Αφηρημένο

Ιστορικό

μυελοειδή προέρχεται κατασταλτικά κύτταρα (MDSC) είναι σημαντικοί ρυθμιστές των ανοσολογικών αποκρίσεων. Αξιολογήσαμε τη μηχανιστική ρόλο της εξάντλησης MDSC σε κύτταρο παρουσίασης αντιγόνου (APC), δραστηριότητες ΝΚ, Τ κυττάρων και θεραπευτική ανταπόκριση στον εμβολιασμό σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο του πνεύμονα.

Κύρια Ευρήματα

Ατομική εξάντληση μεσολάβηση αντισώματος του MDSC (αντι-Gr1 ή αντι-Ly6G) ενίσχυσε την αντικαρκινική δράση έναντι του καρκίνου του πνεύμονα. Σε σύγκριση με τους μάρτυρες, εξάντληση MDSC ενίσχυσε την δραστηριότητα APC και αύξησε τη συχνότητα και τη δραστηριότητα των τελεστών κυττάρων ΝΚ και Τ στον όγκο. Σε σύγκριση με τους μάρτυρες, το αντι-Gr1 ή θεραπεία αντι-Ly6G οδήγησε σε αύξηση: (i) CD8 Τ κύτταρα, (ii) τα κύτταρα ΝΚ, (iii) CD8 Τ ή ΝΚ ενδοκυτταροπλασματική έκφραση ΙΡΝγ, περφορίνης και γράνζυμο (iv) CD3 Τ κύτταρα που εκφράζουν τον CD107a δείκτης ενεργοποίησης και CXCR3, (v) μείωσε CD8 Τ κυττάρων IL-10 στην παραγωγή στους όγκους (vi) μείωσε όγκου αγγειογόνο (VEGF, CXCL2, CXCL5, και Angiopoietin1 & amp? 2), αλλά ενισχυμένη αντι-αγγειογενετική (CXCL9 και CXCL10 ) έκφρασης και (vii) μειωμένη χρώση του όγκου των ενδοθηλιακών δείκτη Meca 32. Ανοσοκυτοχημεία των τμημάτων του όγκου παρουσίασαν μειωμένη Gr1 κύτταρα που εκφράζουν με αυξημένη κυττάρων CD3 Τ διεισδύει στην αντι-Gr1 ή ομάδες αντι-Ly6G. εξάντληση MDSC οδήγησε σε σημαντική αναστολή στην ανάπτυξη του όγκου, ενισχυμένη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων και μειωμένη μετανάστευση των όγκων από την πρωτογενή θέση στον πνεύμονα σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Θεραπευτική ανταπόκριση στον εμβολιασμό ενισχύθηκαν

in vivo

μετά από εξάντληση MDSC με το 50% των ποντικών που έλαβαν την εξάλειψη εντελώς καθιερωμένους όγκους. Ποντίκια με αγωγή που απορρίφθηκε πρωτοπαθείς όγκους τους επίκτητη ανοσολογική μνήμη έναντι δευτερεύουσα πρόκληση όγκου. Το υπόλοιπο 50% των ποντικών σε αυτήν την ομάδα είχαν 20 φορές μειώσεις φορτίο όγκου σε σύγκριση με τους ελέγχους.

Η σημαντικότητα

Τα δεδομένα μας καταδεικνύουν ότι η στόχευση MDSC μπορεί να βελτιώσει κατά του όγκου ανοσοαποκρίσεων που υποδηλώνει μια ευρεία εφαρμοσιμότητα των συνδυασμένων ανοσοποιητικό προσεγγίσεις που βασίζονται κατά του καρκίνου. Αυτή η πολύπλευρη προσέγγιση μπορεί να αποδειχθεί χρήσιμη κατά όγκων όπου MDSC παίζουν ρόλο στον όγκο του ανοσοποιητικού φοροδιαφυγής

Παράθεση:. Srivastava MK, Zhu L, Harris-Λευκό Μ, Kar U, Huang Μ, Johnson MF, et al. (2012) Μυελογενής κατασταλτικά κύτταρα εξάντληση Augments Αντικαρκινική Δραστηριότητα στον καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (7): e40677. doi: 10.1371 /journal.pone.0040677

Επιμέλεια: Devanand Sarkar, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Μάρ του 2012? Αποδεκτές: 12, Ιούν 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 Ιουλίου, 2012 |

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια στο Λος Άντζελες πνεύμονα Πρόγραμμα Καρκίνου, Τμήμα Υποθέσεων Βετεράνων Ιατρικής Έρευνας Ταμεία, Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας ( ΝΙΗ) Επιχορηγήσεις (RO1 CA95686, RO1 CA126944 και Ρ50 CA90388), Εθνικό Κέντρο για την Προώθηση της Μεταγραφική Επιστημών, Grant UL1TR000124, και καπνός ασθενειών που σχετίζονται Πρόγραμμα Πρόγραμμα Βραβείο του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια (15RT-0207 και 20FT0082). Το περιεχόμενο είναι αποκλειστική ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα τις επίσημες απόψεις του ΝΙΗ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Όταν αυτή η μελέτη διεξήχθη RS ήταν υπάλληλος του Πανεπιστημίου της Βιρτζίνια, Charlottesville. RS είναι τώρα απασχολούνται σε Norvartis Ινστιτούτα Βιοϊατρικών Ερευνών. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

