Αφηρημένο

Εισαγωγή

μυοσίνης-9 (MYH9) ανήκει στην μυοσίνης υπερ της ακτίνης-δεσμευτική πρωτεΐνη κινητήρα . Πρόσφατα, MYH9 έχει θεωρηθεί ότι σχετίζεται με τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, εισβολή, και μετάσταση. Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να εξετάσει ανοσοϊστοχημικά MYH9 έκφραση σε χειρουργικά μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), και να αξιολογήσει συσχετισμούς της με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους και την πρόγνωση των ασθενών.

Μέθοδοι

έκφραση MYH9 ήταν ανοσοϊστοχημικά μελετήθηκε σε 266 συνεχόμενες εκτομή NSCLCs, και αξιολογήθηκαν οι ενώσεις του με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier και Cox μοντέλα αναλογικών κινδύνων χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η επίδραση της MYH9 έκφρασης στην επιβίωση.

Αποτελέσματα

MYH9 έκφραση ανιχνεύθηκε σε 102 από 266 (38,3%) NSCLCs. έκφραση MYH9 συσχετίστηκε σημαντικά με την ιστολογία αδενοκαρκινώματος (

P

= 0,014), φτωχότερες διαφοροποίηση ((

P

= 0.033), εντός του όγκου αγγειακής εισβολής και του λεμφικού εισβολή ((

P

= 0.013 και P = 0,045 αντίστοιχα), καθώς και μια χειρότερη πρόγνωση ((

P

= 0.032) Επιπλέον, πολυπαραγοντική ανάλυση αποκάλυψε ότι MYH9 έκφραση προέβλεψε ανεξάρτητα φτωχότερη επιβίωση (HR, 2,15?. 95% CI, 1,17 – 3,92? (

P

= 0,01)

Συμπέρασμα

Η παρούσα μελέτη αποκάλυψε ότι MYH9 εκφράζεται σε ένα υποσύνολο των NSCLC με μια πιο κακοήθη φύση, και του. έκφραση είναι ένας δείκτης της μια φτωχότερη πιθανότητα επιβίωσης

Παράθεση:. Katono K, Sato Υ, Jiang SX, Kobayashi Μ, Nagashio R, Ryuge S, et al (2015) προγνωστική σημασία της MYH9 Εκφραση σε εκτομή μη. . -μικρό καρκίνο του πνεύμονα PLoS ONE 10 (3): e0121460 doi:. 10.1371 /journal.pone.0121460

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Γιάννης Souglakos, Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Ηρακλείου και Εργαστήριο όγκων Κυτταρικής Βιολογίας, Σχολή ιατρικής, Πανεπιστήμιο Κρήτης, ΕΛΛΆΔΑ

Ελήφθη: 29 Αυγούστου του 2014? Αποδεκτές: 1η Φεβρουαρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 31 Μαρ, 2015

Copyright: © 2015 Katono et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έλαβαν καμία ειδική χρηματοδότηση για το έργο αυτό

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο, με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) που αντιπροσωπεύουν σχεδόν το 80% των θανάτων [1]. Η πρόγνωση των ασθενών με NSCLC είναι κυρίως συσχετίζεται με μετάσταση όγκου. Η διαδικασία της μετάστασης όγκου αποτελείται από σύνθετα στάδια: ότι η συμμετοχή μετανάστευση των κυττάρων του όγκου που ακολουθείται από απόσπαση από τον πρωτογενή όγκο, διήθηση σε περιβάλλοντες ιστούς, ενδαγγείωση σε αίμα ή λεμφικά αγγεία, διάδοση στο hemolymphatic σύστημα, και εξαγγείωση σε δευτερεύουσες θέσεις [2]. Κατανόηση πρωτεΐνες που σχετίζονται με την μετανάστευση του όγκου, εισβολή, και μετάσταση μπορεί να είναι χρήσιμα ως νέες προγνωστικοί δείκτες ή θεραπευτικών στόχων σε NSCLC. Μια στενή συσχέτιση μεταξύ της μετάστασης και χημειοαντίσταση ήταν συχνά παρατηρείται σε ασθενείς με καρκίνο του ανθρώπου, μερικά μόρια τα οποία σχετίζονται με τη μετάσταση και χημειοαντίσταση έχουν αναφερθεί [3,4,5]. Ως εκ τούτου, εστιάσαμε πρωτεΐνες από σισπλατίνη ανθεκτικά υπο-γραμμές για την ανίχνευση ενός νέου δείκτη που υποδεικνύει την επιθετική κλινική συμπεριφορά σε NSCLC.

