Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια από τις πλέον θανατηφόρες των καρκίνων με ποσοστό επιβίωσης 5 ετών 6 %. Οι θεραπευτικές επιλογές είναι πολύ περιορισμένες και υπάρχει μία ανικανοποίητη ιατρική ανάγκη για ασφαλή και αποτελεσματικά θεραπείες. μεταβολισμός και τα μιτοχόνδρια των κυττάρων του καρκίνου παρέχει ανεξερεύνητη στόχους για την ασθένεια αυτή. Εμείς εντοπίστηκαν πρόσφατα μια νέα τάξη άλατα τριφαινυλοφωσφονίου, ενώσεις TP, με ευρέος φάσματος αντικαρκινικές ιδιότητες. Εξετάσαμε την ικανότητα των πρωτότυπη ένωσης μας TP421- επιλέγονται για τις ιδιότητες φθορισμού του -. Να αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος και περαιτέρω ερευνήθηκε των μοριακών μηχανισμών με τους οποίους ασκεί αντικαρκινικά αποτελέσματα του

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

TP421 παρουσίασαν υπο-μικρομοριακή IC

50 τιμές σε όλες τις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας αναλύσεις ΜΤΤ και του σχηματισμού αποικιών. TP421 εντοπίζεται κυρίως στα μιτοχόνδρια και προκαλείται από G

0 /G

1 σύλληψης, ROS συσσώρευση και ενεργοποίηση αρκετών άγχος ρυθμίζονται κινάσες. Κασπάσης και PARP-1 διάσπασης παρατηρήθηκαν υποδεικνύοντας μία αποπτωτική απόκριση ενώ LC3B-ΙΙ και Ρ62 είχαν συσσωρευθεί υποδεικνύοντας αναστολή της αυτοφαγία. Επιπλέον, TP421 που προκαλείται de-φωσφορυλίωση των βασικών μορίων σηματοδότησης που εμπλέκονται στην ΡΑΚ προσκόλληση που συσχετίζεται με την αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης.

Συμπεράσματα /Σημασία

TP421 είναι μια αντιπροσωπευτική ένωση ενός νέου υποσχόμενη κατηγορία παράγοντες μιτοχονδριακή στόχευση χρήσιμες για παγκρεατικό θεραπεία του καρκίνου. Λόγω της μοναδικής τους μηχανισμό δράσης και την αποτελεσματικότητα της περαιτέρω ανάπτυξης είναι δικαιολογημένη

Παράθεση:. Shabaik YH, Millard Μ, Neamati Ν (2013) Μηχανιστικές αξιολόγηση ενός νέου μικρού μορίου Στόχευση μιτοχόνδρια στα κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 8 (1): e54346. doi: 10.1371 /journal.pone.0054346

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 του Ιούλη του 2012? Αποδεκτές: 12, Δεκ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιανουαρίου του 2013

Copyright: © 2013 Shabaik et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από κεφάλαια από την Congressionally Σκηνοθεσία Πρόγραμμα Ιατρικής Έρευνας του Καρκίνου του μαστού Βραβείο Concept και την Sharon και ο William Cockrell Προικισμένο Καρκίνο Ταμείο Έρευνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος είναι η τέταρτη κύρια αιτία που σχετίζονται με τον καρκίνο των θανάτων στις Ηνωμένες Πολιτείες με συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών 6% [1]. Από το 2005, η τυπική χημειοθεραπευτική αγωγή είναι η χορήγηση της γεμσιταβίνης, ενός αναλόγου νουκλεοζίτη, σε συνδυασμό με erlotinib, ένας αναστολέας κινάσης [2], [3]. Γεμσιταμπίνη στοχεύει ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης με αποτέλεσμα την εξάντληση των dNTPs και επιπλέον παίρνει ενσωματωθεί στο DNA που προκαλεί έναν στάβλο στη σύνθεση [4]. Από την άλλη πλευρά erlotinib, αρχικά σκέφτηκε να στοχεύουν τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι είναι ένας αναστολέας κινάσης πολυ-[5]. Η οδός για την δραστικότητα γεμσιταμπίνη είναι επαρκώς περίπλοκη, συμπεριλαμβανομένων των μεταφορέων πρόσληψη και ενδοκυτταρική φωσφορυλίωση που οδηγεί σε κυτταροτοξικότητα, η οποία συμβάλλει στο χαμηλό ποσοστό χαμηλό ποσοστό ανταπόκρισης σε ασθενείς και την αυξανόμενη ανάπτυξη του χημειοαντίσταση [6]. Έχει πρόσφατα προταθεί ότι PDAC διαστρωμάτωση σε πολλαπλούς υποτύπους με βάση το μοριακό διαφορές μπορεί να καθορίσει απόκριση στη χημειοθεραπεία [7]. Δύο από τις τρεις που ορίζονται υποτύπους εκπροσωπούνται μεταξύ των κοινώς χρησιμοποιούμενα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων ΜΙΑ PaCa-2, PANC-1 και HPAC που χρησιμοποιήσαμε στην μελέτη μας.

