Αφηρημένο

υποδοχέα ανδρογόνων είναι ένας πρωταρχικός παράγοντας μεταγραφής που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Έτσι, ορμονοθεραπεία χρησιμοποιώντας αντι-ανδρογόνα, όπως βικαλουταμίδη, είναι μια θεραπεία πρώτης γραμμής για την ασθένεια. Αν και η θεραπεία ορμονικής αρχικά μειώνει το φορτίο του όγκου, πολλοί ασθενείς τελικά υποτροπιάζουν, την ανάπτυξη όγκων με επίκτητη ενδοκρινικό αντίσταση. Διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών στους οποίους ενδοκρινικές αντίσταση είναι επομένως ένα θεμελιώδες ζήτημα για την κατανόηση και την ανάπτυξη εναλλακτικών θεραπευτικών για προχωρημένο καρκίνο του προστάτη. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήσαμε μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) μεσολάβηση λειτουργική διαλογή για την ταυτοποίηση γονιδίων που εμπλέκονται στην βικαλουταμίδη μεσολάβηση αποτελέσματα επί καρκινικών κυττάρων LNCaP του προστάτη. Μεταξύ αυτών των υποψηφίων γονιδίων που επιλέγεται με διαλογή χρησιμοποιώντας ανάλυση οικόπεδο ηφαιστείου, ριβοσωμική πρωτεΐνη L31 (RPL31) βρέθηκε να είναι ουσιώδης για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα βικαλουταμίδης ανθεκτικά LNCaP (BicR), με βάση μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) – μεσολάβηση νοκ ντάουν πειράματα. Αξίζει να σημειωθεί ότι,

RPL31

mRNA εκφράζεται με μεγαλύτερη αφθονία σε κύτταρα BicR ό, τι σε γονικά κύτταρα LNCaP, και κλινικά δεδομένα από ONCOMINE και The Cancer Genome Altas έδειξε ότι RPL31 υπερεκφράζεται σε καρκινώματα του προστάτη σε σύγκριση με καλοήθη ιστούς του προστάτη. Περιέργως, τα επίπεδα της πρωτεΐνης του καταστολέα όγκου ρ53 και τους στόχους του, p21 και MDM2, αυξήθηκαν στα κύτταρα LNCaP και BicR θεραπεία με

RPL31

siRNA. Παρατηρήσαμε μειωμένη αποικοδόμηση της πρωτεΐνης ρ53 μετά από

RPL31

νοκ ντάουν. Επιπλέον, η καταστολή της ανάπτυξης και του κυτταρικού κύκλου κατά την

RPL31

νοκ ντάουν ήταν ανέκαμψε εν μέρει με

p53

siRNA θεραπεία. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι RPL31 εμπλέκεται σε βικαλουταμίδη ανθεκτικά ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Η shRNA μεσολάβηση λειτουργική οθόνη σε αυτή τη μελέτη παρέχει νέα εικόνα των μοριακών μηχανισμών και θεραπευτικών στόχων του προχωρημένου καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Maruyama Υ, Μιγιαζάκι Τ, Ikeda K, Okumura Τ, Sato W, Horie-Inoue Κ, et al. (2014) Σύντομη φουρκέτα RNA Βιβλιοθήκη-Based Λειτουργική Screening Προσδιόρισε L31 Ριβοσωματιακής πρωτεΐνη η οποία ρυθμίζει τον καρκίνο του προστάτη ανάπτυξη των κυττάρων μέσω του p53 οδό. PLoS ONE 9 (10): e108743. doi: 10.1371 /journal.pone.0108743

Επιμέλεια: Chih-Pin Chuu, Εθνική Έρευνα Υγείας Ινστιτούτα, την Ταϊβάν

Ελήφθη: 4, Ιούνη του 2014? Αποδεκτές: 25 Αυγ 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Οκτ, 2014

Copyright: © 2014 Maruyama et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Ο αριθμός προσχώρηση GEO για τα δεδομένα μικροσυστοιχιών είναι GSE60382

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το κελί του Προγράμματος Καινοτομίας, επιχορηγήσεις-in-Aid, καθώς και Σχέδιο στήριξης του Στρατηγικού Κέντρου Ερευνών στην Ιδιωτικών Πανεπιστημίων από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας, την Ιαπωνία? με επιχορηγήσεις από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης, της Ιαπωνίας? από επιχορηγήσεις-in-Aid από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας της Ιαπωνίας? από το Advanced Research για Ιατρικά Προϊόντα Εξόρυξη Πρόγραμμα του Εθνικού Ινστιτούτου Βιοϊατρικής Καινοτομίας, Ιαπωνία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η τέταρτη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με, και η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του προστάτη στην Ιαπωνία αυξάνεται, με & gt? 11.000 θάνατοι ετησίως από την ασθένεια. Ενώ οι περισσότεροι σε πρώιμα στάδια, εντοπισμένη ασθένεια μπορεί να αντιμετωπιστεί επιτυχώς με θεραπεία ακτινοβολίας και /ή χειρουργική επέμβαση, όσο το 50% των ασθενών που έλαβαν θεραπεία για εντοπισμένη νόσο θα έχουν τοπική υποτροπή ή απομακρυσμένες μεταστάσεις [1], [2]. Οι τρέχουσες θεραπείες πρώτης γραμμής για υποτροπιάζον ή μεταστατικό καρκίνο του προστάτη είναι ορμόνη θεραπείες, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που στοχεύουν υποδοχέα ανδρογόνου (AR) σηματοδότησης όπως βικαλουταμίδη, και φάρμακα όπως γοναδοτροπίνη που απελευθερώνει αγωνιστές ορμόνης που εμποδίζουν την παραγωγή ανδρογόνων στους όρχεις και τα επινεφρίδια. Αν και ορμονικές θεραπείες μειώνουν αρχικά το φορτίο του όγκου, πολλοί ασθενείς καθίστανται ανθεκτικά σε αυτές τις θεραπείες και να αναπτύξει ένα τερματικό μορφή της νόσου, που ονομάζεται ευνουχισμός ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC) [3]. Οι ασθενείς με CPRC έχουν κακή πρόγνωση και λογαριασμό για την πλειοψηφία των θανάτων που οφείλονται στην ασθένεια.

