Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά ρυθμιστικά RNA που εμπλέκονται στην παθογένεση του καρκίνου και έχουν δείξει πρόσφατα υπόσχεση ως βιοδείκτες με βάση το αίμα για την ανίχνευση του καρκίνου. Επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών είναι μια θανατηφόρα νόσος για την οποία βελτιωμένα αποτελέσματα μπορούν να επιτευχθούν με την επιτυχή έγκαιρη ανίχνευση και την ενισχυμένη κατανόηση της μοριακής παθογένεσης που οδηγεί σε βελτιωμένες θεραπείες. Ένα σημαντικό βήμα προς την κατεύθυνση των στόχων αυτών είναι η δημιουργία μια ολοκληρωμένη άποψη των miRNAs που εκφράζονται σε επιθηλιακά ιστών καρκίνο των ωοθηκών, καθώς και στα φυσιολογικά κύτταρα της επιφάνειας του επιθηλίου των ωοθηκών.

Μεθοδολογία

Εμείς που χρησιμοποιούνται μαζικά παράλληλη Pyrosequencing (π.χ. , «454 αλληλούχιση») για να ανακαλύψουν και να χαρακτηρίσει τα νέα και γνωστά miRNAs που εκφράζονται σε πρωτογενείς καλλιέργειες φυσιολογικών ανθρώπινων επιφανειακού επιθηλίου των ωοθηκών (ΣΩΛΗΝΑ) και σε ιστό από τρία από τα πιο κοινά histotypes του καρκίνου των ωοθηκών. Βαθιά αλληλούχιση των μικρών βιβλιοθηκών cDNA RNA που προέρχεται από την κανονική σωλήνα και τα δείγματα καρκίνου των ωοθηκών έδωσε συνολικά 738.710 αλληλουχίας υψηλής ποιότητας διαβάζει, δημιουργώντας ολοκληρωμένη ψηφιακή προφίλ έκφρασης miRNA. προφίλ έκφρασης για 498 προηγουμένως σχολιασμένο miRNAs έχουν οριοθετηθεί και ανακαλύψαμε έξι νέα miRNAs και 39 υποψήφιες miRNAs. Ένα σύνολο από 124 miRNAs ήταν εκφράζονται διαφορικά σε κανονικά έναντι δείγματα καρκίνου και 38 miRNAs εκφράστηκαν διαφορικά απέναντι ιστολογική υποτύπους του καρκίνου των ωοθηκών. TaqMan qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα υποσύνολο των miRNAs επιβεβαιωμένα αποτελέσματα της μελέτης αλληλουχίας που βασίζεται.

Συμπεράσματα

Αυτή η έκθεση διευρύνει το σώμα του miRNAs είναι γνωστό ότι εκφράζονται σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών και παρέχει μια χρήσιμη πηγή για τις μελλοντικές μελέτες του ρόλου των miRNAs στην παθογένεση και την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Wyman SK, Parkin RK, Μίτσελ PS, Fritz BR, O’Briant Κ, Godwin ΑΚ, κ.ά. . (2009) Ρεπερτόριο microRNAs στον επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών, όπως καθορίζεται από Επόμενης Γενιάς αλληλουχίας των μικρών RNA cDNA βιβλιοθήκες. PLoS ONE 4 (4): e5311. doi: 10.1371 /journal.pone.0005311

Επιμέλεια: Sudhansu Kumar Dey, Ίδρυμα Έρευνας Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23, Νοεμβρίου του 2008? Δεκτές: 7 Φεβρουαρίου 2009? Δημοσιεύθηκε: 23, Απριλίου 2009

Copyright: © 2009 Wyman et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το κόστος της αλληλουχίας μερικώς αναλαμβάνεται από τη Roche. Η μελέτη αυτή υποστηρίχθηκε εν μέρει από το καρκίνο των ωοθηκών SPORE στο Αντικαρκινικού Κέντρου Fox Chase (Ρ50 CA083638), στον Ειρηνικό ωοθηκών Cancer Research Consortium ωοθηκών σπορίων (Ρ50 CA83636 να NU και MT), χρωμοσωμάτων Μεταβολισμός Εκπαίδευση Grant 5 Τ32 CA09657-16 (σε SKW ), μια υποτροφία από το Merck Research Laboratories (SKW) και Έρευνας Καρκίνου Fred Hutchinson του Κέντρου και τη χρηματοδότηση των Καναρίων Ίδρυμα (Νέα κονδύλια Ανάπτυξης MT). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Μ. Tewari είναι αμειβόμενη μέλος του Επιστημονικού Συμβουλίου της CombiMatrix, Inc.

Εισαγωγή

επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία των γυναικολογικών σχετίζονται με τον καρκίνο των θανάτων στις Ηνωμένες Πολιτείες [1], με διαγνώσεις τελικού σταδίου που έχει μια & lt? ποσοστό πενταετούς επιβίωσης 30% [2]. Τα ποσοστά επιβίωσης μπορούσε να βελτιωθεί με την καλύτερη κατανόηση της μοριακής παθογένεσης, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε ανάπτυξη της ανώτερης στοχευμένες θεραπείες, καθώς και από την έγκαιρη ανίχνευση της νόσου σε ένα χειρουργικά ιάσιμη φάση. Όταν ανιχνεύεται σε ένα στάδιο στο οποίο νόσος περιορίζεται στην ωοθήκη, για παράδειγμα, οι πέντε χρόνια αυξάνεται το ποσοστό επιβίωσης σε & gt? 80%. Κλινικά αποτελεσματική βιοδείκτες για την έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών θα μπορούσε να βελτιώσει σημαντικά τα ποσοστά επιβίωσης και την ανακάλυψη του καρκίνου των ωοθηκών βιοδείκτη είναι ένας σημαντικός τομέας της εν εξελίξει έρευνας [3].

