Αφηρημένο

Ion κανάλια και ροές ιόντων ελέγχουν πολλές πτυχές της ομοιόστασης των ιστών. Κατά τη διάρκεια της ογκογόνο μετασχηματισμό, λειτουργίες κρίσιμες διαύλου ιόντος μπορεί να διαταραχθεί αλλά διατηρημένη όγκου συλλιπάσματα ειδικών ιόντων παραμένουν να καθοριστούν. Εδώ χρησιμοποιήσαμε το ογκοκτόνο πρωτεΐνη-λιπιδίου ΑΜΛΕΤ ως ένας ανιχνευτής για τον εντοπισμό ροές ιόντων που συμμετέχουν στην κυττάρου όγκου θάνατο. Δείχνουμε ότι ΑΜΛΕΤ ενεργοποιεί ένα μη επιλεκτικό τρέχουσα κατιόντων, η οποία έφθασε σε μέγεθος 2.74 ± 0.88 nA κατά 1,43 ± 0,13 λεπτά από ΑΜΛΕΤ εφαρμογή. Ταχεία ροές ιόντων ήταν απαραίτητα για ΑΜΛΕΤ-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο καρκίνωμα ως αναστολείς (αμιλορίδη, BaCl

2), εμποδίζοντας τις αλλαγές στην ελεύθερη κυτταρικό Na

+ και Κ

+ συγκεντρώσεις εμπόδισε επίσης βασικά βήματα που συνοδεύουν κυτταρικό καρκίνωμα θάνατο , συμπεριλαμβανομένων των μεταβολών στη μορφολογία, την πρόσληψη, την παγκόσμια μεταγραφής, και ενεργοποίηση ΜΑΡ κινάσης. Μέσα από την παγκόσμια συστοιχίες ανάλυση της μεταγραφής και της φωσφορυλίωσης, μια ισχυρή ροή ιόντων εξαρτάται p38 ΜΑΡΚ απάντηση ανιχνεύθηκε και η αναστολή της σηματοδότησης ρ38 καθυστερήσει ΑΜΛΕΤ που προκαλείται από το θάνατο. Υγιή, τα διαφοροποιημένα κύτταρα ήταν ανθεκτικά στην πρόκληση ΑΜΛΕΤ, η οποία συνοδεύτηκε από την έμφυτη ανοσία και όχι p38-ενεργοποίηση. Τα αποτελέσματα δείχνουν, για πρώτη φορά, ένα ενοποιητικό μηχανισμό για την έναρξη της ευρείας και ταχείας θανατηφόρο αποτέλεσμα Άμλετ στα κύτταρα του όγκου. Τα ευρήματα αυτά είναι ιδιαίτερα σημαντικά ενόψει της τεκμηριωμένη θεραπευτική αποτελεσματικότητα του Άμλετ σε ανθρώπινες μελέτες και ζωικά μοντέλα. Τα αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι ΑΜΛΕΤ προσφέρει δύο επιπέδων θεραπευτική προσέγγιση, σκοτώνοντας τα καρκινικά κύτταρα, τονώνοντας παράλληλα μια έμφυτη ανοσολογική απόκριση σε περιβάλλοντες υγιείς ιστούς

Παράθεση:. Θύελλα P, Kjaer Klausen T, Trulsson Μ, Χο CS J, Dosnon Μ, Westergren Τ, et al. (2013) A Unifying Μηχανισμός θάνατο των καρκινικών κυττάρων μέσω Ion ενεργοποίηση καναλιών από Άμλετ. PLoS ONE 8 (3): e58578. doi: 10.1371 /journal.pone.0058578

Επιμέλεια: Irina V. Λεμπέντεβα, Enzo Life Sciences, Inc., Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 του Αύγ, 2012? Αποδεκτές: 6 Φεβ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 7 Μαρτίου του 2013

Copyright: © 2013 Storm et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την επιχορήγηση θεμέλια Sharon Δ Lund και την αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία, η σουηδική Αντικαρκινική Εταιρεία, η Ιατρική Σχολή (Πανεπιστήμιο του Lund), το Ίδρυμα Söderberg, το Ίδρυμα Segerfalk, η Άννα-Λίζα και Sven-Erik Ίδρυμα Lundgren Ιατρικών Ερευνών , το Ίδρυμα Knut και Alice Wallenberg, ο Lund Πόλη Jubileumsfond, ο Γιάννης και η Augusta Ίδρυμα Persson Ιατρικών Ερευνών, το Ίδρυμα Μάγκι Stephens, το Ίδρυμα Gunnar Nilsson Καρκίνου, η Inga-Britt και Arne Ίδρυμα Lundberg, το Ίδρυμα HJ Forssman Ιατρικών Ερευνών και η Royal Society φυσιογραφικούς. Υποστήριξη ελήφθη επίσης από το Συμβούλιο της Δανίας για ανεξάρτητη έρευνα (Ιατρικές επιστήμες). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας ΑΜΛΕΤ κατέχονται από ΑΜΛΕΤ Pharma – ένα εμπορικά ανενεργή εταιρεία.. Οι μελέτες που περιγράφονται σε αυτό το χειρόγραφο δεν υποστηρίζεται από εμπορικές πηγές /συνεργασίες. Οι συγγραφείς έχουν κατέθεσε αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας που περιέχουν πληροφορίες σχετικές με αυτό το χαρτί. Τον αριθμό της αίτησης είναι WO 2012/069836. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνω ότι αυτό το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

κανάλια ιόντων αποτελούν προϋπόθεση για τη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων. Είναι άκρως συντηρημένες μέσω της εξέλιξης, και ενεργοποιούνται από μία μεγάλη ποικιλία σημάτων, συμπεριλαμβανομένων μηχανικών δυνάμεων, τάση, ρΗ, οι αλληλεπιδράσεις πλέγματος και δραστικότητα υποδοχέα αυξητικού παράγοντα [1], [2], [3], [4], [5] , [6]. Ως αποτέλεσμα, τα κανάλια ιόντων διευκολύνει την κυτταρική προσαρμογή σε διαφορετικά φυσικά περιβάλλοντα, ρυθμίζοντας πολλαπλασιασμό και την απόπτωση, την ανάπτυξη των οργάνων και ομοιόστασης. ενεργοποίηση κανάλι ιόντων έχει προταθεί να ρυθμίζουν τη δραστηριότητα των βασικών κυτταρικών καταρρακτών σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του ρ38 μιτογόνο ενεργοποιημένη πρωτεΐνη κινάσες (MAPKs), υδρολάσες τριφωσφορική μικρό γουανίνη (GTPases), η φωσφατιδυλ-ινοσιτόλη-3-κινάσης (ΡΙ3Κ) -Akt μονοπατιού, NFκB- και Ca