Σε CRPC, επανενεργοποίηση της σηματοδότησης AR αναγνωρίζεται ως θεμελιώδες γεγονός που έχει ως αποτέλεσμα την ανανέωση της ανάπτυξης του όγκου σε συνθήκες στέρησης ανδρογόνων. Πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι CRPC συνήθως συνδέεται με αυξημένη σηματοδότηση AR λόγω ενίσχυση AR, AR μετάλλαξη, ενεργοποίηση συμπαράγοντα μεταγραφής, φωσφορυλίωση ανεξάρτητη από συνδέτη του AR, και άλλες διαδικασίες [4] – [7].

Πράγματι , ανοσοϊστοχημικές μελέτες δείχνουν ότι η υπερέκφραση του AR πρωτεΐνη βρίσκεται στις περισσότερες περιπτώσεις από CRPC [6] – [8]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι AR παίζει κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη /αύξησης τόσο εξαρτώμενων από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη και CRPC [9] – [12]. AR επανενεργοποίηση είναι κλινικά σημαντική επειδή η ίδια AR και πορεία προς τα κάτω σηματοδότησης του θα μπορούσε να είναι θεραπευτικοί στόχοι στην CRPC. Οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν AR επανενεργοποίησης σε CRPC, ωστόσο, δεν είναι σαφείς, λόγω της αλληλεπίδρασης της οδού μεταγωγής σήματος AR με άλλες οδούς σηματοδότησης.

Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήσαμε μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) διαλογή για τον εντοπισμό νέων γονιδίων διαμόρφωση της απάντηση στην βικαλουταμίδης αντιανδρογόνο σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Σε μια συγκριτική μελέτη βικαλουταμίδης επεξεργασμένου και υπό αγωγή με όχημα καρκινικά κύτταρα προστάτη, ανάλυση οικόπεδο ηφαιστείου [13], [14] χρησιμοποιήθηκε για την διαλογή γονιδίων που εμπλέκονται στην απόκριση βικαλουταμίδης. Μία δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας χρησιμοποιώντας μικρά RNA που παρεμβαίνει (siRNAs) ειδικά για τις shRNA στόχευση υποψήφια γονίδια αποκάλυψε ότι ριβοσωμικής πρωτεΐνης L31 (

RPL31

), σύμπλεγμα ιστόνης 1 H2bd (

HIST1H2BD

), και ADAM μεταλλοπεπτιδάση με τον τύπο θρομβοσπονδίνης 1 μοτίβου 1 (

ADAMTS1

) ενεπλάκησαν στον πολλαπλασιασμό των βικαλουταμίδης ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Ειδικότερα, RPL31, μια πρωτεΐνη που αποτελεί μέρος των 60S μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα [15] – [18], δείχθηκε ότι διαμορφώνουν την έκφραση του καταστολέα όγκων ρ53 [19] – [21] και την κυτταρική ρυθμιστής κύκλου p21 [20] . Αυτή η μελέτη αποκαλύπτει νέα μονοπάτια διαμόρφωση της απόκρισης βικαλουταμίδη και θεραπευτικών στόχων για τον καρκίνο του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και αντιανδρογόνα

LNCaP, vcap και 22Rv-1 του προστάτη καρκινικά κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, πενικιλλίνη (100 U /mL), και στρεπτομυκίνη (100 mg /mL) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. VCAP και 22Rv-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, πενικιλλίνη (100 U /mL), και στρεπτομυκίνη (100 mg /mL) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Οι Βικαλουταμίδη ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα προστάτη (BicR) έχουν περιγραφεί προηγουμένως [22] – [24], και αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI συμπληρωμένο με 1 μΜ βικαλουταμίδη, 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, πενικιλλίνη (100 U /mL), και στρεπτομυκίνη (100 mg /mL) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Για σταθερή επιμόλυνση, τα κύτταρα LNCaP μορφομετατράπηκαν με C-τερματικά Flag-tagged RPL31 πλασμιδίου ή κενό φορέα (pcDNA3? Invitrogen) και επιλέχθηκαν σε μέσο καλλιέργειας που περιείχε 0,1 mg /mL G418 (NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan). Τα σταθερά μετασχηματισμένα κύτταρα LNCaP που εκφράζουν RPL31-Flag (LNCaP-RPL31 # 39 και # 63) και άδειο φορέα (LNCaP-vec # 19 και # 22) έχουν κλωνοποιηθεί. Βικαλουταμίδη και docetaxel αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich Ιαπωνία (Τόκιο, Ιαπωνία).