Μεταξύ τις πρώτες μοριακές αλλαγές υποκείμενου καρκίνου του παγκρέατος είναι ένα ιδιοσυστατικά ενεργοποίηση μετάλλαξη Κ-ras που συμβαίνει σε σχεδόν 100% των περιπτώσεων [8], [9]. Κατά τη διάρκεια της μετατροπής, K-ras σηματοδότησης drives υπερβολικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων και προάγει την επιβίωση. Έχει προταθεί ότι η μιτοχονδριακή παραγωγή ενέργειας είναι απαραίτητη για την υποστήριξη Ras-μετασχηματισμένα κύτταρα που γίνονται σε μεγάλο βαθμό από την αυτοφαγία, μια κατάσταση που αναφέρεται ως «εθισμός αυτοφαγία», για να διατηρηθεί ένα υγιές πισίνα των μιτοχονδρίων και επαρκή κύκλο TCA ενδιάμεσα για να υποστηρίξει την οξειδωτική φωσφορυλίωση ( OXPHOS) [10], [11]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές και δείγματα ασθενούς, το βασικό επίπεδο autophagy ανυψώνεται σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα ή κύτταρα από άλλα κυτταρικές γραμμές όγκου και συσχετίζεται με φτωχότερη κλινικές εκβάσεις [10], [12]. Αυτός ο φαινότυπος, χαρακτηριστικό του Ras-μετασχηματισμένα κύτταρα, τα καθιστά μοναδικά ευαίσθητα σε διάσπαση από μιτοχονδριακή αναπνοή και αυτοφαγία. Στην πραγματικότητα, η φαρμακολογική αναστολή καθώς και αποσιώπηση γονιδίων βασικών autophagy οδήγησε με επιτυχία σε μείωση του μιτοχονδριακού κατανάλωσης οξυγόνου και ενδοκυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ οδηγεί σε βαθιά αναστολή της παγκρεατικής ανάπτυξης του καρκίνου, τόσο in vitro όσο και in vivo [10]. Ως εκ τούτου, η αναστολή της αυτοφαγία και μιτοχονδριακή στόχευση θα μπορούσε να προσφέρει μία νέα προσέγγιση για τη θεραπεία PDACs που είναι συνήθως ιδιαίτερα ανθεκτικοί σε χημειοθεραπείες διαθέσιμα. Μάλιστα, έχει υπάρξει μια πρόσφατη αύξηση του ενδιαφέροντος για τη στόχευση μιτοχόνδρια των καρκινικών κυττάρων μετά την αναγνώριση των αλλαγμένη βιοενεργειακό ιδιότητα τους ως συμβολή στην παθογένεση του καρκίνου [13]. Κατά συνέπεια, τα μιτοχόνδρια στόχευσης έχει αναδειχθεί ως ένα νέο ιδανικό για αντικαρκινική θεραπεία ενισχυόμενο εν μέρει από τη γνώση της επίτευξης ακριβούς παροχή φαρμάκων στο οργανίδιο. Η χρήση της μιτοχονδριακής στοχευμένων παραγόντων για αντικαρκινικών θεραπειών παρουσιάζει μια πρόσθετο πλεονέκτημα της απευθείας ενεργώντας κατόπιν ο κύριος ρυθμιστής του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου εντός του κυττάρου και εντελώς παρακάμπτοντας τα ανάντη καταρράκτες σηματοδότησης που συχνά υπονομεύεται [14]. Έχει καλά τεκμηριωμένο ότι τα μιτοχόνδρια των κακοηθών κυττάρων εμφανίζουν ένα υψηλότερο δυναμικό διαμεμβράνης σε σύγκριση με μη-κακοήθη κύτταρα με διαφορές στην ενζυμικές δραστηριότητες, φορείς ηλεκτρονίων και τη δομή των λιπιδίων της μεμβράνης ως πιθανά υποκείμενα αίτια [15]. Αξιοποίηση αυτό το μοναδικό χαρακτηριστικό έχει οδηγήσει στο σχεδιασμό νέων λιπόφιλα κατιόντα που μπορούν επιλεκτικά συσσωρεύεται σε μιτοχόνδρια των κυττάρων του όγκου πάνω από φυσιολογικό ιστό οδηγείται από την αυξημένη διαμεμβρανικό δυναμικό [15]. Σύζευξη του τριφαινυλοφωσφονίου (ΤΡΡ) κατιόντων σε μια ποικιλία χημικών ανιχνευτών και φάρμακα χρησιμοποιείται ευρέως για την επίτευξη συγκεκριμένων στόχευσης στα μιτοχόνδρια [16], [17], [18], [19], [20]. Μια TPP-tagged E ανάλογο βιταμίνης (MitoVES) έχει μελετηθεί εκτενώς για αποπτωτική και αντι-αγγειογόνες ιδιότητες, οι οποίες πολύ βελτιωμένη έναντι εκείνης του πατρικού un-tagged ένωση, υποστηρίζοντας μιτοχονδριακή στόχευση ως βιώσιμη προσέγγιση για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας των μετρίως δραστική υποψήφιων φαρμάκων [20], [21], [22]. Εναλλακτικά, φορείς χορήγησης φαρμάκου όπως δενδριμερών και lipososmes έχουν τροποποιηθεί με ΤΡΡ κατιόντα και χρησιμοποιούνται για να παραδώσει το φορτίο στα μιτοχόνδρια [17], [23], [24], [25]. Όταν αυτοί οι φορείς φορτώθηκαν με μοντέλο χημειοθεραπευτικά φάρμακα συμπεριλαμβανομένης paclitaxel ή δοξορουβικίνη, η αποτελεσματικότητα ενισχύθηκε έναντι των μη στοχευμένων φορέων που υποδεικνύει ότι η παράδοση στα μιτοχόνδρια μπορούν να βελτιώσουν την απόπτωση και την κυτταροτοξικότητα.