2 + εξαρτώμενη μονοπατιών σηματοδότησης [7], [8]. Πρόσφατα, απορύθμιση διαύλων ιόντων έχει προταθεί για την προώθηση επίσης κακοήθη μετασχηματισμό, ογκογένεση και μετάσταση, προτείνοντας ένα κεντρικό ρόλο των διαύλων ιόντων για την ανάπτυξη του καρκίνου. Πράγματι, ένα ευρύ φάσμα των διαύλων ιόντων, συμπεριλαμβανομένων Ca

2+, Κ

+, Na

+, και Cl

– κανάλια, και μη εκλεκτικά διαύλους κατιόντων, έχουν εμπλακεί σε διάφορες πτυχές της ανάπτυξης του καρκίνου (για σχόλια, δείτε [1], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]).

ΑΜΛΕΤ (ανθρώπινο άλφα-λακταλβουμίνη γίνει θανατηφόρο σε κύτταρα όγκου) είναι το πρώτο μέλος μιας νέας οικογένειας ογκοκτόνο μορίων με αξιοσημείωτες ιδιότητες. Συγκροτήθηκε από μερικώς αναδιπλωμένη α-λακταλβουμίνη και με ελαϊκό οξύ ως αναπόσπαστο συστατικό [16], [17], ΑΜΛΕΤ ανακαλύφθηκε από serendipity όταν μελετούν την ικανότητα του ανθρώπινου γάλακτος για την πρόληψη βακτηρίδια από δέσμευση σε κύτταρα-ξενιστές. Πρόωρη

in vitro

πειράματα έδειξαν ότι ΑΜΛΕΤ εμφανίζει ευρεία δράση κατά των όγκων με υψηλό βαθμό επιλεκτικότητας του όγκου [16], [17]. Μεταγενέστερες θεραπευτικές μελέτες σε ασθενείς και ζωικά μοντέλα έχουν επιβεβαιώσει HAMLET’s αντικαρκινική δράση και τη σχετική εκλεκτικότητα για τον ιστό του όγκου

in vivo

. θεραπεία ΑΜΛΕΤ καθυστερήσει την εξέλιξη του όγκου και οδήγησε σε αυξημένη επιβίωση σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος γλοιοβλαστώματος αρουραίου χωρίς ενδείξεις κυτταρικού θανάτου σε υγιή ιστό του εγκεφάλου [18]. Η τοπική χορήγηση ΑΜΛΕΤ αφαιρεθεί ή να μειωθεί το μέγεθος των θηλωμάτων του δέρματος, όπως φαίνεται, χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο, με διετή παρακολούθηση [19]. Τοπική ενστάλαξη ΑΜΛΕΤ σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης σκοτώθηκαν ταχέως καρκινικά κύτταρα χωρίς τοξικές επιδράσεις σε υγιείς ιστούς που περιβάλλουν τον όγκο [20] και η θεραπευτική αποτελεσματικότητα ΑΜΛΕΤ καταδείχθηκε σε ένα μοντέλο ποντικού καρκίνου της ουροδόχου κύστης [21]. Πρόσφατα, από του στόματος χορήγηση ΑΜΛΕΤ έχει δείξει θεραπευτικές καθώς και προφυλακτικές αποτελεσματικότητα κατά του καρκίνου του παχέος εντέρου σε ποντίκια min APC (GUT, in press).

Η ευαισθησία για ΑΜΛΕΤ τουλάχιστον εν μέρει αντανακλά την αυξημένη έκφραση του ογκογονιδίου c-Myc και απορυθμισμένης γλυκόλυση σε καρκινικά κύτταρα [22], αλλά οι ειδικές αλληλεπιδράσεις μεμβράνη που κινεί τη διαδικασία κυτταρικού θανάτου ΑΜΛΕΤ επαγόμενη δεν έχουν καθοριστεί. Cellular αποκρίσεις σε ΑΜΛΕΤ είναι αρκετά ταχεία σε σύγκριση με επαγωγείς κυτταρικού θανάτου όπως FAS συνδέτη ή ΤΝΡ-α [23], που συνεπάγεται μια πιο άμεση και γενικό μηχανισμό για την ανίχνευση ΑΜΛΕΤ στην κυτταρική μεμβράνη από τα παραδοσιακά μέσω επαγωγής απόπτωσης εξωγενή. Στις αρχικές μελέτες, ανιχνεύσαμε ταχεία Ca

2+ ροές μετά την έκθεση των καρκινικών κυττάρων σε ΑΜΛΕΤ [17], γεγονός που υποδηλώνει ότι τα κανάλια ιόντων ή /και οι μεταφορείς θα μπορούσε να ενεργοποιηθεί. Πρόσφατα, δραματικές αλλαγές στη δομή των τεχνητών, οι μεμβράνες υποδοχέα-free και κυστίδια πλασματικής μεμβράνης από τα καρκινικά κύτταρα έχουν παρατηρηθεί μετά ΑΜΛΕΤ πρόκληση [24]. Στρογγυλεμένο, ορίζεται κυστίδια αλλάξει μορφολογία να άμορφο σχήματα, αντανακλώντας τον σχηματισμό μακράς διατάσεις μεμβράνη με αυξημένη ρευστότητα. Μια παρόμοια απάντηση σε ΑΜΛΕΤ παρατηρήθηκε σε κυστίδια μεμβράνης πλάσματος από τα κύτταρα καρκινώματος, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι άμεσες επιπτώσεις της μεμβράνης μπορεί να συμβάλλουν στο φαινόμενο του ογκοκτόνο του Άμλετ. Κανονική διαφοροποιημένα κύτταρα δεν έδειξε στοιχεία της διατάραξης μεμβράνης [24], γεγονός που υποδηλώνει ότι οι διαταραχές της μεμβράνης μπορεί να χαρακτηρίσει ΑΜΛΕΤ ευαίσθητα κύτταρα του όγκου.