καρκίνου

πνεύμονα παραμένει ένα δύσκολο πρόβλημα υγείας με περισσότερα από 1,1 εκατομμύρια θάνατοι αποδίδονται σε καρκίνο του πνεύμονα σε όλο τον κόσμο κάθε χρόνο [1]. Με τις υπάρχουσες θεραπευτικές προσπάθειες που καταβάλλει η μακροπρόθεσμη επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα παραμένει σε χαμηλά επίπεδα, έτσι οι νέες θεραπευτικές στρατηγικές που απαιτούνται. Αν και ανοσοθεραπεία καρκίνου προσφέρει μια ελκυστική θεραπευτική επιλογή, η ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος από μόνη της δεν είναι επαρκής για αντικαρκινική δράση. Αναμένουμε ότι συνδυασμένες θεραπείες που στοχεύουν οδούς του ανοσοποιητικού μηχανισμούς ενεργοποίησης και της ανοσοκαταστολής θα είναι απαραίτητη για την καταπολέμηση του καρκίνου του πνεύμονα. Το μικροπεριβάλλον του όγκου αποτελείται από καρκινικά κύτταρα, στρώμα, τα αιμοφόρα αγγεία, το ανοσοποιητικό διηθήσεις και της εξωκυττάριας μήτρας. Γενετικές αλλοιώσεις σε ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια ή επιγενετικές μεταβολές στον όγκο που διαμορφώνουν την ανάπτυξη του όγκου και την εισβολή στον περιβάλλοντα ιστό ενορχηστρώνουν την εμμονή των φλεγμονωδών διηθημάτων. Αυτές οι κυτταρικές διηθήσεις ρυθμίζουν την ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου. Οι διηθήσεις του όγκου διαφέρουν ανάλογα με το μέγεθος και τη σύνθεση σε διάφορους τύπους όγκων και σε διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης του όγκου. Τα προγράμματα του όγκου οι κυτταρικές διηθήσεις για να στηρίξει μια απορρυθμισμένη φλεγμονής που είναι υπογλυκαιμίας αποκρίνεται στον όγκο. Συμβολή των κυτταρικών φλεγμονώδεις διηθήσεις προέρχονται μυελοειδή καταστολέα κύτταρα (MDSC) που ρυθμίζουν αρνητικά ανοσοαποκρίσεις και να προωθήσει την εξέλιξη του όγκου και των μεταστάσεων [2].

MDSC είναι μια ετερογενής πληθυσμός των ανώριμων μυελοειδών κυττάρων το οποίο αποτελείται από μυελοειδείς προγόνους και πρόδρομοι των μακροφάγων, κοκκιοκυττάρων και δενδριτικών κυττάρων (DC) [3]. Στα ποντίκια, MDSC αναγνωρίζονται από αντισώματα τα οποία ανιχνεύουν την επιφανειακή έκφραση κυττάρου του Gr1 και CD11b. Αυξήσεις του αριθμού των MDSC προκαλούν ισχυρή φυσική κατασταλτική δράση σε ασθενείς με καρκίνο [4], [5] ή ποντίκια που φέρουν όγκο [4], [6], [7]. Έχει αποδειχθεί ότι Gr1 + CD11b + ανοσοκατασταλτικά κύτταρα είναι ικανά να αναστέλλουν την Τ κυττάρου πολλαπλασιαστική απόκριση που διεγείρεται από αλλοαντιγόνα [8], CD3 πρόσδεση [9], ή διάφορα μιτογόνα [10], [11], και μπορεί επίσης να αναστείλει IL- 2 εκτέλεσης [12], καθώς και της δραστηριότητας των κυττάρων ΝΚ [5], [13]. Αυτές οι μελέτες υποδεικνύουν ότι η προοδευτική ανάπτυξη του όγκου συνδέεται με την προς τα κάτω ρύθμιση των αποκρίσεων των κυττάρων Τ και ότι η MDSC εμπλέκονται σε αρνητική ανοσορυθμιστικές μηχανισμούς. Σε μοντέλα όγκου ποντικού, αυξήσεις MDSC στους όγκους, σπλήνες, μυελού των οστών και του αίματος ρυθμίζει προς τα κάτω αποκρίσεις Τ κυττάρου [2]. Λαμβάνοντας υπόψη τις παραπάνω πληροφορίες, είναι σημαντικό να κατανοήσουν την επίδραση της εξάντλησης MDSC στη ρύθμιση των ανοσολογικών αποκρίσεων στον καρκίνο του πνεύμονα.

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε τη συμβολή των Gr1 ή Ly6G εκφράζουν μυελομονοκυτταρικού κύτταρα σε καρκινικά 3LL ανάπτυξη και θεραπευτικό εμβολιασμό αποκρίσεις σε C57BL /6 ποντίκια. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η εξάντληση MDSC αυξημένη δραστηριότητα APC και επαυξημένης τη συχνότητα και τη δραστηριότητα των ΝΚ και Τ κύτταρα τελεστές που οδήγησε σε μειωμένη ανάπτυξη του όγκου, ενισχυμένη απαντήσεις θεραπευτικό εμβολιασμό και παρέχει ανοσολογική μνήμη. Τα δεδομένα μας παρέχει υποστήριξη για την ανάπτυξη των παραγόντων που στοχεύουν MDSC για τη συνδυασμένη ανοσολογικές θεραπευτικές προσεγγίσεις στον καρκίνο του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και αντιδραστήρια

Η ποντικού Lewis καρκίνωμα του πνεύμονα (3LL, η-2

b, επίσης γνωστή ως LLC, ATCC CRL-1642) που ελήφθη από την American Type Culture Collection (Manassas, VA), DC2.4 (είδος δώρου από KL Ροκ Dana Farber Cancer Institute, Boston , Mass.) [14] και η β γαλακτοσιδάση ανταποκριτού Τ κυττάρου υβριδώματος (B3Z) η οποία αναγνωρίζει το k