Προβολή των γονιδίων βικαλουταμίδης-απόκρισης που σχετίζονται με τη χρήση ενός λεντοϊού shRNA βιβλιοθήκη

Thermo Scientific Open Biosystems Decode RNAi Viral βιβλιοθήκη Screening (RHS5339) αγοράστηκε από την Thermo Scientific (Huntsville, AL, USA). Η οθόνη shRNA πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται αλλού [1], [13], [14], [25]. Εν συντομία, μεταγωγές πραγματοποιήθηκαν σε πλακίδια των 100 mm έτσι ώστε κάθε shRNA εκπροσωπήθηκε με μέσο όρο 100 αντίγραφα, έτσι ώστε η πολλαπλότητα της μόλυνσης (m.o.i.) ήταν ίση με 0,3 για διάμεση ενσωμάτωση μόνο αντίτυπο κάθε shRNA. Η μόλυνση των κυττάρων-στόχων σε Μ.Ο.Ι. ≤0.3 επιβεβαιώθηκε με μικροσκοπία φθορισμού και ενεργοποιημένη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) 48 ώρες μετά τη μόλυνση. LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει 1 μΜ βικαλουταμίδης ή φορέα (0,1% αιθανόλη) για 1 μήνα

μικροσυστοιχίες

Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από μεταχθέντα κύτταρα με τη χρήση του κιτ DNeasy Ο καθαρισμός (QIAGEN.? Tokyo, Japan) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι ολοκληρωμένες Τα siRNAs παρασκευάζονται από LNCaP γονιδιωματικά DNAs ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας εκκινητές (Αποκωδικοποίηση RNAi-GIPZ, σχολιασμένα γονίδια διαλογή βιβλιοθήκης-αρνητικά kit επιλογή από Thermo Scientific) ειδικό για τα barcodes για το πλασμίδιο βιβλιοθήκη DNA [13], [14], [25] . Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν με πηκτή χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού QIAquick PCR (Qiagen). θραύσματα καθαρίζονται DNA (1.5 μg) από κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με όχημα ή βικαλουταμίδη σημάνθηκαν με κυανίνη-3 (Cy3) ή-5 κυανίνης (Cy5) χρωστική, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας το γονιδίωμα DNA Η ενζυματική Labeling Kit (Agilent? Santa Clara, CA, USA) και καθαρίστηκε με την απομάκρυνση του μη δεσμευμένου βαφών κυανίνης με Microcon συσκευή φυγοκεντρικού φίλτρου Ultracell ΥΜ-30 (Millipore Ιαπωνία? Tokyo, Japan). υβριδοποίηση μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το Oligo cDGH /τσιπ on-chip Kit Hybridization (Agilent). Agilent λογισμικού Χαρακτηριστικό Extractor χρησιμοποιήθηκε για να σαρώσετε εικόνες μικροσυστοιχιών. Ο αριθμός προσχώρηση GEO για τα δεδομένα μικροσυστοιχιών είναι GSE60382. Ένα οικόπεδο ηφαίστειο δημιουργήθηκε από ομαδοποίηση με βάση ανιχνευτές. Εξαντλημένο (fold αλλαγή & lt? 0.5?

P

& lt? 0,01) σήματα στις υπό θεραπεία με βικαλουταμίδη LNCaP κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα επιλέχθηκαν ως γονίδια απόκριση που σχετίζονται με βικαλουταμίδη [23], [25], [26].

siRNA επιμόλυνση και ανάλυση Western blot

Silencer επιλέξτε προσχεδιασμένες siRNAs που στοχεύουν τις υποψήφια γονίδια ελήφθησαν από την Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) (Πίνακας 1). p53 siRNA που στοχεύει (sip53: SC-29435) αγοράστηκε από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Ένα siRNA ελέγχου στόχευση του λουσιφεράσης γονίδιο (siLuc) και ένα στοιχείο ελέγχου μη-στόχευσης siRNA (siControl) χωρίς ομολογία με τα γνωστά γονίδια στόχοι σε κύτταρα θηλαστικών ελήφθησαν από RNAi (Tokyo, Japan). LNCaP και BicR κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων σε πυκνότητα 100.000 κύτταρα ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA σε μία τελική συγκέντρωση 10 ηΜ χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMAX (Invitrogen? Carlsbad, CA, USA). Knockdown αποτελεσματικότητα των siRNA προσδιορίστηκε με qRT-PCR χρησιμοποιώντας RNA που παρασκευάζεται από τα κύτταρα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και ομαλοποιήθηκε με εκείνη του siControl. Για ανάλυση κηλίδος western, βικαλουταμίδη (1 μΜ) ή όχημα προστέθηκε στα μέσον 12 ώρες μετά την επιμόλυνση. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ένα ρυθμιστικό δείγματος στους 100 ° C για 15 λεπτά για ηλεκτροφόρηση επί πηκτώματος δωδεκυλθειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν σε 10% ή 15% πήκτωμα SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore Ιαπωνία). Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με ένα από τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-RPL31 (Abcam? Τόκιο, Ιαπωνία), αντι-ρ53 (DO-7? LeicaBiosystems? Newcastle, UK), αντι-MDM2 (SMP14? Santa Cruz Biotechnology), αντι- p21 (C-19? Santa Cruz Biotechnology), και αντι-Flag (Μ2? Sigma-Aldrich). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με IgG horseradish υπεροξειδάση συζευγμένο αντι-κουνελιού (GE Healthcare? Buckinghamshire, UK) ή αντι-ποντικού IgG, και οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (GE Healthcare). Οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν και ξαναϊχνηθετούνται με ένα αντίσωμα ποντικού αντι-β-ακτίνης αντισώματος. (AC-74? Sigma-Aldrich) ως έλεγχος φόρτωσης [27]

