Abstract

Droplet ψηφιακό PCR (ddPCR) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση μεταλλάξεων χαμηλής συχνότητας σε ογκογονίδιο με γνώμονα καρκίνο του πνεύμονα. Το φάσμα των

KRAS

σημειακές μεταλλάξεις που παρατηρήθηκαν σε NSCLC απαιτεί μια πολλαπλή προσέγγιση για την αποτελεσματική ανίχνευση μεταλλάξεων στα κυκλοφορούντα DNA. Εδώ αναφέρουμε το σχεδιασμό και τη βελτιστοποίηση των τριών προσδιορισμών multiplex διακρίσεις ddPCR διερευνά εννέα διαφορετικές

KRAS

μεταλλάξεις χρησιμοποιώντας PrimePCR ™ ddPCR ™ Μετάλλαξη Αναλύσεις και το σύστημα Bio-Rad QX100. Μαζί αυτές οι μεταλλάξεις ευθύνονται για το 95% των νουκλεοτιδίων αλλαγές βρίσκονται στο

KRAS

στον καρκίνο του ανθρώπου. Multiplex αντιδράσεις βελτιστοποιηθεί για γονιδιακό DNA που εξάγεται από

KRAS

μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές και έχουν δοκιμαστεί σε DNA που εξάγεται από σταθερό ιστό του όγκου από μια ομάδα των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα, χωρίς προηγούμενη γνώση της συγκεκριμένης

KRAS

γονότυπο. Τα multiplex δοκιμασίες ddPCR είχε ένα όριο ανίχνευσης καλύτερη από 1 μεταλλαγμένο

KRAS

μόριο σε 2.000 άγριου τύπου

KRAS

μορίων, που συγκρίνεται ευνοϊκά με όριο ανίχνευσης 1 σε 50 για την επόμενη αλληλούχιση γενεά και 1 στα 10 για αλληλούχιση Sanger. Multiplex ddPCR ανιχνεύσεις έτσι παρέχουν μια εξαιρετικά αποτελεσματική μεθοδολογία για τον εντοπισμό

KRAS

μεταλλάξεις στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα

Παράθεση:. Pender Α, Garcia-Murillas Ι Ράνα S, Cutts RJ, Kelly G, Fenwick K , et al. (2015) Αποτελεσματική γονοτυπικός έλεγχος του

KRAS

Μεταλλαγμένα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση πολυπλεξίας Droplet Ψηφιακή PCR. PLoS ONE 10 (9): e0139074. doi: 10.1371 /journal.pone.0139074

Επιμέλεια: Giuseppe Viglietto, ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ Μεγάλη Ελλάδα, Ιταλία

Ελήφθη: 12 Φεβρουαρίου, 2015? Αποδεκτές: 9η Σεπτεμβρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 28 του Σεπτέμβρη, 2015

Copyright: © 2015 Pender et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς εκφράζουν την ευγνωμοσύνη αναγνωρίζουν την υποστήριξη του έργου αυτού από την Εθνική Υπηρεσία Υγείας (Αγγλία), μέσω της χρηματοδότησης του Εθνικού Ινστιτούτου Κέντρου Ερευνών Υγείας Βιοϊατρικής Έρευνας στο Royal Marsden Hospital. Αναγνωρίζουν επίσης ευγνωμοσύνη χρηματοδότηση από το Ινστιτούτο Έρευνας για τον Καρκίνο και Cancer Research UK, Πρόγραμμα Στρωματοποιημένη Ιατρικής. Η έρευνα αυτή υποστηρίζεται επίσης εν μέρει από το Revere Charitable Trust, μια απεριόριστη εκπαιδευτική δωρεά από τον Pierre-Fabre Ltd., το Ευρωπαϊκό Συμβούλιο Έρευνας επιχορηγήσεις προηγμένης RASTARGET και το βραβείο ανώτερος ερευνητής Wellcome Trust, 103799 /Z /14 /Z. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η χρηματοδότηση που παρέχεται από τον Pierre-Fabre Ltd. δεν αντιπροσωπεύει ένα ανταγωνιστικό ενδιαφέρον για οποιαδήποτε των συγγραφέων, και καμία άλλη σχετική δήλωση σχετικά με την απασχόληση, παροχή συμβουλών, διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα στην ανάπτυξη ή εμπορία προϊόντων απαιτείται. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

καρκίνου

πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1] και πάνω από 20 000 περιπτώσεις μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) διαγνώστηκαν στο Ηνωμένο Βασίλειο το 2012 [2]. Οι πιο συχνά μεταλλαγμένα ογκογονίδια στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα είναι η

RAS

οικογένεια GTPases και

EGFR

(25% και 15% αντίστοιχα [3]). Η γνώση της μοριακής προφίλ των προηγμένων αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα είναι κρίσιμη για τη θεραπευτική λήψη αποφάσεων [4], ιδιαίτερα κατά τη χρήση των αναστολέων της κινάσης τυροσίνης EGFR και ALK [5,6]. Η παρουσία ενός

KRAS

μετάλλαξη μπορεί επίσης να έχει θεραπευτική σημασία αν οι συνδυασμοί αναστολέα ΜΕΚ και ταξάνη αποδειχθεί αποτελεσματική σε αυτή την ομάδα ασθενών [7]. Η απόκτηση επαρκών ιστός του όγκου για οριστική γονοτυποποίηση στον καρκίνο του πνεύμονα μπορεί να είναι προβληματική, όμως [8]. Σταγονίδιο ψηφιακό PCR (ddPCR) είναι μία ευαίσθητη μέθοδος ποσοτικής ανίχνευσης μετάλλαξης [9,10], η οποία έχει τη δυνατότητα να γονότυπο ακρίβεια του υλικού ασθενών που προέρχεται από μία μικρή ποσότητα του αρχικού υλικού.

