Abstract

Η αλλαγμένη έκφραση και η λειτουργία του λεκτίνη όπως οξειδωμένη χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη υποδοχέα-1 (LOX-1) έχει συνδεθεί με αρκετές ασθένειες, όπως η ενδοθηλιακή δυσλειτουργία, η αθηροσκλήρωση και η παχυσαρκία. Σε αυτές τις παθολογίες, oxLDL /LOX-1 ενεργοποιεί οδούς που προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, κυτταρική κινητικότητα και την αγγειογένεση σηματοδότησης. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι

ΟΦ

1 mRNA υπερεκφράζεται στο στάδιο ΙΙΙ και IV του ανθρώπινου προστάτη αδενοκαρκινώματα. Ωστόσο, η λειτουργία του LOX-1 στην αγγειογένεση καρκίνου του προστάτη παραμένει να προσδιοριστεί. Στόχος μας ήταν να αναλυθεί η συμβολή της oxLDL και LOX-1 σε αγγειογένεση όγκου χρησιμοποιώντας C4-2 κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Αναλύσαμε την έκφραση των προ-αγγειογόνων μορίων και την αγγειογένεση σε ξενομοσχεύματα όγκων καρκίνου του προστάτη, χρησιμοποιώντας μοντέλα κυττάρων καρκίνου του προστάτη με υπερέκφραση ή knockdown του LOX-1 υποδοχέα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ενεργοποίηση του LOX-1 χρησιμοποιώντας oxLDL αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και την έκφραση των προ-αγγειογόνων μορίων VEGF, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Εμφανώς, οι επιδράσεις αυτές αποτράπηκαν στο μοντέλο καρκίνου του προστάτη C4-2 όταν LOX-1 έκφρασης χτυπήθηκε κάτω. Η αγγειογενετική δράση του LOX-1 ενεργοποιείται με oxLDL καταδείχθηκε περαιτέρω με τη χρήση της δοκιμασίας αορτικού δακτυλίου και το μοντέλο ξενομοσχεύματος της ανάπτυξης του όγκου σε χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη των εμβρύων κότας. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι LOX-1 ενεργοποίηση από oxLDL είναι ένα σημαντικό γεγονός που ενισχύει την αγγειογένεση του όγκου σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. González-Chavarría Ι, Cerro RP, Parra NP, Sandoval FA, FA Zuñiga, Omazábal VA, et al. (2014) Λεκτίνη-Like Η οξειδωμένη LDL υποδοχέα-1 είναι ένας ενισχυτής του όγκου αγγειογένεση σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 9 (8): e106219. doi: 10.1371 /journal.pone.0106219

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Φλεβάρη, 2014? Αποδεκτές: 29 Ιούλη 2014? Δημοσιεύθηκε: 29 Αύγ, 2014

Copyright: © 2014 González-Chavarría et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από Fondecyt Grant 1121159, CONICYT, Χιλή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Λεκτίνη-όπως οξειδωμένη χαμηλής-πυκνότητας λιποπρωτεϊνη υποδοχέα-1 (LOX-1) είναι ένα μέλος της οικογένειας υποδοχέα καθαριστή [1], η οποία μεσολαβεί την αναγνώριση και εσωτερικοποίηση της οξειδωμένης LDL (ox-LDL) [2 ]. LOX-1 εκφράζεται κυρίως στα ενδοθηλιακά κύτταρα, αν και αυτός ο υποδοχέας μπορεί επίσης να βρεθεί σε πολλούς άλλους τύπους κυττάρων όπως τα μονοκύτταρα, cardiomiocytes, λιποκύτταρα, τα αιμοπετάλια, τα μακροφάγα και αγγειακά λεία μυϊκά κύτταρα [3]. Η αλλαγμένη έκφραση και η λειτουργία του LOX-1 υποδοχέα έχει συσχετισθεί με νόσους όπως η ενδοθηλιακή δυσλειτουργία, η αθηροσκλήρωση, παχυσαρκία, και πρόσφατα επίσης με την ανάπτυξη του όγκου [4] – [6]. Η ενεργοποίηση του LOX-1 μέσω oxLDL σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα επάγει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης? pro μονοπάτια φλεγμονώδη σηματοδότηση? και προ-αγγειογόνο πρωτεΐνες, όπως μεταλλοπρωτεϊνάσης-2 και 9 (MMP-2 και ΜΜΡ-9), αγγειοτενσίνη II (Ang II) και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) [7] – [10]. Η αγγειογένεση είναι μια φυσιολογική διαδικασία, η οποία καθορίζει το σχηματισμό νέων αιμοφόρων αγγείων από προϋπάρχον σκαφών [11]. Θεωρείται ένα φυσιολογικό φαινόμενο κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη, την ανάπτυξη του οργανισμού και την επούλωση τραυμάτων [12]. Ωστόσο, η αγγειογένεση είναι επίσης μια θεμελιώδης διαδικασία για την ανάπτυξη και την εξέλιξη των διαφόρων τύπων όγκων [13]. Όγκου αγγειογένεση ρυθμίζεται από την ισορροπία μεταξύ προ- και αντι-αγγειογόνους μόρια που απελευθερώνονται από τα κύτταρα του όγκου και στρωματικά κύτταρα όγκου όπως οι ινοβλάστες και τα μακροφάγα, τα οποία καθορίζουν την ενεργοποίησης της αγγειογένεσης του όγκου [14], [15]. Η έκφραση του γονιδίου σε αγγειογένεση όγκου ρυθμίζεται περαιτέρω σε απόκριση προς διάφορα ερεθίσματα, περιλαμβανομένων υποξία, το οξειδωτικό στρες και φλεγμονή. Σε σχέση με αυτό μεταξύ ερεθισμών και της έκφρασης προ-αγγειογενετική πρωτεΐνη, VEGF έχει ταυτοποιηθεί ως κύριος παράγοντας στην αγγειογένεση του όγκου [16], [17]. Η υποξία, έκκριση κυτοκίνης και το οξειδωτικό στρες στα κύτταρα του όγκου να αυξήσει την έκφραση του VEGF, προκαλώντας έτσι την αγγειογένεση των όγκων [18].