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία των μικρών (-22 nt) μη-κωδικοποίησης των μορίων RNA που δρουν μετα-μεταγραφικά να ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση [4]. Τα microRNAs προέρχονται από πρόδρομα φουρκέτα RNA που υποβάλλονται σε επεξεργασία για να δημιουργήσει τόσο τη λειτουργική ώριμο miRNA και miRNA «μορφή αστέρι» του παρόμοιου μήκους που προέρχονται από το αντίθετο σκέλος της φουρκέτας. MicroRNA μεσολάβηση διαμόρφωση των βιολογικών συστημάτων έχει βρεθεί να διαταραχθεί σε πολλαπλά νοσήματα [5], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [6] – [8]. πρότυπα έκφρασης των miRNAs συσχετίζονται με τον ιστό προέλευσης [8], [9], η πρόγνωση [10], [11] και με την κλινική συμπεριφορά του καρκίνου [12], καθιστώντας miRNAs πολύτιμο βιοδείκτες ιστού που βασίζεται. Επιπλέον, και άλλοι έχουν δείξει πρόσφατα ότι miRNAs προέρχονται από όγκους εισέλθουν στην κυκλοφορία του αίματος σε μετρήσιμα επίπεδα, υποδεικνύοντας ότι miRNAs που απελευθερώνονται από ιστό του όγκου αντιπροσωπεύουν μια ισχυρή νέα κατηγορία με βάση το αίμα, ελάχιστα επεμβατική βιοδείκτες για την ανίχνευση του καρκίνου [13] – [16] . Ως εκ τούτου, υπάρχει μια ισχυρή ώθηση για μια ολοκληρωμένη ανάλυση του ρεπερτορίου miRNA εκφράζονται σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών.

Αρκετές πρόσφατες εκθέσεις έχουν αρχίσει να χαρακτηρίσουν την έκφραση των miRNAs σε καρκίνο των ωοθηκών χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες στίγματα με ανιχνευτές για ένα διαφορετικό αριθμό γνωστό miRNAs [17] – [20]. Αν και αυτά είναι πρωτοποριακές μελέτες, έχουν επίσης περιορισμούς. Το κύριο από αυτά είναι ότι όλες οι συστοιχίες έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα έχουν ελλιπή κάλυψη των γνωστών miRNAs. Από τους 959 miRNAs και τις μορφές αστέρων που υπάρχουν στο miRBase (αφήστε 12,0) [21], [22], οι περισσότερες πλατφόρμες μικροσυστοιχιών εφαρμόζεται μέχρι σήμερα δοκιμασία μόνο μερικές εκατοντάδες miRNAs, με την πιο ολοκληρωμένη από τις συστοιχίες αναλύοντας 470 miRNAs και τις μορφές αστέρων. Επιπλέον, μικροσυστοιχιών προσεγγίζει μόνο μέτρο που είχαν διαπιστωθεί miRNAs και δεν είναι εξοπλισμένα για να ανακαλύψετε και το προφίλ μυθιστόρημα miRNAs. Αυτή είναι μία σημαντική διάκριση να κάνουν δεδομένου ότι πολλές αναφορές δείχνουν ότι ιδιαίτερα εκείνων που μπορεί να είναι τύπου κυττάρου ειδική έκφραση σε, παραμένουν να ανακαλυφθούν ένας σημαντικός αριθμός miRNAs, [23], [24]. Τέλος, λόγω του μικρού μεγέθους των miRNAs και τις προκλήσεις για την επίτευξη ομοιόμορφων συνθηκών υβριδισμού σε μια ολόκληρη μικροσυστοιχιών miRNA, υπάρχει πιθανότητα για διασταυρούμενη υβριδοποίηση των miRNAs που είναι πολύ σχετικές με τη σειρά, καθιστώντας μερικές φορές αδύνατο να διακρίνει οριστικά μεταξύ miRNAs που διαφέρουν από ένα ή δύο νουκλεοτίδια.

για να ξεπεραστούν οι περιορισμοί που σχετίζονται με τις σπουδές μικροσυστοιχίες, χρησιμοποιήσαμε «επόμενης γενιάς» της τεχνολογίας αλληλουχίας (ειδικά μαζικά παράλληλη Pyrosequencing χρησιμοποιώντας το 454 πλατφόρμα Life Sciences) των μικρών βιβλιοθηκών cDNA RNA για να χαρακτηρίσει πληρέστερα miRNA έκφραση σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών, καθώς επίσης και σε πρωτογενείς καλλιέργειες φυσιολογικών κυττάρων επιφανειακών επιθηλιακών ωοθηκών. Αυτή η προσέγγιση, η οποία βασίζεται στις 5 ‘και 3’ καθολική συνδετήρα απολίνωση /RT-PCR και μέτρηση αλληλουχίας αναγνώσεις που ελήφθησαν για διακριτά miRNAs, μπορεί σε σύλληψη θεωρία όλων των miRNAs που υπάρχουν στα δείγματα RNA (συμπεριλαμβανομένων και εκείνων των νέων αλληλουχία) και επιτρέπει την ακριβή ταυτοποίηση των miRNAs, ακόμη και όταν διαφέρουν κατά ένα μόνο νουκλεοτίδιο. Εμείς που παράγονται συνολικά 738.710 ακολουθία διαβάζει από τέσσερις μικρές βιβλιοθήκες cDNA RNA που αντιπροσωπεύουν φυσιολογικά πρωτογενή ανθρώπινα επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών (ΣΩΛΗΝΑ) πολιτισμών και τρία κοινά επιθηλιακά υποτύπων καρκίνου των ωοθηκών (ορώδες, σαφείς κυττάρων και ενδομητριοειδές). Εδώ περιγράφουμε τα αποτελέσματα της προσπάθειας αυτής, συμπεριλαμβανομένου του προσδιορισμού και της προφίλ και των δύο στο παρελθόν σχολιασμένη και τα νέα miRNAs που εκφράζονται στον καρκίνο των ωοθηκών.

Μέθοδοι

Πρόσθετες λεπτομέρειες σχετικά με κυτταρική καλλιέργεια, απομόνωση RNA, μικρά RNA cDNA βιβλιοθήκη κατασκευή, μαζικά παράλληλος αλληλουχίας, υπολογιστική περιγραφή αγωγών και miRNA TaqMan αλυσιδωτής αντίδρασης ποσοτικής πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (qRT-PCR) παρέχονται αναλυτικά στο συμπληρωματικές μεθόδους S1 και στο [23].