Ανίχνευση

KRAS

hotspot μεταλλάξεις από ddPCR έχει περιοριστεί από την ποικιλία των πιθανών αλληλόμορφα μέσα σε παρακείμενες θέσεις, αν και ορισμένοι

KRAS

μεταλλάξεις συμβαίνουν πιο συχνά στον καρκίνο από ό, τι άλλες (πίνακες 1 και 2). Οι τέσσερις συνηθέστερες μεταλλάξεις ευθύνονται για το 80% όλων των αλλαγών KRAS νουκλεοτιδίων που βρέθηκαν σε ανθρώπινους καρκίνους (85% του συνόλου των αλλαγών στον NSCLC), ενώ οι εννέα συχνότερες μεταλλάξεις ευθύνονται για το 95% όλων των αλλαγών και 97,5% των αλλαγών στον NSCLC. Επισημασμένο με φθοροφόρο ανιχνευτές ψηφιακή PCR συμπληρώσει μια συγκεκριμένη μεταλλαγμένη αλληλουχία του DNA και έτσι μόνο να ανιχνεύσει ένα συγκεκριμένο

KRAS

μετάλλαξη. Χρησιμοποιώντας αυτές τις δοκιμασίες σε duplex με έναν ανιχνευτή για την ανίχνευση της μεταλλαγμένο αλληλόμορφο και ένα ανιχνευτή για την ανίχνευση το αλληλόμορφο αγρίου τύπου επιτρέπουν μεταλλαγμένο υπολογισμό κλάσμα αλληλόμορφο για μια δεδομένη μετάλλαξη, αλλά αυτή η προσέγγιση απαιτεί ενδεχομένως πολλαπλούς προσδιορισμούς και τη χρήση περισσότερων υλικού πριν σωστή ταυτοποίηση του το γονότυπο. Ανάπτυξη ενός multiplex δοκιμασία που συνδυάζει πολλές διαφορετικές μεταλλαγμένο ανιχνευτές στην ίδια αντίδραση είναι επομένως μια ελκυστική εναλλακτική λύση. Multiplex

έχουν KRAS

ψηφιακό PCR δοκιμασίες έχουν περιγραφεί χρησιμοποιώντας το σύστημα σταγόνα βροχής ™ Digital PCR (Raindance Technologies, Billerica, Massachusetts, USA) σε προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου [11], αλλά δεν έχει ακόμη με το σύστημα Bio-Rad QX100, ένα προσιτό ψηφιακό σύστημα PCR με εμπορικά διαθέσιμα ανιχνευτές για αρκετές

KRAS

μεταλλάξεις, ούτε έχει ένα πολλαπλό εργαλείο έχει χρησιμοποιηθεί στον καρκίνο του πνεύμονα.

η

Ξεκινήσαμε να σχεδιάσει multiplex ψηφιακή PCR δοκιμασίες που θα προσδιορίσει με ακρίβεια εννέα διαφορετικές

KRAS

μεταλλάξεις και να αποδείξει την εφαρμογή αυτών των δοκιμασιών σε υλικό ασθενών που προέρχονται από τη χρήση του συστήματος Bio-Rad QX100.

Υλικά και Μέθοδοι

δοκιμασίες ανιχνευτή ψηφιακή PCR

Κάθε ψηφιακή ανιχνευτής PCR είναι ένα ολιγονουκλεοτίδιο ειδικά για την περιοχή ενδιαφέροντος με ένα 5 ‘φθοροφόρο και ένα 3’ αποσβεστήρα. Το φθοροφόρο είναι είτε Hex για ανιχνευτές ειδικούς για αλληλουχίες άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο FAM για ανιχνευτές.

KRAS

c.35G & gt? T (G12V?. Γάτα δεν dHsaCP2500592), c.35G & gt? Α (G12D?. Γάτα δεν dHsaCP2500596), c.35G & gt? C (G12A?. Γάτα δεν dHsaCP2500586), γ .34G & gt? Α (G12S?. γάτα δεν dHsaCP2500588), c.34G & gt? C (G12R?. γάτα δεν dHsaCP2500590), c.34G & gt? T (G12C? dHsaCP2500584), c.37G & gt? T (G13C?. γάτα δεν dHsaCP2500595 ), c.38G & gt? Α (G13D?. γάτα δεν dHsaCP2500598), c.183A & gt? C (Q61H?. γάτα δεν dHsaCP2000133), WT για c.35G & gt? T (WT για G12V?. γάτα δεν dHsaCP2500593), WT για c.35G & gt? Α (WT για G12D?. γάτα δεν dHsaCP2000002), WT για c.35G & gt? C (WT για G12A?. γάτα δεν dHsaCP2000004), WT για c.34G & gt? Α (WT για G12S?. γάτα δεν dHsaCP2000012 ), WT για c.34G & gt? C (WT για G12R?. γάτα δεν dHsaCP2000010), WT για c.34G & gt? T (WT για G12C?. γάτα δεν dHsaCP2000008), WT για c.37G & gt? T (WT για G13C? γάτα δεν dHsaCP2500595), WT για c.38G & gt?. Α (WT για G13D?. γάτα δεν dHsaCP2000014) και WT για c.183A & gt? C (WT για Q61H?. γάτα δεν dHsaCP2000132) 20x PrimePCR ™ ddPCR ™ Μετάλλαξη Αναλύσεις (που περιέχει τόσο εκκινητές και ανιχνευτές ddPCR) αγοράστηκαν από τη Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA) και χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη.

βελτιστοποίηση Δοκιμασία και DNA ποσοτικοποίηση

δοκιμασίες Digital PCR βελτιστοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρική σειρά γενωμικού DNA (gDNA) ή συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια όπως αρμόζει. Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη είχαν επικυρωθεί χρησιμοποιώντας STR προφίλ από την εγκατάσταση των κυττάρων υπηρεσίες στο Cancer Research UK Λονδίνο Ινστιτούτο Ερευνών και το Ινστιτούτο Έρευνας για τον Καρκίνο. Αυτές περιλάμβαναν NCI-H727 (

KRAS

G12V, πνευμόνων), NCI-H358 (

KRAS

G12C, πνευμόνων), Α549 (

KRAS

G12S, πνευμόνων), SK- LU-1 (

KRAS

G12D, πνευμόνων), Α427 (

KRAS

G12D, πνευμόνων), HCT-116 (

KRAS

G13D, του παχέος εντέρου) και NCI-H1975 (

KRAS

WT, των πνευμόνων). Όλες οι κυτταρικές γραμμές που παρέχονται απευθείας από Cancer Research UK κυττάρων Υπηρεσιών με την εξαίρεση των HCT-116 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA? Cat Νο ATCC