Αυτή η μελέτη χαρακτηρίζεται ροές ιόντων που προκλήθηκε από ΑΜΛΕΤ και εξέτασε το ρόλο τους στην καρκινικών κυττάρων θάνατο. Δείχνουμε ότι ΑΜΛΕΤ ενεργοποιεί ένα ολόκληρο κύτταρο μη επιλεκτικό ρεύμα κατιόν, την οποία χαρακτηρίζουν ηλεκτροφυσιολογικά. Είναι σημαντικό ότι, δείχνουμε ότι ροές ιόντων είναι απαραίτητες για την έναρξη ΑΜΛΕΤ-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο καρκινικών και να διακρίνει κύτταρα όγκου από τα φυσιολογικά κύτταρα σε αυτό το πλαίσιο. Οι επιδράσεις του Άμλετ στη βιωσιμότητα καρκινικών κυττάρων αντιστράφηκαν με αμιλορίδη ή BaCl

2, μη-ειδικοί αναστολείς διαφόρων διαύλων ιόντων και μεταφορέων. Παράλληλα, οι αλλαγές στη μορφολογία, ροές ιόντων, παγκόσμια μεταγραφή, ΜΑΡΚ σηματοδότησης και p38 ΜΑΡΚ-εξαρτώμενη καρκινικών κυττάρων θανάτου ήταν επίσης καταργηθεί. Επιπλέον, η απόκριση των φυσιολογικών, διαφοροποιημένων κυττάρων προς ΑΜΛΕΤ έδειξε σημαντικές διαφορές από εκείνη των καρκινικών κυττάρων, που ορίζεται από το πρότυπο των αλλαγών στην παγκόσμια μεταγραφή, σηματοδοτώντας ενεργοποίηση μονοπατιού και την επιβίωση. Η δημιουργία ενός μη-επιλεκτική, αμιλορίδη ευαίσθητο κανάλι κατιόντων ως απαραίτητη για ΑΜΛΕΤ που προκαλείται θάνατο των καρκινικών κυττάρων περιγράφει ένα μέχρι σήμερα άλυτο μηχανισμό και μπορεί να αντιπροσωπεύει μια νέα θεραπευτική επιλογή.

Υλικά και Μέθοδοι

ΑΜΛΕΤ

Παραγωγή

α-λακταλβουμίνη καθαρίστηκε από απολιπανθέντα ανθρώπινο γάλα με καθίζηση με θειικό αμμώνιο και χρωματογραφία υδρόφοβης αλληλεπίδρασης και μετατρέπεται σε ΑΜΛΕΤ με μερική εκτυλίσσεται και πρόσδεση σε ελαϊκό οξύ, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, η μητρική α λακταλβουμίνη διαλύθηκε σε Tris (10 mM Tris /HCl ρΗ 8,5) και Ca

2+ απομακρύνθηκε με την προσθήκη 3,5 mM EDTA. Το μερικώς ξεδιπλωμένη πρωτεΐνη εφαρμόστηκε σε μια μήτρα ϋΕΑΕ-Trisacryl Μ προ-ρυθμισμένο με ελαϊκό οξύ σε ρΗ 8.5 (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Το συγκρότημα ΑΜΛΕΤ εκλούσθηκε με μία βαθμίδα NaCl. Η διαπίδυση χρησιμοποιήθηκε για να απομακρυνθεί η περίσσεια άλατος και ΑΜΛΕΤ λυοφιλίστηκε και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C. Η καθαρότητα του κάθε ΑΜΛΕΤ παρτίδα επιβεβαιώθηκε με SDS PAGE (NuPAGE, Invitrogen) και δραστικότητα με την ποσοτικοποίηση κυτταρικού θανάτου, όπως περιγράφεται παρακάτω.

Το ανθρώπινο γάλα ελήφθη από ατομικούς δότες, αφού υπογραφεί ενημερωμένη συγκατάθεση. Κάθε δότης γνώριζε ότι τα δείγματα μπορούν να χρησιμοποιούνται στην επιστημονική έρευνα. Τα δείγματα de-εντοπίστηκαν και ελήφθησαν μέτρα για την προστασία ταυτότητα των συμμετεχόντων. Η διαδικασία εγκρίθηκε από την επιτροπή ανθρώπινη ηθική της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Lund, Lund, Σουηδία.

Cells

Για τον εντοπισμό οδών συντηρημένες απάντηση εξηγώντας τους γενικούς ογκοκατασταλτικό επιπτώσεις της ΑΜΛΕΤ [25] όγκου κύτταρα που διαφέρουν ως προς την καταγωγή των ιστών, ογκογονίδιο ρεπερτόριο, τη σύνθεση της κυτταρικής μεμβράνης, της έκφρασης κανάλι ιόντων και την ικανότητα ανάπτυξης χρησιμοποιήθηκαν. κύτταρα Τ-λεμφώματος κυττάρων (Jurkat), καρκίνωμα πνεύμονα (Α549), ωοθηκών καρκίνωμα (HeLa) και των νεφρών (Α498) κύτταρα καρκινώματος (ATCC, Manassas, VA) καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 με μη ουσιώδη αμινοξέα (1:100 ), 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, γενταμικίνη (50 μg /ml, Gibco, Paisley, UK), και 5% (Α549 και Jurkat) ή 10% (HeLa και Α498) ορό εμβρύου μόσχου (FCS, Gibco), αντίστοιχα. Υγιή, διαφοροποιημένα ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα νεφρού (HRTEC) σε πρωτογενή καλλιέργεια ευγενώς από τον καθηγητή Δ Karpman (Πανεπιστήμιο του Lund, Lund, Σουηδία) μετά από δεοντολογική έγκριση από την Επιτροπή Ιατρικής Ηθικής του Πανεπιστημίου Lund Ιατρική Σχολή (αριθμός απόφασης LU 456- 96). Αυτά τα κύτταρα έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι είναι ανθεκτικά στις θανατηφόρα αποτελέσματα της ΑΜΛΕΤ [16]. HRTECs καλλιεργήθηκαν σε DMEM /F12 με 15% FCS (όπως στο [26]) Πρωτογενή κύτταρα RPTEC (ανθρώπινο νεφρικό εγγύτατο σωληνάριο επιθηλιακά κύτταρα) αγοράστηκαν από την Lonza (Basel, Switzerland) και καλλιεργήθηκαν σε DMEM-F12 συμπληρωμένου με ΝΕΑΑ, πυροσταφυλικό νάτριο , γενταμυκίνη, glutamax και 15% FBS (Gibco).