Κυτταρική καλλιέργεια και κλινικές υλικά |

τα φυσιολογικά κύτταρα πρωτευόντων ανθρωπίνων επιφανειακών επιθηλιακών ωοθηκών (ΣΩΛΗΝΑ) ελήφθησαν από τις φυσιολογικές ωοθήκες των μετεμμηνοπαυσιακών γυναικών χρησιμοποιώντας μία τροποποίηση της τεχνικής που περιγράφεται προηγουμένως στο [25]. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα δείγματα ελήφθησαν από φυσιολογικά εμφανιζόμενο επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών, το οποίο επιβεβαιώθηκε κατόπιν ιστοπαθολογική αξιολόγηση. δείγματα ΣΩΛΗΝΑ ελήφθησαν κάτω από ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Έρευνας επιτροπή εξέτασης και Εσωτερικών κριτική στο Κέντρο Καρκίνου Fox Chase από ασθενείς που υποβάλλονται σε ενδείκνυται κλινικά χειρουργική επέμβαση (είτε προφυλακτική μείωση του κινδύνου σαλπιγγοωοθηκεκτομή ή ολική κοιλιακή υστερεκτομή με αμφοτερόπλευρη εκτομή oopherectomy) και οι οποίοι παρείχαν έγγραφη συγκατάθεση για ιστών δεν απαιτούνται για τη διάγνωση που θα χρησιμοποιηθούν για την έρευνα. Πρωτογενή κύτταρα ΣΩΛΗΝΑ καλλιεργήθηκαν με τη χρήση μέσων που περιγράφονται στο [26] στους 37 ° C σε 5% CO

2.

Ο καρκίνος των ωοθηκών snap-κατεψυγμένα δείγματα που αντιστοιχούν στο στάδιο III /IV επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (19 ορώδες, τέσσερις σαφείς κυττάρων και 10 ενδομητριοειδές) περιείχαν & gt? 70% κακοήθων επιθηλιακών κυτταρικότητα όπως αξιολογείται με ανασκόπηση παθολογοανατόμο ενός γειτονικού τμήματος βάφονται ιστό. Ωοθηκών δείγματα καρκίνου ελήφθησαν από τον Ειρηνικό ωοθηκών Cancer Research Consortium Αποθετήριο. Τα δείγματα συλλέχθηκαν κάτω από ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο του Κέντρου Έρευνας Καρκίνου Institutional Review Fred Hutchinson και ελήφθησαν από ασθενείς που είχαν παράσχει γραπτή συγκατάθεση για ιστών δεν απαιτείται για τους σκοπούς της κλινικής διαχείρισης που θα χρησιμοποιηθούν για την έρευνα.

εκχύλιση RNA και miRNA προετοιμασία βιβλιοθήκη

Κανονική πρωτογενείς καλλιέργειες σωλήνα (πέρασμα 4-7) λύθηκαν σε 600 μl ρυθμιστικού mirVana Λύσης /βιβλιοδεσίας (Ambion, Inc., Austin, TX). δείγματα όγκου (~ 100 mg το καθένα) ομογενοποιήθηκε σε ένα Qiagen Tissuelyser με ρυθμιστικό mirVana Λύσης /βιβλιοδεσίας 600 μl. Ολικό RNA εξήχθη από τους δύο τύπους δείγμα χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης mirVana ™ miRNA (Ambion) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. RNA από snap-κατεψυγμένων όγκων (19 ορώδες, τέσσερις σαφείς κυττάρων και 10 ενδομητριοειδές όγκων, αντίστοιχα) συνενώθηκε σύμφωνα με ιστολογική υπότυπο. MicroRNA κλωνοποίηση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27], (https://web.wi.mit.edu/bartel/pub/protocols/miRNACloningUpdate0705.pdf) με τροποποιήσεις στα βήματα ενίσχυσης για την προετοιμασία των δειγμάτων για μαζικά παράλληλος αλληλουχίας με 454 Επιστήμες της ζωής.

προσαρμοσμένη βιοπληροφορικής ανάλυσης δεδομένων αγωγού

Επεξεργασία και σχολιασμός των αλληλουχιών με βάση την ταυτότητα σε γνωστά μεταγραφεί RNAs ή ως νέα miRNAs πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός αγωγού έθιμο βιοπληροφορική περιγράφονται λεπτομερώς στο συμπληρωματικές μέθοδοι S1 .

Μέτρηση των επιπέδων των miRNAs σε RNA από κλινικά δείγματα χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς TaqMan® qRT-PCR

το συνολικό RNA μεταγράφηκε ανάστροφα και προετοιμασμένοι για qRT-PCR χρησιμοποιώντας το TaqMan® miRNA Reverse Transcription Kit και miRNA -ειδικές εκκινητές stem-loop (Applied Biosystems, Inc.) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με SDS έκδοση Σχετική Ποσοτικοποίηση λογισμικού 2.2.2 (Applied Biosystems, Inc.), με την αυτόματη ρύθμιση Ct για την ανάθεση βασική γραμμή και το όριο για τον προσδιορισμό Ct.

Αποτελέσματα

Επισκόπηση των μικρών cDNA RNA βιβλιοθήκες και 454 αλληλούχιση

βιβλιοθηκών RNA cDNA Μικρές κατασκευάστηκαν από πισίνες δείγμα RNA που απομονώθηκε από πρωτογενείς καλλιέργειες ιστολογικά φυσιολογικό πρωτογενούς σωλήνα (

n

= 4) και επιθηλιακά ωοθηκών δείγματα ορώδες ( OSC,

n

= 19), σαφείς κυττάρων (OCC,

n

= 4) και ενδομητριοειδές (OEC,

n

= 10) ιστολογίες. Επελέγησαν δείγματα όγκου για να περιέχει τουλάχιστον 70% κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα. Ολικό RNA κλασματώθηκε βάσει μεγέθους με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και μικρές RNAs που αντιστοιχούν στο μοριακό βάρος με την ώριμη πληθυσμό miRNA (18-24 κλάσμα nt) εκχυλίστηκαν gel και υποβάλλονται σε επεξεργασία για αντίστροφη μεταγραφή και ενίσχυση PCR για να δημιουργήσει βιβλιοθήκες cDNA (Εικόνα 1Α). Μαζικά παράλληλη Pyrosequencing χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα των 454 Life Sciences »που έχουν παραχθεί 80.501 κανονική ΣΩΛΗΝΑ διαβάζει, 273.739 OSC διαβάζει, 292.942 OCC διαβάζει, και 91.528 ΣΜΕΟ διαβάζει (Εικόνα 1Β). Αυτά αντιστοιχούσαν σε 10.544 ΣΩΛΗΝΑ, 26849 OSC, 37792 OCC και 13.134 ΣΜΕΟ μη περιττή ακολουθίες. Ο μεγαλύτερος αριθμός των διαβάζει αντιστοιχούν σε δείγματα ορώδες και σαφή κύτταρο οφειλόταν σε μεγαλύτερο βάθος του προσδιορισμού αλληλουχίας (δηλαδή, ένα μεγαλύτερο τμήμα της πλάκας προσδιορισμού αλληλουχίας που χρησιμοποιείται) και όχι σε ιδιαίτερες παραλλαγές κατά την παρασκευή της βιβλιοθήκης.