Στην παρούσα μελέτη, επικεντρώθηκε σε μυοσίνης-9 (MYH9), η οποία είναι αυξημένη σε cisplatin ανθεκτικές υπο-γραμμές. Η υπερ-μυοσίνης εκπροσωπείται από δεκαπέντε κατηγορίες. Μυοσίνης-ΙΙ, το συμβατικό δικέφαλο μυοσίνης που σχηματίζει νημάτια διπολική, είναι απευθείας εμπλέκεται στη ρύθμιση κυτοκίνηση, κινητικότητα κυττάρου, και η μορφολογία των κυττάρων σε nonmuscle κύτταρα. Σπονδυλωτά εκφράζουν τουλάχιστον δύο μη-μυϊκή μυοσίνης II ισομορφών βαριά αλυσίδα, που αναφέρεται ως μυοσίνη-ΙΙΑ και μυοσίνης-IIB. Το πρώτο αποτελείται από δύο μη μυ μυοσίνη ΙΙΑ βαριές αλυσίδες (NMMHC-ΠΑ), που αναφέρεται ως μυοσίνης-9 (MYH9), δύο ρυθμιστικές ελαφριές αλυσίδες (RLC), και δύο βασικά ελαφρές αλυσίδες. Η δραστηριότητα της μυοσίνης-ΙΙΑ ρυθμίζεται κυρίως από την φωσφορυλίωση του RLC και MYH9 [6]. Επειδή MYH9 συμβάλλει στην κυτταρική πολικότητα, πρόσφυση, διαίρεση, και τη μετανάστευση [7,8], αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι MYH9 παίζει βασικό ρόλο στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, εισβολή, και μετάσταση [9,10]. Σε ανθρώπινα MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού, MCF-7/6 κύτταρα τα οποία έχουν μια επεμβατική ικανότητα παρουσιάζουν υψηλότερη έκφραση του MYH9 από κύτταρα /Ζ MCF-Α, τα οποία είναι μη επεμβατική. Η ικανότητα εισβολής των MCF-7/6 μειώνεται, είτε με εξουδετέρωση του MYH9 ή θεραπεία με blebbistatin, η οποία αναστέλλει τη λειτουργία του MYH9, υποδεικνύοντας την εμπλοκή της MYH9 στη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων. Η υπερέκφραση του MYH9 σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε οισοφάγου [11], της ουροδόχου κύστης [12], και γαστρικού καρκίνου [13]. Maeda et al. ανέφεραν ότι το στάδιο Ι ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα που στερούνται την έκφραση είτε MYH9 ή βιμεντίνη έχουν ευνοϊκή έκβαση χωρίς μετεγχειρητική επικουρική χημειοθεραπεία [14]. Ωστόσο, οι σχέσεις μεταξύ της έκφρασης MYH9 και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά, και οι προγνώσεις των ασθενών πρέπει να μελετηθούν περαιτέρω σε ένα μεγάλο αριθμό περιπτώσεων NSCLC σε διάφορα στάδια της νόσου, καθώς και σε πνεύμονα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων. Η παρούσα μελέτη εξέτασε MYH9 έκφραση σε εκτομή NSCLCs συμπεριλαμβανομένων των πλακωδών κυττάρων καρκινωμάτων του παθολογικού σταδίου I-III, και ανέλυσε τη συσχέτιση με κλινικοπαθολογικών παραμέτρων των ασθενών και προγνωστική σημασία της.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δηλώσεις

Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Kitasato Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου (B13-53) και ακολούθησαν τη Διακήρυξη του πρωτοκόλλου του Ελσίνκι. Όλοι οι ασθενείς είχαν προσεγγιστεί με βάση την εγκεκριμένη δεοντολογικές κατευθυντήριες γραμμές, συμφώνησαν να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη, και θα μπορούσε να αρνηθεί την είσοδο και να διακόψει τη συμμετοχή ανά πάσα στιγμή. Όλοι οι συμμετέχοντες αποδείχθηκαν γραπτή συγκατάθεση. Τα ζώα σε αυτή τη μελέτη αντιμετωπίζονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για τα πειράματα σε ζώα των Kitasato Σχολή του Πανεπιστημίου της Allied Επιστημών Υγείας, καθώς και όλα τα ζωικά πειραματικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή σχετικά με τη δεοντολογία των πειραμάτων σε ζώα της Kitasato Σχολή του Πανεπιστημίου Allied Επιστημών Υγείας (14- 16).

Οι κυτταρικές σειρές

Η LCN1, που προέρχεται από μεγάλες καρκίνωμα νευροενδοκρινείς, ιδρύθηκε το εργαστήριό μας [15]. Η LC-2 /ad και Α549, και οι δύο προέρχονται από ένα αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, αγοράστηκαν από την RIKEN Bioresource Center (Ibaraki, Japan) και Ιαπωνικά Cancer Research Τράπεζα Πόρων (Tokyo, Japan), αντιστοίχως. Αυτά τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 (Sigma, Steinheim, Germany) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Biowest, Miami, FL, USA), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνης και 100 μg /ml στρεπτομυκίνης ( GIBCO, Όκλαντ, Νέα Ζηλανδία). Μετά τη συγκομιδή και πλύση δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό χωρίς δισθενή ιόντα (PBS-), υπο-συρρέοντα κύτταρα αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για πρωτεομική ανάλυση και μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη για ανοσοϊστοχημεία. κύτταρα LCN1 επίσης Amex-σταθερή [16] για την ανοσοϊστοχημική εξέταση. Τα /κυττάρων O-Ag14 SP2 που προέρχεται από ένα μυέλωμα ποντικού αγοράστηκαν από την Bioresource Κέντρο RIKEN, και αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI-1640 συμπληρωμένο με 1 χ 8-αζαγουανίνη (50 × Hybri-Max, SIGMA), 10% FBS, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνης και 100 mg /ml στρεπτομυκίνης (GIBCO).