Η

ανάλυση ποσοτικής PCR

LNCaP και τα κύτταρα BicR επιμολύνθηκαν με siRNA (10 ηΜ) για 48 ώρες. Το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Isogen (Nippon Gene? Τόκιο, Ιαπωνία). Πρώτου κλώνου cDNA συντέθηκε από 2 μg ολικού RNA με τη χρήση SuperScript III ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen) με ολίγο (dT) 20 εκκινητή. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα όργανο StepOnePlus (Life Technologies) χρησιμοποιώντας το FAST SYBR Green Master Mix (Life Technologies) και 150 ηΜ του κάθε γονιδίου-ειδική προς τα εμπρός και αντίστροφο εκκινητή (Πίνακας S1). Οι συνθήκες κυκλοποίησης ήταν 95 ° C για 2 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους στους 95 ° C για 2 s και στους 60 ° C για 30 s. Οι σχετικές διαφορές στις ποσότητες PCR προϊόντος προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο συγκριτικής κατώφλι κύκλου, χρησιμοποιώντας αφυδρογονάση γλυκεραλδεϋδης-3-φωσφορικής (

GAPDH

) ως ένας εσωτερικός έλεγχος [27], [28]. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η Φοιτητών

t-test

χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση, και μια τιμή πιθανότητας

P

& lt?. 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

δοκιμασία

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ που περιέχει WST-8 ((2- (2-μεθοξυ-4-νιτροφαινυλ) -3- (4-νιτροφαινυλ) -5- (2,4-δισουλφοφαινυλ) -2Η τετραζόλιο, μονονάτριο άλας? Nacalai Tesque?. Kyoto, Japan) BicR, LNCaP, VCAP και κύτταρα 22Rv-1 σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητες 2,000, 4,000, 16,000, και 4000 κύτταρα ανά φρεάτιο, αντιστοίχως, σε μέσο καλλιέργειας, και επιμολυσμένα με siRNA που στοχεύει είτε ένα υποψήφιο γονίδιο ή λουσιφεράση (siLuc) (10 ηΜ έκαστο) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMAX την ημέρα 0. μετά από 12 h μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει 1 μΜ βικαλουταμίδης ή όχημα. στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση, 10 μι διαλύματος αντιδραστηρίου που περιέχει WST-8 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν για 2 ώρες στους 37 ° C. οι τιμές απορρόφησης για κάθε κυψελίδα μετρήθηκε στα 450 nm σε αναγνώστη Multiskan FC ELISA ( Thermo Scientific? Ulm, Γερμανία) [23], [28]. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από & gt? Οι 3 ανεξάρτητα πειράματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± s.d. της εις τριπλούν πηγάδια. Μαθητή

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ χρησιμοποιήθηκαν για στατιστική ανάλυση, και

P

& lt?. 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

ανάλυση του κυτταρικού κύκλου

LNCaP και τα κύτταρα BicR επιμολύνθηκαν με siRNA (10 ηΜ) για 12 ώρες. μέσων των κυττάρων αλλάχθηκαν σε μέσα που περιέχουν βικαλουταμίδη (1 μΜ) ή όχημα, και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για επιπλέον 36 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη. Αυτά στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0.2 μg /μL RNase Α για 30 λεπτά. Τέλος, χρωματίστηκαν με 5 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου (Sigma-Aldrich). Τα δείγματα μετρήθηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα FACScalibur (Becton Dickinson? Cockeysville, MD, USA) με βάση το περιεχόμενο DNA, και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με λογισμικό CellQuest (Becton Dickinson) για τον προσδιορισμό των ποσοστών των κυττάρων στην G0 /G1, S και G2 /M φάσεις [28], [29].

Βιοπληροφορική

Η ONCOMINE βάση δεδομένων είναι μια βάση δεδομένων του καρκίνου μικροσυστοιχιών και online πλατφόρμα εξόρυξης δεδομένων με στόχο τη διευκόλυνση της ανακάλυψης από την έκφραση του γονιδιώματος σε επίπεδο αναλύσεων [30]. Η βάση δεδομένων ONCOMINE (https://www.oncomine.org/resource/login.html) αναζητήθηκε για υποψήφια γονίδια που υπερεκφράζονται στον καρκίνο του προστάτη έναντι φυσιολογικό ιστό του προστάτη κατά τουλάχιστον 2 φορές (

P

& lt ? 0,01). δεδομένα αλληλούχισης RNA από το πρόγραμμα Cancer Genome Altas (TCGA) [31], [32] ανακτήθηκαν και μεταγραφή ανά εκατομμύριο (TPM) τιμές για RPL31 χρησιμοποιήθηκαν ως επίπεδα έκφρασης του γονιδίου.

Εκτιμήσεις για σταθεροποίηση πρωτεΐνης

κύτταρα BicR επιμολύνθηκαν με siRPL31 ή siLuc (5 ηΜ το καθένα) για 12 ώρες, καλλιεργήθηκαν για επιπλέον 36 ώρες σε siRNA μέσο ελεύθερο, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 μg /mL κυκλοεξιμιδίου. Κύτταρα κατεργασμένα με κυκλοεξιμίδιο για τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα p53 [33], [34]. Οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν και ανιχνεύθηκαν και πάλι με ένα αντι-β-ακτίνης αντίσωμα ως έλεγχος φόρτωσης. τα επίπεδα της πρωτεΐνης p53 ήταν ποσοτικά με πυκνομετρία και ομαλοποιήθηκε στα επίπεδα του αντίστοιχου β-ακτίνης.