®CCL-247

TM.). Κυττάρων gDNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το DNeasy ™ αίματος και ιστού Kit (Qiagen, Venlo, Limburg, Κάτω Χώρες) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα DNA που χρησιμοποιείται στις επόμενες ψηφιακό PCR αντιδράσεις, εκτός συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, ποσοτικοποιήθηκε σε ένα σύστημα QX100 ddPCR χρησιμοποιώντας TaqMan® αντιγραφής Δοκιμασία ανθρώπινης RNase Ρ Αριθμός αναφοράς (Life Technologies Corporation, Carlsbad, California, USA). 1 μί προϊόντος έκλουσης προστέθηκε σε ένα ψηφιακό αντίδραση PCR που περιέχει 10 μι ddPCR Supermix για ανιχνευτές (Bio-Rad) και 1 μι TaqMan αντιγραφής Δοκιμασία αριθμό αναφοράς, την ανθρώπινη, RNase Ρ (Life Technologies) σε ένα συνολικό όγκο 20 μL. Η αντίδραση μοιράστηκε σε ~ 14.000 σταγονίδια ανά δείγμα σε μια γεννήτρια σταγονιδίων QX-100 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντιδράσεις Γαλακτοποιημένη PCR διεξήχθησαν σε μία πλάκα 96 φρεατίων (Eppendorf, Stevenage, UK) σε μια G-Storm GS4 θερμικό κυκλοποιητή (G-Storm, Somerton, Somerset, UK) επώαση των πλακών στους 95 ° C για 10 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους 95 ° C για 15 sec και 60 ° C για 60 δευτερόλεπτα, ακολουθούμενο από 10 min επώασης στους 98 ° C. Η αύξηση ράμπα θερμοκρασία ήταν 2,5 ° C /sec για όλα τα βήματα. Οι πλάκες αναγνώστηκαν σε αναγνώστη σταγονιδίων Bio-Rad QX-100 χρησιμοποιώντας λογισμικό v1.4.0.99 QuantaSoft (Bio-Rad). Τουλάχιστον μία φρεάτια αρνητικού ελέγχου χωρίς DNA συμπεριλήφθηκαν σε κάθε εκτέλεση. Η ποσότητα του ενισχύσιμου RNase Ρ DNA προσδιορίστηκε ποσοτικά από τη συγκέντρωση που παρέχονται από το λογισμικό. Μετά τον ποσοτικό προσδιορισμό, η κυτταρική γραμμή DNA υπέστη πέψη χρησιμοποιώντας Hind 3-HF ένζυμο περιορισμού ™ (New England BioLabs, Ίπσουιτς, Massachusetts, USA) στους 37 ° C για 1 ώρα.

σταγονίδιο ψηφιακό PCR για την ανίχνευση μεταλλάξεων KRAS

μίγματα αντίδρασης PCR παρασκευάστηκαν σε ένα συνολικό όγκο 20 μί περιείχε: 10 μL 2x Supermix για Probes χωρίς dUTP (Bio-Rad), σχετικές δοκιμασίες ανιχνευτή εκκινητή, DNA (μεταβλητού όγκου) και ύδατος άνευ νουκλεάσης (Life Technologies Corporation, Carlsbad, California, USA). Πολλαπλές φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν εάν απαιτείται για να αναλύσει την αναγκαία DNA εκλούσματος. Τουλάχιστον 500 pg ισοδύναμο DNA έκλουσμα αναλύθηκε σε κάθε πολλαπλή δοκιμασία για κάθε ασθενή. 20 μι του μίγματος της αντίδρασης PCR μεταφέρθηκε σε ένα δείγμα καλά σε μια αναλώσιμη κασέτα γεννήτρια σταγονιδίων (Bio-Rad). 70 μL του πετρελαίου σταγονιδίου γενιάς (Bio-Rad) στη συνέχεια φορτώθηκε μέσα στο λάδι καλά για κάθε κανάλι και την κασέτα φορτώνεται σε ένα QX100 Droplet Generator (Bio-Rad). Τα σταγονίδια στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μια 96 φρεατίων πλάκα PCR. Αντιδράσεις Γαλακτοποιημένη PCR έτρεξαν σε G-Storm GS4 θερμικό κυκλοποιητή επώαση των πλακών στους 95 ° C για 10 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους των 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 54 ° C για 60 δευτερόλεπτα, που ακολουθείται από 10 λεπτών επώαση στους 98 ° ΝΤΟ. Η αύξηση ράμπα θερμοκρασία ήταν 2,5 ° C /sec για όλα τα βήματα. Οι πλάκες αναγνώστηκαν σε αναγνώστη σταγονιδίων Bio-Rad QX-100 χρησιμοποιώντας λογισμικό v1.4.0.99 QuantaSoft από την Bio-Rad. Τουλάχιστον ένας αρνητικός μάρτυρας καλά με κανένα ϋΝΑ περιλαμβάνονται σε κάθε τρέξιμο. Κάθε φρεάτιο στη συνέχεια αναγνώστηκε χρησιμοποιώντας το QX100 Droplet Reader (Bio-Rad) και σταγονίδια αναλύθηκαν για εκπομπή στο εξάγωνο ή FAM μήκη κύματος. Δισδιάστατη οικόπεδα πλάτους εμφάνιση μετράται το πλάτος HEX και FAM για κάθε σταγονίδιο δείχνουν τέσσερις κύριους πληθυσμούς σταγονίδιο? σταγονίδια που δεν περιέχουν ενισχυμένο DNA, σταγονίδια με μόνο μεταλλαγμένο DNA και υψηλού πλάτους FAM, σταγονίδια με μόνο άγριου τύπου DNA και υψηλού πλάτους ΗΕΧ και σταγονίδια τόσο με άγριου τύπου και μεταλλαγμένων ενισχυμένο DNA και υψηλή FAM και ΗΕΧ πλάτος. Εάν πολλαπλά αντίγραφα αγρίου τύπου και μεταλλαγμένο DNA που περιέχεται στο ίδιο σταγονίδιο, σταγονίδια με θα διαβαστεί υψηλότερο εύρος FAM και ΗΕΧ. Αυτά τα σταγονίδια έχουν αποκλειστεί από αναλύσεων σε όλη αυτή τη μελέτη.

Ψηφιακές PCR ανάλυση

Για να εκτιμηθεί το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο κλάσμα, η συγκέντρωση του μεταλλαγμένου DNA (αντίγραφα του μεταλλαγμένου DNA ανά σταγονίδιο) εκτιμήθηκε από η κατανομή Poisson. Αριθμός των μεταλλαγμένων αντιγράφων ανά σταγονίδιο MMU = -Ιη (1- (NMU /n)), όπου NMU = ο αριθμός των σταγονιδίων θετικά για μεταλλαγμένο ιχνηλάτη FAM και n = συνολικός αριθμός των σταγονιδίων. Η συγκέντρωση του DNA στην αντίδραση εκτιμήθηκε ως εξής: MDNAconc = -Ιη (1- (nDNAcon /n)), όπου nDNAconc = ο αριθμός των σταγονιδίων θετικά για μεταλλαγμένο ιχνηλάτη FAM ή /και ανιχνευτή ΗΕΧ άγριου τύπου και n = συνολικός αριθμός σταγονίδια. Το μεταλλαγμένο κλάσμα αλληλόμορφο = MMU /MDNAconc. Η μετρούμενη συχνότητα των προϊόντων μετάλλαξης αλληλόμορφο περιγράφει το μεταλλαγμένο κλάσμα αλληλόμορφο που εκφράζεται ως ποσοστό.