Έχουμε αναφέρει προηγουμένως την ανακάλυψη μιας νέας κατηγορίας αλάτων ΤΡΡ που έχουν αντικαρκινική δράση ευρέος φάσματος [26]. Οι ενώσεις αυτές μπορεί να συσσωρεύονται στα μιτοχόνδρια δυνάμει θετικά φορτισμένων τμημάτων τους ΤΡΡ και το αρνητικό δυναμικό κατά μήκος των μιτοχονδριακών μεμβρανών [27]. Στη συνέχεια, έχουμε αποδείξει ότι αυτές οι ενώσεις είναι ικανές για την κατάργηση μιτοχονδριακή αναπνοή και αυξάνοντας μιτοχονδριακή υπεροξειδίου επίπεδα. Το πιο σημαντικό, έχουμε δείξει ότι αυτή η κατηγορία ενώσεων μπορούν να αναστέλλουν αποτελεσματικά την ανάπτυξη του όγκου σε ένα γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου μαστού ποντικού χωρίς εμφανή τοξικότητα [26]. Λόγω της μοναδικής τους μηχανισμού στόχευσης δράσης μιτοχόνδρια και την εξαίσια εξάρτηση της Ras με γνώμονα όγκων στη λειτουργία των μιτοχονδρίων, επιδιώξαμε να αναπτυχθεί αυτή η κατηγορία ενώσεων ως νέων παραγόντων κατά του καρκίνου του παγκρέατος. Επιπλέον, δεδομένης της σημασίας της αυτοφαγία να διατηρήσουν μια υγιή ομάδα των μιτοχονδρίων για την υποστήριξη επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των Ras μετασχηματισμένα κύτταρα, υποθέσαμε ότι TP421 θα προκαλεί κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος κατά τρόπο που περιλαμβάνει ρύθμιση αυτοφαγία των μιτοχονδρίων.

Υλικά και Μέθοδοι

γραμμές καλλιέργειας κυττάρων και αντιδραστήρια

ΜΙΑ PaCa-2, PANC-1, κυτταρικές σειρές καρκίνου του παγκρέατος HPAC αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC BxPC-3 και? Manassas, VA). ΥΠΟΙΟ atg3 + /+ και atg3 – /- κυτταρικές σειρές ποντικού ήταν ένα δώρο από τον Masaaki Komatsu (Juntendo Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου, Μπούνκιο-ku, Τόκιο) [28]. HFF-1 φυσιολογική κυτταρική σειρά ινοβλαστών παρασχέθηκε από τον Δρ Κάρλα Grandori (Έρευνας Καρκίνου Fred Hutchinson κέντρο, Seattle, WA). Όλες οι κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιούνται για πειραματισμό διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια κάτω από 35 περάσματα και ελέγχονται τακτικά για μόλυνση μυκοπλάσματος χρησιμοποιώντας PlasmoTest ™ (InvivoGen, San Diego, CA). ΜΙΑ PaCa-2 και τα κύτταρα PANC-1 διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? Gemini-Bioproducts, West Sacramento, CA). BxPC-3, MEF atg3 + /+ και atg3 – /- κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI συμπληρωμένο με 10% FBS. κύτταρα HPAC διατηρήθηκαν σε 1:01 μίγμα DMEM και του Ham F12 συμπληρωμένο με 5% FBS. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2. Για όλα τα πειράματα, τα κύτταρα σε εκθετική φάση ανάπτυξης ξεπλύθηκαν με DPBS χωρίς ασβέστιο και μαγνήσιο, εν συντομία σε επεξεργασία με θρυψίνη σε ένα μικρό όγκο από 0,25% διάλυμα θρυψίνης-ΕϋΤΑ (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), αιωρούνται εκ νέου σε πλήρες μέσο καλλιέργειας , με το χέρι μετρήθηκαν και σπάρθηκαν στους αποστειρωμένες πλάκες και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύχτα πριν την αγωγή.

ενώσεις

Όλες οι ενώσεις αποθηκεύονται ως συμπυκνώθηκαν στοκ DMSO καταψύχθηκαν στους -20 ° C. Οι αραιώσεις παρασκευάστηκαν σε DPBS, χωρίς ασβέστιο και μαγνήσιο, και να επαναχρησιμοποιηθούν για ένα μέγιστο 3 κύκλους ψύξης-απόψυξης. Ενώσεις αγοράστηκαν από LKT Laboratories Inc. (St. Paul, MN), Sigma-Aldrich Corp. (Saint Louis, ΜΟ) και Asinex Ltd (Μόσχα, Ρωσία).

Η κυτταροτοξικότητα Δοκιμασία

η κυτταροτοξικότητα μετρήθηκε με την 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο (ΜΤΤ) χρωματομετρικής δοκιμασίας όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26].

αποικίας δοκιμασία σχηματισμού

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (500-1000 κύτταρα ανά φρεάτιο, ανάλογα με την κυτταρική γραμμή) και αφέθηκε όλη τη νύχτα να προσκολληθούν. Την επόμενη ημέρα, τα φάρμακα προστέθηκαν στα φρεάτια για 24 ώρες, μετά την οποία μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο ελεύθερο φάρμακο. Τα κύτταρα περαιτέρω επωάστηκαν για 7-14 ημέρες για να επιτραπεί να σχηματίσουν αποικίες. Οι αποικίες βάφτηκαν με ένα διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους (0,05% κρυσταλλικό ιώδες, 0,74% φορμαλδεΰδη και 36% μεθανόλη), ξεπλένονται και κατόπιν απεικονίζεται.

αποκλεισμό trypan blue Δοκιμασία

Τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν μέσω σύντομη θρυψινοποίηση και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας trypan blue διάλυμα 0,4% (Lonza Group Ltd) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο.

Alamar Μπλε Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Τα κύτταρα αντιμετωπίζονται πανομοιότυπα με ΜΤΤ δοκιμασία που περιγράφεται παραπάνω. Στο τέλος της θεραπείας, Alamar Blue (Serotec Abd

©) προστέθηκε σε φρεάτια σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Ο φθορισμός ανιχνεύθηκε σε 560/590 ex /em μήκη κύματος.