Cisplatin ανθεκτικές υπο-γραμμές

Cisplatin ανθεκτικές υπο-σειρές (LCN1-cis, LC-2 /ad-cis, και Α549-cis) καθορίστηκαν με την καλλιέργεια των κυττάρων για 6 μήνες με σισπλατίνη (Randa inj., Nippon Kayaku Co., Ltd., Tokyo, Japan), ξεκινώντας από μια συγκέντρωση των 25 και αυξάνεται σταδιακά σε 3.200 ng /ml. Η σισπλατίνη ανθεκτικές υπο-γραμμές σταθερά αναπτύχθηκαν σε συγκέντρωση 3200 ng /ml σισπλατίνης για πάνω από 12 μήνες σε εργαστήριο μας [17].

δημιουργία μονοκλωνικών αντισωμάτων

λύμα

LCN1-cis κύτταρο παρασκευάστηκε με PBS (-) χρησιμοποιώντας ένα υπερηχητικό ομογενοποιητή (UH-50? SMT Company, Tokyo, Japan). Πέντε εβδομάδων θηλυκούς ποντικούς BALB /c ανοσοποιήθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς με 50 mg υγρού βάρους του κυτταρικού λύματος LCN1-cis σε 500 ml PBS (-) 3 φορές, με διάστημα δύο εβδομάδων. Ο τίτλος του αντισώματος ελέγχθηκε με IHC χρησιμοποιώντας 100 φορές αραιωμένο ορό από τα ανοσοποιημένα ποντίκια ως το πρώτο αντίσωμα επί Amex-σταθερής LCN1-cis κύτταρα. Τρεις ημέρες πριν από τη σύντηξη των κυττάρων, το ζώο με τον υψηλότερο τίτλο ήταν ενδο-περιτοναϊκά ενισχυμένα από την ίδια ποσότητα LCN1-cis λύμα. παρασκευή υβριδωμάτων και διαλογή IHC με Amex στερεωμένα LCN1-cis κύτταρα περιγράφηκε προηγουμένως [18,19].

Προσδιορισμός ισοτύπου αντισώματος

ένα αντίσωμα, ορίζεται ως KU-Lu-6, η οποία έδειξε μεμβρανώδη χρώση σε LCN1-cis κύτταρα, αλλά όχι σε μητρικό LCN1 κύτταρα του, πάρθηκε-up και περαιτέρω μελετηθεί. Για να προσδιορισθεί ο ισότυπος της καθιερωμένης KU-Lu-6 αντίσωμα, χρησιμοποιήσαμε το Isostrip

TM μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ισοτύπου Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ανοσοκατακρήμνισης

Η μέθοδος ανοσοκαθίζησης που χρησιμοποιείται για την Pierce πρωτεΐνη L αγαρόζης (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) σε αυτή τη μελέτη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, LC-2 /ad-cis κύτταρα πλύθηκαν με PBS (-) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με δοκιμασία ραδιο-ανοσοκαταβύθιση (RIPA) ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει Complete-mini EDTA-free (Roche Diagnostics) σε πάγο για 30 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση στις 15.000 rpm για 30 λεπτά στους 4 ° C, το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Για να συζευχθεί το πρωτογενές αντίσωμα, 200 μL του πρωτογενούς αντισώματος (KU-Lu-6 υπερκείμενο υβριδώματος) και 50 μι χάντρες αγαρόζης L πρωτεΐνη αιωρούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA επωάστηκαν με περιστροφή σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση, το προϊόν σύζευξης αντισώματος-αγαρόζης και 500 μg ολικής κυτταρικής πρωτεΐνης από το υπερκείμενο LC-2 /ad-cis επωάστηκαν με περιστροφή σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Τα ανοσοϊζήματα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις 15.000 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C. Μετά από πλύση τρεις φορές με ρυθμιστικό RIPA, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε προσεκτικά και τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 20 μΐ 1 χ ρυθμιστικού Laemmili του. Στη συνέχεια, όλα τα δείγματα έβρασαν και διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE με 10% πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. Μετά την SDS-PAGE, τα πηκτώματα Ζη-βάφτηκαν με τον αρνητικό κιτ Gel Stain MS (Wako Pure Chemical, Tokyo, Japan), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ταυτοποίηση πρωτεϊνών αντιγόνου

Η κηλίδα πρωτεΐνη αποκόπηκε από την πηκτή SDS-PAGE και κιμά έως 1 mm

3, αποχρωματίζονται με διάλυμα αποχρωματισμού (Wako Pure Chemical), αφυδατωμένο με 100% (ν /ν) ACN, και ξηραίνεται υπό συνθήκες κενού. Θρυπτική πέψη διεξήχθη με ελάχιστο όγκο του διαλύματος πέψης που περιέχει 10 ng /μΙ τρυψίνης (θρυψίνη Gold, Φασματομετρία Μάζας Grade, Promega Madison, WI, USA) και 25 mM NH4HCO3 για 24 ώρες στους 37 ° C. Μετά την επώαση, πέψη πρωτεϊνικά θραύσματα εκλούστηκαν σε διάλυμα συλλέχθηκαν, και τα πηκτώματα πλύθηκαν μία φορά σε 5% (ν /ν) τριφθοροξικό οξύ /50% (ν /ν) ACN και συλλέγονται στο ίδιο σωληνάριο.

