώτημα αυτό, πρέπει αρχικά πραγματοποιήθηκε κινητική προσομοίωσης με το μοντέλο κυτταρικού πληθυσμού. Θεωρήσαμε μια ομάδα κυττάρων με πανομοιότυπα

K

αξίες Μ και αρχικά επίπεδα υποστρώματος αλλά με διαφορετικό

V

max (κατανεμημένα σε μια Gaussian τρόπο πάνω από ένα 9-πλάσια περιοχή ) (Σχ. 3Α, Πίνακας 1). Κινητική ίχνη εξώθηση υπόστρωμα για κάθε κύτταρο προσομοιώθηκαν χρησιμοποιώντας την ολοκληρωμένη εξίσωση Michaelis-Menten (Σχ. 3Β). Κινητική μεμονωμένα κύτταρα μπορούν να υποβάλλονται σε επεξεργασία σε δύο τρόπους που περιγράφονται παρακάτω (βλέπε Εικ. 1).

Προσομοίωση μονοκύτταρους και πληθυσμός κινητική της αντίδρασης Michaelis-Menten-τύπου.

Μια

, παραλλαγή του

V

max σε έναν πληθυσμό των 10 μεμονωμένων κυττάρων κύτταρα.

Β

, προσομοίωση ενός κυττάρου και κατά μέσο όρο κινητική πληθυσμού, προσομοίωση εκτελείται χρησιμοποιώντας την ενσωματωμένη εξίσωση Michaelis-Menten:

V

max

t

= ([S]

0 – [S]) +

K

Μ ln ([S]

0 /([S]

0 – [S]).)

Πρώτον, οι κινητικές παράμετροι για κάθε κύτταρο μπορεί να συναχθεί από την κινητική ίχνη μονοκύτταρους με προσαρμογή στην ολοκληρωμένη εξίσωση Michaelis-Menten και στη συνέχεια ο μέσος όρος για τον πληθυσμό. Αυτοί οι μέσοι όροι θα είναι ίσο με μέσους όρους των παραμέτρων εισόδου που χρησιμοποιούνται για τις προσομοιώσεις (Πίνακας 1, σειρά 6). Ειδικότερα, η μέση τιμή

V

max είναι ίσο με το

V

μέγιστη τιμή του τρόπου εκτέλεσης των κυττάρων τύπου (Εικ. 3Α, κεντρική bin). Έτσι, οι κατά μέσο όρο κινητικές παράμετροι του πληθυσμού συμπίπτουν με τις παραμέτρους του τρόπου εκτέλεσης κυτταρικό τύπο, η οποία αναμένεται για Gaussian κατανομές.

Δεύτερον, αντί του μέσου όρου των παραμέτρων Michaelis-Menten, μπορεί κανείς να μέση κινητική ίχνη (Σχ. 3Β). Σημειώστε ότι σε ένα πείραμα, αυτό συμβαίνει όταν το συνολικό σήμα από τον κυτταρικό πληθυσμό έχει καταχωρηθεί με μεθόδους όπως η κινητική κυτταρομετρία ροής, φασματοφθορισμομετρικές, και μικροσκοπία ολόκληρο πεδίου. Από το Σχ. 3Β, μπορεί κανείς να δει ότι ο μέσος όρος κινητική πληθυσμός που παράγεται με αυτόν τον τρόπο αποκλίνει σημαντικά από την κινητική του τροπικού τύπου κυττάρου (Εικ. 3Β, το παχύτερο ίχνος αντιστοιχεί στα κύτταρα του τύπου 3). Το μέσο ίχνος πληθυσμό αποκλίνει από την τροπική ίχνος πληθυσμό, διότι τα ταχύτερα κύτταρα τείνουν να επιβραδύνουν και να ολοκληρώσει η αντίδραση νωρίτερα από ό, τι οι πιο αργή αυτά, καθώς και την περαιτέρω η αντίδραση προχωρεί προς την ολοκλήρωσή της, η μεγαλύτερη συνεισφορά αργή κύτταρα έχουν σχετικά με τις κατά μέσο όρο κινητική πληθυσμού. Για το λόγο αυτό, κατά μέσο όρο ίχνη πληθυσμός που παράγεται με αυτόν τον τρόπο έχουν υψηλότερη καμπυλότητα από τα τροπική ίχνη του πληθυσμού, και να οδηγήσει σε λανθασμένη αντίληψη της κυτταρικής κινητικής. Ως αποτέλεσμα, αν και κάθε μονό κύτταρο μένει στενά από την κινητική Michaelis-Menten, για ένα 9-πλάσια διακύμανση