Κύκλου Κυττάρου Προσδιορισμός

κύτταρα επεξεργασμένα Drug συλλέχθηκαν μέσω σύντομη θρυψινοποίηση, και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη στους -20 ° C για τουλάχιστον 4 ώρες. Για τον προσδιορισμό του περιεχομένου του DNA, τα δείγματα περιδινήθηκαν και επανα-εναιωρήθηκαν σε DPBS που περιείχε ιωδιούχο προπίδιο (50 μg /mL τελική συγκέντρωση) και RNase Α (100 μg /mL τελική συγκέντρωση) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Κυττάρων Τα προϊόντα λύσεως και κηλίδωση Western Ανάλυση

κατεργασμένης cellswere ξεπλένεται με DPBS και λύθηκαν επί πάγου με την προσθήκη ενός μικρού όγκου που περιέχει SDS ρυθμιστικό κυτταρικής λύσης για 15 λεπτά. Τα προϊόντα λύσης συλλέχθηκαν σε σωλήνες Eppendorf, σε υπερήχους επί πάγου σε διάτμηση του DNA, και ποσοτικοποιείται χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης RC DC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Τριάντα μικρογραμμάρια προϊόντος λύσης κυττάρου φορτώθηκε σε κάθε λωρίδα και υποβάλλονται σε SDS-PAGE και εν συνεχεία μεταφέρθηκαν σε Immun-Blot μεμβράνες φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF? Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Εν συντομία, οι μεμβράνες αποκλείστηκαν σε 5% γάλα εντός TBST και ακολούθησε επώαση σε πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος στους 4 ° C overnight.After, μεμβράνες πλύθηκαν, κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα προστέθηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και τελικά να ξεπλυθεί πριν από την απεικόνιση. Όλα τα αντισώματα αγοράστηκαν από είτε Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, ΜΑ) ή Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). ανίχνευση της πρωτεΐνης διεξήχθη χρησιμοποιώντας Σούπερ σήματος West Dura χημειοφωταύγειας υποστρώματος (ThermoFisher Επιστημονική, Waltham, ΜΑ) και απεικονίζεται στο + σύστημα ChemiDoc ™ XRS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Για όλα τα δεδομένα κηλίδος western, οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές κηλίδες που επιλέγονται από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Μέτρηση Επιπέδων υπεροξειδίου του υδρογόνου

Η παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ενζύμου Amplex Red. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων διαυγούς πυθμένα μαύρες πλάκες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 4 ώρες με την επιθυμητή συγκέντρωση του φαρμάκου στο άνευ ερυθρού φαινόλης DMEM μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS. Στο τέλος της θεραπείας, τα κύτταρα πλύθηκαν και λύθηκαν σε ρυθμιστικό DPBS που περιείχε 50 μΜ Amplex Red (Molecular Probes) και 0,1 μονάδες /mL με υπεροξειδάση (HRP? Sigma, St. Louis, ΜΟ) και επωάζονται για 30 λεπτά στους 37 ° C , προστατευμένο από το φως. Μετά την επώαση, η ένταση φθορισμού της κάθε φρεάτιο ανιχνεύθηκε στα 540/590 ex /em μήκη κύματος.

Μέτρηση ανιόντος υπεροξειδίου Επίπεδα

κατεργάζεται Drug ΜΙΑ PaCa-2 και BxPC-3 κύτταρα χρωματίστηκαν συντομία με MitoSOX Red Μιτοχονδριακή υπεροξειδίου Indicator (Invitrogen, Carlsbad, CA) ακολουθώντας ένταση recommendations.Fluorescence κατασκευαστή μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26].

φθορισμού Μικροσκοπίας του TP421 Υποκυτταρική Localization

MIA PaCa-2 και PANC-1 κυτταρικών γραμμών σπάρθηκαν σε διπλά θαλάμους γυάλινο κάλυμμα (Nalge Nunc International, Rochester, ΝΥ) σε πυκνότητα 50.000 κύτταρα /θάλαμο και αφήνεται όλη τη νύχτα να προσκολληθούν. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2 μΜ TP421 για χρονικές περιόδους έως και 72 ώρες. Πριν από την απεικόνιση, τα κύτταρα χρωματίστηκαν για 15 λεπτά στους 37 ° C χρησιμοποιώντας είτε 200 ηΜ Mitotracker Red CMXRos ή 50 ηΜ Lysotracker Red DND 99 ζωντανά λεκέδες κύτταρο οργανιδίου (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) ακολουθώντας τις συστάσεις του κατασκευαστή. Τα ζωντανά κύτταρα έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας ένα Nikon DAIPHOT 300 ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Nikon Instruments, Melville, ΝΥ) εξοπλισμένο με ϋΑΡΙ και Cy3 μπλοκ φίλτρων, κομμάτι 10x μάτι και 100x /1.3 φακός εμβύθισης έλαιο Nikon και λαμπτήρα υδραργύρου υπερυψηλής πίεσης. Για να αποφευχθεί η φωτολεύκανση, η έκθεση του δείγματος στο φως ελαχιστοποιήθηκε κατά τη διάρκεια της απόκτησης εικόνας με τη συμμετοχή ουδέτερης πυκνότητας (ND2 και ND4) φίλτρα για να περιορίσουν την ένταση του φωτός που φθάνει το δείγμα. Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Φωτομετρικά CoolSNAP φωτογραφική μηχανή 9 CCD (Roper Επιστημονική, Ottobrun, Γερμανία) και επεξεργασία με χρήση Q-σύλληψη Pro v 5.1.1.14 λογισμικό απεικόνισης (Q εταιρεία απεικόνισης, Surrey, BC, Καναδάς).