Η συλλέγονται πεπτιδικά θραύσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας autoflex III μήτρας που σχετίζονται με εκρόφηση λέιζερ /ιονισμός-χρόνος πτήσεως /ώρα πτήσεως σπεκτρομετρίας μάζης (MALDI-TOF /TOF MS? Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany). Μια μίας χρήσης πλάκα, εντόπισε α-κυανο-4-υδροξυκινναμωμικού οξέος για τα δείγματα, και PAC Peptide Calibstandard για τη βαθμονόμηση (Prespotted AnchorChip 96 σετ για Πρωτεϊνωματική, Bruker Daltonik GmbH) χρησιμοποιήθηκαν. Πεπτίδιο δακτυλικά αποτυπώματα μάζας (PMF) μετρήθηκαν και στη συνέχεια μερικές κορυφές που λαμβάνονται από PMF περαιτέρω μετρήθηκαν για τα διαδοχικά φάσματα μάζας τους ως μητρική μάζες. ΜΑΣΚΩΤ (https://www.matrixscience.com) χρησιμοποιώντας το 3,85 της βάσης δεδομένων IPI Ανθρώπου (89.952 ακολουθίες? 36.291.020 υπολείμματα), χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών από τα δεδομένα PMF και παράλληλα μάζα

Επειδή η KU-Lu-. 6 αντίσωμα δεν λειτουργεί για ανοσοαποτύπωση, η δοκιμασία απορρόφησης αντισωμάτων για επιβεβαίωση του αντιγόνου χρησιμοποιώντας καθαρισμένη συνθετική πρωτεΐνη αντιγόνο που χρησιμοποιείται.

Μια MYH9 κλώνος έκφρασης κατασκευάστηκε από τον κλώνο CU013414 και διανυσματικά προορισμό pINSOL20 με το σύστημα πύλης ( Life Technologies, USA). Η πρωτεϊνοσύνθεση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της μεθόδου στην προηγούμενη έκθεση μας [20]. Η ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών υπολογίστηκε ως η πυκνότητα της ζώνης της χρώσης CBB σε SDS-PAGE ως προτύπου πρωτεΐνης BSA.

Εκατό μλ κάθε μη αραιωμένου υπερκείμενα υβριδώματος προ-απορροφήθηκε με 0,12, 0,24, και 0.48 μg συνθετικού MYH9 πρωτεΐνες, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες και στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Αφού φυγοκεντρήθηκε στα 20.000 g για 10 λεπτά, το κάθε υπερκείμενο συλλέχθηκε και χρησιμοποιούνται ως τα πρώτα αντισώματα.

IHC με απορροφάται αντισώματα που περιγράφονται στο 2.8.

Ασθενείς και ιστών δείγματα

Ένα σύνολο από 266 συνεχόμενες NSCLC ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε πλήρη εκτομή από Ιανουάριος 2002 – Δεκέμβριος 2005 στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Kitasato συμπεριλήφθηκαν σε αυτήν την αναδρομική μελέτη κοόρτης. Εκείνοι που έλαβαν προεγχειρητική χημειοθεραπεία και /ή ακτινοθεραπεία αποκλείστηκαν. Δέκα τοις εκατό των μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη και εγκλεισμένοι σε παραφίνη ιστοί υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε 3-μm πάχους τομές και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Η ιστολογική διάγνωση με βάση τα κριτήρια του Παγκόσμιου Οργανισμού /Διεθνούς Ένωσης Υγείας για τη Μελέτη του Καρκίνου του Πνεύμονα ταξινόμηση των πνευμόνων και του υπεζωκότα όγκων [21]. Κάθε ασθενής επανεκτιμήθηκε σύμφωνα με την 7η έκδοση της ταξινόμησης ΤΝΜ [22]. Οι κλινικές και παθολογικές παραμέτρους αναδρομικά περιλαμβάνονται η ηλικία κατά την χειρουργική εκτομή, το φύλο, τις συνήθειες καπνίσματος, ιστολογικό τύπο, τη διαφοροποίηση του όγκου, παθολογική ΤΝΜ (p-TNM) και το στάδιο, κομβική θέση, εντός του όγκου αγγειακή εισβολή, εντός του όγκου λεμφική εισβολή, υπεζωκότα εισβολή, τη λήψη επικουρική χημειοθεραπεία, την κατάσταση της βιωσιμότητας, και ο χρόνος επιβίωσης μετά την επέμβαση. Η κατάσταση βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με βάση το αν ή όχι NSCLC σχετίζονται θανάτου, και ο χρόνος επιβίωσης ορίστηκε ως η διάρκεια από την ημερομηνία της χειρουργικής επέμβασης για την ημερομηνία του θανάτου ή το τέλος της παρακολούθησης. Περιπτώσεις θανάτου από άλλες αιτίες ή έχασαν την παρακολούθηση αντιμετωπίστηκαν ως λογοκρισία περιπτώσεις.

Η ανοσοϊστοχημική χρώση του KU-Lu-6 αντισώματος

Μετά από παραφίνες σε ξυλόλιο, 3-μm πάχους τομές ή παρασκευάσματα κυττάρου επανυδατώθηκαν σε μια σειρά αιθανόλης κατιόντα, και στη συνέχεια κατεργάζεται με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 10 λεπτά. Είχαν αντιγόνου ανακτώνται από αυτόκαυστο για 10 λεπτά σε 0,01 Μ κιτρικού ρυθμιστικού (ρΗ 6,0) με 0,1% Tween20. Μετά από αποκλεισμό με 2% κανονικό /Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα ορού των χοίρων (0,01 Μ Tris-HCl, ρΗ 7.5, 150 mM NaCl) για 10 λεπτά, αυτοί αντέδρασαν με μη αραιωμένο υπερκείμενο του KU-Lu-6 αντίσωμα όλη τη νύκτα σε θερμοκρασία δωματίου . Αφού ξεπλύθηκαν σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα τρεις φορές για 5 λεπτά η κάθε μία, που αντέδρασαν με αντιδραστήριο ChemMate ENVISION (ϋΑΚΟ, Glostrup, Denmark) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτά στη συνέχεια οπτικοποιήθηκαν με σταθερό διάλυμα DAB (Invitrogen? Carlsbad, CA, USA) και με αιματοξυλίνη Mayer του. Οι αρνητικοί έλεγχοι παρασκευάστηκαν με υποκατάσταση του αλατούχου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος για το αντίσωμα KU-Lu-6.