V

max, ο πληθυσμός-μέσο ίχνος ταιριάζει αυτό το κινητική πολύ άσχημα. Για μια 3-πλάσια διακύμανση, Michaelis τοποθέτηση φαίνεται να είναι ικανοποιητικό οπτικά, αλλά παράγει αρκετές φορές υπερεκτίμηση των

V

max και

K

Μ (Πίνακας 1, σειρά 7).

Δύο άλλες κινητικές παραμέτρους,

K

M και [S]

0, υποβλήθηκαν σε ανάλογη μεταβολή στο επίπεδο ενός κυττάρου, και προκάλεσε ποιοτικά παρόμοια αλλά ποσοτικά μικρότερο υπερεκτίμηση της αξίας τους επίπεδο κατά μέσο όρο του πληθυσμού (20-50% της μέσης τιμής της παραμέτρου στην 3-φορές μεταβολή, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μια τέτοια διαφορά μπορεί να είναι περιορισμένης σημασίας για την ανάλυση των πραγματικών διάσπαρτα πειραματικά δεδομένα. Την ίδια στιγμή, ένα αρκετά φορές υπερεκτίμηση του πληθυσμού

V

max και

K

Μ, που προκαλείται από κύτταρο σε κύτταρο

V

μέγιστη μεταβολή, θα μπορούσε να δημιουργήσει μια εντελώς λανθασμένη εικόνα της διαδικασίας υπό μελέτη.

θα πρέπει ne σημειωθεί ότι τόσο ο πληθυσμός και η προσέγγιση μονοκύτταροι θα δώσει τα ίδια αποτελέσματα αν ο πληθυσμός των κυττάρων που αναλύθηκαν ήταν απολύτως ομοιογενείς , η οποία είναι, προφανώς, δεν συμβαίνει ποτέ. Η προσέγγιση πληθυσμός οδηγεί πάντα σε συστηματικά σφάλματα όταν εφαρμόζεται σε ένα ετερογενή κυτταρικό πληθυσμό και τα σφάλματα αυξάνουν με την αύξηση της ετερογένειας. Η προσέγγιση μονοκύτταροι είναι σωστή από την άποψη της μαθηματικής στατιστικής και, ως εκ τούτου, πάντοτε επιστρέφει κινητικών δεδομένων σωστά περιγράφουν τον κυτταρικό πληθυσμό που αναλύθηκαν δεν έχει σημασία πόσο ετερογενή είναι ο πληθυσμός. Έτσι, για την αποσαφήνιση των πιθανών κινητικής διαφορές μεταξύ των κυττάρων σε διάφορα στάδια του κυτταρικού κύκλου, εφαρμόσαμε την προσέγγιση μονοκύτταροι.

Διαμόρφωση της MDR Κινητική κατά τη διάρκεια της εξέλιξης Cells »μέσω του κυτταρικού κύκλου