ανοσοφθορισμού Χρώση LC3B

κύτταρα μΙΑ PaCa-2 εμβολιάστηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες σε πυκνότητα 50.000 κυττάρων και αφέθηκε όλη τη νύχτα να προσκολληθούν. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα κατεργάστηκαν με 2μΜ TP421 παρουσία ή απουσία 5 μΜ ραπαμυκίνη ή 10 μΜ χλωροκίνη για 18 ώρες. Στο τέλος της θεραπείας, τα μέσα απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα πλύθηκαν με 500 μι ϋΡΒδ πριν από τη μονιμοποίηση με 3.7% φορμαλδεΰδη για 15 m σε RT. Σταθερή κύτταρα πλύθηκαν με 500 μί DPBS πριν και μετά την permeablization με παγωμένο ακετόνη για 5 λεπτά στους -20 ° C. Οι καλυπτρίδες αποκλείστηκαν για 30 λεπτά με λευκωματίνη 1% βόειου ορού (BSA) σε DPBS πριν από την επώαση όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντίσωμα LC3B σε 1% BSA. Αντίσωμα απομακρύνθηκε και καλυπτρίδες πλύθηκαν σε DPBS με ήπια ανάδευση. Cy5 και Cy3-συζευγμένα αντισώματα (GE Healthcare Lifesciences, Pittsburgh, ΡΑ) αραιωμένο σε 1% BSA επωάστηκαν με καλυπτρίδες για 2 ώρες. Οι καλυπτρίδες πλύθηκαν πάλι σε DPBS με ήπια ανάδευση, ξηραίνονται στον αέρα και τοποθετείται σε προ-καθαρίζονται γυαλί slidesusing Prolong Gold αντι-ξεθωριάσματος μέσα στερέωσης (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ). Εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας Lieca SP2 συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Leica Microsystems, Χαϊδελβέργη, Γερμανία) εξοπλισμένη με 488 nm αργόν και 633 λέιζερ κρυπτόν ηΜ (ισχύς λέιζερ διατηρήθηκε στο ελάχιστο & lt? 50% του συνόλου) και Leica Συνεστιακό λογισμικό v 2.61 ( Leica Microsystems, Χαϊδελβέργη, Γερμανία).

In vitro μετανάστευση Δοκιμασία

η μετανάστευση των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένθετα κυτταρικής καλλιέργειας 24-φρεατίων εφοδιασμένο με μεμβράνες διαφανές ΡΕΤ που έχει 8 μm μεγέθους πόρων (BD Biosciences, San Jose, CA). 7,5 × 10

4 στερήθηκαν ορού κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 απλώθηκαν στον άνω θάλαμο σε μέσο ελεύθερο ορού και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα ελαφρά. Την επόμενη ημέρα, η μετανάστευση διεγέρθηκε με 10% FBS μέσο προστίθεται στον κάτω θάλαμο. Αρνητικός φρεάτια ελέγχου έλαβε 1% ορό μέσο αντ ‘αυτού. TP421 επεξεργασμένα δείγματα, έλαβε 10% μέσου FBS στον κάτω θάλαμο και ένωσης σε μέσο χωρίς ορό στην κορυφή του θαλάμου. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα προσκολλημένα στην άνω πλευρά της μεμβράνης ελαφρά διαλυθεί καλά χρησιμοποιώντας ένα Q-tip. Τα κύτταρα στην κάτω πλευρά της μεμβράνης σημάνθηκαν σύμφωνα με Giemsa πυρηνική χρώση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκε με απιονισμένο νερό. Εικόνες των χρωματισμένων μεμβρανών συλλήφθηκαν από αντιπροσωπευτικά πεδία χρησιμοποιώντας ανεστραμμένο μικροσκόπιο Nikon χρησιμοποιώντας ένα αντικειμενικό φακό 10Χ.

Επούλωση Δοκιμασία

καλλιέργειας ιστού κατεργάζεται πλάκες 96-φρεατίων επικαλύφθηκαν με κολλαγόνο Ι διαλύεται σε 0,2 Ν οξικό οξύ (στείρο διηθηθέν) σε μια τελική συγκέντρωση των 45 μg /mL, όλη τη νύκτα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα η περίσσεια κολλαγόνου απομακρύνθηκε, τα φρεάτια πλύθηκαν δύο φορές με DPBS και αποκλείστηκαν με 2 mg /ml BSA σε DPBS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά τον αποκλεισμό, τα φρεάτια και πάλι πλύθηκαν DPBS. κύτταρα PANC-1 στη συνέχεια εμβολιάστηκαν σε πυκνότητα 35.000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλήρη μέσα ενημέρωσης ορού και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Το μέσο άλλαξε σε μέσα χωρίς ορό και τα κύτταρα επωάζονται περαιτέρω όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα, γρατσουνιές έγιναν χρησιμοποιώντας την άκρη του ενός άκρου 200 μL και τα φρεάτια πλύθηκαν με DPBS. Τα επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα φρεάτια ελέγχου έλαβε 10% FBS που περιέχει μέσα και προστέθηκε ναρκωτικών. Αρνητικός φρεάτια ελέγχου έλαβαν μέσα ελεύθερα ορού. Τα τραύματα αφέθηκαν 24 ώρες για να κλείσει στο τέλος του οποίου πηγάδια ξεπλύθηκαν με DPBS, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 100% μεθανόλη για 10 λεπτά και χρωματίστηκαν με Giemsa πυρηνική χρώση για 30 λεπτά. Τέλος, τα φρεάτια πλύθηκαν με απιονισμένο νερό και τυχόν διευρυμένες να στεγνώσει. Οι πληγές απεικονίστηκαν με ένα χρησιμοποιώντας ένα αντικειμενικό 4X.

Στατιστική Ανάλυση

Όπου ενδείκνυται, οι τιμές ρ υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας t-test δύο ουρών μη ζευγαρωμένο σπουδαστή με άνισες διακυμάνσεις. P-τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

TP421 δείχνει ταχεία και ισχυρή κυτταροτοξικότητα σε ένα πίνακα του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων Γραμμές

Στην αρχική μας έκθεση σχετικά με την αντικαρκινική δράση αυτής της τάξης των ενώσεων που περιγράψαμε ισχυρή κυτταροτοξικότητα εναντίον καρκινικών κυτταρικών γραμμών διαφόρων καταγωγών [26]. Εδώ μέσα, ελέγξαμε την ικανότητα ενός από τις ενώσεις μολύβδου προσδιορίζονται μορφή αρχική μας οθόνη, TP421, να επάγει κυτταροτοξικότητα και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ένα πάνελ του παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Χρησιμοποιώντας δοκιμασία ΜΤΤ, αξιολογήσαμε την επίδραση της 72 ώρες συνεχούς έκθεσης σε αυξανόμενες δόσεις του TP421, TP187, και TP197 επί της ανάπτυξης ΜΙΑ PaCa-2, BxPC-3, PANC-1 και HPAC κυτταρικές σειρές. Τα αποτελέσματα (Πίνακας 1) αποκάλυψαν ισχυρή κυτταροτοξικότητα, με TP421 IC