κυτταρικού θανάτου Δοκιμασίες

κύτταρα καρκινώματος αποκολλήθηκαν από φιάλες καλλιέργειας κυττάρων με Versen (0,2 g EDTA σε 200 ml H

2O και 800 ml PBS) πλύθηκαν με PBS και επαναιωρήθηκαν σε RPMI-1640 χωρίς ορό. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια πυκνότητα 50,000 /φρεάτιο σε πλάκα 24-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα σε μέσο ανάπτυξης. ΑΜΛΕΤ διαλυμένο σε PBS επωάσθηκε με κύτταρα σε μέσο άνευ ορού και FCS προστέθηκαν μετά από 1 ώρα. κύτταρα Jurkat σε εναιώρημα (& gt? 80% βιώσιμα) αναμίχθηκαν με ΑΜΛΕΤ στους 37 ° C σε μια πυκνότητα των 10

6 /ml σε μέσο χωρίς ορό. Όλες οι μετρήσεις κυτταρικού θανάτου διεξήχθησαν τρεις ώρες μετά την προσθήκη ΆΜΛΕΤ, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Ο κυτταρικός θάνατος προσδιορίσθηκε ποσοτικά με αποκλεισμό trypan blue (Chroma Gesellschaft Schmid & amp? Co) μετρώντας τουλάχιστον 300 κύτταρα /δείγμα ή με μέτρηση των επιπέδων ΑΤΡ (ΑΤΡϋίβ Kit, PerkinElmer, άπειρη F200, Tecan). Φως εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας το HoloMonitor ™ M2 ψηφιακή ολογραφική μικροσκόπιο (Φάση ολόγραμμα απεικόνισης ΑΒ, Lund, Σουηδία). Trypan blue είναι μια κλασσική ζωτικής χρωστικής, αντανακλώντας την απώλεια της ακεραιότητας της μεμβράνης σε κύτταρα πεθαίνουν. ATP χρησιμοποιείται ευρέως ως υποκατάστατο βιοχημικός δείκτης για τη βιωσιμότητα, με βάση τις παραδοχές που ζωντανά κύτταρα παράγουν ΑΤΡ και είναι απαραίτητο για την κυτταρική ζωή [27]. κύτταρα κατεργασμένα ΑΜΛΕΤ έχουν προηγουμένως εξεταστεί για απόδειξη του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, συμπεριλαμβανομένων απόπτωση και autophagy [28], [29]. Ενώ οι κασπάσες και αυτοφαγία ενεργοποιείται σε κύτταρα επεξεργασμένα ΑΜΛΕΤ, η αναστολή αυτών των οδών δεν διασώσει τα κύτταρα από τον Άμλετ που προκαλείται από το θάνατο. Ως εκ τούτου, αποπτωτικών και αυτοφαγικά παράμετροι είναι απίθανο να εξηγήσει τις ΑΜΛΕΤ-επαγόμενη συνέπειες και δεν εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη.

Η ενδοκυτταρική ιόντων Συγκεντρώσεις και Ion Συλλιπάσματα

Οι σχετικές, δωρεάν ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις Ca

2+ ([Ca

2 +]

i) και Na

+ ([Na

+]

i) εκτιμήθηκαν με τη χρήση του δείκτη ασβεστίου Fluo-4 ΒΔ και το φθοροφόρο νατρίου CORONA Green, αντίστοιχα (Invitrogen). Για Ca

2+ μετρήσεις, τα κύτταρα Α549 δόθηκε φρέσκο ​​μέσον με Fluo-4 NW (5 μΜ) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά, και στη συνέχεια κατεργάζεται όπως υποδεικνύεται. Fluo-4 φθορισμός μετρήθηκε στα 535 nm μετά από διέγερση στα 485 nm χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη πλάκας φθορισμού (TECAN άπειρη F200, Tecan Group, Ελβετία). Το Ca

2 + ιονοφόρου Α23187 (1 μΜ, Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας. Σχετική [Na

+]

i μετρήθηκε σε κύτταρα Jurkat με φόρτωση των κυττάρων με το δείκτη νάτριο Corona Green (Invitrogen) σε 10 μΜ για 30 λεπτά. Για την εκτίμηση της Κ

+ ροές, η δοκιμασία δίαυλο ιόντων καλίου FluxOR ™ (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν με FluxOR ™, το οποίο είναι ένα ΤΙ

+ δείκτη. Μία αύξηση στο σήμα φθορισμού αντιστοιχεί σε μια εισροή των ΤΙ

+, υποδεικνύοντας άνοιγμα των διαύλων καλίου, το οποίο μετρήθηκε στα 535 nm μετά από διέγερση στα 485 nm σε αναγνώστη πλακός άπειρο TECAN. Κ

+ ροές και [Ca

2 +]

i είχαν επιπλέον αναλύθηκαν με συνεστιακή απεικόνιση. Εικόνες συνελήφθησαν κάθε 10 s για 5 λεπτά σε LSM 510 META ομοεστιακό μικροσκόπιο (520 nm εκπομπή μετά από διέγερση στα 488 nm).

Μετρήσεις Patch σφιγκτήρας

Λύσεις.

Η πρότυπο εξωκυτταρικό διάλυμα περιείχε (σε mM): 150 NaCl, 6 ΟδΟΙ, 2 MgCl

2, 1 CaCl

2, 10 HEPES, 10 γλυκόζη και το ρΗ ρυθμίστηκε στο 7,4 χρησιμοποιώντας ΝαΟΗ. Το διάλυμα πιπέτας για πρότυπο μέτρησης περιείχε (σε mM): ΟδΟΙ 20, 100 Cs-ασπαρτικό, 1 MgCl

2, 0,08 CaCl

2, 10 HEPES, 10 1,2-δις (2-αμινοφαινοξυ) αιθανο- Ν, Ν, Ν ‘, Ν’-τετραοξικό (ΒΑΡΤΑ), 4 Na

2-ΑΤΡ και το ρΗ ρυθμίστηκε στο 7.2 χρησιμοποιώντας CsOH. Η ελεύθερη συγκέντρωση ασβεστίου αυτού του διαλύματος είναι -200 ηΜ. Για εκτίμηση της σχετικής διαπερατότητας των μονοσθενών κατιόντων το εξωκυτταρικό διάλυμα περιείχε: (σε mM) 20 CsCl, 130 XCL, 10 HEPES και γλυκόζη 10 όπου το Χ αντιπροσωπεύει την αντίστοιχη μονοσθενές κατιόν (Na