Η κινητική της φλουορεσκεΐνης εκροής από μεμονωμένα κύτταρα μετρήθηκε με τη χρήση ποσοτικών time-lapse μικροσκοπία συνεστιακή φθορισμού. Η βαθμονόμηση του κυτταρικού φθορισμού πραγματοποιήθηκε σε δύο στάδια. Πρώτον, συγκρίθηκαν φθορισμού από ενδοκυτταρικό φλουορεσκεΐνη και φθορεσκεΐνη σε διάλυμα. Για το σκοπό αυτό, εξετάσαμε την εκπομπή από το εναιώρημα των κυττάρων φλουορεσκεΐνης-φορτωμένο πριν και μετά την λύση των κυττάρων με 0.1% Triton Χ-100. Η απελευθέρωση της χρωστικής από τα κύτταρα δεν είχαν σημαντική επίδραση επί του φθορισμού του, δείχνοντας ότι το σήμα φθορισμού από ενδοκυτταρικό φλουορεσκεΐνη μπορεί να ποσοτικοποιείται χρησιμοποιώντας φθοροσκεΐνη λύσεις για βαθμονόμηση. Δεύτερον, μετά από κάθε σειρά μετρήσεων κυττάρων, πρότυπα διαλύματα του φθορεσκεΐνης τοποθετήθηκαν εντός του θαλάμου κύτταρο, και τα σήματά τους καταγράφηκαν με τις ίδιες οπτικές ρυθμίσεις. Γραμμική εξάρτηση εκπομπής-συγκέντρωση που δημιουργείται με τον τρόπο αυτό (τα δεδομένα δεν φαίνονται) μας επέτρεψε να προσδιοριστεί απόλυτες συγκεντρώσεις ενδοκυτταρικού φλουορεσκεΐνης (η εστιακή όγκος ήταν μικρότερος από τον όγκο των κυττάρων).

Φλουορεσκεΐνη εκροής ξεκίνησε με απομάκρυνση της γλυβουρίδης, το οποίο αναστέλλει την αντλία μεμβράνης, και παρακολουθείται μέχρι την προφανή ολοκλήρωση (Εικ. 4αα και 4βα). Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PI για τον εντοπισμό αποπτωτικών κυττάρων, προκειμένου να τους αποκλείσει από την ποσοτική ανάλυση. Τέλος, με την προσθήκη σαπωνίνης (που διαπερνά τη μεμβράνη του πλάσματος) και ΚΝΑάση (που αφαιρεί παρεμβολής RNA), PI αφέθηκε να εισέλθουν όλα τα κύτταρα και χρώση του DNA (Σχ. 4AB). Η ένταση φθορισμού του ΡΙ χρησιμοποιείται για την κατανομή των κυττάρων είτε 2c (G1 /Ο0) φάση ή 4γ (G2 /M) φάσης (Σχ. 4BB), έτσι ώστε η κινητική της χρωστικής εκροής από μεμονωμένα κύτταρα που ανήκουν στο πρώτο και δεύτερο μισά της ο κυτταρικού κύκλου (πριν και μετά το DNA επικαλύψεις) θα μπορούσε να εκτιμηθεί

Αντιπροσωπευτικές εικόνες φθορισμού (μέγεθος σάρωσης 100 × 100 μm) φλουορεσκεΐνης εκροής ακολουθούμενη από χρώση ΡΙ (β) σε κύτταρα MCF-7 που χρησιμοποιείται για τις μετρήσεις των μεταφορών κινητική και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, αντίστοιχα.

B

, (α) τυπικό κινητική ίχνος δείχνοντας τη μεταφορά φλουορεσκεΐνης από ένα μόνο κύτταρο και κατά Michaelis-Menten της, και (β) ιστόγραμμα του κυτταρικού κύκλου που ελήφθη μετά την ολοκλήρωση της φλουορεσκεΐνης μεταφοράς.

C

, πολύγωνα συχνότητας εμφανίζει χαρακτηριστικές κατανομές των

V

max (α), και

V

max /

K

Μ (β) τις τιμές μεταξύ των κυττάρων στο 2γ και τις 4γ καταστάσεις (οι τυπικές κατανομές που αντιπροσωπεύουν 4 ανεξάρτητα κυτταρικών πληθυσμών φαίνεται). Τα βέλη δείχνουν μέση και τροπική θέσεις στις κατανομές των παραμέτρων MDR (παχύ και λεπτό βέλη αντιστοιχούν σε 2γ και 4γ κύτταρα, αντίστοιχα).