Αποτελέσματα

shRNA οθόνη για τον εντοπισμό ρυθμιστών της απόκρισης βικαλουταμίδης

Για τον εντοπισμό υποψήφιων γονίδια που εμπλέκονται στην απόκριση βικαλουταμίδης στον καρκίνο του προστάτη, πραγματοποιήσαμε ένα λειτουργικό οθόνη με μόλυνση κυττάρων LNCaP με λεντοϊού βιβλιοθήκη shRNA που αποτελείται ~10,000 Τα siRNAs με μοναδική barcodes, που ακολουθείται από 1 μήνα κυτταρικής καλλιέργειας με την παρουσία 1 μΜ βικαλουταμίδης ή όχημα ( Σχήμα 1Α). Στη συγκεντρωτική οθόνες πολλαπλασιασμό των κυττάρων υπό θεραπεία βικαλουταμίδη, κύτταρα μολυσμένα με Τα siRNAs έναντι γονιδίων που εμπλέκονται στην βικαλουταμίδη αντίσταση θα απομακρυνθεί από τον κυτταρικό πληθυσμό πάροδο του χρόνου. Ενσωματωμένο στο χρωμόσωμα Τα siRNAs ενισχύθηκαν με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιώντας γονιδιωματικό ϋΝΑ που παρασκευάζεται από bicalutamide- και υπό αγωγή με όχημα κύτταρα και ποσοτικά με τη χρήση κατά παραγγελία μικροσυστοιχιών [25], [26]. Θεωρώντας Τα siRNAs που ήταν παρόντες πολλές φορές ή να στοχεύουν στα υποθετικά γονίδια, βικαλουταμίδη θεραπεία μείωσε την έκφραση του 25 Τα siRNAs που μπορούν να στοχεύσουν τα συμβατικά γονίδια (& lt? 0,5 ​​φορές από το όριο του

P

& lt? 0,01) σε σύγκριση με θεραπεία του οχήματος, όπως φαίνεται στην ανάλυση οικόπεδο ηφαιστείου (Σχήμα 1 Β και Πίνακας 1). Αυτή η ανάλυση διαλογής shRNA ήταν χρήσιμη για την απομάκρυνση των γονιδίων τα οποία πιθανώς εμπλέκονται στην βικαλουταμίδη αντίσταση.

(Α) Σχηματική αναπαράσταση του shRNA διαλογής. LNCaP κύτταρα μολύνθηκαν με ένα βραδέος ιού βιβλιοθήκη shRNA και περαιτέρω καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς βικαλουταμίδη για 1 μήνα. Ατομική ολοκληρωμένη ποσά shRNA ήταν ποσοτικά με μικροσυστοιχιών. (Β) οικόπεδο ηφαίστειο των δεδομένων μικροσυστοιχιών, όπως προκύπτουν από την ομαδοποίηση με βάση ανιχνευτές που εμπλουτίστηκαν ή εξαντλημένο (πάσο αλλαγή & lt? 0.5?

P

& lt? 0,01) σε κύτταρα υπό θεραπεία με βικαλουταμίδη σε σύγκριση με τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα .

η

Εκκαθάριση των υποψηφίων γονιδίων

για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα των μεμονωμένων γονιδίων που επιλέγονται από shRNA διαλογή στην κυτταρική βιολογία του καρκίνου του προστάτη, το νοκ ντάουν αποτελεσματικότητα των διαθέσιμων siRNAs απευθύνονται σε 19 από τα 25 υποψήφια γονίδια αξιολογήθηκε με ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή (qRT) -PCR. Δεκατρία από τα 19 siRNAs μείωσε την έκφραση του αντίστοιχου γονιδίων στόχων τους κατά 37-94% (Πίνακας 1). Στη συνέχεια, η επίδραση αυτών των siRNAs στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα βικαλουταμίδης ανθεκτικά LNCaP (BicR) εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων WST-8 (Σχήμα 2). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αποσιώπηση του

RPL31, HIST1H2BD

, και

ADAMTS1

σημαντικά καταπιεσμένη τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα BicR από & gt?. 50% σε σχέση με τον έλεγχο των siRNA αναστολή

Η ανάπτυξη της BicR κύτταρα με siRNA που στοχεύει

RPL31

(siRPL31),

HIST1H2BD

(siHIST1H2BD), και

ADAMTS1

(siADAMTS1) δείχθηκε. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 10 ηΜ siRNA σε μέσο καλλιέργειας. Δώδεκα ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν περαιτέρω εντός μέσου περιέχοντος 1 μΜ βικαλουταμίδης. WST-8 δοκιμασίες πολλαπλασιασμού κυττάρου διεξήχθησαν σε δεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση. Η απορρόφηση των φρεατίων στις πλάκες μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών στα 450 nm. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± s.d. (N = 3? *,

P

& lt? 0,05? **,

P

& lt? 0,01).

Η

υπερέκφραση του

RPL31, HIST1H2BD

, και

ADAMTS1

στα κύτταρα BicR

στη συνέχεια, θα αξιολογηθούν τα επίπεδα έκφρασης του

RPL31, HIST1H2BD

, και

ADAMTS1

mRNA σε LNCaP και BicR κύτταρα από qRT-PCR. Αυτά τα τρία γονίδια ουσιαστικά υπερεκφράζεται σε κύτταρα BicR συγκριτικά με γονικά κύτταρα LNCaP (Σχήμα 3Α). Να διερευνήσει κατά πόσον