+, Κ

+, ή cs

+). Όλα τα διαλύματα ρυθμίστηκαν σε ρΗ 7,4 χρησιμοποιώντας Tris. Το διάλυμα της πιπέτας για τις μετρήσεις επιλεκτικότητα ήταν: (σε mM) 100 Cs-ασπαρτικό, 20 XCL, 10 HEPES και 10 γλυκόζης, με Χ = Na

+, Κ

+, ή Cs

4 Na

2-ΑΤΡ και 5 αιθυλενογλυκόλη τετραοξεικό οξύ (EGTA) με Χ = Na

+, K

+ ή Cs

+. ρΗ ρυθμίστηκε στο 7.2 χρησιμοποιώντας Tris. Για να διατηρηθεί η ιοντική σύνθεση, ΑΜΛΕΤ, α-λακταλβουμίνη και ελαϊκό άμεσα διαλύονται σε λύσεις καταγραφής.

Ηλεκτροφυσιολογική εγγραφής.

Για μετρήσεις patch clamp, Α549 κύτταρα όπου σπέρνονται σε στρογγυλά καλύμματα 24-48 ώρες πριν από τη μέτρηση. Οι μετρήσεις έγιναν σε θερμοκρασία δωματίου με σταθερή αιμάτωσης. Ρεύματα ολόκληρου κυττάρου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν ενισχυτή EPC10-USB (ΗΕΚΑ Elektronik, Lambrect, Γερμανία), χρησιμοποιώντας ρήξη μπαλώματα. αντίσταση πιπέτα ήταν 6,5 ± 0,4 ΜΩ σε ασύμμετρη λύσεις. Χωρητικότητα και αντίσταση σειράς καταγράφηκαν συνεχώς και το 65% της αντίστασης σειράς ήταν ηλεκτρονικά αντιρροπούμενη για τη μείωση των σφαλμάτων τάσης. Ως ηλεκτρόδιο αναφοράς, Ag-AgCl ηλεκτρόδιο χρησιμοποιήθηκε υπό πρότυπες συνθήκες, ενώ μια γέφυρα άγαρ 3 Μ KCl χρησιμοποιήθηκε για τις μετρήσεις της επιλεκτικότητας. Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση όπου μια ράμπα 400 ms γραμμική τάση από -100 mV έως 100 mV. Το πρωτόκολλο ξεκίνησε από μια προ-παλμού 50 ms σε -100 mV και ακολουθείται από 1550 ms στα -30 mV. Όλα τα δεδομένα φιλτράρονται 2,9 kHz και δειγματοληψίας 1 kHz.

Υπολογισμός της σχετικής διαπερατότητας.

Λόγω της σχετικά στενό παράθυρο του χρόνου από τον Άμλετ διέγερση για να σφραγίσει ρήξη (πιθανώς αντανακλά διαταραχή της μεμβράνης από ΑΜΛΕΤ , βλέπε αποτελέσματα), σχετικές αναλογίες διαπερατότητας υπολογίστηκαν από τις απόλυτες δυναμικά αντιστροφή (V

rev) χρησιμοποιώντας την εξίσωση [30]: όπου Ρ

το Χ αντιπροσωπεύει δίνει τη διαπερατότητα του δεδομένου ιόντος [X

+]

i, [X

+]

e αντιπροσωπεύει την ενδοκυτταρική και εξωκυτταρική συγκεντρώσεις, και F, T, R έχει φυσιολογικές τιμές τους. Η σχετική Ca

2 + διαπερατότητα υπολογίστηκε ως [30]:.

στην οποία α = P

Na /P

Cs

Πριν από υπολογισμούς, V

rev διορθώθηκε για υγρά δυναμικά κόμβο [31] (V

LJ) ως εξής:.

V

LJ υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το ενσωματωμένο λογισμικό JPCalcW σε Clampex7 (Αχοη Instruments, USA)

ομοεστιακή μικροσκοπίας

για συνεστιακή μικροσκοπία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για μία νύχτα σε διαφάνειες 8-καλά θάλαμο (Nalge Nunc Α /S, Roskilde, Δανία). Μετά από τις αντίστοιχες πειραματικές διαδικασίες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 3.7% παραφορμαλδεΰδη, πυρήνες και μεμβράνης πλάσματος βάφτηκαν με DRAQ5 (eBiosciences) και Alexa-Fluor 488-σημασμένο συγκολλητίνη φύτρου σιταριού (Invitrogen) και εξετάστηκαν σε ένα LSM 510 DUO συνεστιακό μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας ένα 63 × αντικειμενικό φακό λαδιού (Carl Zeiss, Jena, Germany). Η 488 nm Argon γραμμή λέιζερ χρησιμοποιείται για να διεγείρει Alexa Fluor-488 φθορισμού, η οποία ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο μπάντα από 505 έως 530 nm. Alexa Fluor-568 διεγέρθηκε με χρήση του λέιζερ HeNe543 nm, και ο φθορισμός ανιχνεύθηκε με τη χρήση ενός φίλτρου ζώνης πέρασμα από 560 να 615 nm. Το λέιζερ HeNe 633 nm χρησιμοποιήθηκε για να διεγείρει DRAQ5, και ο φθορισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο 650 μακράς-pass. Για την αναστολή διαύλων ιόντων, τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με αναστολείς μέσο που περιέχει για 30 λεπτά και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 35 μΜ ΑΜΛΕΤ (3,5 μΜ Alexa-Fluor 568-σημασμένο ΑΜΛΕΤ (Invitrogen, Carlsbad, CA) και 31,5 μΜ μη επισημασμένου ΑΜΛΕΤ) σε ελεύθερο ορού μέσον. Για την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων, τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C, οι πυρήνες χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 (Invitrogen) και Alexa Fluor-568-σημασμένο ΑΜΛΕΤ προστέθηκε σε μέσο χωρίς ορό. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2 και οι εικόνες συλλέχθηκαν τακτικά με συνεστιακή μικροσκοπία, χρησιμοποιώντας ένα LSM 510 META (Carl Zeiss, Jena, Germany).