Αξιολόγηση των ανοσοϊστοχημική χρώση

μεμβρανώδη ανοσοχρώση των κυττάρων του όγκου θεωρήθηκε θετική για την KU-Lu -6 αντίσωμα. Η ένταση χρώσης κατηγοριοποιούνται σε τρεις ομάδες: 0 = αρνητική? 1 = ασθενώς θετικό? 2 = ισχυρά θετική. Τα καρκινικά κύτταρα με σκορ χρώση των 2 κρίθηκαν ως θετικά. Παρατηρήσαμε σε όλα τα κύτταρα του όγκου του δείγματος, ένας όγκος με θετική χρώση σε περισσότερο από το 25% των καρκινικών κυττάρων της θεωρήθηκε ως θετική. Όλα τα ανοσοχρωματίστηκε τμήματα εξετάστηκαν από δύο ερευνητές (Κ.Κ και S. Υ), χωρίς γνώση των κλινικών δεδομένων. Ασύμφωνα περιπτώσεις εξετάστηκαν και συζητήθηκαν μέχρι να επιτευχθεί συναίνεση.

Η στατιστική ανάλυση

Οι συνεχείς μεταβλητές παρουσιάζονται ως διάμεση τιμή (εύρος), ενώ οι αριθμητικές μεταβλητές δίνονται ως Ν (%). Οι σχέσεις μεταξύ της έκφρασης NMIIA και κλινικοπαθολογοανατομικές παράμετροι αξιολογήθηκαν με χ Pearson ‘s

2 δοκιμών ή ακριβές τεστ του Fisher, ανάλογα με την περίπτωση. Η αθροιστική επιβίωση των ασθενών εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier, και η σημασία των διαφορών επιβίωση μεταξύ MYH9 θετικών και -αρνητικοί ομάδες δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank. Η πιθανότητα αθροιστικής επιβίωσης 5 ετών εκτιμήθηκε με τη μέθοδο του πίνακα ζωή με το μήκος του διαστήματος ορίζεται σε ένα μήνα. Πολυπαραγοντική ανάλυση έγινε με τη χρήση του μοντέλου αναλογικού κινδύνου παλινδρόμησης Cox για να εξετάσει την αλληλεπίδραση μεταξύ MYH9 έκφρασης και άλλα κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές, και εκτιμούν την ανεξάρτητη προγνωστική επίδραση της MYH9 στην επιβίωση από την προσαρμογή για συγχυτικούς παράγοντες. Η συμβατική

P

-τιμή 0,05 ή λιγότερο χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το επίπεδο σημαντικότητας. Όλες οι αναφερόμενες

P

-τιμές είναι δύο όψεων. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν ανεξάρτητα σε κλινικές έρευνες μας κέντρο, χρησιμοποιώντας SPSS έκδοση 17.0 του λογισμικού. (SPSS? Chicago, IL, USA)

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός της KU-Lu-6 αντισώματος

Χρήση Amex στερεωμένα LCN1-cis κύτταρα για ανοσοϊστοχημική εξέταση, επιλέξαμε τελικά ένας κλώνος που προσδιορίζεται ως KU-Lu-6, η οποία έδειξε μεμβρανώδη χρώση σε LCN1-cis κύτταρα, αλλά όχι σε κύτταρα LCN1 (Εικ. 1).

μεμβρανώδη χρώση παρατηρήθηκε σε LCN1-cis κύτταρα, αλλά όχι σε κύτταρα LCN1. (Αρχική μεγέθυνση: Α, Β × 400).

Η

με ανοσοϊστοχημική χρώση του KU-Lu-6 αντισώματος με φορμαλίνη σταθερές κυτταρικές γραμμές, η εντατική χρώση παρατηρήθηκε σε σισπλατίνη ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές, ειδικά σε LC2 /ad-cis κύτταρα (Εικ. 2Α).

KU-LU-6 υπερκείμενο αντίσωμα προ-απορροφήθηκε με κανένα (Α), 0.12 ug (Β), 0,24 ug (C), και 0,48 ug (D) από συνθετικές πρωτεΐνες MYH9. Κάθε απορροφάται αντίσωμα ανοσοχρώση με κύτταρα /ad-cis φορμόλη σταθερό LC2. Η stainability του KU-Lu-6 αντίσωμα μειώθηκε σταδιακά ανάλογα με την συγκέντρωση του MYH9 πρωτεΐνης.