RPL31, HIST1H2BD

, και

ADAMTS1

επίπεδα έκφρασης μεταβλήθηκαν σε κλινικά δείγματα καρκίνου του προστάτη, εκτιμήσαμε την κατάσταση έκφρασης αυτών των γονιδίων με βάση την ONCOMINE σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχιών [30]. Σε μια σύγκριση των δειγμάτων καρκινώματος του προστάτη και φυσιολογικά δείγματα προστάτη σε ένα κατώτατο όριο τουλάχιστον ένα 2-φορές αλλαγή (

P

& lt? 0,01) (Εικόνα 3Β),

RPL31

παρατηρήθηκε αυξητική ρύθμιση σε η μελέτη που διεξήχθη από Tomlins και οι συνεργάτες του [35]. Σε μια μελέτη RNA αλληλουχίας ενσωματωθεί στο Cancer Genome Atlas [31], [32],

RPL31

έκφραση επίσης αυξημένα σε καρκίνους του προστάτη σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς προστάτη (Σχήμα 3C). Για

HIST1H2BD

, προς τα πάνω ρύθμιση δείχθηκε σε ένα σύνολο δεδομένων, ενώ ρύθμιση προς τα κάτω δείχθηκε στο άλλο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον,

ADAMTS1

έκφραση ήταν μειωμένη σε καρκίνο του προστάτη, σε ορισμένες ομάδες δεδομένων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το

RPL31

παίζει ένα ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη, συμπεριλαμβανομένης της αντίστασης βικαλουταμίδη. Για τη μελέτη των ανασταλτικά αποτελέσματα κυτταρικής ανάπτυξης των siRPL31 σε διάφορα κύτταρα καρκίνου προστάτη, VCAP, 22Rv-1, και LNCaP κύτταρα αναλύθηκαν με τη χρήση μίας ανιχνεύσεως WST-8. siRPL31 κατασταλεί ο πολλαπλασιασμός αυτών των κυττάρων (Σχήμα S1).

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης του

RPL31

,

HIST1H2BD

, και

ADAMTS1

mRNA αξιολογείται από ποσοτική ανάστροφης μεταγραφής PCR ανάλυση (qRT-PCR) με το γονίδιο-ειδικούς εκκινητές. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται για

GAPDH

και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± s.d. (N = 3? **

P

& lt? 0,01). (Β)

RPL31

mRNA εκφράζεται άφθονα σε ιστούς καρκινώματος του προστάτη κλινική σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς προστάτη (με & gt? 2 φορές)., Όπως ανακτώνται από σύνολα δεδομένων με Tomlins

κ.ά.

στην ONCOMINE βάση δεδομένων [30]. Κανονικό: φυσιολογικό ιστό του προστάτη, του προστάτη: ο καρκίνος του προστάτη, ΡΙΝ: προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία. (C)

RPL31

έκφραση του mRNA είναι αυξημένο σε κλινικά δείγματα καρκίνου του προστάτη

έναντι

κανονικά δείγματα σε μια μελέτη του RNA αλληλουχίας στην ανάλυση Cancer Γονιδιώματος [31], [32].

RPL31

ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο εξέλιξης

Από τα siRNAs που εξετάστηκαν, si

RPL31

ήταν το πιο αποτελεσματικό στην καταστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού BicR. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε περαιτέρω τον παθοφυσιολογικό ρόλο του

RPL31

στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου των κυττάρων BicR αποκάλυψε ότι

RPL31

knockdown αύξησε σημαντικά την αναλογία των κυττάρων σε φάση G0 /G1, ενώ μειώνουν την αναλογία στην S φάση, σε σύγκριση με τον έλεγχο της θεραπείας siLuc (Σχήμα 4Α και 4Β).

RPL31

νοκ ντάουν, επίσης, προκάλεσε παρόμοιες κυτταρικού κύκλου προφίλ αλλοιώσεις στα κύτταρα LNCaP (Σχήμα 4C και 4D). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι το

RPL31

knockdown ουσιαστικά κατέστειλε την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων BicR καθώς και κύτταρα LNCaP.

(Α) εξόντωση

RPL31

σε κύτταρα BicR αύξησαν το ποσοστό κυττάρων σε G0 /G1 και μείωσε το ποσοστό εκείνων στην S φάση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRPL31 ή siLuc σε μέσο καλλιέργειας για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS, χρωματίσθηκαν με ιωδιούχο προπίδιο, και υποβλήθηκαν σε ανάλυση FACS. (Β) Τα ποσοστά των κυττάρων BicR στο S, G0 /G1, και G2 /M φάση προσδιορίσθηκαν με τη χρήση του λογισμικού CellQuest και δείχνονται ως μέση ± s.d. (N = 3? *,

P

& lt? 0,05? **,

P

& lt? 0,01). (Γ) εξόντωση

RPL31

μείωσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον ίδιο όπως περιγράφεται στο (Α). (D) Τα ποσοστά των κυττάρων LNCaP σε S, G0 /G1, και G2 /M φάσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας CellQuest λογισμικό και δείχνονται ως μέση ± s.d. (N = 3? **,

P

& lt? 0,01).

Η

RPL31 ρυθμίζει την έκφραση του p53 και MDM2, καθώς και ρ53 πρωτεϊνικής αποδόμησης

Για να φωτιστούν οι μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω του ρόλου των RPL31 στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, εξετάσαμε την επίδραση της

RPL31

knockdown για την έκφραση των ρυθμιστικών του κυτταρικού κύκλου, περιλαμβανομένων των p53, MDM2 και ρ21. Περιέργως, τα επίπεδα πρωτεΐνης της ογκοκατασταλτικό ρ53 [19], [29], [36] – [40] και κατάντη του κύκλου κυττάρου αρνητικός ρυθμιστής p21 του [20] ενισχύθηκαν από

RPL31

knockdown σε κύτταρα BicR και τα κύτταρα LNCaP (Σχήμα 5Α). Η έκφραση MDM2 πρωτεΐνη, γνωστή Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης p53 στόχευση [21], [36], [37], ήταν επίσης ενισχυμένη κατά

RPL31

νοκ ντάουν.