b μόριο Κατηγορίας Ι και ένα ωολευκωματίνη (OVA) πεπτίδιο, SL8 (SIINFEKL) ελήφθη από Ν Shastri (UC Berkeley, CA) [15] χρησιμοποιήθηκαν σε αυτές τις μελέτες. κύτταρα 3LL-OVA παράχθηκαν με επιμόλυνση 3LL γονικών κυττάρων με τα κατασκευάσματα ωάρια έχουν ληφθεί από τον Dr. Frelinger (University of Rochester, ΝΥ). Οι φορείς έκφρασης που κωδικοποιούν είτε το πλήρους μήκους ωάρια ή κολοβωμένη Ova- (138-386) (OVA μη εκκριτική) επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Lipofectin (GIBCO /BRL) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η επιλογή με το κατάλληλο φάρμακο διεξήχθη όπως περιγράφεται [16]. Επιλέχθηκαν σταθερά προϊόντα μεταμόλυνσης 3LL-ΟνΑ μετά από OVA ELISA των κυτταρολυμάτων και κλωνοποιήθηκε με περιορισμένη αραίωση σε πλάκες των 96 φρεατίων. Για τα πειράματα που περιγράφονται σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήσαμε το 3LL-OVA που εξέφραζαν την κολοβωμένη Ova- (138 – 386). Το μέσο καλλιέργειας (CM) περιείχε RPMI 1640 (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA), πενικιλλίνη (100 μονάδες /ml), στρεπτομυκίνη (0.1 mg /ml), και 2 mmol /L γλουταμίνη (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Φλουορεσκεΐνη isothiocyanate-, Phycoerythrin-, allophycocyanin-, PerCP- ή APC-Cy7-συζευγμένα mAbs αντι-ποντίκι για να CD3 (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD69 (H1.2F3) και CD8a (53-6.7) αγοράστηκαν από την BD Biosciences (San Diego, CA). Φθορισμού-συζευγμένο Abs ποντικού: αντι-CD49b, αντι-CD11c, αντι-CD69, αντι-CD44, αντι-περφορίνη, αντι-γρανζύμου, αντι-IL10, αντι-ΙΡΝγ, αντι EpCam και αντι-CD107a ήταν από eBioscience (San Diego , CA) και αντι-Gr1, αντι-CD45 και αντι-CD11b ήταν από Biolegend (San Diego, CA). Εξουδετερώνοντας Abs σε: Gr1 (RB6-8C5), Ly6G (1A8) ήταν από BioXCell (West Lebanon, ΝΗ) και κερατίνη ήταν από Sigma. IL-2, ΙΡΝγ, IL-12, IL-10 και TNFa προσδιορίστηκαν ποσοτικά με κυτοκίνη ειδικά κιτ ELISA (eBioscience). Ευαισθησία: IL-2 (3 pg /ml), ΙΡΝγ (3 pg /ml), IL-12 (3-5 pg /ml), IL-10 (30 pg /ml) και ΤΝΡα (8 pg /ml). Ωολευκωματίνη πρωτεΐνη και χρωστική πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση Bradford ελήφθη από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). ρυθμιστικό πέψης ιστού αποτελούνταν από [0,2 mg /ml του κολλαγονάση Α (Boehringer Mannheim /Roche, Indianapolis, ΙΝ), ϋΝΑση 25 U /ml (Sigma), και 0,3 U /ml του Dispase (Invitrogen, Carlsbad, CA) σε RPMI. στηλών καθαρισμού Τ κυττάρου αγοράστηκαν από την R &? D (Minneapolis) και MDSC μαγνητικού διαχωρισμού Ab ήταν από τη Miltenyi Biotech (Auburn, CA). κιτ απομόνωσης RNA ήταν από την Qiagen (Valencia, CA) και σετ cDNA από BioRad (Hercules, CA) και πραγματικού χρόνου PCR εκκινητές ήταν από την IDT (Coralville, Iowa). Καρβοξυφθοριεσκίνη ηλεκτριμιδύλ εστέρα (CFSE) ελήφθη από την Invitrogen.

Cell Culture

Cells (3LL, DC 2.4, B3Z και 3LL-OVA) ήταν συνήθως καλλιεργούνται σε Corning T75 cm

2 ιστού φιάλη καλλιέργειας σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 στον αέρα σε μέσο καλλιέργειας (CM). Οι κυτταρικές σειρές ήταν

Mycoplasma

και ιικό παθογόνο ποντικού δωρεάν. Οι κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν μέχρι το 10

ου πέρασμα. μυελού των οστών (ΒΜ) συλλέχθηκε με έκπλυση τα μηριαία οστά των C57BL /6 ποντικών με RPMI συμπληρωμένο με 20% εμβρυϊκό μέσο βοοειδών (RP-20). Τα συγκεντρωμένα κύτταρα μυελού επιστρώθηκαν σε RP-20 συμπληρωμένο με 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη και καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες σε φιάλες επικαλυμμένες με 2% ζελατίνης (Sigma, St Louis ΜΟ). Τα μη προσκολλημένα κύτταρα πλύθηκαν μακριά και προσκολλημένα κύτταρα επεκτείνονται σε RP-20. Μετά την περίοδο καλλιέργειας (11-14 ημέρες), αιωρήματα απλών κυττάρων καλλιεργημένα κύτταρα BMA βάφτηκαν για δείκτες κυτταρικής επιφάνειας για: μονοκύτταρα (CD11b

+), μακροφάγα (CD11b

+ /F4 /80

+ ), στρωματικά κύτταρα (CD45

– /CD11b

– /CD44

+ /CD34

-), DC (CD11c

+, DEC205

+) και Β κύτταρα (CD19

+) και αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής αναλύει

Ογκογένεση Μοντέλο

παθογόνα δωρεάν C57BL /6 ποντίκια (6-8wk παλιά?. Charles River) διατηρήθηκαν στα δυτικά του Λος Άντζελες Υποθέσεων Βετεράνων Έρευνα ζώων ιχθυοτροφείο σε συμφωνία με τις κατευθυντήριες γραμμές του σκάφους επανεξέταση των ζώων του ιδρύματος. Όλες οι εργασίες των ζώων διεξήχθη σε συμφωνία με τη φροντίδα Υποθέσεων Βετεράνων Θεσμικών των ζώων και τις κατευθυντήριες γραμμές Χρήση Επιτροπή: id A3002-01. Η φροντίδα Υποθέσεων Βετεράνων Θεσμικών των ζώων και του σκάφους επανεξέταση Χρήση επιτροπή ενέκρινε το σύνολο των μελετών που αφορούν τα ζώα σε αυτό το χειρόγραφο. Τα ζώα που παρουσιάζουν σημάδια του πόνου ή πληρούν τα κριτήρια καταληκτικό σημείο θανατώθηκαν αμέσως σύμφωνα με την αποδεκτή ίδρυμα με βάση το πρωτόκολλο.

Τα ποντίκια παρακολουθούνταν καθημερινά για σημάδια δυσφορίας από το βάρος του όγκου και να βελτιώσει τον πόνο και την οδύνη ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία, αν η ζώα παρουσίασαν κλινικά συμπτώματα δυσφορίας, όπως η απώλεια της όρεξης, απώλεια βάρους 10% καχεξία, απώλεια της κινητικότητας, ανησυχία, κατάθλιψη, αναπνευστική δυσχέρεια, όγκου /βλάβης του δέρματος, ή την αποτυχία να γαμπρό. κύτταρα 3LL όγκου (2,0 × 10

5) εγχύθηκαν

s.c.