Η

Για να προσδιοριστεί η πρωτεΐνη αντιγόνο που αναγνωρίζεται από το KU-Lu-6 αντίσωμα, εκτελέσαμε IP με λύμα από LC 2-κύτταρα /ad-cis. Τα αποτελέσματα της έρευνας που φαίνεται στο Σχ. 2. Η αντιγονική πρωτεΐνη παρατηρήθηκε σε περίπου 250 kDa στη λωρίδα 2 (Εικ. 3). Δεν υπάρχει σήμα παρατηρήθηκε σε λωρίδα 3 και 4 ως αρνητικός έλεγχος (Εικ. 3). Για να προσδιοριστεί η αντιγονική πρωτεΐνη που αναγνωρίζεται από KU-Lu-6 αντισώματος, που αποκόπηκαν και συλλέχθηκε το σημείο από το Zn-χρωματισμένο ζελέ, και προχώρησε με την πέψη σε γέλη. Μετά την ανάλυση χρησιμοποιώντας μια αναζήτηση MALDI-TOF /TOF MS και ΜΑΣΚΩΤ, η πρωτεΐνη προσδιορίστηκε ως ισομορφή 1 της μυοσίνης-9 (MYH9, ένταξη: IPI00019502), η οποία αποτελείται από 1.960 αμινοξέα με ένα προβλεπόμενο μοριακό βάρος του 226.532 Da. Ο ισότυπος ανοσοσφαιρίνη του KU-Lu-6 αντισώματος προσδιορίστηκε ως IgM, k. Με την δοκιμή απορρόφησης αντισώματος, η stainability του KU-Lu-6 αντίσωμα μειώθηκε σταδιακά ανάλογα με την συγκέντρωση του MYH9 πρωτεΐνης. Η stainability του KU-Lu-6 αντίσωμα εντελώς χαθεί με 0,48 μg πρωτεΐνης MYH9 (Εικ. 2)

Λωρίδα 1:. Δείκτης μοριακού βάρους, λωρίδα 2: LC-2 /ad-cis λύματος σε συνδυασμό με KU-Lu-6 αντισώματος, λωρίδα 3: LC-2 /ad-cis λύμα σε συνδυασμό με πρωτεΐνη L, λωρίδα 4: KU-Lu-6 αντίσωμα σε συνδυασμό με πρωτεΐνη L, λωρίδα 5: LC-2 /ad-cis λύμα. Οι διαδρομές 3 και 4 είναι αρνητικοί μάρτυρες, και τα ειδικά ανοσοκαταβυθίστηκαν προϊόν με KU-Lu-6 αντίσωμα ανιχνεύθηκε στη λωρίδα 2 (βέλος).

Η

MYH9 έκφραση σε NSCLC

MYH9 εκφράστηκε στη μεμβράνη και κυτόπλασμα ορισμένων καρκινικών κυττάρων. Ειδικά, η ένταση χρώσης σημαδεύτηκε στην κυτταρική μεμβράνη. Από τους 266 χειρουργικά NSCLCs, συμπεριλαμβανομένων 203 αδενοκαρκινώματα, 51 ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα, 10 μεγάλου κυττάρου καρκινώματα, και 2 αδενοχοληδωτό καρκινώματα, θετική MYH9 έκφραση σε κύτταρα όγκου παρατηρήθηκε σε 102 περιπτώσεις (38,3%) (Εικ. 4). MYH9 έκφραση παρατηρήθηκε επίσης σε ινοβλάστες στο στρώμα του όγκου και σε φυσιολογικά βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα. έκφραση MYH9 δεν ανιχνεύθηκε στα κανονικά κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα. Δεν παρατηρήθηκε έκφραση σε αρνητικούς μάρτυρες

Α:. MYH9 έντονα εκφράζεται στη μεμβράνη των καρκινικών κυττάρων σε αδενοκαρκίνωμα. Β: MYH9 έντονα εκφράζεται σε μεμβράνη και κυτόπλασμα των κυττάρων όγκου στο καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων. (Αρχική μεγέθυνση: Α, Β × 400)

Η

κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών

Τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Συνολικά 168 άνδρες και 98 γυναίκες. συμπεριλήφθηκαν, με ηλικίες που κυμαίνονται από 34 έως 85 ετών (μέσος όρος 64 έτη), εκ των οποίων 166 (62,4%) ήταν καπνιστές. Η συνολική διάρκεια παρακολούθησης κυμαίνονταν από 3 έως 129 μήνες (διάμεσος, 84 μήνες). Ένα σύνολο 142 ασθενών ήταν ζωντανοί στο τέλος της παρακολούθησης, 88 ασθενείς είχαν πεθάνει από καρκίνο του πνεύμονα, 19 ασθενείς είχαν πεθάνει από άλλες αιτίες, και 17 ασθενείς χάθηκαν κατά την παρακολούθηση. Οι αιτίες των 19 μη-πνευμόνων θανάτων από καρκίνο ήταν πνευμονία (n = 11), χολαγγειοκυτταρικοί καρκίνωμα (n = 2), χρόνιας αποφρακτικής πνευμονοπάθειας (n = 1), σήψη (n = 1), εγκεφαλική απόφραξη (n = 1) , οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου (n = 1), γαστρικό καρκίνο (n = 1), και λευχαιμία (η = 1). Κανένας από αυτούς τους 19 ασθενείς είχαν θανάτους που σχετίζονται με χειρουργική επέμβαση. Στο 17 έχασε στη συνέχεια ασθενείς, όλα χάθηκαν κατά την παρακολούθηση λόγω της διακοπής νοσοκομείο συμμετοχή και δεν ήταν σε θέση να έρθει σε επαφή. Οι διάρκειες παρακολούθηση των 17 ασθενών που έχασαν την παρακολούθηση κυμάνθηκε 15-92 μήνες (διάμεση τιμή, 61 μήνες).