Μια

. Μικρές RNAs απομονώθηκαν από φυσιολογικό πρωτογενείς καλλιέργειες σωλήνα και από το ορώδες (OSC), σαφείς κυττάρων (OCC) και ενδομητριοειδές (OEC) ωοθηκών καρκινικούς ιστούς. Μετά 5 ‘και 3’ συνδετήρα απολίνωση, RT-PCR πραγματοποιήθηκε για να δημιουργήσει τέσσερις ανεξάρτητες βιβλιοθήκες cDNA των μικρών RNA που στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα για μαζικά παράλληλος Pyrosequencing (454 αλληλούχιση).

Β

. Περιγραφή των βημάτων στον αγωγό ανάλυση δεδομένων. Το αρχικό βήμα της ανάλυσης των δεδομένων ήταν απομάκρυνση των αλληλουχιών που αντιστοιχούν σε 18 nt και 24 nt RNA δείκτες που είχαν εμπλουτισθεί εντός του συνολικού RNA πριν από την ηλεκτροφόρηση πηκτής. Ποσοστό του συνολικού διαβάζει από ΣΩΛΗΝΑ, οι OSC, OCC και ΣΜΕΟ σύνολα δεδομένων ταξινομούνται στις προκαθορισμένες κατηγορίες και φιλτράρονται σε κάθε βήμα παρατίθενται στον πίνακα στα δεξιά. Στο κάτω μέρος του πίνακα, ο αριθμός των «μοναδικών αλληλουχιών» αντιπροσωπεύει την μη περιττών αλληλουχίες που προέρχονται μετά από την κατάρρευση πολλαπλές διαβάζει ταυτόσημης αλληλουχίας. Μερικά κανονική αλληλουχίες χάρτη σε περισσότερες από μία θέση στο γονιδίωμα. Κατά την ολοκλήρωση της ανάλυσης, 199 σειρές συνολικού ύψους 215 διαβάζει και χαρτογράφηση για 568 θέσεις πληρούνται τα κριτήρια μας για την κανονική ακολουθίες φουρκέτα που προέρχονται από τα συνδυασμένα σύνολα δεδομένων.

Η

Τα δεδομένα αλληλουχίας υποβλήθηκε σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένες μας υπολογιστική αγωγού (Εικόνες 1Β, S1 και τον πίνακα S1). Τα αρχικά στάδια του αγωγού προσδιορίζονται ακολουθία ταιριάζει σε βάσεις δεδομένων των προηγουμένως σχολιασμένα RNAs (π.χ., γνωστό miRNAs, άλλα μη κωδικοποιητική RNAs, RNAs messenger) και σε εξαιρετικά επαναλαμβανόμενα στοιχεία ακολουθίας. Υπόλοιπες σειρές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για την ταυτοποίηση νέων miRNAs (Σχήμα S1? Τα στοιχεία του υπολογιστικού αγωγού παρέχεται σε συμπληρωματικές μέθοδοι S1). Στις επόμενες ενότητες, θα συζητήσουμε λεπτομερώς τις αλληλουχίες που ταιριάζουν με τα γνωστά miRNAs και την ταυτοποίηση νέων miRNAs

microRNA προφίλ:. Προηγουμένως σχολιασμένο miRNAs

Αγώνες στο γνωστό miRNAs σε miRBase (αφήστε 12.0. ) [21], [22] αντιπροσώπευε 68-73% του διαβάζει, ανάλογα με το σύνολο δεδομένων (Εικόνα 1Β και S1) και αντιστοιχεί στο συνολικό ποσό των 498 γνωστών miRNAs (συμπεριλαμβανομένων των μορφών αστέρων). Η συχνότητα κλωνοποίηση των επιμέρους miRNAs, που εκφράζεται ως ένα κλάσμα του συνολικού διαβάζει λαμβάνεται από ένα δεδομένο δείγμα, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη σύγκριση σχετική έκφραση miRNAs μεταξύ των δειγμάτων [28] – [30]. Η παγκόσμια σύνοψη των 454 συνόλων δεδομένων αλληλούχισης μας παρουσιάζεται στο Σχήμα 2, το οποίο απεικονίζει τη σχετική έκφραση miRNAs μεταξύ κανονικής πρωτογενούς σωλήνα και συνόλων δεδομένων καρκινικού ιστού (

A

), καθώς επίσης και μεταξύ των τριών επιθηλιακών υποτύπους των ωοθηκών (

Β

). Οι πιο διαφορικά εκφρασμένων miRNAs (δηλαδή, ≥4 πολλαπλή μεταβολή) εμφανίζονται ως κόκκινες κουκκίδες. Είναι αξιοσημείωτο, αν και δεν είναι απροσδόκητο, ότι ο καρκίνος των ωοθηκών ιστολογική υποτύπου προφίλ miRNA ήταν πιο διαφορετικό από το συνηθισμένο σωλήνα (

Α

) από ό, τι ήταν ο ένας από τον άλλο (

Β

). Σε πίνακα 454 δεδομένα αλληλουχίας για miRNA αφθονία σε όλα τα σύνολα δεδομένων, καθώς και τα ονόματα των miRNAs και αναλογίες αφθονία για όλους τους κατά ζεύγη συγκρίσεις μεταξύ των διαφόρων τύπων δείγματος, παρέχονται στο σύνολό τους στον Πίνακα S2.

Είναι

Σύνολα σύγκριση κατά ζεύγη, σχεδιάζοντας το αρχείο καταγραφής του κλάσματος του συνολικού διαβάζει για μια δεδομένη miRNA σε ένα δεδομένο σύνολο δεδομένων κατά την αντίστοιχη αξία του στο δεύτερο σετ δεδομένων. Για κάθε αγροτεμάχιο, μόνο miRNAs που είχαν αλληλουχία στα δύο σύνολα δεδομένων απεικονίζονται? miRNAs που αλληλουχήθηκαν μόνο σε μία από τις δύο συνόλων δεδομένων δεν απεικονίζονται. Η κορυφαία σειρά (

Α

), συγκρίνει ωοθηκών σύνολα δεδομένων (OSC, OCC και OEC) στην κανονική πρωτογενείς καλλιέργειες σωλήνα? η κάτω σειρά (

B

), συγκρίνει υποτύπους ιστολογική όγκου των ωοθηκών ο ένας στον άλλο. Κόκκινες κουκίδες δηλώνουν miRNAs που είχε μια πολλαπλή μεταβολή ≥4.