πρόσβαση FFPE DNA ιστού και εξόρυξη

φορμόλη σταθερό παραφίνη δείγματα ενσωματωμένα (FFPE) όγκου από NSCLC πλεόνασμα ασθενείς με κλινική φροντίδα ήταν συλλέγονται με τη γραπτή συγκατάθεση του ασθενούς στο The Royal Marsden NHS Foundation Trust. FFPE ιστός DNA εκχυλίστηκε (μετά macrodissection εάν απαιτείται να διασφαλιστεί & gt? Περιεκτικότητα όγκου 10%) με χρήση του Qiagen DNA FFPE Kit Tissue (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η έκλουση του DNA αποθηκεύτηκε στους -20 ° C.

Δήλωση Ηθικής

Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση για αυτή τη μελέτη (έγκριση δεοντολογία 13 /LO /1389, Επιτροπή NRES Λονδίνο Central), η οποία ενσωματωθεί πλεόνασμα σωματικών DNA από το πρόγραμμα Στρωματοποιημένη Ιατρικής Cancer Research UK (έγκριση δεοντολογία 11 /EE /0202, NRES Επιτροπή East of England).

Sanger αλληλούχισης

Η περιοχή ενδιαφέροντος ενισχύθηκε με τη χρήση 10 μΜ εμπρός (5′-TATTATAAGGCCTGCTGAAAATG-3 ‘) και ανάστροφα (5′-TTGGATCATATTCGTCCACAA-3’) εκκινητές, 10 μL Amplitaq Gold® PCR Master Mix (Life Technologies) και 3 ng του εκμαγείου FFPE DNA προερχόμενο ή 5ng gDNA. Οι συνθήκες PCR ήταν σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Το καθαρισμένο PCR προϊόν στη συνέχεια υποβλήθηκε σε μια περαιτέρω βαθμίδα PCR χρησιμοποιώντας διδεοξυνουκλεοτίδια τερματισμού αλύσου (BigDye® 1.0, Life Technologies) και την επακόλουθη αλληλουχία DNA διαβάστηκε σε ένα αυτοματοποιημένο αλληλουχητή.

Ion torrent πρωτόνιο αλληλούχιση

Sequencing βιβλιοθήκες παρασκευάσθηκαν με το ιόν AmpliSeq Cancer ™ Hotspot Panel v2 (Life Technologies) χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο Ion AmpliSeq Βιβλιοθήκη Παρασκευή με 3-5ng του DNA, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά barcoding, βιβλιοθήκες ποσοτικά χρησιμοποιώντας qPCR και αραιώνεται σε 100 ρΜ. Βιβλιοθήκες templated με το σύστημα Ion OneTouch2 (Life Technologies) και η αλληλουχία σε ένα τσιπ PI με τη χρήση του Ion PI OT2 200 Kit (Life Technologies), 520 ροών και μέσο μήκος αμπλικόνιο των 112 βάσεων σε ένα μέσο βάθος x2721307. Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας οδήγησε σε 45272-11767856 διαβάζει ανά δείγμα.

Ion torrent Variant καλούντος v4.0-r73742 χωρίς περιοχή Hotspot και τη διαμόρφωση του «βλαστικής χαμηλής έντασης» χρησιμοποιήθηκε για την κλήση παραλλαγές. Διαβάστε μετράει για όλες τις θέσεις που είχαν υπολογιστεί χρησιμοποιώντας pileup (SAMtools v1.1 [12]) και τα δεδομένα αναλύθηκαν για πιθανές παραλλαγές χρησιμοποιώντας έθιμο Perl και R σενάρια. Παραλλαγές σε & gt? 3% αναφέρθηκαν από τις δύο μεθόδους ανάλυσης και δεν αναφέρονται στο 1000 βάση δεδομένων γονιδιώματος του έργου (www.1000genomes.org) ταυτοποιήθηκαν ως πιθανές σωματικές μεταλλάξεις. Τα δεδομένα διασταυρώνονται κατά του Cosmic V70 βάση δεδομένων (cancer.sanger.ac.uk) για τον εντοπισμό πιθανών μεταλλάξεων hotspot.

Η στατιστική ανάλυση

Γραμμική παλινδρόμηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας τον τύπο r

2 = 1- (SS

reg /SS

tot), όπου SS

reg αναφέρεται στο άθροισμα των τετραγώνων των αποστάσεων να ταιριάζει καλύτερα γραμμικής παλινδρόμησης και SS

tot αναφέρεται στο άθροισμα των τα τετράγωνα των κάθετων αποστάσεων από την μηδενική υπόθεση (y = μέσος όρος όλων των y τις τιμές) χρησιμοποιώντας GraphPad Prism έκδοση 6.0a (GraphPad Software, La Jolla, California, USA).

KRAS multiplex ειδικότητας δοκιμασία

92 φρεάτια

KRAS

άγριου τύπου gDNA αναλύθηκαν με κάθε multiplex. Το όριο ανίχνευσης ορίστηκε στο 0,05% ώστε να αντικατοπτρίζει μετριέται τα αποτελέσματά μας με καρφιά

KRAS

μεταλλαγμένα είδη gDNA (S8 σχήμα). Μεμονωμένα σταγονίδια συγκεντρώθηκαν σύμφωνα με πλάτος HEX τους σε δύο ομάδες, χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο kMeans. Ένα όριο για μεταλλάξεις υπολογίστηκε με βάση 1,5 φορές τη μέση τιμή των τιμών FAM αυτών των σταγόνων που ανήκουν στο σύμπλεγμα με υψηλότερες κατηγορίες HEX. Ψευδώς θετικά «μεταλλαγμένο» σταγονίδια είχαν ταξινομηθεί ως σταγονίδια που ήταν στο κάτω σύμπλεγμα HEX, αλλά του οποίου η FAM αξία υπερβαίνει το όριο ώστε να αντικατοπτρίζει τις FAM και HEX πλάτη μετρώνται για οποιοδήποτε από τα μεταλλαγμένα είδη KRAS δοκιμαστεί στο εν λόγω πολλαπλή δοκιμασία. Ένα ψευδώς θετικό αποτέλεσμα ορίστηκε ως τρεις ψευδώς θετικά «μεταλλαγμένο» σταγονίδια σύμφωνα Σπάνιες Ανίχνευση κατευθυντήριες γραμμές βέλτιστων πρακτικών Η μετάλλαξη [13]. Για να αξιολογηθεί η ειδικότητα, υπολογίσαμε την διωνυμική πιθανότητα επίτευξης λιγότερες από τρεις «μεταλλαγμένο» σταγονίδια ανά 6000 σταγονίδια άγριου τύπου για κάθε multiplex δοκιμασία.