Η

Σχέση μεταξύ MYH9 έκφρασης και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά

Η οι σχέσεις μεταξύ των MYH9 έκφρασης και κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικά συνοψίζονται στον πίνακα 2. έκφραση MYH9 ήταν πιο συχνά ανιχνεύθηκε σε αδενοκαρκίνωμα ό, τι σε πλακώδες καρκίνωμα και άλλες ιστολογικές υποτύπους (

P

= 0,014). έκφραση MYH9 επίσης σχετίζεται με φτωχότερη διαφοροποίηση (

P

= 0.033), εντός του όγκου αγγειακή εισβολή (

P

= 0,013), και εντός του όγκου του λεμφικού εισβολή (

P

= 0,045) . Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ MYH9 έκφρασης και την ηλικία, το φύλο, τις συνήθειες καπνίσματος, το στάδιο π-ΤΝΜ, κομβική θέση, ή του υπεζωκότα εισβολή

Η

Kaplan-Meier εκτίμηση της επιβίωσης σε MYH9-θετικά και. – αρνητικούς ασθενείς

Όλοι οι ασθενείς συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση επιβίωσης. Οι συνολικές περιόδους παρακολούθησης κυμαίνονταν από 3 έως 129 μήνες (διάμεσος, 84 μήνες), και η πιθανότητα σωρευτική επιβίωση 5 χρόνια ήταν 70% για όλους τους ασθενείς. Επειδή μια αθροιστική πιθανότητα επιβίωσης του 50% δεν είχε ακόμη επιτευχθεί, ο συνολικός μέσος χρόνος επιβίωσης δεν προσδιορίστηκε. Η πιθανότητα αθροιστικής επιβίωσης 5-ετών ήταν 66% για την MYH9-θετική ομάδα και 78% για την MYH9-αρνητική ομάδα. Ενώ ο μέσος χρόνος επιβίωσης δεν ήταν διαθέσιμο, το ποσοστό επιβίωσης των MYH9-θετική ομάδα ήταν σημαντικά φτωχότερη ομάδα (

P

= 0,029) (Σχ. 5Α). Σε περαιτέρω αναλύσεις, MYH9 έκφραση συσχετίστηκε σημαντικά με φτωχότερη επιβίωση σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα (

P

= 0,007) (Εικ. 5Β) ή ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (

P

= 0,032) (Εικ . 5C). Η πιθανότητα επιβίωσης 5-ετών ήταν 69 και 85% για MYH9-θετικών και ασθενείς -αρνητικοί αδενοκαρκίνωμα, αντίστοιχα, και 43 και 74% για MYH9-θετικών και -αρνητικοί ασθενείς πλακώδες καρκίνωμα, αντίστοιχα.

(Α ) για όλους τους ασθενείς? (Β) για ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα? (C) για ασθενείς με καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων, αντιμετωπίζοντας όλες τις άλλες αιτίες θανάτου και έχασε την παρακολούθηση και λογοκρίνεται περιπτώσεις. MYH9 έκφραση συσχετίστηκε σημαντικά με φτωχότερη επιβίωση σε εκτομή NSCLCs.

Η

Επίδραση των MYH9 έκφρασης στην επιβίωση με ομοιόμορφη και πολυμεταβλητή ανάλυση

μονοπαραγοντική ανάλυση έγινε σύμφωνα με το μοντέλο αναλογικών κινδύνων Cox να αξιολογηθεί η επίδραση των MYH9 έκφρασης και άλλα κλινικοπαθολογικών παραγόντων στην επιβίωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ιστολογικό τύπο (HR, 1,94? 95% CI, 01.23 – 03.06?

P

= 0.004), το στάδιο π-ΤΝΜ (HR, 4,58? 95% CI, 2,89 – 7,26?

P

& lt? 0.001), επικουρική χημειοθεραπεία (HR, 2,81? 95% CI, 1,73 – 4,57?

P

& lt? 0.001), της διαφοροποίησης των όγκων (HR, 2,45? 95% CI, 1.53- 3,92?

P

& lt? 0.001), αγγειακή εισβολή (HR, 5,67? 95% CI, 3,25 – 9,90?

P

& lt? 0.001), λεμφική εισβολή (HR, 4,43? 95% CI, 2,65 – 7,40?

P

& lt? 0.001), του υπεζωκότα εισβολή (HR, 2,64? 95% CI, 1,73 – 4,03?

P

& lt? 0.001), και MYH9 έκφρασης (HR , 1,57? 95% CI, 1,03 – 2,39?

P

= 0.03) ήταν σημαντικοί προγνωστικοί καρκίνου ειδικά επιβίωσης. Επιπλέον, MYH9 έκφρασης και άλλα clinicopathlogical μεταβλητών, περιλαμβανομένου του ιστολογικό τύπο, το στάδιο π-ΤΝΜ, επικουρική χημειοθεραπεία, η διαφοροποίηση του όγκου, αγγειακή εισβολή, λεμφική εισβολή, και υπεζωκότα εισβολή είχαν τεθεί σε πολυπαραγοντική ανάλυση με τη χρήση του μοντέλου παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου του Cox. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι MYH9 έκφραση ήταν σημαντικά ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας μια φτωχότερη επιβίωση. (HR, 2,15? 95% CI, 1,17 – 3,92?