LOX-1 έχει προταθεί ως μια πιθανή σύνδεση μεταξύ της παχυσαρκίας, της δυσλιπιδαιμίας και του καρκίνου [19] . Σταθερά, κλινικές συνθήκες της παχυσαρκίας και της αθηροσκλήρωσης έχουν συσχετιστεί εξέλιξης του όγκου και τη μετάσταση του καρκίνου του προστάτη [20] – [22]. Οι ασθενείς διαγνώστηκαν με το μεταβολικό σύνδρομο, χρόνιες φλεγμονώδεις ασθένειες και αυτοάνοσες συνθήκες έδειξαν μια υψηλή συχνότητα και επιθετικότητα στην ανάπτυξη του όγκου [23]. Πράγματι, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει αυξημένη έκφραση του LOX-1 σε ανθρώπινα αδενοκαρκινώματα του προστάτη στα στάδια III και IV [5], που απαιτούν νέες αγγείωση και την αγγειογένεση για την τοπική εισβολή. Ωστόσο, η συγκεκριμένη επίδραση του LOX-1 στην αγγειογένεση του όγκου δεν έχει ακόμη περιγραφεί.

Αυτή η εργασία επιδεικνύει ότι LOX-1 και η ενεργοποίηση του χρησιμοποιώντας oxLDL επάγουν αγγειογένεση όγκου και διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Συγκεκριμένα, αποδεικνύουμε ότι η ενεργοποίηση του LOX-1 χρησιμοποιώντας oxLDL προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και η έκφραση των προ-αγγειογόνων μορίων VEGF, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι επιπτώσεις αυτές αποτράπηκαν στο μοντέλο καρκίνου του προστάτη C4-2 όταν LOX-1 έκφρασης χτυπήθηκε κάτω. Επιπλέον, η αγγειογενετική δράση του LOX-1 ενεργοποιείται από oxLDL καταδείχθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία αορτικού δακτυλίου και το μοντέλο ξενομοσχεύματος της ανάπτυξης του όγκου σε χοριοαλλαντοϊκές μεμβράνες (CAM) εμβρύων κοτόπουλων. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι LOX-1 ενεργοποίηση από oxLDL είναι μια σχετική οδό ενεργοποίησης που απαιτούνται για την αγγειογενετική ενίσχυση της ανάπτυξης όγκου των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του προστάτη.

Αποτελέσματα

Δημιουργία κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη υπερεκφράζουν LOX-1 και shRNA έναντι olr1

Οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη C4-2 μετήχθησαν με τον φορέα έκφρασης λεντοϊού LvCW-LOX-1, που κωδικοποιεί το

olr1

γονίδιο υπό τον έλεγχο του κυτταρομεγαλοϊού προαγωγό (CMVp), και απομονώθηκε χρησιμοποιώντας την περιοριστική μέθοδο κλωνοποίησης αραίωσης. Η υπερέκφραση του LOX-1 σε κύτταρα C4-2 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου, ανοσοαποτύπωση, και ανοσοφθορισμό. Επτά διαφορετικοί κλώνοι με LOX-1 υπερέκφραση ελήφθησαν, εκτός από αυτά, επιλέχθηκαν 3 κλώνοι μετά πειράματα κηλίδος Western και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου (Εικ. 1Α και D). Ο επιλεγμένος κυτταρικός κλώνος C4-2 /​​LOX-1 (+) (κλώνος 5) είχαν 1,2 × 10