(Α) Νοκ ντάουν της RPL31 αυξάνει p53, MDM2, και η έκφραση πρωτεΐνης ρ21. LNCaP και BicR κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRPL31 ή siLuc για 48 ώρες. κυτταρικά εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και ανάλυση στυπώματος western χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Β) RPL31 ρυθμίζεται η αποικοδόμηση της πρωτεΐνης ρ53. κύτταρα BicR επιμολύνθηκαν με siRPL31 ή siLuc για 60 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 μg /mL κυκλοεξιμιδίου (CHX) για τον υποδεικνυόμενο χρόνο. Τα κυτταρικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. (C) Τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία και κανονικοποιήθηκε ως προς τα επίπεδα του αντίστοιχου β-ακτίνης πρωτεΐνης και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± s.d. (N = 3? *,

P

& lt? 0,05).

Η

Στη συνέχεια αξιολογείται κατά πόσον

RPL31

αποσιώπηση επηρέασαν την υποβάθμιση του p53 στον καρκίνο του προστάτη κύτταρα. Τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 ποσοτικοποιήθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western σε κύτταρα BicR σε επεξεργασία με

RPL31

siRNA και κυκλοεξιμίδιο, ένας αναστολέας της πρωτεϊνικής σύνθεσης (Σχήμα 5Β). τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 κανονικοποιήθηκαν με τα επίπεδα του αντίστοιχου β-ακτίνης, χρησιμοποιώντας πυκνομετρία (Σχήμα 5C). p53 σταθεροποιείται πάνω στο

RPL31

-silenced κύτταρα BicR ό, τι σε siLuc-επεξεργασμένα κύτταρα.

p53 μεσολαβεί μερικώς τις κυτταρικές επιδράσεις της RPL31

Εξετάσαμε δίπλα τα αποτελέσματα της

RPL31

νοκ ντάουν στο

p53

και

MDM2

επίπεδα έκφρασης mRNA σε BicR και γονικών κυττάρων LNCaP.

p53

επίπεδα mRNA δεν αυξήθηκαν στα κύτταρα BicR και LNCaP μετά

RPL31

νοκ ντάουν (Σχήμα 6Α, Εικόνα S2). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι

RPL31

φίμωση υπερέκφραση p53 στο επίπεδο της πρωτεΐνης. Σε αντίθεση,

MDM2

και

p21

mRNA επίπεδα ήταν αυξημένα κατά

RPL31

knockdown στο BicR και LNCaP κύτταρα (Σχήμα 6Α, το Σχήμα S2), σύμφωνα με την προς τα πάνω ρύθμιση αυτών πρωτεΐνες στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 5Α).

(Α) knockdown επιδράσεις της RPL31 και ρ53 για MDM2 και ρ21 mRNA. κύτταρα BicR επιμολύνονται με siRPL31, sip53, siRPL31 συν sip53, ή siLuc. qRT-PCR για RPL31, ρ53, MDM2 και ρ21 mRNAwas διεξαχθεί. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν? έκφραση mRNA ομαλοποιείται προς GAPDH και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± s.d. (N = 3? **

P

& lt? 0,01). (Β) sip53 μερικώς ακύρωσε την καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων που προκαλείται από siRPL31. κύτταρα BicR επιμολύνθηκαν με 10 ηΜ κάθε siRPL31, sip53, siRPL31 συν sip53 ή siLuc, και καλλιεργήθηκαν με το θρεπτικό μέσο που περιείχε 1 μΜ βικαλουταμίδης. WST-8 δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρου διεξήχθη στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Οι απορροφήσεις των φρεατίων στις πλάκες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλάκας σε 450 nm. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± s.d. (N = 4? **,

P

& lt? 0,01).

Η

Επαληθεύσαμε περαιτέρω εάν p53 συνέβαλε ουσιαστικά στην αναστολή της ανάπτυξης που διαμεσολαβείται από

RPL31

αποσιώπηση . Είναι αξιοσημείωτο ότι RPL31 νοκ ντάουν μεσολάβηση προς τα πάνω ρύθμιση του

MDM2

και

p21

mRNA σε κύτταρα BicR μειώθηκε σημαντικά κατά p53 νοκ ντάουν σε συνδυασμό με RPL31 νοκ ντάουν (Σχήμα 6Α). Τα αποτελέσματα αυτών των siRNAs επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού BicR εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία WST-8 (Σχήμα 6Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι

p53

και

RPL31

νοκ ντάουν μερικώς αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σύγκριση με το

RPL31

νοκ ντάουν και μόνο με την παρουσία της βικαλουταμίδης. Σε κύτταρα LNCaP, συνδυασμός sip53 και siRPL31 επίσης αντιστραφεί εν μέρει τις συνέπειες της siRPL31 στο

MDM2

και

p21

τα επίπεδα έκφρασης του mRNA, καθώς και την ανάπτυξη των κυττάρων (Εικόνα S2). Στη συνέχεια εξετάστηκε η επίδραση της συνδυαστικής χρήσης siRPL31 και sip53 στο προφίλ κυτταρικού κύκλου των κυττάρων BicR (Σχήμα S3). Διπλό νοκ ντάουν του