Η

Η επικάλυψη των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs μεταξύ των υποτύπων οπτικοποιείται στα διαγράμματα Venn στο Σχήμα 3, το οποίο ενσωματώνει επίσης miRNAs εξαιρούνται από το Σχήμα 2, λόγω της μηδενικής διαβάζει είτε σε κανονικό σωλήνα ή δείγματα καρκίνου των ωοθηκών. Από τη διασταύρωση των τριών ομάδων στα διαγράμματα Venn, είναι προφανές ότι σε πολλές περιπτώσεις miRNAs εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνο των ωοθηκών σε σχέση με την κανονική ΣΩΛΗΝΑ δείχνουν το ίδιο σχήμα διαφορικής έκφρασης ανεξάρτητα από ιστολογική υπότυπο. Πίνακας S3 παρέχει μια πλήρη λίστα με τα ονόματα των μεμονωμένων miRNAs και την αναλογία έκφρασης και

P

-τιμές για τις συγκρίσεις που συνοψίζονται στο Σχήμα 3.

διαγράμματα Venn απεικονίζουν τον αριθμό των miRNAs που εκφράζονται διαφορικά σε ιστολογική καρκίνο των ωοθηκών υποτύπους σε σχέση με την κανονική πρωτοβάθμια ανθρώπινο επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών (ΣΩΛΗΝΑ) πολιτισμών. Κριτήρια για miRNA όπως διαφορικά εκφρασμένων ορίστηκε από την πολλαπλή μεταβολή ≥4 με την ακριβή δοκιμασία κατά Fisher για

P

-τιμή & lt? 5.0 × 10

-6 για miRNAs που είχε ανιχνεύσιμη έκφραση τόσο σωλήνα και ωοθηκών δείγματα καρκίνου, ή από το ακριβές τεστ του Fisher ενός

P

-τιμή & lt? 5.0 × 10

-6 και μόνο σε περιπτώσεις όπου μια τιμή πολλαπλή μεταβολή ήταν απροσδιόριστο οφείλεται στο μηδέν διαβάζει για ένα συγκεκριμένο miRNA είτε ο εύκαμπτος σωλήνας ή δείγμα σύγκρισης καρκίνο των ωοθηκών. Εντοπίστηκαν συνολικά 74 υπερ-εκφράζεται miRNAs (

Πίνακας Α

) και 49 υπο-εκφράζεται miRNAs (

Πίνακας Β

) στον καρκίνο των ωοθηκών σε σχέση με το κανονικό σωλήνα. Τα microRNAs που βρέθηκαν να είναι σταθερά υπερεκφράζεται ή σταθερά κάτω-εκφράζεται σε τρεις υποτύπους του καρκίνου των ωοθηκών ιστολογική αναφέρονται ονομαστικά.

Η

Εμείς απευθείας σύγκριση της έκφρασης των miRNAs μεταξύ των υποτύπων καρκίνου των ωοθηκών ιστολογικής από που προέρχονται οι αναλογίες της έκφρασης για κάθε miRNA με βάση κλασματικές τιμές αφθονίας. Η σημαντικότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher. Οι δέκα miRNAs εκφράζονται διαφορικά σε κάθε μια από τις συγκρίσεις κατά ζεύγη των υποτύπων του καρκίνου των ωοθηκών ιστολογικής απαριθμούνται στον Πίνακα S4 (τα αποτελέσματα για όλες τις miRNAs παρέχονται στο σύνολό τους στον Πίνακα S2). Μεταξύ των πιο ιστολογικών υποτύπων συγκεκριμένες miRNAs είναι miR-449Α (ορώδες-ειδική), miR-499-5p /miR-375 /miR196a /miR-196b /miR-182 (ενδομητριοειδές-ειδική) και miR-486-5p /miR -144 /miR-30a /miR-199α-5P (σαφής κυττάρου-ειδική).

Επικύρωση της 454 αλληλουχίας miRNA αποτελέσματα έκφρασης από qRT-PCR.

Εμείς που χρησιμοποιούνται εμπορικά διαθέσιμα miRNA TaqMan qRT -PCR δοκιμασίες ως ανεξάρτητη επιβεβαίωση των miRNA διαφορικής έκφρασης που προσδιορίζονται από 454 αλληλούχιση. δοκιμασίες microRNA TaqMan qRT-PCR πραγματοποιήθηκαν για ένα δείγμα των 38 γνωστών miRNAs που επιλέχθηκαν με βάση την υπερ- ή υπό-έκφραση σε σχέση με την πρωτογενή κανονική ΣΩΛΗΝΑ, ή με βάση την διαφορική έκφραση μεταξύ διαφορετικών υποτύπων καρκίνου των ωοθηκών (που υπολογίζεται με βάση 454 αλληλουχίας δεδομένα). δοκιμασίες Taqman διεξήχθησαν σε δείγματα από τις ίδιες δεξαμενές RNA που χρησιμοποιείται για αλληλούχιση. Τριάντα έξι από τους 38 διαφορικά εκφρασμένων miRNAs εξετάστηκε με TaqMan qRT-PCR κατέδειξαν συνεπή αποτελέσματα με εκείνα που ελήφθησαν από 454 αλληλουχίας (Σχήματα 4 και 5, Α, Β, C). Από τις οκτώ miRNAs προσδιορίζονται από 454 αλληλούχιση να υπερ-εκφράζεται σε καρκίνο των ωοθηκών σε σχέση με την κανονική ομάδα σωλήνα (Σχήμα 4Α), και τα οκτώ αποδεικνύεται υπερ-έκφραση σε ορώδες και σαφή υποτύπους καρκινικών κυττάρων όταν μετρήθηκε χρησιμοποιώντας TaqMan qRT-PCR, ενώ έξι των οκτώ έδειξε σταθερά αποτελέσματα σε υπότυπο του καρκίνου ενδομητριοειδές (Mirs-126 *, – 142-3p, 195, 200α, 200b, 200c, 338-3p, 378 *). Εννέα miRNAs ήταν υπό-εκφράζεται σε καρκίνο των ωοθηκών σε σχέση με το κανονικό σωλήνα (Σχήμα 4Β), με όλους τους υποτύπους δείχνουν συνεπή αποτελέσματα όταν μετράται με TaqMan qRT-PCR. Υπήρχαν έξι miRNAs που ήταν μη ανιχνεύσιμες (μηδέν διαβάζει) σε καλλιέργειες κανονικών σωλήνα (Σχήμα 4C), αλλά δεν είχε ανιχνεύσιμη έκφραση σε ΣΜΕΟ, OSC ή /και OCC στα δεδομένα 454 αλληλουχίας, και παρομοίως έδειξαν αυξημένη έκφραση σε ωοθηκών ιστολογική δείγματα υποτύπου έναντι κανονική πρωτοβάθμια ΣΩΛΗΝΑ όταν εξετάστηκε από TaqMan qRT-PCR (Σχήμα 4C).