50 τιμές στο υπο-μικρομοριακό εύρος σε όλες τις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές ανεξάρτητα από τις διαφορές τους στην κατάσταση διαφοροποίησης ή γενετική μεταλλακτική φόντο. Οι δομές των ενώσεων που δοκιμάστηκαν παρουσιάζονται στο σχήμα στήριξης (Σχήμα S1). Το τμήμα ΤΡΡ σε αυτή την ένωση είναι απαραίτητη για τη δραστικότητα ως 7-διαιθυλαμινο-4-μεθυλοκουμαρίνη, μία δομικά πανομοιότυπη ανάλογο της TP421 λείπει το ήμισυ TPP, δεν παρήγαγε κυτταροτοξικότητα σε κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Εξετάσαμε περαιτέρω την επίδραση της έκθεσης 24 ώρες για να TP421 για την ικανότητα σχηματισμού αποικιών των κυττάρων ΜΙΑ PaCa-2 σε σύγκριση με γεμσιταβίνη και erlotinib (Σχήμα 1). Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την ικανότητα του TP421 να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

in vitro

σε επίπεδα συγκρίσιμα με γεμσιταβίνη και πολύ πιο ισχυρά από ό, τι erlotinib. Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό των κυτταροτοξικών δραστηριότητες του TP421, επωάσαμε τα κύτταρα με την παρουσία ή απουσία μιας περιοχής συγκεντρώσεων από TP421 για 0,25, 0,5, 1 ή 5 ώρες, ακολουθούμενη από επώαση σε χωρίς φάρμακο πολυμέσων για 24, 48 και 72 ώρες. Παράλληλα, κατεργασμένα κύτταρα με συνεχή έκθεση σε TP421 για 24, 48 και 72 ώρες. Στο τέλος της επωάσεων αξιολογήσαμε την βιωσιμότητα των κυττάρων μέσω ΜΤΤ. Όπως ήταν αναμενόμενο, το IC

50 TP421 είχε μια αντίστροφη συσχέτιση με τον χρόνο θεραπείας, καθώς και τη συνολική διάρκεια του χρόνου επώασης, όπως φαίνεται στον Πίνακα 2. Αναπάντεχα όμως, παρατηρήσαμε ότι με πολύ μικρούς χρόνους έκθεσης, η συντομότερη 15 min, TP421 ήταν ικανά να επιτύχουν 50% κυτταροτοξικότητα αν και σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (20 μΜ) υποδεικνύοντας μία πολύ ταχεία αρχική δράση του φαρμάκου. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι για PANC-1 κύτταρα επεξεργασμένα με τον τρόπο αυτό, μικρότερους χρόνους έκθεσης στο φάρμακο μειώνεται σημαντικά την κυτταροτοξικότητα της TP421. Οι καμπύλες επιβίωσης συγκρίνοντας συνεχής και 0.25 h χρόνους έκθεσης στις τρεις κυτταρικές γραμμές που φαίνεται στο Σχήμα 2.

Επίδραση του 24 ώρες έκθεσης στο φάρμακο σε ικανότητα σχηματισμού (Α) ΜΙΑ PaCa-2 και (Β) BxPC αποικία -3. Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

δόσης καμπύλες επιβίωσης απόκρισης για κυτταρικές γραμμές που έλαβαν θεραπεία με TP421 συγκρίνοντας συνεχή έκθεση (κλειστά τετράγωνα) σε έκθεση στο φάρμακο 0,25 ώρες ακολουθούμενο από ένα μέσο έκπλυσης (ανοιχτά τετράγωνα) και περαιτέρω επώαση. Συνολικός χρόνος επώασης υποδεικνύεται σε παρένθεση. Τα δεδομένα είναι μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι συγκεντρώσεις TP421 απεικονίζονται σε μια βάση καταγραφής 10 κλίμακα.

Η

Η

TP421 κυτταροτοξικότητα είναι επιλεκτικό προς Cancer Cells

Μετά την παραδοχή ότι TP421 θα συσσωρεύονται επιλεκτικά σε καρκινικά κύτταρα οδηγείται από το υψηλότερο δυναμικό διαμεμβράνης, συγκρίναμε την επίδραση της TP421 στα χαρακτηριστικά της ανάπτυξης της κανονικής κυτταρική σειρά ινοβλαστών HFF-1 έναντι τριών από τα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Θεραπεία PaCa-2 και HFF-1 κύτταρα ΜΙΑ με μια σειρά δόσεων TP421 για 72 ώρες αποκάλυψε σαφώς υψηλότερη ευαισθησία του παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικής γραμμής προς το φάρμακο (Σχήμα 3Α). Αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με μέτρηση του ποσοστού των νεκρών κυττάρων που συσσωρεύονται από κατεργασία TP421 η οποία ήταν σημαντικά υψηλότερη στα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με HFF-1 (Σχήμα 3Β). Περαιτέρω, χρησιμοποιώντας την Alamar blue βαφής δείκτου, παρατηρήσαμε μια 4-πλάσια διαφορά στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΜΙΑ PaCa-2 σε σύγκριση με κύτταρα HFF-1 μετά από περίοδο επώασης 72 ωρών με TP421 στις ενδεικνυόμενες δόσεις. (Σχήμα 3C).