D

, 4c /2c αναλογίες των μέσων τιμών των

V

max, και

V

max /

K

Μ λαμβάνεται με παράλληλη εφαρμογή του ενιαίου σε κύτταρα (κενές στήλες) και πληθυσμό, (γεμάτο στήλες) προσανατολισμένο ανάλυση για MDR κινητική σε 2γ και 4γ υποπληθυσμών, που αντιπροσωπεύουν 4 ανεξάρτητα παρασκευάσματα κυττάρου.

η

φλουορεσκεΐνης εκροής από την πλειοψηφία των κυττάρων και μόνο MCF-7 ήταν σύμφωνα με κινητική Michaelis-Menten, με την εξαίρεση των περ. 5% των κυττάρων που είχαν αποδειχθεί χρώση ΡΙ πριν από την διαπέραση και /ή μη φυσιολογική κινητική εκροής? Αυτά τα κύτταρα αποκλείστηκαν από την ανάλυση. Εικόνα 4C δείχνει ότι η μετάβαση του κυτταρικού κύκλου από τη 2c φάση στην 4c φάση συνοδεύτηκε με μια μετατόπιση στη δραστηριότητα MDR (που χαρακτηρίζεται από

V

max) και της αποτελεσματικότητας (που χαρακτηρίζεται από

V

max /

K

Μ) διανομές προς τους υψηλότερους βαθμούς. Κατά συνέπεια, τα κύτταρα 4Ν αποδειχθεί αυξημένες μέσες τιμές των

V

max και

V

max /

K

Μ (άνω βέλη στο σχήμα . πολύγωνα συχνότητας 4C, και στατιστικό δελτίο στο Σχ. 4D). Αυτή η διαφορά ήταν ακόμη μεγαλύτερη από την άποψη του τρόπου εκτέλεσης των επιπέδων MDR στο 4γ και 2γ υποπληθυσμών (κάτω βέλη σε πολύγωνα συχνότητας Εικ. 4C). Οι τροπική αξίες της δραστηριότητας MDR χαρακτηρίζουν το πιο άφθονο κυτταρικό τύπο στον πληθυσμό και συχνά καθορίζει τη συμπεριφορά του όγκου [32]. Εδώ, δεν είχαμε εξετάσει την πιθανή παρουσία μιας πλευράς πληθυσμού με αυξημένη δραστηριότητα MDR (

V

max), η οποία θα μπορούσε να ασκήσει μόνο μια μικρή συμβολή στη συνολική κατανομή της δραστηριότητας MDR μέσα στο σύνολο του πληθυσμού.

Για να συγκρίνετε την αναλυτική ικανότητα του πληθυσμού και μονοκύτταρους κινητική προσεγγίσεων, θα πραγματοποιηθεί μια παράλληλη ανάλυση των ίδιων των πρώτων δεδομένων χρησιμοποιώντας και τις δύο μεθόδους. Η Εικόνα 4D δείχνει MDR κινητικών παραμέτρων στα 4γ και 2γ μελών, που καθορίζεται με τις δύο προσεγγίσεις. Η μονοκύτταροι προέρχεται 4γ /2c αναλογίες

V

max και

V

max /

K

M ήταν υψηλότερες από αυτές που ελήφθησαν από τους υπολογισμούς του μέσου όρου του πληθυσμού, και μόνο η μονοκύτταροι τιμές ήταν σημαντικά διαφορετικές από την ενότητα, γεγονός που υποδηλώνει μια δύναμη υψηλότερο επίλυση για την προσέγγιση ενός κυττάρου.

Συζήτηση

το πλήθος ναρκωτικά επιλεγμένων τύπων κυττάρων ανθεκτικών στα φάρμακα χρησιμοποιούνται ευρέως σε μελέτες MDR τείνουν να αποκτούν μια μεγαλύτερη-από φυσιολογικό επίπεδο αντίστασης, και είναι πιθανό να ρυθμίζονται στη μεταβλητή μόδες [33], κάνοντας τη σημασία τους για MDR λειτουργούν in vivo συζητήθηκε ευρέως [34], [35]. Επομένως, σε αυτή την εργασία, μελετήθηκε η φυσιολογικώς απαντώμενα αντίσταση εγγενείς σε πολλά φάρμακα, το οποίο καθορίζει την επιλογή του φαρμάκου και την έκβαση για τον πρώτο γύρο της χημειοθεραπείας.