Αποτελέσματα

KRAS

μετάλλαξη διπλής όψης ddPCR

Δοκιμάσαμε όλα τα

KRAS

δοκιμασίες ddPCR ξεχωριστά σε όλη την βαθμίδα θερμοκρασίας ανόπτησης για τη βελτιστοποίηση των συνθηκών θερμικούς κύκλους. Κάθε δοκιμασία ελέγχθηκε με την κατάλληλη gDNA ή ολιγονουκλεοτιδίων μόνη της και στη συνέχεια, διπλής όψης με άγριου τύπου και

KRAS

μεταλλαγμένου DNA και οι δύο σχετικές FAM και HEX ανιχνευτές παρόντες. Μειώνοντας ανόπτηση θερμοκρασία αυξήθηκε πλάτος FAM του μεταλλαγμένου ανιχνευτή σε ένα πλάτωμα στους 54 ° C για

KRAS

G12V, D, A, S, R και C και G13C και 13Δ ανιχνευτές (Σχήμα 1). Η

KRAS

καθετήρα Q61H είχε μια περαιτέρω ελάχιστη αύξηση στο πλάτος FAM στους 53,4 ° C σε σύγκριση με 54 ° C. Όλες οι ανιχνευτές ελέγχθηκαν έδειξε καλό διαχωρισμό των τεσσάρων διαφορετικών ομάδων σταγόνας στους 54 ° C, επιτρέποντας σαφή προσδιορισμό και την ποσοτικοποίηση των διαφορετικών πληθυσμών DNA.

πληθυσμοί σταγονιδίων που παρατηρήθηκε για κάθε δοκιμασία διπλής όψης δοκιμαστεί με άγριου τύπου και των σχετικών μεταλλαγμένη κυτταρική σειρά gDNA ή ολιγονουκλεοτίδιο στη βέλτιστη θερμοκρασία ανόπτησης π.χ. G12V επάνω αριστερό πάνελ δείχνει πληθυσμοί σταγονιδίων δει με WT για G12V δοκιμασία, δοκιμασία G12V, NCI-H727 gDNA και NCI-H1975 gDNA παρόν. ΗΕΧ πλάτος είναι μέχρι 6000 στον άξονα χ και πλάτος FAM έως 11.000 επί του γ-άξονα του κάθε πάνελ. Κλειδί:. Μαύρο drops- άδειο σταγονίδια, καταρροϊκό πυρετό του μεταλλαγμένου DNA FAM θετική σταγονίδια, θερμοκήπια άγριου τύπου HEX DNA θετικά σταγονίδια, καφέ-αγρίου τύπου και μεταλλαγμένα DNA διπλό θετικό σταγονίδια

Η

KRAS

multiplex ddPCR σχεδιασμό δοκιμασία

Σχεδιάσαμε ένα ψηφιακό multiplex εργαλείο που βασίζεται στην PCR για την οθόνη για την πιο κοινή

KRAS

μεταλλάξεις στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα? G12C, G12D και G12V (https://www.sanger.co.uk/cosmic). δοκιμασίες ανιχνευτών άγριου τύπου για κάθε μετάλλαξη δοκιμάστηκαν σε συνδυασμό με διάφορες συγκεντρώσεις των μεταλλαγμένων δοκιμασίες ανιχνευτή, προκαλώντας μεταλλαγμένο πληθυσμούς σταγονίδιο μεταβαλλόμενο πλάτος FAM (Σχήμα 2). Το πλάτος HEX όλων των δοκιμασιών ανιχνευτών άγριου τύπου βρέθηκε να είναι πολύ παρόμοια και έτσι η WT για G12C, WT για G12V και WT για επιλεγμένες αναλύσεις G12D είχαν ως αναφορές για όλες τις επόμενες

KRAS

G12 και G13 μεταλλαγμένο δοκιμασίες . Από τους διάφορους συνδυασμούς των μεταλλαγμένων δοκιμασίες δοκιμαστεί, ο multiplex δοκιμασία η οποία έδωσε καλύτερο διαχωρισμό των πληθυσμών των σταγονιδίων χρησιμοποιήθηκαν 900 εκκινητές ηΜ και 500 ηΜ ιχνηλάτη G12C, 562,5 εκκινητές ηΜ και 312.5 ηΜ ιχνηλάτη G12D και 225 εκκινητές ηΜ και 125 ηΜ ιχνηλάτη G12V (Εικόνα 2 , πάνω αριστερά πάνελ).

KRAS

G12C μεταλλαγμένο πληθυσμοί σταγονιδίων που υποδεικνύεται από μια διακεκομμένη κόκκινη πλατεία,

KRAS

G12D μεταλλαγμένων πληθυσμών από ένα μπλε διακεκομμένη πλατεία και

KRAS

G12V μεταλλαγμένων πληθυσμών από μία κίτρινη διακεκομμένη πλατεία. Κάθε multiplex δοκιμασία, συνδυάζοντας όλες τις σχετικές αναλύσεις FAM και HEX,

KRAS

WT gDNA και G12V, Δ και Γ μεταλλαγμένο gDNA, εμφανίζεται στην κορυφή του πίνακα. Η αντίστοιχη ανάλυση εκτύπωσης διπλής όψης για κάθε μετάλλαξη, χρησιμοποιώντας την ίδια FAM και δοκιμασία HEX συγκέντρωση με

KRAS

WT DNA και η κατάλληλη

KRAS

μεταλλαγμένο DNA το παρόν, φαίνεται στο παρακάτω κάθε multiplex δοκιμασία πάνελ. Multiplex 1 (επάνω αριστερό πάνελ) είναι ένας συνδυασμός προσδιορισμού των 900 εκκινητών nM και 500 nM καθετήρα G12C, 562.5 εκκινητών nM και 312,5 nM καθετήρα G12D και 225 εκκινητών nM και 125 nM G12V καθετήρα με 450 nm εναύσματα και 250 nM WT για ανιχνευτή G12C. Multiplex 2 χρησιμοποιεί την ίδια συγκέντρωση G12V και WT για δοκιμασία G12C ως Multiplex 1, αλλά περιέχει επίσης 450 εκκινητές ηΜ και 250 ηΜ ιχνηλάτη G12C και 675 ηΜ εκκινητών και 375 ηΜ ιχνηλάτη G12D. Multiplex 3 χρησιμοποιεί την ίδια συγκέντρωση