(Α) Η ανάπτυξη των φυσιολογικών κυττάρων HFF-1 δεν επηρεάζεται, ενώ τα κύτταρα του παγκρεατικού καρκίνου ΜΙΑ PaCa-2 δείχνουν εκτεταμένη θάνατο μετά από έκθεση 72 h σε κλιμακούμενες δόσεις TP421. (Β) TP421 επάγει μεγαλύτερη κυτταρικό θάνατο σε τρία παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές σε σύγκριση με κύτταρα HFF-1 όπως μετρήθηκε με εξαίρεση κυανούν τρυπανίου. (Γ) Διάδοση της MIA PaCa-2 αλλά όχι HFF-1 αναστέλλεται σε μεγάλο βαθμό από TP421 στο μπλε δοκιμασία Alamar. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν, οι αντιπροσωπευτικές εικόνες φαίνεται στο (Α), μέση ± SD απεικονίζονται στο (Β) και (C). *, **, *** Και **** δείχνουν τιμή-p & lt? 0,05, p & lt? 0,01, p & lt? 0.001 και p & lt?. 0,00005 αντίστοιχα

Η

TP421 Συλλήψεις καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές σε G

0 /G

1 φάση του κύκλου των κυττάρων σε έναν χρόνο και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο

για να διευκρινιστεί ο μηχανισμός με τον οποίο TP421 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αξιολογήθηκε η επίδρασή της στο κυτταρικό κύκλο κινητική. ΜΙΑ PaCa-2 (Σχήμα 4), PANC-1, BxPC-3, και HPAC (3 Πίνακας) κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δύο συγκεντρώσεις TP421 για την αύξηση διάρκειες χρόνου και DNA περιεκτικότητα αναλύθηκε μέσω κυτταρομετρίας ροής. Εκτεταμένες G

0 /G

1 σύλληψης παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές γραμμές παρά τις μικρές διαφορές στις ευαισθησίες τους να TP421. Είναι ενδιαφέρον ότι, η κατανομή του κυτταρικού κύκλου για τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 σε αγωγή με τις δύο άλλα ανάλογα, TP187 και TP197, έμοιαζε επίσης TP421 με σημαντική και έγκαιρη σύλληψη στο G

0 /G

1 (Πίνακας 3). Αυτό το αποτέλεσμα διαφέρει από την G

2 /M και διακοπή φάσης S που προκαλείται από αυτές τις ενώσεις σε μη παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές [26], υποδηλώνοντας μια πιθανή όγκο τύπου ειδικό αποτέλεσμα.

Η επίδραση του θεραπεία TP421 σχετικά με την κατανομή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων μΙΑ PaCa-2 εξετάστηκε σε μία δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Τα κύτταρα χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 0.1 και 1 μΜ TP421 για 24, 48 και 72 ώρες. Ιστογράμματα που απεικονίζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

TP421 εντοπίζεται μιτοχονδριακού Δομές με παρατεταμένη συγκράτηση πάροδο του χρόνου

TP421 ανήκει σε μια κατηγορία ενώσεων που περιέχουν ένα κατιόν TPP είναι γνωστό ότι συσσωρεύονται στα μιτοχόνδρια [27]. Για να επιβεβαιωθεί μιτοχονδριακή εντοπισμού, κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 2 μΜ TP421 για διάφορες χρονικές περιόδους. Αμέσως πριν από την απεικόνιση, τα κύτταρα συν-χρώση με 200 ηΜ Mitotracker κόκκινη χρωστική ουσία για την επισήμανση των μιτοχονδρίων. Παρατηρήσαμε σημαντική συν-εντοπισμό επιμένει για μέχρι 72 ώρες (Σχήμα 5Α) υποδεικνύοντας ότι TP421 πράγματι συσσωρεύεται σε μιτοχόνδρια και διατηρήθηκε για μια παρατεταμένη χρονική περίοδο. Ως δευτερογενής επαλήθευση των μιτοχονδριακών εντοπισμού επιδιώξαμε να καθοριστεί ο ρόλος του μιτοχονδριακού διαμεμβρανικού δυναμικού στη συσσώρευση TP421 στα κύτταρα. Χρησιμοποιώντας την φαινυλυδραζόνη ιονοφόρο καρβονυλ κυανιούχου-4- (τριφθορομεθοξυ) (FCCP), που χρησιμοποιούνται συνήθως για να διαλύσει το μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό, εξετάσαμε το πρότυπο του φθορισμού TP421. Εμείς προεπεξεργασμένων κύτταρα PANC-1 για 30 λεπτά με 10 μΜ FCCP ακολουθούμενη από 15 λεπτών επώαση με TP421. Τα κύτταρα ελέγχου δεν έλαβε καμία FCCP και εκτέθηκαν σε μόνο 15 λεπτά TP421. Με την παρουσία του FCCP, παρατηρήσαμε μια ευδιάκριτα διάχυτο TP421 φθορισμού (Σχήμα 5Β) που δεν μοιάζουν με εκείνη της μιτοχονδριακής εντοπισμού επιβεβαιώνοντας ότι υπό κανονικές συνθήκες TP421 συσσωρευτεί εντός μιτοχόνδρια οδηγείται από το διαμεμβρανικό δυναμικό. Επειδή είχαμε παρατηρήσει ότι 7-διαιθυλαμινο-4-μεθυλοκουμαρίνη δεν ήταν κυτταροτοξική σε κύτταρα, θα διερευνηθεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ μιτοχονδριακό εντοπισμό και TP421 κυτταροτοξικότητα. Εμείς προεπεξεργασμένα ΜΙΑ κύτταρα PaCa-2 για 30 λεπτά με 10 μΜ FCCP συνέχεια προστέθηκε TP421 για επιπλέον 30 λεπτά. Στο τέλος της διάρκειας της θεραπείας, πλύναμε τα κύτταρα και αντικαταστάθηκε το μέσο για την απομάκρυνση της περίσσειας φαρμάκου και επωάζονται τα κύτταρα επί 24, 48 και 72 ώρες και μετρήθηκαν βιωσιμότητα των κυττάρων. Με την παρουσία του FCCP τα κύτταρα σημαντικά προστατεύεται από TP421 κυτταροτοξικότητα (Εικόνα 5C) υποδεικνύοντας ότι εντόπιση στα μιτοχόνδρια ήταν άμεσα υπεύθυνος για τη δράση του φαρμάκου μας.