Η πλειοψηφία των κυτταρικών διεργασιών που ρυθμίζονται από την εξέλιξη του κυττάρου διαμέσου του κυτταρικού κύκλου [ ,,,0],36], και μπορεί κανείς να αναμένει ότι η εγγενής δραστηριότητα μεταφοράς MDR σε καρκινικά κύτταρα δεν αποτελεί εξαίρεση. Λίγες μελέτες, στις οποίες απευθύνεται αυτό το θέμα, που θεωρείται η έκφραση ειδικών μεταφορέων ABC σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου [2], [4], [5]. Ταυτόχρονα, παρατηρήθηκε ότι οι ευρέως χρησιμοποιούμενες μετρήσεις της γονιδιακής έκφρασης MDR σε δείγματα όγκου δεν ήταν πάντοτε κλινικά αποτελεσματική, επειδή δεν παρέχουν κατ ‘ανάγκην πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργική δραστηριότητα των αντλιών εκροής φαρμάκου [6], [37]. Αμφιλεγόμενα κλινικά αποτελέσματα σχετικά με την συσχέτιση μεταξύ χημειοαντίσταση και την έκφραση του ABC μεταφορέων [38], [39] είναι πιθανό να αντανακλά τη συμβολή των παραγόντων, εκτός από την έκφραση του μεταφορέα, για τον καθορισμό δραστηριότητα MDR. Ειδικότερα, η εξέλιξη των κυττάρων μέσω του κυτταρικού κύκλου συνοδεύεται από αλλαγές σε πολλές παραμέτρους (κυτταρική ενεργητική κατάσταση, η φυσική κατάσταση του πλασματικής μεμβράνης, και τα επίπεδα του συμπαράγοντες), ότι μπορούν ενδεχομένως να επηρεάσουν τις κινητικές παραμέτρους του MDR μεταφορέων. Υποθέσαμε ότι η ένταση της αποβολής του φαρμάκου είναι ο πιο σημαντικός δείκτης της ικανότητας των κυττάρων χημειοαντίσταση και αντικατοπτρίζει τόσο το MDR αντλία έκφραση και μοριακές καταλυτική δράση στο σύνολό τους. Η εντοπιστεί εδώ μεταφοράς MDR του MRP-τύπου μόνο σε κύτταρα MCF-7 συμφωνεί με ενδογενή έκφραση των πρωτεϊνών MRP1 και έλλειψη πρωτεϊνών MDR1 αναφέρθηκε νωρίτερα (24).

Μερικές μελέτες λειτουργικά προσανατολισμένη είχαν προηγουμένως πραγματοποιηθεί η είχε χρησιμοποιηθεί μια έμμεση, ημιποσοτική εκτίμηση της αποτελεσματικότητας MDR και πρότεινε την ενεργοποίηση της μεταφοράς MDR σε S και G2 /M φάσεων σε λευχαιμικά κύτταρα [40]. Εδώ εφαρμόζεται μια αυστηρή ποσοτική μεθοδολογία για τη μελέτη του κυτταρικού κύκλου που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση MDR.

Κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας, μια εισαγωγική θεραπευτική προσέγγιση, με στόχο τη μείωση της μάζας του όγκου ώστε να διευκολυνθεί η περαιτέρω θεραπεία, είναι η εξεύρεση αυξανόμενη χρήση. Υπό το πρίσμα αυτής της προσέγγισης, η χημειοαντίσταση του κύριου πληθυσμού καρκινικών κυττάρων μαζί με εκείνη των ογκογενή κύτταρα, είναι κρίσιμης σημασίας. Έτσι, σε αυτή την εργασία μελετήσαμε το σύνολο του πληθυσμού των κυττάρων MCF-7.