KRAS

μεταλλαγμένο δοκιμασίες όπως στο Multiplex 2, αλλά με την WT για G12V παρούσα δοκιμασία ανιχνευτή, χρησιμοποιήθηκε στην ίδια συγκέντρωση όπως το WT για δοκιμασία G12C σε Multiplex 1. Multiplex 4 είναι μία δοκιμασία συνδυασμός της δοκιμασίας G12C όπως στο Multiplex 2 με 225 ηΜ εκκινητών και 125 ηΜ ιχνηλάτη G12D και 675 εκκινητές ηΜ και 375 ηΜ ιχνηλάτη G12V με την WT για την δοκιμασία G12D στην ίδια συγκέντρωση όπως το WT για δοκιμασία G12C σε Multiplex 1. κλειδί: μαύρο – άδειο σταγονίδια, μπλε-μεταλλαγμένο FAM DNA θετικά σταγονίδια, θερμοκήπια άγριου τύπου HEX DNA θετικά σταγονίδια, καφέ-αγρίου τύπου και μεταλλαγμένα DNA διπλό θετικό σταγονίδια. Η ίδια κλίμακα χρησιμοποιείται για όλα τα πάνελ (πλάτος HEX έως 7000 και το πλάτος FAM έως 22000).

Η

Η δυνατότητα να δοκιμάσουν για πολλαπλές

KRAS

μεταλλάξεις θα βοηθήσει να ανιχνεύσει υπο -clonal πληθυσμών με την εφαρμογή της πολλαπλής προσέγγισης για κλινικά δείγματα για τα οποία αρχικό υλικό είναι σπάνιο. Για το μοντέλο αυτό, που απασχολούνται κυτταρική γραμμή που προέρχεται gDNA για τις τρεις μεταλλάξεις και δοκιμαστεί με κάθε ανιχνευτή στο διπλής όψης για να εξασφαλιστεί η ειδικότητα (S1 Σχήμα). Με την παρουσία του μεταλλαγμένου ανιχνευτή G12D και

KRAS

G12D, V και C μεταλλαγμένο DNA, ένα δεύτερο μεταλλαγμένο πληθυσμός σταγονιδίων ταυτοποιήθηκε σε χαμηλότερες πλάτος FAM στο G12D μεταλλαγμένο πληθυσμό DNA (κόκκινο γραμμοσκιασμένο κουτί αριστερά ανώτερο πάνελ ). Αυτός ο πληθυσμός δεν παρατηρήθηκε όταν κάθε μεταλλαγμένο είδος DNA ελέγχθηκε σε διπλό με τον ανιχνευτή G12D (αριστερά δεύτερος πίνακας). Μια παρόμοια δεύτερο μεταλλαγμένο πληθυσμό παρατηρήθηκε με το μεταλλαγμένο ιχνηλάτη G12V και τα τρία είδη μεταλλαγμένο DNA σε σχέση με κάθε μεταλλαγμένο DNA σε διπλής όψης (αριστερά κάτω πάνελ). Αυτό το δεύτερο του πληθυσμού, ιδιαίτερα όπως φαίνεται με το μεταλλαγμένο καθετήρα G12D, μπορεί να πέσει στο αναμενόμενο εύρος FAM ενός διαφορετικού

KRAS

μετάλλαξη στο multiplex δοκιμασία και να οδηγήσει σε ψευδώς θετικά ανίχνευση μεταλλάξεων. Για να διερευνήσουν περαιτέρω αυτή, FFPE DNA ιστού από ένα άτομο που είναι γνωστό ότι έχουν ένα

KRAS

12/13 μετάλλαξη (F124), όπως επαληθεύεται από COBAS® δοκιμών (COBAS®

KRAS

Mutation Test, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA) αναλύθηκε (S1 Σχήμα, δεξιά πάνελ). Η πολλαπλή ανάλυση εντόπισε μια μετάλλαξη του πληθυσμού σταγονιδίων με πλάτος FAM που ερμηνεύτηκε ως G12D ή μετάλλαξη G12V. Όταν το δείγμα ελέγχθηκε με κάθε δοκιμασία duplex χωριστά, καμία μεταλλαγμένη πληθυσμού είτε G12V ή G12C παρατηρήθηκε, ενώ ένα πληθυσμό με ένα χαμηλότερο εύρος FAM από το αναμενόμενο με την G12D παρατηρήθηκε μεταλλαγμένο δοκιμασίας. Στις επόμενες αλληλουχίας και περαιτέρω ανάπτυξη της ψηφιακής ανάλυσης PCR του DNA του ιστού, το δείγμα αυτό αργότερα ταυτοποιήθηκε ως

KRAS

G12A μετάλλαξη (Πίνακας 3).

Η

Η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα της

KRAS

δοκιμασίες ανιχνευτή σε συνδυασμό

Λόγω της στενής ομοιότητες μεταξύ των αλληλουχιών DNA των διαφόρων

KRAS

μεταλλάξεις, σημαντική διασταυρούμενη αντιδραστικότητα παρατηρήθηκε μεταξύ των ανιχνευτών σχεδιαστεί για μεταλλάξεις εντός της ίδια περιοχή. Αυτό ήταν ιδιαίτερα εμφανές με ανιχνευτές έχουν σχεδιαστεί για αντικαταστάσεις στο ίδιο νουκλεοτίδιο, δηλαδή

KRAS

G12V, D και Α και

KRAS

G12S, Ε και C. Η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα της δοκιμασίας ανιχνευτή με ‘ παράταιρα «DNA που φέρει ένα διαφορετικό

KRAS

μετάλλαξη (S2 και S3 Σχήματα) οδηγεί σε έναν πληθυσμό σταγονιδίων ποικίλης FAM και VIC πλάτη σχετικά κοντά στο άδειο πληθυσμού σταγονιδίων και ενός άλλου πληθυσμού κοντά στην αληθινή πληθυσμού σταγονιδίων άγριου τύπου . Η θέση αυτών των πρόσθετων πληθυσμών των σταγονιδίων υπαγορεύει το σχεδιασμό των δοκιμασιών multiplex για να μειωθεί το δυναμικό παρερμηνεία του

KRAS

γονότυπους. Ως εκ τούτου, τα τρία multiplex δοκιμασίες σχεδιάστηκαν για κάθε συνδυάσει έναν ανιχνευτή για μια μετάλλαξη στη θέση νουκλεοτιδίου 35, έναν ανιχνευτή για μια μετάλλαξη στη θέση 34 και έναν ανιχνευτή για μία μετάλλαξη στη θέση είτε 37, 38 ή 183.