στη σωστή supra περιοχή της ωμοπλάτης του C57BL /6 ποντίκια. Οι όγκοι των όγκων παρακολουθήθηκε με μέτρηση δύο διχοτομεί διάμετροι κάθε όγκου με καλίμπρες. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο: V = 0.4ab

2, (α = μεγάλη διάμετρο και b = μικρής διαμέτρου). Έχουμε χρησιμοποιήσει δυο δόσεις για το

in vivo

εξάντληση των MDSC βασίζεται σε προηγούμενες μελέτες [100 μg /δόση [17]] ή [200 μg /δόση] χορηγούμενη κάθε δεύτερη ημέρα [18], [19]. Για τις μελέτες που περιγράφονται στο παρόν χειρόγραφο χρησιμοποιήσαμε το 200 μg /δόση. Μία εβδομάδα μετά τον εμβολιασμό του όγκου, οι ποντικοί με ψηλαφητά νεοπλάσματα εγχύθηκαν

ip

ξεχωριστά με αντι-Gr-1-ειδικά (200 μg /δόση), ή αντι-Ly6G ειδική (200 μg /δόση), ή ισοτύπου IgG2b Ab (200 μg /δόση) κάθε 48 ώρες για 2 εβδομάδες. Ένα, δύο ή τρεις εβδομάδες μετά την εμφύτευση του όγκου, οι όγκοι, σπλήνα, μυελό των οστών και το αίμα συλλέχθηκαν για εκτίμηση της συχνότητας και της δραστηριότητας των λευκοκυττάρων πληθυσμών με ειδική χρώση /αναλύσεων κυτταρομετρίας ροής.

πρότυπο ορθοτοπικής

εμφύτευση των όγκων στον πνεύμονα διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Εν συντομία, 10

4 3LL κύτταρα σε 25 μΙ αποστειρωμένο αραιωτικό μέσο NS ενέθηκαν διά της οδού του διαθωρακική C57BL /6 ποντίκια χρησιμοποιώντας μια σύριγγα φυματίνης με βελόνα 30-gauge στο αριστερό πνεύμονα υπό κεταμίνη /ξυλαζίνη αναισθησία. Μία εβδομάδα μετά τον εμβολιασμό του όγκου, μία ομάδα ποντικών θυσιάστηκαν για να επιβεβαιωθεί και να προσδιοριστεί η βασική γραμμή φορτίου του όγκου πριν από την έναρξη της θεραπείας. Μία εβδομάδα μετά τον εμβολιασμό του όγκου, τα ποντίκια υποβλήθηκαν μεμονωμένα σε επεξεργασία με ισότυπο ελέγχου ή αντι-Gr1Ab (200 μg /δόση) μέσω

ί.ρ.

Διαδρομή κάθε 48 ώρες για 4 εβδομάδες. Πέντε εβδομάδες μετά την εμφύτευση του όγκου, οι πνεύμονες διαποτίστηκαν και συλλέχθηκαν για την αξιολόγηση του βάρους του όγκου με Η & amp? Ε χρώση τομών όγκου. φορτίο όγκου αξιολογήθηκε σε ένα μόνο κυτταρικό εναιώρημα των πέψης όγκου πνεύμονα με EpCAM χρώσης των κυττάρων όγκου που ακολουθείται από αξιολόγηση με κυτταρομετρία ροής. Συνολικά 20.000 γεγονότα που θα αγοράζονταν στην FACSCanto κυτταρομετρητή ροής και ανέλυσε στοιχεία από το λογισμικό FCS Express 3.

Ο εμβολιασμός Μοντέλο

καρκινικών κυττάρων

3LL-OVA (2.0 × 10

5) εγχύθηκαν

sc

στη σωστή supra περιοχή της ωμοπλάτης του C57BL /6 ποντίκια. Το εμβόλιο αποτελούνταν από τα προσκολλημένα κύτταρα μυελού των οστών (ΒΜΑ) που είχε παλμικά με ΟνΑ πρωτεΐνη. Εν συντομία, τα κύτταρα BMA δονήθηκαν με πρωτεΐνη ΟνΑ (2,5 mg /ml) σε cm στους 37 ° C σε έναν επωαστήρα με μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 στον αέρα για 6 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και επαναιωρήθηκαν σε φυσιολογικό ορό (0.1 × 10

6 σε 200 μλ /ποντικό) και χορηγούνται με

sc

ένεση στο αριστερό αντίπλευρη πλευρά της εμφύτευσης του όγκου στις ημέρες 7 και 14 μετά τον εμβολιασμό του όγκου. Ομάδες περιλαμβάνονται: (i) Αραιωτικό, (ii) ΒΜΑ-OVA, (iii) ΒΜΑ-OVA + ισότυπου και (iv) ΒΜΑ-OVA + αντι-Gr1. Επτά ημέρες μετά τον εμβολιασμό του όγκου, ο ισότυπος ή αντι-Gr1 Ab (200 μg /δόση) χορηγήθηκαν κάθε 48 ώρες για 2 εβδομάδες. φορτίο του όγκου παρακολουθήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω και Η &? Ε ή ανοσοϊστοχημεία χρώσης (IHC) διεξήχθη επί των τμημάτων του όγκου. Ποντίκια με αγωγή που είχε απορρίψει εντελώς οι όγκοι 3LL-OVA επανα-προκλήθηκαν με καρκινικά κύτταρα 3LL-OVA (2 × 10

5) στην αριστερή πλευρά και να παρακολουθούνται για την ανάπτυξη του όγκου.

1A

,

αντιπροσωπευτικά οικόπεδα FACS για MDSC στο αίμα, ΒΜ, σπλήνα και του όγκου του 3LL ποντικών που φέρουν όγκο (ημέρες 7, 14 και 21) σε σύγκριση με παρθένα ποντίκια.

1Β

,

FACS στοιχεία για τη συχνότητα MDSC στο αίμα, BM, σπλήνα και του όγκου (Ημέρες 7, 14 και 21) απεικονίζεται ως ιστογράμματα (* p & lt? 0,05 ημέρες 14 vs ημέρα 7) (** p & lt? 0,005 ημέρες 21 vs ημέρα 14).

1C

,

MDSC από ποντίκια που φέρουν όγκο καταστέλλουν δραστικότητα DC2.4 APC να ενεργοποιήσει συγκεκριμένα το αντιγόνο CD8 Τ κύτταρα να εκκρίνουν IL-2 (* ρ & lt? 0.05 με MDSC σε σύγκριση με χωρίς MDSC) ,

1D

,

MDSC από ποντίκια που φέρουν όγκο καταστολή αντι-CD3 /CD28 διεγείρεται CFSE επισημασμένα τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων.