Transcriptomic Ανάλυση

για την ανάλυση μικροσυστοιχίας, 200.000 κύτταρα Α549 /φρεάτιο αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη την νύχτα σε 6-φρεατίων. Μετά από 1 ώρα θεραπείας ΑΜΛΕΤ (21 μΜ), συνδεδεμένη καθώς και επιπλέοντα κύτταρα λύθηκαν και το RNA εκχυλίσθηκε με χρήση του RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Τα δείγματα αποστέλλονται στο AROS Εφαρμοσμένη Βιοτεχνολογία (Aarhus, Δανία) για την ανάλυση και τρέξιμο στο ανθρώπινο γονιδίωμα U219 Array Πλάκα σύμφωνα με τυποποιημένα πρωτόκολλα Affymetrix. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση R και Bioconductor (https://www.r-project.org). Τα ακατέργαστα δεδομένα ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας RMA (Irizarry et al., 2003), στην οποία πρώτες εντάσεις είναι υποβάθρου διορθωμένη, log2 μετασχηματίζεται και στη συνέχεια κανονικοποιείται χρησιμοποιώντας ποσοστιαία σημεία. Ένα γραμμικό μοντέλο είναι εφοδιασμένο με τα δεδομένα για την απόκτηση τιμή έκφρασης για κάθε σετ καθετήρα. Η κανονικοποιημένα δεδομένα βρέθηκε να είναι άριστης ποιότητας με υψηλή επανάληψη συσχέτισης (& gt? 0,99) και nΧρησιμοποιήστε το (κανονικοποιημένη unscaled λάθη) τιμές κοντά στο 1 (εύρος 0,994 – 1,008). Να αντλήσει διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων ένα γραμμικό μοντέλο εξοπλισμένο με το πακέτο limma Bioconductor και τα γονίδια με τα εμπειρικά Bayes προσαρμοσμένη τιμές p & lt? 0.05 και log2 φορές αλλαγών & gt? 1 θεωρήθηκαν που εκφράζονται διαφορικά και είχαν χαρακτηρισθεί λειτουργικά με τη χρήση της βάσης δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και ολοκληρωμένη Discovery (DAVID?.. (Dennis et al, 2003) και την εφευρετικότητα ανάλυση οδό για την εκτεταμένη ανάλυση μικροσυστοιχιών, η γονιδιακή έκφραση αξιολογήθηκε από ολόκληρο το γονιδίωμα Illumina μικροσυστοιχίες (HumanHT-12 έκφραση BeadChip) δεδομένα ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας πολλαπλής συσχέτισης [32. ] τα γονίδια με Benjamini-Hochberg προσαρμοσμένη τιμή p & lt?.. 0.05 και log2 αλλαγή φορές ≥1.2 στα καρκινικά κύτταρα και ≥2.0 σε φυσιολογικά, διαφοροποιημένα κύτταρα σε οποιοδήποτε χρονικό σημείο είχαν θεωρηθεί ως διαφορικά εκφρασμένων Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών ήταν εγγεγραμμένοι στο Gene NCBI του έκφραση Omnibus (GEO) βάση δεδομένων (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo) με αριθμό ένταξης GSE23772.

Δυτική κηλίδες και κυτταροκινών Ποσοτικοποίηση

Για κηλίδες Western , 200.000 κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα σε 6-φρεατίων, που εκτίθενται σε διαφορετικές πειραματικές συνθήκες και λύθηκαν σε Μ-PER ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Pierce, Rockford, IL) που περιείχε Complete κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και PhosSTOP αναστολέα φωσφατάσης κοκτέιλ (και τα δύο από τη Roche, Mannheim, Germany). Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση συγκεντρώσεις και πρωτεΐνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας την πρωτεΐνη DC Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) σε αναγνώστη πλάκας Tecan άπειρη. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε πηκτώματα 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) και στυπώθηκαν σε μεμβράνες PVDF (GE Healthcare). Οι μεμβράνες κορεσμένο με BSA (GAPDH), άπαχο ξηρό γάλα (φωσφο-ρ38 ΜΑΡΚ, p38 ΜΑΡΚ, φωσφο-ERK1 /2, ERK1 /2, ATF6, φωσφο-eIF2α) ή Sat-1 και Sat-2 (α-λακταλβουμίνη) και επωάστηκαν με αντι-βόειας α-λακταλβουμίνη (1:500, Bethyl Laboratories, Montgomery, Texas), αντι-ρ38 ΜΑΡΚ, αντι-φωσφο- (Thr180 /Tyr182) p38 ΜΑΡΚ, αντι-ERK1 /2, αντι-φωσφο- ( Thr202 /Tyr204) -ERK, αντι-φωσφο-eIF2α (ser51) (όλα 1:500-1000, Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), αντι-ATF6 (1:1000, img-273, Imgenex) ή αντι-GAPDH (1:3000-5000, Novus Biologicals) αντισωμάτων που ακολουθείται από συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου αντι-κουνελιού (1:1000, DakoCytomation, Glostrup, Denmark), αντι-κατσίκα (1:1000, Sigma Aldrich) ή αντι-ποντικού (1: 40,000 με 50,000, Novus Biologicals) δευτερογενή αντισώματα για χρώση. Συνδεδεμένα αντισώματα ανιχνεύτηκαν με αντιδραστήριο ECL Plus Western Blotting (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) και τον εξοπλισμό GelDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Για τον έλεγχο για την ίση φόρτωση, μεμβράνες απογυμνώθηκαν με Επαναφορά Western Blot απογύμνωσης Buffer (Pierce), μπλοκάρει και ξαναϊχνηθετούνται με νέα αντισώματα. Για πειράματα siRNA, ίσους όγκους προϊόντων λύσης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε πηκτώματα 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) και στυπώθηκαν σε μεμβράνες PVDF.

φωσφορυλίωση ΜΑΡΚ αναλύθηκε σε μία συστοιχία Ανθρώπινα Phospho-ΜΑΡΚ ( Proteome Profiler Array, R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Band και spot εντάσεις ποσοτικά με τη χρήση ImageJ [33]. Κυτοκίνης ποσοτικός προσδιορισμός (IL-6, IL-8, TNF-α) εκτελέστηκε σε ένα IMMULITE 1000 σύστημα ανοσοδοκιμασίας (Siemens Diagnostics, Deerfield, IL).