PANC-1 κύτταρα (Α) που έλαβαν θεραπεία με TP421 και χρωματίζονται με Mitotracker Κόκκινο (MTR) αποκαλύπτουν εκτεταμένη συν-εντοπισμό των TP421 και βαφής μιτοχονδριακή δείκτη. (Β) PANC-1 κύτταρα προ-θεραπεία με FCCP δείχνουν μη-μιτοχονδριακό TP421 εντοπισμού. (C) Μειωμένη κυτταροτοξικότητα TP421 σε MIA κύτταρα PaCa-2 σε προεπεξεργασία με FCCP φαίνεται στο 24, 48 και 72 ώρες. Τα δεδομένα είναι μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Υποδηλώνει p & lt?. 0.01

Η

TP421 Θεραπεία Προκαλεί μιτοχονδριακού και κυτοσολίων συσσώρευση των δραστικών μορφών οξυγόνου

TP421 μειώνει μιτοχονδριακή αναπνευστική ικανότητα και αυξάνει υπεροξειδίου (O

2

– ) συσσώρευση [26]. Ωστόσο, σε σύγκριση με O

2

-, υπεροξείδιο του υδρογόνου (H

2O

2) είναι ένα σχετικά πιο σταθερό και μεμβράνη διαπερατή από ROS που μπορούν να προκαλέσουν λιπιδίων, των πρωτεϊνών και της βλάβης του DNA και συμμετέχει σε μεταγωγής σήματος [29]. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε το επίπεδο της H

2O

2 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μετά από θεραπεία TP421. κύτταρα BxPC-3 ΜΙΑ PaCa-2 και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες δόσεις TP421 για 4 ώρες ακολουθούμενη από σύντομη επώαση με 50 μΜ Amplex Red παρουσία 0,1 μονάδες /mL HRP. Με την παρουσία του HRP, Amplex Red αντιδραστήριο αντιδρά με H

2O

2 σε ένα 1:01 στοιχειομετρία για να παράγει υψηλά φθορίζουσα ρεσορουφίνη. Το προκύπτον ένταση φθορισμού μετρήθηκε στα διέγερσης και εκπομπής μήκη κύματος 540 nm και 590 nm, αντίστοιχα. Όπως ήταν αναμενόμενο, η θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα μια 2.5-πλάσια αύξηση της H

2O

2 επίπεδα σε BxPC-3 στην υψηλότερη συγκέντρωση του TP421 με μια καλή συσχέτιση μεταξύ H

2O

2 επίπεδα και τη δόση του TP421 χρησιμοποιούνται (Σχήμα 6Α). Από την άλλη πλευρά, μια παρόμοια αύξηση του φθορισμού δεν μπορούσε να ανιχνευθεί σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να προσδιοριστεί εάν η έλλειψη H

2O

2 συσσώρευση σε αυτά τα κύτταρα οφείλεται στην απουσία O

2

– γενιάς, χρησιμοποιήσαμε ένα MitoSOX κόκκινο δοκιμασία [26] για τη μέτρηση του επιπέδου της μιτοχονδριακή O

2

– σε ΜΙΑ PaCa-2 και σε σύγκριση με BxPC-3. Και οι δύο γραμμές κυττάρων σε επεξεργασία με αυξανόμενες δόσεις TP421 για 4 ώρες επέδειξε 3-5 φορές αύξηση σε O

2

– επίπεδο (Σχήμα 6Β) και τα εν λόγω επίπεδα παρέμειναν υψηλά στις 24 ώρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό υποδηλώνει ότι η έλλειψη H

2O

2 συσσώρευση παρατηρήθηκε σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 δεν οφείλετο σε ανεπάρκεια O

2

-παραγωγή σε αυτά τα κύτταρα.

Η επίδραση της θεραπείας TP421 για τα επίπεδα (Α) H

2O

2 και (Β) μιτοχονδριακή O

2

– σε κύτταρα BxPC-3 και ΜΙΑ PaCa-2 μετρήθηκαν με τη χρήση των φθοριζόντων ανιχνευτών Amplex κόκκινο και MitoSOX κόκκινο, αντίστοιχα. (C) Επίδραση αντιοξειδωτικών προεπεξεργασίας για την κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα TP421 PANC-1. *, ** Και *** δείχνουν p & lt? 0,05, p & lt? 0.005 και p & lt?. 0.001 αντίστοιχα

Η

Όπως υπερβολική ROS είναι γνωστό ότι οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο, εξετάσαμε περαιτέρω το δυναμικό προστατευτικό ρόλο του ένα αντιοξειδωτικό. κύτταρα PANC-1 προκατεργάστηκαν με 15 mM

N

ακετυλο-L- κυστεΐνη (NAC) για 2 ώρες πριν από την προσθήκη του TP421. Μετά από επώαση 24 h η έκταση της κυτταροτοξικότητας καθορίστηκε με ΜΤΤ. Αντιοξειδωτικές προεπεξεργασία θα μπορούσε να προστατεύσει τα κύτταρα από TP421 επάγεται κυτταροτοξικότητα κατά 35% (Σχήμα 6C) και παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε ΜΙΑ PaCa-2 και BxPC-3 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

TP421 Θεραπεία Ενεργοποιεί Άγχος που προκαλείται Μονοπάτια

Με δεδομένη την έντονη συσσώρευση των ROS μετά τη θεραπεία TP421, υποθέσαμε ότι, κυτταρικό στρες τις οδούς JNK, π-38 και ERK, θα ενεργοποιηθεί [30], [31], [32].