1Di

,

Εκπρόσωπος FACS CFSE οικόπεδα ένταση για τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων (με ή χωρίς MDSC).

1D-ii

,

Γεωμετρικός μέσος όρος (GM) για τα Τ κύτταρα CFSE ένταση εκπροσωπήθηκαν ως ιστογράμματα. (* Ρ & lt? 0.05 με MDSC vs χωρίς MDSC), οι τιμές αντανακλούν μέση ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM), η = 8 ποντικοί ανά ομάδα

Η

ανοσολογική μνήμη

Σπληνοκύτταρα. από ποντίκια που είχαν απορρίψει την δευτερεύουσα πρόκληση όγκου παρακολουθούνταν για Τ κυτταρική ανοσολογική φαινότυπο μνήμης με χρώση για Τ κυττάρων μνήμης επιφανειακούς δείκτες CD44, CD69 και ενδοκυτταροπλασματική ΙΡΝγ με ή χωρίς διέγερση με πρωτεΐνη ΟνΑ (2,5 mg /ml για όλη τη νύχτα)

in vitro

. ΙΡΝγ που εκκρίνεται από σπληνοκύτταρα (5 × 10

6) στο υπερκείμενο της καλλιέργειας προσδιορίστηκε ποσοτικά με ELISA και CD4 και CD8 Τ κυττάρων ΙΡΝγ ή IL-10 παραγωγή ποσοτικά με χρώση /κυτταρομετρίας ροής. Σπληνοκύτταρα από αφελή ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

2Α

,

Αλλαγές στο μέγεθος του όγκου μετά από αντι-Gr1 ή Ab εξάντληση Ly6G αντι-μεσολάβηση MDSC.

2B

,

Αλλαγές στο βάρος όγκου για MDSC εξαντληθεί και ομάδες ελέγχου (ημέρα 21).

2C

,

Εκπρόσωπος FACS οικόπεδα και ιστογράμματα για τη συχνότητα των CD11b + Gr1 + MDSC σε όγκο μετά από αντι-Gr1 ή θεραπεία αντι-Ly6G Ab.

2D

,

Εκπρόσωπος οικόπεδα FACS για τη συχνότητα των CD11b + Gr1 + MDSC σε όγκο μετά από αντι-κερατίνη θεραπεία Ab.

2Ε

,

δραστηριότητα Εκπρόσωπος APC στον όγκο για την ενεργοποίηση των CD8 αντιγόνο ειδικά Τ κύτταρα να εκκρίνουν IL-2 μετά από αντι-Gr1, αντι-Ly6G, έλεγχος ισοτόπου Ab και αραιωτικό θεραπεία.

2F

,

έκφραση δείκτη ενεργοποίησης CD107a σε Τ κύτταρα σε καρκινικά μετά από εξάντληση MDSC.

2G

,

Σύνολο καθαρισμένα σπληνικά Τ κυττάρων κυτταρόλυση έναντι 3LL γονικών όγκων (Ε: Τ 10: 1, 5: 1) για την MDSC εξαντλημένο ομάδες και τους ελέγχους ισοτύπου. Δεν υπήρχαν διαφορές στο κελί κυτταρόλυση Τ γονικής 3LL κυττάρων μεταξύ του αραιωτικού και της ομάδας ελέγχου ισοτύπου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Δεν υπήρχαν αλλαγές στην κυτταρόλυση των κυττάρων Τ κατά των όγκων Β16 που δεν συνδέονται μεταξύ των MDSC εξαντλημένο ομάδες και τους ελέγχους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα δεδομένα σε όλους τους πίνακες είναι αντιπροσωπευτικά 2-3 ανεξάρτητα πειράματα (δεδομένα, μέση ± SEM, p τιμές: σύγκριση με τους ελέγχους * Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0.005, η = 6 ποντίκια /ομάδα

Η

επεξεργασία και παρουσίαση αντιγόνων Δοκιμασία

DC 2.4 ή BMA ή ένα μόνο εναιώρημα κυττάρων του όγκου πέψης (5-10 × 10

4 c /κοιλότητα) από τους ελέγχους, αντι-Gr1 ή αντι-Ly6G αντιμετωπίζονται όγκο ποντικούς που φέρουν συν-καλλιεργήθηκαν με πρωτεΐνη ΟνΑ (2,5 mg /ml) και το MHC κατηγορίας Ι περιορισμένη κυτταρική γραμμή CD8 Τ B3Z (10

5 c /φρεάτιο) σε CM εις τριπλούν φρεάτια μιας πλάκας 96-φρεατίων για 24 . hrs IL-2 που εκκρίνεται από τα ενεργοποιημένα CD8 Τ κύτταρα στο υπερκείμενο ποσοτικοποιείται με ELISA

3Α

,

η &?. Ε και IHC για Τ κύτταρα ή GR1 κύτταρα που εκφράζουν σε ιστούς όγκων μετά από MDSC εξάντληση ή τον έλεγχο θεραπείες

3Β

,

H & amp?.. Ε τμήματα του πνεύμονα να αξιολογήσει μετάσταση στους πνεύμονες μετά από εξάντληση MDSC

3C

,

Συχνότητα διηθήσεις του όγκου (CD3, CD4, CD8, CD 11 c, F480 ή CD49b), 3

D

,

ΝΚ κυττάρων που εκφράζουν ΙΡΝγ, περφορίνης και κοκκιένζυμο,

3Ε

, CD8 εκφράζει ΙΡΝγ, περφορίνης και γρανζύμου αλλά μείωσε την IL-10 έκφραση αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

3F

,

έκφραση των όγκων κυτταροκινών (ΙΡΝγ, IL-12, TNFα και IL-10), μετά την εξάντληση MDSC. (Δεδομένα, μέσος όρος ± SEM, * ρ & lt? 0,05 σύγκριση με τους μάρτυρες, η = 8 ποντικοί /ομάδα)