Αναστολείς και RNAi

Η φαρμακολογική διαύλων ιόντων οι αναστολείς που χρησιμοποιούνται ευρέως ως εργαλεία για να καθορίσουν τη λειτουργία της συγκεκριμένης τάξεις διαύλων ιόντων. Αμιλορίδη αναστέλλει αρκετές Na

+ – που μεταφέρουν τα κανάλια και τους μεταφορείς, συμπερ. Τύπος ENaC Na

+ κανάλια, Na

+ /H

+ εναλλάκτες, και Na

+ /Ca

2 + εναλλάκτες. χλωριούχου βαρίου (BaCl

2) μπλοκ πολλούς τύπους διαύλων καλίου. χλωριούχο γαδολίνιο (GdCl

3) είναι ένας γενικός αναστολέας των μηχανοευαίσθητων κανάλια και tetrandrine αναστέλλει μεγάλης αγωγιμότητος Ca

2+ ενεργοποιηθεί διαύλων καλίου. Ρουθήνιο Red είναι μια ευρεία αναστολέας πολλών καναλιών κατιόντων, συμπεριλαμβανομένων ενδοκυττάριο Ca

2 + κανάλια απελευθέρωσης. Η αμιλορίδη (1 mM), BaCl

2, (1 mM), Ρουθήνιο Red (30 μΜ), tetrandrine (10 μΜ) και GdCl

3 ήταν από την Sigma Aldrich. Για την αναστολή της p38 MAPK, SB202190 (20 μΜ, Sigma Aldrich) ή BIRB796 (10 μΜ, Axon Medchem) χρησιμοποιήθηκαν.

Για την παρεμβολή RNA, FlexiTube siRNA Προμείγματα κατά MAPK11 (SI00606053), MAPK14 (SI00300769) και σε όλους τους αστέρι Αρνητικό siRNA ελέγχου (SI03650318) από QIAGEN (Hilden, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκαν. Α549 κύτταρα εμπρός επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας 25 ηΜ τελική συγκέντρωση siRNA σε πλάκες 24 φρεατίων. Για p38 ΜΑΡΚ, νοκ ντάουν εξετάστηκε από κηλίδα Western και RT-PCR 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Στατιστική Ανάλυση

Επαναλαμβανόμενες μετρήσεις ANOVA ή δύο όψεων Φοιτητές

t-test

εφαρμόστηκαν ως σχετικοί και έγιναν με λογισμικό INSTAT (έκδοση 3.06, GraphPad, San Diego, CA). Δοκιμή για ομαλότητα έγινε χρησιμοποιώντας INSTAT, χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Kolmogorov-Smirnov. Για όλα τα πειράματα, μια ρ-τιμή & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Οι γραμμές σφάλματος σε όλα τα γραφήματα αντιπροσωπεύουν SEMs από τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες βιολογικές επαναλήψεις.

Αποτελέσματα

Na

+, K

+ και Ca

2 + Συλλιπάσματα Induced από ΑΜΛΕΤ σε καρκινικά κύτταρα

οι αλλαγές στην ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις ιόντων που επάγεται από ΑΜΛΕΤ (35 μΜ) σε καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από φθορισμομετρία (Σχήμα 1Α) και σε πραγματικό χρόνο συνεστιακή απεικόνιση (Εικόνα 1Β). ΑΜΛΕΤ προκάλεσε μια ταχεία αύξηση της [Na

+]

i σε κύτταρα Jurkat με προεγκατεστημένο το Na

+ φθοροφόρου CORONA Green. Άνοιγμα μιας μεμβράνης πλάσματος Κ

+ οδού μεταφοράς σε απάντηση ΑΜΛΕΤ καταγράφηκε στα κύτταρα καρκινώματος Α549 πνεύμονα χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία FluxOR ™, η οποία παρακολουθεί την εισροή θάλλιο ως υποκατάστατος δείκτης για K

+ [34]. Με δεδομένη την κινητήρια δύναμη για την Κ

+ ροή κατά μήκος της μεμβράνης του πλάσματος αυτό αντιστοιχεί σε Κ

+ εκροής, υποθέτοντας ότι η οδός μεταφοράς είναι ένα κανάλι (βλέπε Συζήτηση). ΑΜΛΕΤ προκάλεσε επίσης μια ταχεία και σταθερή αύξηση της [Ca

2 +]

i σε Fluo-τέσσερις προεγκατεστημένο καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα (Εικόνα 1Α). Σε αντίθεση, η μητρική α-λακταλβουμίνη ή ελαϊκό οξύ δεν προκάλεσε Na

+, K

+ ή Ca

2+ ροές (Εικόνα 1Α).

(Α) Οι εκτιμήσεις της σχετικής δωρεάν, ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις των Na

+, K

+, και Ca

2 + ([Na

+]

i, [K

+]

i, και [Ca

2 +]

Ι, αντιστοίχως) ελήφθησαν σε κύτταρα Α549 (K

+ και Ca

2+) και κύτταρα Jurkat (Na

+) με φασματομετρία φθορισμού χρησιμοποιώντας πράσινο CORONA , FluxOR και Fluo-4. Ταχεία ροές ιόντων ανιχνεύθηκαν και αυτές οι ενέργειες ήταν ΆΜΛΕΤ ειδικών, ως α-λακταλβουμίνη, ελαϊκό οξύ ή PBS δεν είχαν καμία επίδραση. (Μέσα από τα τέσσερα πειράματα, σ & lt?. 0.05 (Students t-test σε t = 2 λεπτά) (Β) Διαφορά στον Άμλετ που προκαλείται ροές ιόντων μεταξύ των κυττάρων του όγκου και υγιή κύτταρα Ca

2 + και Κ

+ ροές οι ορατές με πραγματικό χρόνο συνεστιακή απεικόνιση κυττάρων καρκινώματος Α549 πνεύμονα και HRTEC υγιή, διαφοροποιημένα κύτταρα νεφρού, φορτωμένα με το Ca

2+ και Κ

+ φθοροφόρων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΑΜΛΕΤ (35 μΜ) για έως 290 δευτερόλεπτα. Αντιπροσωπευτικά στοιχεία από τρία πειράματα φαίνεται στην εικόνα. (C) ιοντοφόρου ασβεστίου (Α23187, 1 μΜ) απόκριση σε κύτταρα καρκινώματος πνεύμονα Α549 φορτώνονται με Fluo-4. αντιπροσωπευτική εικόνα από τρία πειράματα. (D) Αναστολή της ενδοκυτταρικής απελευθέρωσης ασβεστίου από ER μειώνει Ca