RPL31

και

p53

αύξησε το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S σε σύγκριση με το

RPL31

νοκ ντάουν και μόνο. ​​

Εμείς παράγεται LNCaP κύτταρα που εκφράζουν εξωγενή RPL31 από σταθερή επιμόλυνση να εξετάσει την επίδραση της RPL31 υπερέκφραση σε πρωτεΐνη p53 (Σχήμα S4A). Έχει αναφερθεί ότι η πρωτεΐνη ρ53 σταθεροποιείται από ντοσεταξέλη φάρμακο χημειοθεραπείας σε κύτταρα LNCaP [41]. Εξετάσαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 σε αυτή την κατάσταση και διαπίστωσε ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ53 μειώθηκαν σε RPL31 υπερεκφράζουν LNCaP κύτταρα σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων που εκφράζουν το φορέα (Σχήμα S4B). Αυτά τα πειράματα κέρδος-of-λειτουργία ανέφερε επίσης ότι θα μπορούσε να RPL31 ρυθμίζουν αρνητικά τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ρ53. Επιπλέον, εξετάσαμε αν η έκφραση RPL31 ρυθμίζεται από βικαλουταμίδη (Σχήμα S5). Συγκεκριμένα, δείχθηκε ότι η βικαλουταμίδη εντονότερα επαγόμενη έκφραση mRNA RPL31 σε κύτταρα BicR παρά σε κύτταρα LNCaP, δεδομένου ότι, στις 24 και 48 ώρες μετά την αγωγή βικαλουταμίδη, τα επίπεδα RPL31 mRNA ήταν σημαντικά υψηλότερα σε κύτταρα BicR από κύτταρα LNCaP (

P

& lt?. 0.01)

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, εντοπίστηκαν γονίδια διαμόρφωση της απόκρισης βικαλουταμίδη σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη μέσω του λειτουργικού ελέγχου χρησιμοποιώντας ένα λεντοϊού βιβλιοθήκη shRNA σε συνδυασμό με πειράματα siRNA. Από ~10,000 Τα siRNAs που είχαν μεταχθεί στα κύτταρα LNCaP, επιλέξαμε μια μικρή υποομάδα Τα siRNAs με ουσιαστικά μειωμένη έκφραση στα κύτταρα μετά την επεξεργασία βικαλουταμίδης 1 μήνα. Από τα 13 γονίδια που στοχεύει η επιλεγμένη Τα siRNAs, βρήκαμε ότι knockdown του

RPL31, ADAMTS1

, και

HIST1H2BD

ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των BicR κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Εμείς επικεντρωθήκαμε στον χαρακτηρισμό της ριβοσωμικής πρωτεΐνης RPL31 στη βιολογία του καρκίνου του προστάτη, όπως αποσιώπηση των

RPL31

σημαντικά μειωμένη εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων BicR. Βρήκαμε ότι το επίπεδο έκφρασης του

RPL31

mRNA ήταν σημαντικά αυξημένα σε κύτταρα BicR σύγκριση με κύτταρα LNCaP, και κλινικές μελέτες δείχνουν ότι η έκφραση RPL31 σε καρκίνωμα του προστάτη είναι μεγαλύτερη από ότι σε καλοήθεις ιστούς του προστάτη. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι RPL31 συμβάλλει θετικά στην ανάπτυξη και φαινότυπο του καρκίνου του προστάτη.

Σας ζητείται να προσδιοριστεί το μηχανισμό με τον οποίο

RPL31

νοκ ντάουν σοβαρά την ανάπτυξη συνελήφθη BicR προστάτη καρκινικά κύτταρα. RPL31 είναι ένα συστατικό της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος σε ευκαρυωτικά [15], [17], [18], [42]. Επειδή η θεραπεία βικαλουταμίδη σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη μειώνει τη σύνθεση ριβοσωμικού RNA [43],

RPL31

νοκ ντάουν θα μπορούσε να επιδεινώσει περαιτέρω την απορύθμιση της λειτουργίας ριβοσωμάτων με την παρουσία της βικαλουταμίδης. Επιπλέον,

RPL31

knockdown θα μπορούσε να μεσολαβήσει λειτουργίες εξωριβοσωματική και διαμορφώνουν την οδό του καταστολέα όγκου ρ53. Εξωριβοσωματική λειτουργίες είναι κυτταρικά δράσεων πλην της πρωτεϊνικής σύνθεσης, συμπεριλαμβανομένης της αντιγραφής του DNA, μεταγραφή, επιδιόρθωση, RNA splicing, την κυτταρική ανάπτυξη, την απόπτωση, διαφοροποίηση και κυτταρικό μετασχηματισμό [33], [34], [42], [44] – [49] . Ειδικότερα, η σημασία των λειτουργιών εξωριβοσωματική στο κελί ανάπτυξη και την κυτταρική διαίρεση επιβεβαιώθηκε από την παρατήρηση ότι απομείωση αυτών των διαδικασιών απορυθμίζει p53 και προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου [36], [37]. Στην παρούσα μελέτη,

RPL31

νοκ ντάουν σημαντικά αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης του p53, p21, και MDM2. Είναι επίσης αξιοσημείωτο ότι RPL31 νοκ ντάουν βρεγμένο την αποδόμηση των πρωτεϊνών p53 με κυκλοεξιμίδιο θεραπεία. RPL31 νοκ ντάουν μεσολάβηση προς τα πάνω ρύθμιση του

MDM2

και

p21

mRNA θα ρυθμίζεται κυρίως από p53, καθώς μειώθηκε σημαντικά από p53 siRNA.