Τα γραφήματα εμφανίζουν αποτελέσματα miRNA Taqman qRT-PCR για τη δειγματοληψία των miRNAs που προσδιορίζονται από 454 αλληλούχιση να είναι υπερ-εκφράζεται (

Πίνακας Α

) ή υπο-εκφράζεται (

Πίνακας Β

) σε καρκίνο των ωοθηκών σε σχέση με το κανονικό σωλήνα. Οι τιμές σχετική έκφραση που προέρχεται από 454 αλληλούχιση εμφανίζεται στην αριστερή τμήμα του κάθε γραφήματος για σύγκριση. Σχετική τιμές έκφραση των miRNAs σε ενδομητριοειδές (ΣΜΕΟ, μαύρες μπάρες), ορώδες (OSC, λευκές ράβδοι) και σαφείς κυττάρων (OCC, γκρι μπάρες) καρκίνους που απεικονίζονται. Οι Τα microRNAs που δεν ανιχνεύθηκαν σε φυσιολογικό ΣΩΛΗΝΑ από 454 αλληλούχιση αλλά ανιχνεύθηκαν στον καρκίνο των ωοθηκών παρουσιάζονται στο

Πίνακας C

, όπου τα miRNAs εντολή φθίνουσα έκφρασης (η οποία αντιστοιχεί στο όριο του κύκλου φθίνουσα, CT) σε κανονικό σωλήνα. 454 δεδομένων αλληλουχίας δίνεται από την άποψη του ποσοστού των συνολικών διαβάζει μέσα σε κάθε δείγμα. UD, μη ανιχνεύσιμα από miRNA TaqMan qRT-PCR.

Η

Τα γραφήματα εμφανίζουν αποτελέσματα Taqman qRT-PCR για miRNAs που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των υποτύπων καρκίνου των ωοθηκών, με 454 δεδομένα αλληλουχίας που προέρχονται παρουσιάζονται για σύγκριση στο αριστερό τμήμα της κάθε γράφημα. Σχετική τιμές έκφραση των miRNAs ειδικά υπερ-εκφράζεται σε ενδομητριοειδές (

Πίνακας Α

, OEC, μαύρες μπάρες), ορώδες (

Πίνακας Β

, OSC, λευκές ράβδοι) και σαφή κυττάρων (

πίνακας Γ

, Στέγη Γραμμάτων & Τεχνών, οι γκρι μπάρες) καρκίνους που απεικονίζονται. UD, μη ανιχνεύσιμα από miRNA TaqMan qRT-PCR.

Η

Δεκαπέντε miRNAs που προσδιορίζονται από 454 αλληλουχίας να εκφράζονται διαφορικά σε όλη υποτύπων καρκίνου των ωοθηκών (Εικόνα 5Α, Β, Γ) έδειξαν παρόμοια πρότυπα έκφρασης όταν ποσοτικοποιούνται με qRT- PCR. Οκτώ miRNAs ήταν υπερ-εκφράζεται ειδικά σε ενδομητριοειδές καρκίνο των ωοθηκών (Εικόνα 5Α), τέσσερα σε ορώδες καρκίνου (Σχήμα 5Β), και τρεις σε σαφή καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 5C) σε σχέση με άλλους υπότυπους.

Ανάλυση προσδιορισμού αλληλουχίας δεδομένων για την ταυτοποίηση νέων φουρκέτα που προέρχονται από μικρά RNA.

Αφού επικυρωθεί 454 αποτελέσματα αλληλουχίας που αντιστοιχεί σε διαφορική έκφραση προηγουμένως σχολιασμένο miRNAs, είμαστε δίπλα στράφηκε προς τον προσδιορισμό των νέων αλληλουχιών miRNA. Μετά το φιλτράρισμα ταιριάζει με προηγουμένως σχολιασμένο δυνατότητες όπως αγγελιοφόρων RNA, tRNAs και άλλοι γνωστοί RNAs μη κωδικοποιητική, οι υπόλοιπες αλληλουχίες ευθυγραμμίστηκαν με την αλληλουχία αναφοράς ανθρώπινου γονιδιώματος (NCBI Κατασκευάστηκε 36,1) [31]. Οι αλληλουχίες που απαιτούνται για να ταιριάζει με την ανθρώπινη αλληλουχία γονιδιώματος τέλεια να πραγματοποιηθούν περαιτέρω για πρόσθετες υπολογιστική ανάλυση, με μόνη εξαίρεση σε αυτό είναι αλληλουχίες οι οποίες απέδειξαν την προσθήκη 1-3 μη templated νουκλεοτίδια στο 3 ‘άκρο. Σε αυτές τις περιπτώσεις, έχουμε στολισμένα μη templated βάσεις από την αρχική ακολουθία και στη συνέχεια μεταφέρονται περαιτέρω ανάλυσης [32], [33].

Τα στάδια επεξεργασίας δεδομένων που περιγράφονται μέχρι στιγμής απέδωσε 841 κανονική ΣΩΛΗΝΑ, 2840 OSC , 11.224 OCC, και 1.764 ΣΜΕΟ μοναδικές αλληλουχίες που αντιστοιχούν σε νέες μικρές RNAs. Αυτές οι μοναδικές αλληλουχίες αντιστοιχούσαν σε 1.766 κανονική ΣΩΛΗΝΑ, 5795 OSC, 19464 OCC και 3301 OEC γονιδιωματικής τόπους που θα μπορούσαν δυνητικά να δημιουργήσει αυτά τα μικρά RNAs (Σχήμα 1Β, Πίνακας S1). Ο αγωγός ανάλυση δεδομένων επόμενο διαλογή αυτών γονιδιωματική loci (εκτός από 100 νουκλεοτίδια των ανάντη και κατάντη πλευρικές αλληλουχία) για την παρουσία ενός προβλεπόμενη δευτερεύουσα δομή φουρκέτας με υπολογισμό ελεύθερη ενέργεια, πιθανότητα σχήμα (όπως καθορίζεται από το πρόγραμμα RNAshapes [34 ]) και η Randfold-υπολογιστεί [35]

P

-τιμή της προβλεπόμενης δευτεροβάθμια δομές. Μια λεπτομερής περιγραφή των κριτηρίων αναδίπλωσης φουρκέτας παρέχεται σε συμπληρωματικές μεθόδους S1 και στο [23]. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα 224 κανονική ΣΩΛΗΝΑ, 511 OSC, 500 OCC, και 247 ΣΜΕΟ μυθιστόρημα μικρό RNAs βρέθηκε να πιθανώς προέρχεται από μια δομή πρόδρομο φουρκέτα.