Η

Κυτταρομετρίας Ροής

Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε για τον ακόλουθο επιφανείας Τ κυττάρου. δείκτες CD3, CD4, CD8, CD69 σε μονό κυτταρικό εναιώρημα των σπληνοκυττάρων ή πέψης του όγκου μετά από αγωγή όπως περιγράφεται παραπάνω. Σπληνοκύτταρα και πέψης κυττάρου όγκου αξιολογήθηκαν επίσης για τα κύτταρα ΝΚ με τον επιφανειακό σημειωτή CD49b. CD4 Τ, CD8 Τ και ΝΚ κύτταρα ξεχωριστά αξιολογήθηκαν για ενδοκυτταροπλασματική περφορίνης, γρανζύμου, ΙΡΝγ ή IL-10. CD107a σε Τ κύτταρα αξιολογήθηκε με χρώση κυτταρικής επιφάνειας /κυτταρομετρίας ροής. Για τις αναλύσεις των λευκοκυττάρων διηθήσεις στον ιστό του όγκου, οι όγκοι διαχωρίστηκαν μηχανικά σε ένα συρμάτινο πλέγμα από τη σύνθλιψη με μια σύριγγα των 10 ml και επωάστηκαν σε ρυθμιστικό πέψης ιστού στους 37 ° C για 25 λεπτά. Τα κύτταρα διηθούνται μέσω 70 μm σουρωτήρια νάιλον (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ), χρωματίστηκαν με ειδικούς δείκτες και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα δείγματα που αποκτήθηκαν σε μία ροή FACSCanto (BD Biosciences /FACSCalibur κυτταρομετρητή (Becton Dickinson, San Jose, CA) στο Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Λος Άντζελες, Jonsson Cancer Center κυτταρομετρίας ροής πυρήνα διευκόλυνσης. Συνολικά 10.000 έως 25.000 συμβάντα αποκτήθηκαν και τα κύτταρα χρώση θετικά εντός του συνολικού πληθυσμού ζωντανών κυττάρων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FCS Express 3 (de novo Software, Canada). τα κύτταρα επωάστηκαν με άσχετο ισότυπο αντισώματα και μη χρωματισμένα κύτταρα χρησίμευσαν ως μάρτυρες.

4Α

,

IHC για διασπασμένης κασπάσης 3 σε τομές όγκων μετά από εξάντληση MDSC. Τα βέλη είναι ενδεικτικά της διασπασμένης χρώσης κασπάσης 3.

4Β

,

Αηηβχίην και χρώση ΡΙ στο πέψης όγκου με κυτταρομετρία ροής.

4C

,

Σχετική κασπάσης 8 έκφραση από QRTPCR κανονικοποιούνται με β-ακτίνη έκφραση σε ιστούς όγκων.

4D

,

των ενδοθηλιακών MECA έκφραση 32 κύτταρο δείκτη και συνολική έκφραση CXCR3 Τ κυττάρων σε όγκους με κυτταρομετρία ροής.

4Ε-η

,

σχετική έκφραση δείκτη προ-αγγειογενετική και αντι-αγγειογενετική σε όγκους από QRTPCR κανονικοποιήθηκαν με β- ακτίνη. εξάντληση MDSC μειωμένη προ-αγγειογενετική (VEGF-A, CXCL2, CXCL5, Ang1 και Ang2) (4Ε-F) αλλά αυξήθηκε αντι-αγγειογενετική (CXCL9 και CXCL10) (4G) και CXCR3 (4Η) έκφραση στους όγκους. (Data, μέση τιμή ± SEM, σ τιμές: σε σύγκριση με τους μάρτυρες * ρ & lt? 0.05, n = 8 ποντικοί /ομάδα)

Η

5Α

,

Εκπροσώπου. Η &? Ε τμημάτων όγκου πνεύμονα εξής εξάντληση MDSC και τους ελέγχους? βέλη ενδεικτικό όγκου.

5Β

,

Tumor βάρος αξιολογήθηκε με χρώση κυτταρικής επιφάνειας για EpCAM σε ένα μόνο κυτταρικό εναιώρημα του όγκου πέψης και ποσοτικοποιείται με κυτταρομετρία ροής. (Δεδομένα, μέσος όρος ± SEM, p τιμές: σύγκριση με τους ελέγχους * Ρ & lt? 0,05, η = 8 ποντικοί /ομάδα)

Η

CFSE Based ανάλυση κυτταρόλυσης

δραστικότητα Σύνολο κυτταρολυτικών Τ κυττάρων. στον σπλήνα έναντι κυττάρων όγκου γονικών 3LL ή κύτταρα μελανώματος Β16 συγγενικά αξιολογήθηκαν μετά από αγωγή με αντι-Gr1 ή αντι-Ly6G Ab την ημέρα 21 μετά τον εμβολιασμό του όγκου. στόχων όγκου σημάνθηκαν με CFSE σε δόση (1 μΜ) σε PBS για 15-20 λεπτά σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά την πλύση, τα επισημασμένα στόχοι επωάστηκαν με τα Τ κύτταρα καθαρίστηκαν από σπλήνες χρησιμοποιώντας στήλες των Τ κυττάρων (R &? D), και κυτταρολυτικών δραστηριοτήτων αξιολογήθηκαν έναντι αυτόλογων 3LL κυτταρική γραμμή όγκου και το συγγενικό Β16 ελέγχου των καρκινικών κυττάρων μελανώματος γραμμή. Τα καθαρισμένα σπληνός τελεστές Τ κυττάρου συν-καλλιεργήθηκαν με στόχους κυττάρου όγκου (Ε: Τ του 10:01-5:01) για τέσσερις ώρες σε φρεάτια τετράδα σε 96 φρεατίων πλάκα. Μετά από συν-καλλιέργεια, τα κύτταρα πλύθηκαν και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Μειώσεις στη συχνότητα και την ένταση των επισημασμένων CFSE κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό% των κυτταρόλυση στους στόχους του όγκου.

6Α

,

14 ημερών ΒΜΑ κουλτούρα διαδίδεται σε cm.

6Β

,

κύτταρα BMA επεξεργασία και παρουσιάζονται την πρωτεΐνη OVA για να ενεργοποιήσετε την συγκεκριμένη κυτταρική σειρά CD8 Τ OVA να εκκρίνουν IL-2.

6C

,

όγκος του όγκου μετά τον εμβολιασμό (ομάδες: Διαλύτης, BMA-OVA, ΒΜΑ-OVA + ομοιοτυπικά και BMA-OVA + αντι-Gr1 Ab).