2+ συλλιπάσματα. Α549 κύτταρα προκατεργάστηκαν με ένα PLC-αναστολέα (10 μΜ, U73122), αδρανές ανάλογο της (10 μΜ, U73343) ή EDTA (1 mM) για 30 λεπτά και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΑΜΛΕΤ όπως υποδεικνύεται. Μέσα τρία πειράματα. (Ε) αμιλορίδη (Amil, 1 mM) ανέστειλε Na

+ και Ca

2+ ροές σε κύτταρα Α549 (Ca

2+) και κύτταρα Jurkat (Na

+) που προκαλείται από ΑΜΛΕΤ (σημειώνεται ως η στο σχήμα). BaCl

2 (1 mM) ανέστειλε την Na

+, K

+ και Ca

2+ ροές. Τα κύτταρα προ-φορτωμένο με τις αντίστοιχες φθοροφόρα, προεπεξεργασία με αναστολείς (30 λεπτά) και προκλήθηκαν με ΑΜΛΕΤ (35 μΜ) για έως 5 λεπτά. Επιδράσεις της αμιλορίδης για K

+ ροών δεν μπορεί να προσδιοριστεί λόγω του φθορισμού αυτοκινήτων. Ρουθήνιο κόκκινο (RR, 30 μΜ) μείωσε Ca

2+ ροές, ενώ tetranidrine (Tet, 10 μΜ) δεν είχε σημαντική επίδραση.

Η

Η [Ca

2 +]

i και Κ

+ ιόν συλλιπάσματα επίσης ορατά χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία και ότι εντοπίζεται σε όλα σχεδόν τα κύτταρα (Εικόνα 1Β). Αυτά ταχεία ροές ιόντων δεν παρατηρήθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία σε υγιή, διαφοροποιημένα κύτταρα σε πρωτογενή καλλιέργεια (HRTEC). Συνεστιακή απεικόνιση του Fluo-4 φορτωμένα κύτταρα απεκάλυψε μία διαφορά στην κινητική και το μέγεθος μεταξύ απαντήσεις ΑΜΛΕΤ ή το Ca

2+ ιονοφόρου Α23187 (Σχήμα 1 C), υποδεικνύοντας ότι εργάζονται με διακριτούς μηχανισμούς. Ca

2 + -chelation με EGTA είχε μικρή επίδραση στην αύξηση της [Ca

2 +]

i, γεγονός που υποδηλώνει ότι η συμμετοχή του εξωκυττάριου Ca

2+ ήταν ελάχιστη (Σχήμα 1D). Ωστόσο, η αναστολή της InsP3-gated ER Ca

2 + κανάλια με U73122 κατάργησε ουσιαστικά την αύξηση της [Ca

2 +]

i, υποδηλώνοντας ότι προήλθε κυρίως από ενδοκυτταρικά αποθέματα (Σχήμα 1D, [35] ).

ΑΜΛΕΤ που προκαλείται από ion συλλιπάσματα είναι τροποποιήσιμα με αναστολείς διαύλων ιόντων

Μια ομάδα των αναστολέων καλά χαρακτηρίζεται κανάλι ιόντων χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει περαιτέρω τις προκαλούμενες ΑΜΛΕΤ ροές ιόντων. Η αλλαγή στην [Na

+]

i σε Jurkat κύτταρα ανεστάλη από την αμιλορίδη και BaCl

2, η Κ

+ ροή στα κύτταρα καρκινώματος του πνεύμονα από BaCl

2 και το Ca

2+ ροή από αμιλορίδη και BaCl

2 (Σχήμα 1 Ε). Η επίδραση της αμιλορίδης επί της K

+ ροή δεν μπορεί να ελεγχθεί, λόγω αυτοφθορισμό. Η μοριακή φύση της ΑΜΛΕΤ-ενεργοποιημένο τρέχουσα διερευνήθηκε περαιτέρω με τη χρήση του ευρέος φάσματος Ca

2 + αναστολείς καναλιών, ρουθήνιο κόκκινο και tetrandrine, καμία από τις οποίες επηρεάζεται σημαντικά την τρέχουσα (Σχήμα 1 Ε).

ΑΜΛΕΤ ενεργοποιεί ένα μη εκλεκτικό Σύνολο τρέχον κελί κατιόντων σε καρκινικά κύτταρα

Οι παρατηρούμενες μεταβολές στις συγκεντρώσεις της ενδοκυτταρικής ιόντων ήταν ενδεικτικό ότι ΑΜΛΕΤ ενεργοποιείται ένα μη επιλεκτικό κανάλι ιόντων. Αυτή η υπόθεση επιβεβαιώθηκε με ολόκληρο πειράματα κύτταρο patch clamp (Σχήμα 2). ΑΜΛΕΤ (35 μΜ) ενεργοποιείται μια ολόκληρη τρέχον κελί, το οποίο έφθασε σε μέγεθος 2.74 ± 0.88 nA κατά 1,43 ± 0,13 min. Η τρέχουσα εμφάνισε μια μάλλον γραμμική ρεύματος-τάσης-σχέση (Σχήμα 2Α, Β) και ένα σαφές χρονο-εξαρτώμενη απενεργοποίηση σε αποπολωμένα δυναμικά (Σχήμα 2C). Αρχικό ρεύμα ενεργοποίησης παρουσίασαν καθυστέρηση 0,88 ± 0,13 λεπτά από ΑΜΛΕΤ εφαρμογή. Σε αντίθεση, α-λακταλβουμίνη ή ελαϊκό, ήταν ανενεργά, υπογραμμίζοντας την ανάγκη για το συγκρότημα ΑΜΛΕΤ να ενεργοποιήσει το τρέχον κελί (Σχήμα 2Α-Β). Το δυναμικό αναστροφής (V

rev) σε λύσεις Cs-βάση ήταν -5,1 ± 0,99 mV, που αντιστοιχεί στην υπολογισμένη Nernst δυναμικό 4,85 mV ενώ V

rev ήταν -8.3 ± 1.3 mV και 2.4 ± 2 mV σε Na

+ και K

+ λύσεων που βασίζονται, αντίστοιχα, δίνοντας μια αναλογία διαπερατότητα Ρ

Cs (1) & gt? P

Κ (0,88 ± 0,1) & gt? P

Na (0,48 ± 0,03 ) (Σχήμα 2D).