Ακολουθίες που διέρχεται από τα παραπάνω κριτήρια φιλτραρίσματος από τα τέσσερα σύνολα δεδομένων συνενώθηκαν στη συνέχεια και ταξινομημένο σε σχέση με χρωμοσωμικές συντονίζει σε ομάδες που μοιράζονται 5 άκρα ». Από κάθε μία από αυτές τις ομάδες επιλέξαμε μια «κανονική» σειρά αντιπροσωπεύει το εν λόγω γονιδιακού τόπου. Οι κανονικές σειρές επιλέχθηκαν με βάση μια κοινή 5 ‘άκρο, την αφθονία, και το μήκος ακολουθία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23] (πρόσθετες λεπτομέρειες παρέχονται στο συμπληρωματικές μέθοδοι S1). Αυτή η διαδικασία έχει βελτιωθεί περαιτέρω τα δεδομένα σε μια συνδυασμένη λίστα των 199 μοναδικές ακολουθίες (πιθανώς προέρχεται από 568 γονιδιωματική loci) που ορίζεται ως «νέα φουρκέτα που προέρχονται από μικρά RNAs» από την οποία εντοπίσαμε νέες και υποψήφιες miRNAs.

Αναγνώριση μυθιστόρημα και των υποψηφίων miRNAs.

για να προσδιοριστεί ποιες αλληλουχίες να ορίσει ως νέα miRNAs, που προβλήθηκε το σύνολο των νέων φουρκέτα που προέρχονται από μικρά RNAs χρησιμοποιώντας κριτήρια παρόμοια με αυτά που χρησιμοποιούνται σε άλλες πρόσφατες μελέτες miRNA ανακάλυψη [23], [33], [36]:

i

. χαρακτηριστικά αντιστοίχιση του φουρκέτα,

ii

. η παρουσία πολλαπλών διαβάζει μοιράζονται το ίδιο 5 ‘άκρο,

iii

. απουσία σχολιασμού επισημαίνουν μη-miRNA βιογένεση,

iv

. κοινόχρηστη περιοχή σπόρου με ένα γνωστό ζώο miRNA και

ν

. παρουσία του αντίστοιχου miRNA μορφή αστέρι διαβάσει (s). Θεωρήσαμε συμπεριλαμβανομένων φυλογενετική διατήρηση αλληλουχίας ως κριτήριο? Ωστόσο, αυτό δεν προσθέτουν σημαντικά στην ανάλυσή μας, δεδομένου ότι καμία από τις νέες miRNAs φουρκέτα που προέρχονται διατηρήθηκαν πέρα ​​από τα πρωτεύοντα θηλαστικά. Αυτό δεν είναι απροσδόκητο, δεδομένου ότι οι περισσότερες εξελικτικά συντηρημένη microRNAs είναι πιθανό να έχουν ήδη ανακαλυφθεί, χρησιμοποιώντας υπολογιστικές προσεγγίσεις ακολουθούνται από κατευθυνόμενη πειράματα επικύρωσης.

Χρησιμοποιώντας τα παραπάνω κριτήρια, εντοπίσαμε έξι μυθιστόρημα miRNAs. Όλα τα έξι πληρούσαν τα κριτήρια

i κατασκευαστής –

iii

και τρία από τα έξι πληρούσε το κριτήριο

iv

και τρεις πληρούσε το κριτήριο

ν

(Σχήμα 6? περισσότερες λεπτομέρειες παρέχονται στον πίνακα S5). Επιπλέον, χαρτογραφώντας τις αλληλουχίες νέα miRNA με την αλληλουχία αναφοράς ανθρώπινου γονιδιώματος αποκάλυψε ότι τρεις από τις έξι νέων miRNAs υπάρχουν σε εσώνια άλλων γονιδίων (και κωδικοποιούνται στο ίδιο κλώνο με τα αντίστοιχα γονίδια υποδοχής) (Σχήμα 6), όπως και πολλοί προηγουμένως σχολιασμένο miRNAs [37], [38]. Δύο από τα νέα miRNAs μας βρίσκονται σε σχολιασμένη επαναλήψεις, αλλά έχουν ισχυρές αποδείξεις αρκετά υποστηρίζοντας ότι είχαν οριστεί ως μυθιστόρημα. Το πλαίσιο της προβλεπόμενης προδρόμου δομή και η αλληλουχία των μορφών miRNA αστέρι που αντιστοιχούν σε νέες miRNAs δίνεται στο Σχήμα 6.

Υποθετικές δευτερογενείς δομές για τις έξι νέες miRNAs ανακαλύφθηκε σε αυτή τη μελέτη δείχνεται. Οι νέες miRNA ακολουθίες φαίνεται στο κόκκινο και το αστέρι μορφές μυθιστόρημα miRNAs εμφανίζονται με μπλε χρώμα (αν αναγνωρίστηκαν στα δεδομένα αλληλουχίας μας). Ακολουθίες είναι νέες σε σχέση με miRBase απελευθερώσει 12.0 [21], [22]. Αναγνωριστικά σε παρένθεση αναφέρονται στις μορφές miRNA αστέρων όπου αυτά εντοπίστηκαν στα δεδομένα 454 αλληλουχίας. Τα αντίστοιχα στοιχεία των νέων miRNAs δίνονται στον παρακάτω πίνακα τις δομές φουρκέτας πίνακα.

Η

Οι υπόλοιπες ακολουθίες αποτελούνται 181 φουρκέτα που προέρχονται από μικρά RNAs (που αντιστοιχεί σε 550 γονιδιωματική loci). Σας ζητείται να επιλέξετε από τη λίστα τα πιο ελπιδοφόρα ακολουθίες να ορίσει ως «υποψήφιος miRNAs» που θα μπορούσε να επιβεβαιωθεί στο μέλλον, όπως

καλόπιστους

miRNAs ως πρόσθετη απόδειξη συσσωρεύεται. Υποψήφιος miRNAs όφειλαν να πληρούν τα κριτήρια

i-iii

και να έχουν κάποια πρόσθετη μορφή αποδεικτικά στοιχεία (δηλαδή, κοινόχρηστη περιοχή σπόρου με μια γνωστή miRNA). Αυτό μας επέτρεψε να περιορίσετε την τελική λίστα με τις 39 υποψήφιες miRNAs (πιθανώς προέρχονται από 50 γονιδιωματική loci) (Πίνακας S5).