6D

,

H & amp? Ε και IHC για διασπασμένης κασπάσης 3 σε ιστούς όγκων μετά τον εμβολιασμό. Βέλη ενδεικτικό λευκοκυττάρων διηθήσεων και διασπάται χρώση κασπάσης 3 στους όγκους.

6Ε-G

,

αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής σπληνικών δεικτών μνήμης Τ κυττάρων και ενεργοποίηση από ποντικούς που είχαν απορριφθεί όγκοι στην εμβολιασμό συν ομάδα θεραπείας αντι-Gr1 σε σύγκριση με μη φέροντες όγκο ελέγχους αφελής ? 6Ε, Σπληνικά παραγωγή ΙΡΝγ, 6F, Συχνότητα παράγουν ΙΡΝγ CD4 και CD8 μνήμη (CD44) και την ενεργοποίηση (CD69) δείκτης που εκφράζουν τα Τ κύτταρα. 6G, γεωμετρικός μέσος των παράγουν ΙΡΝγ μνήμης Τ κύτταρα από τον εμβολιασμό συν αντι-Gr1 θεραπεία μετά από διέγερση με ΟνΑ πρωτεΐνη συγκριτικά με τους απλοϊκούς μάρτυρες. (Data, μέση τιμή ± SEM, σ τιμές: σε σύγκριση με τους μάρτυρες * ρ & lt? 0.05, n = 8 ποντικοί /ομάδα)

Η

CFSE Σήμανση και Τ Αναλύσεις κυττάρων καταστολή

Τ κύτταρα καθαρίστηκαν από σπλήνες χρησιμοποιώντας τις στήλες απομόνωση των Τ κυττάρων. Μετά από δύο πλύσεις με PBS, καθαρισμένα Τ κύτταρα (2 χ 10

6 κύτταρα /ml) αναμειγνύεται με ίσο όγκο διαλύματος CFSE 10 μΜ για 10 λεπτά. Η αντίδραση τερματίστηκε με την προσθήκη 10 όγκων ψυχρής RPMI 1640/10% FBS. Τα επισημασμένα κύτταρα (1 χ 10

6 κύτταρα /ml) πλύθηκαν δύο φορές με PBS /2% FBS. Σε μια U-πυθμένος 96 φρεατίων πλάκα καλλιέργειας κυττάρων προ-επικαλυμμένες με αντι-CD3 Ab (5 μg /ml), καθαρισμένο Τ κύτταρα (2 χ 10

5) καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS και αντι- CD28 Ab (5 μg /ml) για 72-96 ώρες. Για να προσδιοριστεί η επίδραση των MDSC στον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων, CFSE επισημασμένα Τ κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με καθαρισμένο Gr1 σπληνική MDSC (2-4 × 10

5) από 3LL ποντίκια που έφεραν ή παρθένα ποντίκια και οι αλλαγές στον πολλαπλασιασμό αξιολογήθηκε με ροή κυτταρομετρία. MDSC απομονώθηκαν από σπλήνες με επισήμανση των κυτταρικών εναιωρημάτων με αντι ποντικού αρουραίου Gr1 mAb (eBioscience), ακολουθούμενη από διαχωρισμό των κυττάρων μαγνητικό αντισώματος χρησιμοποιώντας μικροσφαιρίδια αντι-αρουραίου (Miltenyi Biotec). Τα απομονωμένα κύτταρα ήταν & gt?. 90% καθαρά για CD11b + Gr1 + εκφράζουν MDSC όπως προσδιορίζεται με κυτταρομετρία ροής

Cytokine ELISA

Οι κυτοκίνες (ΙΡΝγ, TNFa, IL-10 και IL-12) σε υπερκείμενα καλλιέργειας σπληνοκυττάρων ή από σπλήνα ή του όγκου ομογενοποιήματα προσδιορίστηκαν με ELISA και οι πλάκες διαβάζονται στα καθοριζόμενα μήκη κύματος με Microplate Reader (Amersham Biosciences, Sunnyvale, CA).

όγκου Tissue Τμηματισμός και ανοσοϊστοχημεία

Για να προσδιοριστεί η έκταση των λεμφοκυττάρων που διηθούν τους όγκους από τις διάφορες ομάδες αγωγής, C57BL /6 ποντίκια που φέρουν όγκους 7-ημερών ενέθηκαν

ip

με Gr1-ειδική (200 μg /δόση) ή Ly6G ειδική (200 μg /δόση) ή ισοτύπου IgG2b Ab (200 μg /δόση) κάθε 48 ώρες για 2 εβδομάδες. Μη νεκρωτική όγκοι απομονώθηκαν και ενσωματωμένα σε παραφίνη και τομές σειριακά σε πάχος 5-μm. Οι τομές Η &? Ε ή ανοσολογική χρώση για CD3 Τ λεμφοκύτταρα ή Gr1 εκφράζοντα κύτταρα. Για τον προσδιορισμό αποπτωτικά κύτταρα όγκου, τομές όγκων χρωματίστηκαν για διασπασμένη κασπάση 3. Το αντιγόνο ανάκτηση επιτεύχθηκε με κιτρικό νάτριο (10 mmol /L, ρΗ 6,0). Τα τμήματα αποκλείστηκαν με 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας, και ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα έναντι CD3, Gr1 ή διασπασμένη κασπάση 3. Πρωτεύοντες αντισώματα επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά την επώαση με δευτερεύον αντίσωμα (Vector Laboratories), χρώση αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας DAB κιτ υπόστρωμα για την υπεροξειδάση (SK-4100, Vector Laboratories). Counter-λεκέ επιτεύχθηκε με αιματοξυλίνη. Τα πλακίδια παρατηρήθηκαν κάτω 1X71 Ολύμπου Μικροσκόπιο φθορισμού που συνδέονται με μια κάμερα CCD. Οι εικόνες που αποκτήθηκαν με 10Χ, 20Χ και 60Χ στόχους χρησιμοποιώντας το Pro λογισμικό Image.