P

= 0,01) (Πίνακας 3)

Η

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, MYH9 εκφράστηκε σε 102 από 266 (38,3%) NSCLCs, και η έκφρασή της συσχετίστηκε σημαντικά με ιστολογία αδενοκαρκινώματος, φτωχότερες διαφοροποίηση, και εντός του όγκου αγγειακή και λεμφική εισβολή. Σε συμφωνία με προηγούμενες εκθέσεις του οισοφάγου [11], της ουροδόχου κύστης [12] και του γαστρικού καρκίνου [13], η παρούσα μελέτη αποκάλυψε ότι MYH9 έκφραση είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας και σχετίζεται με φτωχότερη πρόγνωση των ασθενών με εκτομή NSCLCs. Αν και Maeda et al. αναφερθεί ότι οι ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα σταδίου Ι λείπει η έκφραση είτε MYH9 ή vimentin δείχνουν ένα ευνοϊκό αποτέλεσμα, χωρίς μετεγχειρητική επικουρική χημειοθεραπεία [14], η παρούσα μελέτη αποκάλυψε ότι MYH9 έκφραση είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για την επιβίωση σε ασθενείς με εκτομή NSCLCs περιλαμβανομένης της παθολογικής στάδιο Ι-ΙΙΙ και των πνευμόνων καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων.

στην παρούσα μελέτη, MYH9 κηλίδωση ανιχνεύθηκε τόσο στην μεμβράνη και κυτόπλασμα ορισμένων καρκινικών κυττάρων, αν και η ένταση της χρώσης ήταν σημαντικά ισχυρότερη στην κυτταρική μεμβράνη. Σε ΜΟΑ-ΜΒ-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού εξαπλώνεται σε ινονεκτίνη, MYH9 παρατηρείται στην οριακή εξάπλωση φολιδωτή περιοχή των κυττάρων [9]. Επειδή MYH9 φέρεται να συμβάλει στην κυτταρική πολικότητα και ελασματοπόδια κατά περιφέρεια του κυττάρου και αιχμή, ισχυρή ένταση χρώσης στην κυτταρική μεμβράνη μπορεί να αντανακλά το MYH9 δραστικότητα στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή.

Τοπικές εισβολή μικροπεριβάλλον, όπως ενδοογκική lymphovascular διαπερατότητας, αποτελεί ένα σημαντικό βήμα στην πρώιμη φάση της μετάστασης όγκου. MYH9 συμβάλλει στην κυτταρική μετανάστευση που απαιτείται για την εισβολή του τοπικού μικροπεριβάλλοντος.

In vitro

, αρκετές μελέτες ανέφεραν ότι MYH9 εξαντλημένο κύτταρα έδειξε ελαττωματικό μετανάστευσης [10,11]. Επιπλέον, ο σχηματισμός ελασματοπόδια στην αιχμή του κυττάρου είναι απαραίτητη για τη μετανάστευση [23], και τέτοια σχηματισμός ελέγχεται από Rac, το συγκρότημα WAVE, και ARP2 /3complex [24]. Πρόσφατα, Morimura et al. ανέφεραν ότι MYH9 είναι επίσης απαραίτητο για τον σχηματισμό ελασματοπόδια με σύνδεση προς WAVE2 [25]. Έτσι, MYH9 έκφραση μπορεί να σχετίζεται με την εξαγορά της μετανάστευσης και της εισβολής των δυνατοτήτων των καρκινικών κυττάρων, τα οποία στη συνέχεια οδηγεί σε ιδιαίτερα εντός του όγκου lymphovascular εισβολή, και φτωχότερη πρόγνωση στην παρούσα μελέτη.

Στην παρούσα μελέτη, MYH9 έκφραση ήταν συσχετίστηκε σημαντικά με τις φτωχότερες της διαφοροποίησης των όγκων. Τα κακώς διαφοροποιημένο καρκίνωμα χαρακτηρίζεται από τη διευκόλυνση της κυτοκίνησης. Στην κυτοκίνηση, κύτταρα χτίσει μια συσταλτική δαχτυλίδι που συστέλλει την μεμβράνη του πλάσματος για τη δημιουργία δύο θυγατρικά κύτταρα που συνδέονται με μια κυτταροπλασματική γέφυρα. MYH9 συμβάλλει στη συρρίκνωση του συσταλτικές δαχτυλίδι και διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην κυτοκίνηση [26,27]. Επιπλέον, μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι η θεραπεία με blebbistatin, έναν αναστολέα του MYH9, οδηγεί στην αποτυχία της κυτοκίνησης [28]. Έτσι, δεν είναι εκπληκτικό ότι MYH9 έκφραση σχετίζεται με φτωχότερη διαφοροποίηση του όγκου στην παρούσα μελέτη.

Συμπέρασμα

Έχουμε αναφέρει ότι MYH9 εκφράζεται σε ένα υποσύνολο των NSCLC, και η έκφρασή του είναι που σχετίζονται με την ιστολογία αδενοκαρκινώματος, φτωχότερες διαφοροποίηση, εντός του όγκου αγγειακή εισβολή, εντός του όγκου λεμφική εισβολή, και μια φτωχότερη πρόγνωση. MYH9 έκφραση είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για την επιβίωση σε ασθενείς με εκτομή NSCLCs, αν και προγνωστική σημασία της εξακολουθεί να απαιτεί επιβεβαίωση με μεγαλύτερους πληθυσμούς ασθενών.