Συζήτηση

Το έργο αναφέρονται εδώ υποκινήθηκε από την υπόθεση ότι το σύνολο ρεπερτόριο των miRNAs που εκφράζονται σε καρκίνο των ωοθηκών, συμπεριλαμβανομένων δυνητικά ιστών και ειδική για τον καρκίνο miRNAs, δεν είχε ακόμη διευκρινιστεί. Η προσέγγιση μαζικά παράλληλη αλληλουχίας μας επέτρεψε να είναι ολοκληρωμένη (δηλαδή, προσδιορίζοντας όχι μόνο γνωστά αλλά και νέα miRNAs), και το «ψηφιακό» φύση των δεδομένων επιτρέπεται μια ημι-ποσοτική εκτίμηση της σχετικής επίπεδο έκφρασης για πολλούς miRNAs. Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, ανακαλύψαμε έξι νέα και 39 υποψήφιες miRNAs, και οριοθετείται το μοτίβο έκφρασης του 498 προηγουμένως σχολιασμένα miRNAs σε κανονικές πρωτογενείς καλλιέργειες σωλήνα και επιθηλιακών ιστών καρκίνου των ωοθηκών. Είναι αξιοσημείωτο ότι από τις τέσσερις δημοσιευμένες μελέτες μικροσυστοιχιών miRNA του καρκίνου των ωοθηκών [17] – [20], ακόμα και η πιο ολοκληρωμένη από τις πλατφόρμες σειρά περιορίστηκε σε 470 ανθρώπινα miRNAs και τις μορφές αστέρων [17], ενώ η τρέχουσα έκδοση του miRBase ( απελευθερώνουν 12,0) [21], [22] περιέχει 969 ανθρώπινα miRNAs και τις μορφές αστέρων. Επιπλέον, 223 από τα γνωστά miRNAs εντοπίσαμε και η οποία χαρακτηρίζεται από σύνολα δεδομένων αλληλουχίας μας δεν εκπροσωπήθηκαν στην ακόμα πιο ολοκληρωμένη μικροσυστοιχιών. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ επεκτείνει σημαντικά το εύρος των γνώσεων των miRNAs που εκφράζονται στον καρκίνο των ωοθηκών.

Η ταυτοποίηση νέων miRNAs στα δεδομένα μας είναι ιδιαίτερα αξιοσημείωτη. Δεδομένου ότι αυτές οι νέες miRNAs δεν έχουν ανιχνευθεί σε πολλές μελέτες προσδιορισμού αλληλουχίας miRNA μεγάλης κλίμακας άλλων ιστών, εμείς εικάζουν ότι αυτά εκφράζονται σε καρκίνο των ωοθηκών-ειδικό τρόπο και μπορεί να είναι ιδιαίτερου ενδιαφέροντος ως βιοδείκτες του καρκίνου. Οι μελλοντικές μελέτες θα απαιτούνται για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, καθώς και για τη διερεύνηση των βιολογικών ρόλων αυτών των νέων miRNAs στην παθογένεση του καρκίνου των ωοθηκών.

Στο σύνολό τους, οι γνωστές και νέες miRNAs που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη παρέχει μια πισίνα του υποψηφίου σημειωτές miRNA για μελλοντική ανάλυση ως δείκτες με βάση το αίμα για την ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών. Διαφορικής έκφρασης μεταξύ των φυσιολογικών και κακοήθων μέλη μπορούν να προβλέψουν μία μέθοδο για την ιεράρχηση των υποψηφίων κινείται προς τα εμπρός. Μπορούμε επίσης να οραματιζόμαστε ότι τα miRNAs που βρέθηκε να εκφράζεται διαφορικά μεταξύ των ιστολογικών υποτύπων καρκίνου θα μπορούσε να εξυπηρετήσει διττό σκοπό ως δείκτες με βάση το αίμα τόσο για την ανίχνευση του καρκίνου και ιστολογική κατάταξη.

Ένα από τα μοναδικά χαρακτηριστικά της μελέτης μας είναι η χρήση πρωτογενείς καλλιέργειες φυσιολογικών ανθρώπινων επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών ως η κανονική ομάδα σύγκρισης. Αν και το επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών (μαζί με κοντινό περιφερικό φαλλοπειά επιθήλιο σωλήνας) θεωρείται η προέλευση των επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών [39] οι περισσότερες άλλες μελέτες προφίλ miRNA έχουν χρησιμοποιήσει τυπικά ολόκληρο ωοθήκη με την κανονική σύγκριση. Αυτό είναι προβληματικό για τον εντοπισμό miRNAs που εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνο των ωοθηκών σε σχέση με την κανονική, διότι το μόνο κύτταρο-παχύ στρώμα επιφανείας επιθηλιακών περιλαμβάνει πολύ λιγότερο από το 1% του κυτταρικού περιεχομένου του συνόλου ωοθήκη. Εκτελεί τις συγκρίσεις των ιστών του καρκίνου των ωοθηκών σε ένα κατάλληλο φυσιολογικό ελέγχου είναι ένα δύσκολο πρόβλημα στην έρευνα για τον καρκίνο των ωοθηκών. Η προσέγγισή μας, αν και αποφεύγει τα προβλήματα που σχετίζονται με τη χρήση όλη την ωοθήκη σαν ένα κανονικό δείγμα, έχει τον περιορισμό ότι δεν ξέρουμε αν και η οποία αλλάζει στην έκφραση microRNA μπορεί να αποδοθεί σε συνθήκες καλλιέργειας που χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια πρωτογενών κυττάρων σωλήνα. Μελλοντικές μελέτες ενσωματώνοντας παράλληλα αναλύσεις των πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων που προέρχονται από ιστούς καρκίνου των ωοθηκών μπορεί να αντιμετωπίσει αυτό το ζήτημα.

Αν και η χρήση των διαφόρων τύπων των «κανονικών» δείγματα των ωοθηκών κάνει τη σύγκριση των δεδομένων μας με άλλες μελέτες δύσκολη στις περισσότερες περιπτώσεις,