Η εφαρμογή της προσέγγισης μονοκύτταρους έως 2γ και 4c υποπληθυσμών των καρκινικών κυττάρων του μαστού κλωνικών αποκάλυψε μια αύξηση των μέσων τιμών των δύο δραστηριοτήτων MDR και την αποτελεσματικότητα στα κύτταρα 4Ν? Αυτό παρέχει την πρώτη ποσοτική κινητική απόδειξη για αλλαγές στην MDR μεταφοράς κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου. ενεργοποίηση MDR σε κύτταρα 4Ν ήταν ακόμη πιο έντονη όταν χαρακτηρίζεται από τροπική (αντί του μέσου) τιμές των παραμέτρων MDR εντός υποπληθυσμούς (Εικ. 4C). Ο χαρακτηρισμός του MDR με τον πιο άφθονο κυτταρικό τύπο σε έναν όγκο θα ήταν σημαντική στην πρόγνωση του άμεση ανταπόκριση του όγκου στη χημειοθεραπεία, η οποία παίζει βασικό ρόλο στην εισαγωγική θεραπευτική προσέγγιση. Διερεύνηση της stem-σαν υποπληθυσμό καρκινικών κυττάρων θα πρέπει να καταλάβει αν μπορεί να αναμένεται η αύξηση της μακροχρόνιας αποτελεσματικότητας του κυτταρικού κύκλου επιλεκτική χημειοθεραπεία.

Τα πλεονεκτήματα της προσέγγισης κινητικής μονοκύτταρους για μελέτες των πληθυσμών μονότροπη κυττάρων που χρησιμοποιούνται στα πειράματά μας, ελέγχθηκε με τη σύγκριση των αποτελεσμάτων από μονοκύτταρους και τον πληθυσμό (Εικ. 1) αναλύσεις των ίδιων σύνολα δεδομένων (Εικ. 4D). Οι κινητικές παράμετροι του πληθυσμού (

V

max και

V

max /

K

Μ) που λαμβάνεται από την προσέγγιση μονοκύτταρους αυξήθηκε σημαντικά κατά τη μετάβαση των κυττάρων από την 2c στο κράτος 4γ. Ταυτόχρονα, αυτές οι παράμετροι που λαμβάνονται από την προσέγγιση πληθυσμό παρέμεινε σχεδόν αμετάβλητο σε μια τέτοια μετάβαση.

Οι περισσότεροι όγκοι πιστεύεται ότι προέρχονται από ένα και μόνο κύτταρο, αλλά πολλαπλά κλώνοι επιλέγονται τυπικά κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης και αντιληπτή στα προχωρημένα στάδια . Ως εκ τούτου, οι πραγματικές ιστοί όγκου αναμένεται να είναι περισσότερο ετερογενής από ένα ενιαίο καλλιεργημένο κλώνο. Ως αποτέλεσμα, η προσέγγιση του πληθυσμού, η οποία δίνει τα σφάλματα για ένα μόνο καλλιεργημένα κλώνος, θα οδηγήσει σε ακόμη μεγαλύτερα σφάλματα για την πραγματική όγκους. Κατά συνέπεια, το όφελος από τη χρήση της προσέγγισης μονοκύτταροι θα είναι ακόμη μεγαλύτερη αν οι ιστοί πραγματικό όγκο αναλύονται.