KRAS

multiplex ddPCR βελτιστοποίηση δοκιμασία

multiplex α είναι ένας συνδυασμός των δοκιμασιών FAM για

KRAS

G13C, G12C και G12V. Αρκετοί διαφορετικοί συνδυασμοί των μεταλλαγμένων συγκεντρώσεων ανιχνευτή ελέγχθηκαν και η χρήση ενός ανιχνευτή άγριου τύπου για G12C και G13C σε διάφορες συγκεντρώσεις (S4 Εικ). Υπήρξε σημαντική επικάλυψη μεταξύ του πλάτους HEX των πληθυσμών των σταγονιδίων άγριου τύπου και λόγω της εγγύτητας των σχετικών νουκλεοτιδικών βάσεων και το εκτιμώμενο μήκος του ανιχνευτή, κρίθηκε ότι η 450 εκκινητές ηΜ και 250 ηΜ G12C, V ή D άγριας ανιχνευτή τύπου ήταν επαρκής για την ποσοτικοποίηση των δύο G12 και των πληθυσμών άγριου τύπου G13. Η βέλτιστη multiplex δοκιμασίας (S4 Σχ, επάνω αριστερά πάνελ) περιελάμβανε 900 εκκινητές ηΜ και 500 ηΜ G13C μεταλλαγμένου ανιχνευτή, 450 ηΜ εναρκτήρων και 250 ηΜ ιχνηλάτη G12C και 225 ηΜ εκκινητών και 125 ηΜ ιχνηλάτη G12V. Multiplex B είναι ένας συνδυασμός των δοκιμασιών FAM για

KRAS

G12S, G12D και G13D. Από όλες τις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν, ο βέλτιστος συνδυασμός μεταλλαγμένου δοκιμασίες ανιχνευτή ήταν 675 εκκινητές ηΜ και 375 ηΜ G12S ανιχνευτή, 450 ηΜ εναρκτήρων και 250 ηΜ ιχνηλάτη G12D και 225 ηΜ εκκινητών και 125 ηΜ ιχνηλάτη G13D (S5 Σχ, επάνω αριστερά πάνελ). Multiplex C αναλύει

KRAS

μεταλλάξεις σε G12R, G12A και Q61H. Απαιτεί ένα ανιχνευτή άγριου τύπου, τόσο για τη θέση G12 /13 και τη θέση Q61 για την ακριβή ποσοτικοποίηση της μεταλλαγμένης συχνότητας αλληλόμορφου. Η δοκιμασία βελτιστοποιήθηκε με 450 ηΜ εκκινητών και 250 ηΜ ιχνηλάτη G12C και 900 ηΜ εκκινητών και 500 ηΜ Q61H ανιχνευτή όπως τις δοκιμασίες άγριου τύπου. Ο καλύτερος διαχωρισμός των μεταλλαγμένων πληθυσμών σταγονιδίων επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές 675 ηΜ και 375 ηΜ ιχνηλάτη G12R, 450 εκκινητές ηΜ και 250 ηΜ ιχνηλάτη G12A και 900 εκκινητές ηΜ και 500 ηΜ Q61H μεταλλαγμένου ανιχνευτή (S6 Σχ, επάνω αριστερά πάνελ).

Όλα βελτιστοποιηθεί multiplex δοκιμασίες (Σχήμα 3) εξετάστηκαν για διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με διάφορα είδη

KRAS

μεταλλαγμένο DNA (S7 Εικ). Δεν υπάρχει επικάλυψη μεταξύ των επιθυμητών πληθυσμών των σταγονιδίων και των πληθυσμών για το άλλο

KRAS

μεταλλαγμένα είδη DNA σε όλες τις τρεις πολυπλέκτες. Επιπλέον, η θέση των πληθυσμών των σταγονιδίων λόγω διασταυρούμενης αντιδραστικότητας είναι ιδιαίτερα αναπαραγώγιμη και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να ξεκινήσει να προσδιορίσει ποια

KRAS

γονότυπος είναι παρούσα σε μια multiplex δοκιμασίας που περιέχει άλλα μεταλλαγμένο ανιχνευτές.

multiplex A (πάνω αριστερά πάνελ) είναι ένας συνδυασμός προσδιορισμού των 900 nm και εκκινητών και 500 nM καθετήρα G13C (κόκκινη διακεκομμένη πλατεία), 450 εκκινητών nM και 250 nM καθετήρα G12C (μπλε διακεκομμένη τετράγωνο) και 225 εκκινητών nM και 125 nM καθετήρα G12V (κίτρινο διακεκομμένη πλατεία). Multiplex B (επάνω μεσαίο πάνελ) είναι ένας συνδυασμός προσδιορισμού των 675 nM εκκινητών και 375 nM G12S καθετήρα (κόκκινη διακεκομμένη πλατεία), 450 εκκινητών nM και 250 nM καθετήρα G12D (μπλε διακεκομμένη τετράγωνο) και 225 εκκινητών nM και 125 nM καθετήρα G13D (κίτρινο διακεκομμένη πλατεία). Multiplex C (πάνω δεξιά πλευρά) είναι ένας συνδυασμός προσδιορισμού των 675 nM εκκινητών και 375 nM καθετήρα G12R (κόκκινη διακεκομμένη πλατεία), 450 εκκινητών nM και 250 nM καθετήρα G12A (μπλε διακεκομμένη τετράγωνο) και 900 εκκινητών nM και 500 nM καθετήρα Q61H (κίτρινο διακεκομμένη πλατεία). Multiplex C έχει 900 εκκινητές ηΜ και 500 ηΜ ιχνηλάτη Q61H άγριου τύπου εκτός από μία δοκιμασία άγριου τύπου G12C. Όλοι οι άλλοι πληθυσμοί σταγονιδίων άγριου τύπου δείχνεται, εκτός από την δοκιμασία Q61H διπλής όψης, είναι 450 nm εκκινητές και 250 ηΜ ιχνηλάτη G12C άγριου τύπου. Όλα τα πάνελ στις στήλες αριστερά και το κέντρο δείχνουν πλάτος FAM έως 18000 και πλάτος HEX έως 6000. πάνελ στη δεξιά στήλη έχει ένα πλάτος FAM έως 18000 και πλάτος HEX έως 11000.