Η απόπτωση

Για να προσδιοριστεί η έκταση των καρκινικών κυττάρων απόπτωσης, ένα μόνο κύτταρο αναστολή των καρκινικών ιστών σημάνθηκαν σύμφωνα με ένα κιτ PI /Αννεξίνη V-FITC ανίχνευση της απόπτωσης (BD Pharmingen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων του όγκου (με περίφραξη σε CD45

– κύτταρα) αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής

Ολικό RNA. Παρασκευή, cDNA Σύνθεση και σε πραγματικό χρόνο QPCR

Ποντίκια που φέρουν όγκους παλαιά επτά ημερών υποβλήθηκαν σε αγωγή με ισότυπο, αντι-Gr1 ή αντι-Ly6G Ab και 2 εβδομάδας μετά τη θεραπεία, οι ιστοί όγκων ποσοτικοποιήθηκαν για

Caspase 8, Angiopoietin1, Angiopoietin2, VEGF-α, η γονιδιακή έκφραση CXCL2, CXCL5, CXCL9, CXCL10 και CXCR3

χρησιμοποιώντας SYBR Green ποσοτική PCR Kit στο iCycler (Bio-Rad) και διορθώθηκε με το β-

ακτίνης

γονίδιο έλεγχο καθαριότητας. Για τις αναλύσεις QPCR, RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας κιτ Qiagen. Το cDNA παρασκευάστηκε με ένα κιτ (BioRad) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ενισχύσεις έγιναν σε ένα συνολικό όγκο 25 μΐ για 40 κύκλους 15 s στους 95 ° C, 20 s στους 60 ° C, και 30 s στους 72 ° C. Primer αλληλουχίες ήταν ως εξής: β-

ακτίνη

F, 5′- CCACAGCTGAGAGGGAAATC -3 ‘και R, 5′-TCTCCAGGGAGGAAGAGGAT -3’?

Caspase

8 F, 5′- TGCTTGGACTACATCCCACAC-3 ‘και R, 5′-GTTGCAGTCTAGGAAGTTGACC -3’?

Ang-1

F, 5′- TCTCATGCTAACAGGAGGTTGGTG -3 ‘R, 5′-GGATCATCATGGTGGTGGAACGTA-3’?

Ang-2

F, 5′-CAAGAGCTCGGTTGCTATCCGTAA-3 ‘R, 5’ GTCCATGTCACAGTAGGCCTTGAT3 »?

VEGF-α

F, 5′- TGTACCTCCACCATGCCAAGT-3 ‘R, 5′- CGCTGGTAGACGTCCATGAA-3’?

CXCL5

F, 5′- GGTCCACAGTGCCCTACG-3 ‘R, 5′- GCGAGTGCATTCCGCTTA-3’?

CXCL2

F, 5′-AGTGAACTGCGCTGTCAATG -3 ‘R, 5′-GAGAGTGGCTATGACTTCTGTCTG-3’?

CXCL9

F, 5′- GCACGATCCACTACAAATCCC-3 ‘R, 5′- GGTTTGATCTCCGTTCTTCAGT-3’?

CXCL10

F, 5′- CCAAGTGCTGCCGTCATTTTC-3 ‘R, 5′- TCCCTATGGCCCTCATTCTCA-3’? και

CXCR3

F, TCTCCCTACGATTATGGGGAAAA-3 ‘και R, 5′-GGTTCTGTCAAAGTTCAGGCT-3’.

Στατιστικές Αναλύσεις

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Prism (GraphPad Software). Χρησιμοποιήσαμε ανάλυση διακύμανσης για δεδομένα με πολλές ομάδες, unpaired Student του

t-test

για διπλή σύγκριση.

P

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

MDSC αυξημένη σε καρκινικά ποντίκια ως συνάρτηση της ανάπτυξης των όγκων

Για να προσδιοριστεί η επίδραση. της ανάπτυξης του όγκου 3LL για τη συχνότητα των MDSC, μη νεκρωτικές όγκων, αίμα, σπλήνα ή ΒΜ αξιολογήθηκαν για Gr1 + CD11b + έκφραση (ημέρες 7, 14 και 21 μετά τον εμβολιασμό του όγκου). Παρόμοια με τα ευρήματα της αύξησης MDSC σε ασθενείς με καρκίνο [4], [5], υπήρχαν αυξημένη συχνότητα MDSC σε 3LL ποντίκια που φέρουν όγκο. MDSC συχνότητα αυξήθηκε στο αίμα (2-4 φορές), σπλήνα (2,6 έως 4 φορές) και ΒΜ (1.5-2 φορές) των ποντικών που φέρουν όγκο σε σύγκριση με τον έλεγχο naive ποντικούς (Εικόνα 1Α-Β). Ημέρα-7 όγκοι είχαν χαμηλότερο συχνότητα MDSC σε σύγκριση με τις ημέρες 14 και 21. Η συχνότητα των MDSC στα προϊόντα πέψης του όγκου ενισχύθηκε περαιτέρω την ημέρα 21 (3 φορές) σε σύγκριση με την ημέρα 14 όγκους (Σχήμα 1Α-Β). Για να επιβεβαιωθεί το ανοσοποιητικό κατασταλτικά αποτελέσματα του MDSC, αξιολογήσαμε τη λειτουργία του σπληνός MDSC από ποντίκια που φέρουν όγκο σχετικά με την αναστολή της δραστηριότητας DC2.4 APC ή Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Για το

in vitro

DC APC αξιολόγησης δραστηριότητα, μπορούμε επιλεγμένους αριθμούς κυττάρων ειδικών DC και OVA CD8 Τ κύτταρα που παρήγαγαν υψηλά επίπεδα της IL-2 υπό τις συνθήκες δοκιμασίας για την παροχή σαφείς διαφορές στην παραγωγή IL-2 επίπεδα στο παρουσία ή απουσία MDSC. MDSC από αφελή ποντίκια δεν καταστέλλουν τη δράση DC APC. Αν και MDSC από την ημέρα 7 ποντικούς που φέρουν όγκο καταστέλλεται δραστικότητα DC APC, η κατασταλτική δράση ήταν χαμηλότερη σε σύγκριση με MDSC από την ημέρα 14 και 21 τα ποντίκια που φέρουν όγκο (Εικόνα 1 C). Επιπλέον, MDSC από παρθένα ποντίκια δεν αναστέλλει αντι-CD3 /CD28 διεγείρεται CFSE επισημασμένα τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ και MDSC από την ημέρα 7 ποντικούς που φέρουν όγκο είχαν χαμηλότερο κατασταλτική ικανότητα για πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων σε σύγκριση με MDSC από την ημέρα 14 και 21 τα ποντίκια που φέρουν όγκο