Όταν η προσέγγιση μονοκύτταρους εφαρμόζεται στην πραγματική ιστούς όγκων, η ανέλυσε πληθυσμό κυττάρων μπορεί να περιλαμβάνει κύτταρα από διαφορετικούς κλώνους. Ενώ η προσέγγιση μονοκύτταροι θα καθορίσει σωστά κινητικές παράμετροι που περιγράφουν την αναλύονται πληθυσμού, η ερμηνεία των αποτελεσμάτων πρέπει να γίνεται πάντα με προσοχή. Για παράδειγμα, αν η προσέγγιση μονοκύτταροι αποκαλύπτει ότι MDR εκροή συσχετίζεται με τον κυτταρικό κύκλο για ένα μίγμα κλώνων, μπορούμε να συμπεράνουμε με μεγάλη βεβαιότητα ότι όλοι οι κλώνοι συμπεριφέρονται με παρόμοιο τρόπο σε σχέση με MDR εκροή. Ωστόσο, αν δεν βρεθεί συσχέτιση, δύο ερμηνείες είναι δυνατές: (i) MDR δεν συσχετίζεται με τον κυτταρικό κύκλο ή (ii) MDR συσχετίζεται διαφορετικά για διαφορετικούς κλώνους και οι διάφοροι συσχετισμοί αλληλοεξουδετερώνονται όταν ένα μίγμα κλώνων τραβιέται μαζί. Για να βρείτε τη σωστή απάντηση, κάποιος θα πρέπει να διεξάγει εκτεταμένες πρόσθετες μελέτες για MDR κινητική σε επιμέρους κλώνους. Νομίζουμε ότι η σύγκριση διαφορετικών καλλιεργημένα κλώνοι πρέπει να είναι το επόμενο βήμα σε μια προσπάθεια να ανακαλύψει εάν διαφορετικών κλώνων εντός του ίδιου όγκου διαφέρουν σε σχέση με συσχέτιση MDR-κυτταρικού κύκλου. Ενώ είναι πολύ δυσκίνητη με ένα συνηθισμένο μικροσκόπιο, μια τέτοια μελέτη θα μπορούσε να είναι απόλυτα εφικτό εάν χρησιμοποιείται ένα αυτοματοποιημένο κυτταρομετρία εικόνα.

Η πειραματικά διαπίστωσε ευρεία διακύμανση των παραμέτρων Michaelis-Menten σε μεμονωμένα κύτταρα είναι συνεπής με μερικές εκθέσεις στην οποία μονοκύτταροι παράμετροι Michaelis εξετάστηκαν [41]. Ένας από τους λόγους για αυτήν την παραλλαγή θα μπορούσε να είναι η ύπαρξη δύο μορφών του μεταφορέα, με το καθένα έχει μοναδικές ιδιότητες [42], [43].

Αποδείχθηκε ότι πολλοί τύποι κυττάρων που συνελήφθησαν στον κυτταρικό κύκλο [ ,,,0],44], συμπεριλαμβανομένων εκείνων που συνελήφθησαν στη φάση G2 [3], [45], μπορούν να καταδεικνύουν την αυξημένη αντοχή σε αντικαρκινική θεραπεία η οποία εξηγείται συνήθως από τη διαφοροποίηση των αποπτωτικών και μιτωτικής μηχανισμούς. Η έννοια του κύκλου με τη μεσολάβηση της αντοχής στα φάρμακα κυττάρων που προέρχονται από αυτές τις μελέτες στοχεύει στην κατανόηση και τη βελτιστοποίηση του κυτταρικού κύκλου με βάση τις αλληλεπιδράσεις φαρμάκων [3]. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η μεταβολή της δραστηριότητας σε πολλαπλά φάρμακα των μεταφορών μπορεί να συμβάλει σημαντικά στην διαμόρφωση του κυτταρικού κύκλου που σχετίζονται με της χημειοαντίσταση.

Οι πιθανοί μετάφραση της πειραματικής μας προσέγγιση στην κλινική πρακτική, θα απαιτήσει περαιτέρω εκτεταμένες εργασίες, κυρίως, μελετώντας τις σχέσεις μεταξύ συγκεκριμένων μεταφορείς ABC και κυτταροστατικών παραγόντων. Δεδομένου ότι μπορεί να αναμένει κανείς ότι η ετερογένεια των ιστών του όγκου είναι υψηλότερη από εκείνη των κυτταρικών σειρών, η προσέγγιση μονοκύτταρους θα ήταν ιδιαίτερα επωφελής στην περίπτωση αυτή.

Η παρουσία και η δράση των MDR μεταφορέων σε κλινικά δείγματα θεωρείται να είναι ένα πολύτιμο προγνωστικό δείκτη για πολλές μορφές καρκίνου [8], [46].