Η

KRAS

multiplex ddPCR δοκιμασία χαρακτηρισμού

Μειώνοντας τα ποσά των NCI-H358 (

KRAS

G12C) και Α549 (

KRAS

G12S) gDNA εμπλουτίστηκαν στο

KRAS

άγριου τύπου gDNA (NCI-H1975) και δοκιμάστηκαν στο κατάλληλο

KRAS

multiplex δοκιμασία. Το όριο ανίχνευσης για

KRAS

G12C μεταλλαγμένο DNA σε multiplex Α ήταν 0,03% και για το

KRAS

G12S DNA σε multiplex Β ήταν 0,045% (S8 σχήμα, επάνω πάνελ) η μετρούμενη συχνότητα των προϊόντων μετάλλαξης αλληλόμορφο συσχετίζεται καλά με μειούμενες ποσότητες εμπλουτισμένου

KRAS

μεταλλαγμένο gDNA σε πολυπλέκτες Α και Β (R2 = 0.9992 και 0.0998 αντίστοιχα), αποδεικνύοντας την γραμμικότητα της ανίχνευσης μετάλλαξης στα multiplex δοκιμασίες. Συχνότητα των προϊόντων μετάλλαξης αλληλόμορφο έδειξε μικρή μεταβλητότητα ενδο-καλά ούτε για πολλαπλή ανάλυση και υψηλή επαναληψιμότητα μεταξύ δύο διαφορετικών φορέων σε τρεις εναλλασσόμενες ημέρες για μια σειρά από συχνότητες αλληλόμορφου (S8 σχήμα, μέση και κάτω πάνελ).

Παρόμοιες

KRAS

συχνότητα αλληλόμορφο παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες πολλαπλής ή διπλής όψης και στα δύο DNA κυτταρικής σειράς (μόνο είδος

KRAS

μεταλλαγμένο gDNA και συνδυασμοί

KRAS

μεταλλαγμένο gDNA σε διάφορα αλληλόμορφο συχνότητες) ή ολιγονουκλεοτίδια και FFPE DNA ιστού (Σχήμα 4? r2 = 0,9302 και 0,9542 αντίστοιχα)

η

Αναλύσαμε πολλαπλά φρεάτια NCI-H1975

KRAS

άγριου τύπου gDNA με κάθε ένα από τα τρία

KRAS

multiplex δοκιμασίες και υπολογίζεται η πιθανότητα ψευδώς θετικών ανίχνευσης μετάλλαξης, θέτοντας το όριο ανίχνευσης στο 0,05% ώστε να αντικατοπτρίζει μετριέται τα αποτελέσματά μας με καρφιά

KRAS

μεταλλαγμένα είδη gDNA (S8 σχήμα). Η ιδιαιτερότητα του κάθε multiplex είναι 99,99995%, 99,99857% και 99,85578% για πολυπλέκτες Α, Β και C, αντίστοιχα (S1 πίνακα).

Σύγκριση των

KRAS

multiplex δοκιμασία ανίχνευσης μεταλλαγμένων με αλληλουχίας Sanger

Μια σειρά από δείγματα που περιέχουν μειούμενες ποσότητες του NCI-H358 (

KRAS

G12C) ή Α549 (

KRAS

G12S) gDNA εμπλουτίστηκε σε

KRAS

άγριας πληκτρολογήστε DNA (NCI-H1975) ήταν ταυτόχρονα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ψηφιακή αλληλουχίας PCR και Sanger.

KRAS

G12C μεταλλαγμένο DNA ήταν ανιχνεύσιμο με χρήση multiplex Α κάτω σε ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο συχνότητα του 0,2%, ενώ ο μεταλλάκτης αιχμής στο χρωματογράφημα είναι ορατό μόνο σε ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο συχνότητα των 31.5% και όχι κάτω από 10% (S9 Σχήμα, κορυφαία πάνελ).

KRAS

G12S μεταλλαγμένο DNA παραμένει ανιχνεύσιμο με ψηφιακή PCR με τη χρήση πολυπλεξίας Β σε ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο συχνότητα 0,1%, αλλά είναι ορατό μόνο με τη χρήση αλληλούχισης Sanger στο 17%. (S9 σχήμα, κάτω πάνελ).

Ανίχνευση

KRAS

μεταλλάξεις στο DNA των ιστών FFPE

DNA FFPE ιστού εξάγεται από τις 11 περιπτώσεις των προηγμένων

KRAS

μεταλλαγμένο NSCLC (S2 Πίνακας) αναλύθηκε χρησιμοποιώντας κάθε multiplex δοκιμασία. Η παρουσία ενός

KRAS

12/13 μετάλλαξη ήταν γνωστό από προηγούμενες δοκιμές COBAS® (COBAS®

KRAS

Mutation Test, Roche), αλλά οι ερευνητές δεν γνώριζαν τη συγκεκριμένη

KRAS

γονότυπο. Τουλάχιστον ένα

KRAS

μετάλλαξη ανιχνεύτηκε σε κάθε περίπτωση και δύο περιπτώσεις είχε δύο ανιχνεύσιμη

KRAS

κλώνους (Σχήμα 5). Οι μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν με την κατάλληλη δοκιμασία διπλής όψης. Η χαμηλή συχνότητα G12D μετάλλαξη σε περίπτωση S011 μπορεί να αντιπροσωπεύουν τεχνούργημα FFPE λόγω της συχνής απαμίνωση των νουκλεοτιδίων γουανίνης κατά την διάρκεια της διαδικασίας διατήρηση των ιστών [14]. Η μετάλλαξη G12F σε S018 πιστοποιήθηκε με επακόλουθη ανάλυση αλληλουχίας του δείγματος του ιστού μετά την παρατήρηση του πληθυσμού σταγονιδίων διασταυρούμενη αντιδραστικότητα σε όλους τους multiplex δοκιμασίες. Επιπλέον, δύο είδη του KRAS μεταλλαγμένο gDNA εμπλουτίστηκαν σε ένα φόντο του

KRAS

άγριου τύπου DNA (NCI-H1975) gDNA να δημιουργηθούν τρία δείγματα που περιέχουν μια μείζονα και ελάσσονα κλώνος KRAS? C1 είναι ένας συνδυασμός του NCI-H358 (

KRAS

G12C) και Α549 (

KRAS

G12S) gDNA, C2 είναι ένας συνδυασμός του NCI-H358 (

KRAS

G12C) και Α427 (

KRAS

G12D) gDNA και C3 είναι ένας συνδυασμός του Α427 (

KRAS

G12D) και Α549 (

KRAS

G12S) gDNA. Όλα τα είδη KRAS ήταν ανιχνεύσιμα με τη χρήση των multiplex προσδιορισμούς KRAS, συμπεριλαμβανομένων των ανήλικος κλώνους κάτω σε ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο συχνότητα του 0,3% που μετρήθηκε για το

KRAS

G12D μεταλλαγμένο DNA σε C3 δείγμα (Σχήμα 6).