3 φορές πάνω από τα βασικά έκφραση του LOX-1 mRNA επίπεδα της φυσικής κυτταρικής γραμμής C4-2 ή C4-2 /GFP ελέγχου υπερέκφραση. Επιπλέον, LOX-1 υπερέκφραση στον κλώνο αυτό immunolocalized στην κυτταρική μεμβράνη, χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία (Εικ. 1 F). Για να προσδιορίσετε αν η υπερέκφραση διαμεσολαβείται από λεντοϊού σωματίδια είχε επίδραση στην έκφραση του LOX-1, ένα στοιχείο ελέγχου υπερέκφραση (κύτταρα C4-2 /​​GFP) δημιουργήθηκε. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στην έκφραση των LOX-1 σε αυτόν τον έλεγχο συγκριτικά με την φυσική κυτταρική γραμμή C4-2 (Σχ. 1C και F).

Α) κηλίδα Western για LOX-1 (40 kDa ) έκφραση σε ανθρώπινα κλώνους καπάκι με υπερέκφραση του LOX-1. Β) κηλίδα Western για LOX-1 (40 kDa) έκφραση σε κλώνους ανθρώπινου προστάτη καρκινική κυτταρική με LOX-1 knockdown C) PCR πραγματικού χρόνου για LOX-1 έκφρασης σε τρεις κλώνους με υπερέκφραση του LOX-1. Δ) PCR πραγματικού χρόνου για LOX-1 έκφραση προσδιορίστηκε σε τρεις κλώνους που εκφράζουν shRNA /LOX-1 (Α), και τρεις κλώνοι που εκφράζουν shRNA /LOX-1 (Β). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και αναλύθηκαν στατιστικώς χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης και μετά τη δοκιμή του Dunnett? (***

p≤0.001

, **

p≤0.01

, *

p ≤ 0,05

).

Η

Η LOX- 1 knockdown σε κύτταρα C4-2 επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας ένα shRNA έναντι του mRNA που κωδικοποιείται από το

olr1

γονίδιο. C4-2 κύτταρα υπέστησαν μεταγωγή με φορείς λεντοϊού για την έκφραση κάθε shRNA (LVW-U6 /

ΟΦ

1) αλληλουχία έναντι

olr1

υπό τον έλεγχο του υποκινητή U6. Τα μεταδιηγερμένα κύτταρα απομονώθηκαν με τη χρήση της μεθόδου περιοριστική κλωνοποίηση αραίωσης, και LOX-1 κάτω-έκφραση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου, ανοσοαποτύπωση, και ανοσοφθορισμό (εικ. 1). Δύο διαφορετικές ακολουθίες shRNA, shRNA-Α και shRNA-Β, αναλύθηκαν. Τρεις διαφορετικοί κλώνοι των shRNA-Α και shRNA-Β-1 LOX knockdown ελήφθησαν. Ο επιλεγμένος κλώνος shRNA-Β μειωμένη έκφραση του LOX-1 κατά 98%, σε σύγκριση με βασική LOX-1 mRNA επίπεδα της φυσικής κυτταρικής γραμμής C4-2 ή το κύτταρο ελέγχου knockdown γραμμή C4-2 /​​LvEmpty (Εικ. 1 Β-Ε). Επιπλέον, η προς τα κάτω έκφραση του LOX-1 σε αυτόν τον κλώνο επιβεβαιώθηκε με ανοσοϊστοχημεία (Εικ. 1 F). Για να προσδιορίσετε αν το νοκ ντάουν που διαμεσολαβείται από λεντοϊού σωματίδια είχε επίδραση στην έκφραση του LOX-1 α νοκ ντάουν ελέγχου (C4-2 /​​LvEmpty) δημιουργήθηκε. Δεν παρατηρήσαμε σημαντικές αλλαγές στην έκφραση του LOX-1 σε αυτόν τον έλεγχο συγκριτικά με την φυσική κυτταρική γραμμή C4-2 (Σχ. 1C και F).

Τα μοντέλα κυττάρων καρκίνου του προστάτη που λαμβάνεται, δηλαδή C4-2 /LOX-1 (+) [κλώνος 5], C4-2 /​​LOX-1 (-) [κλώνος shRNA-B1] και η μητρική C4-2 κυτταρική γραμμή, χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα σε όλες τις δοκιμασίες που εκτελούνται σε αυτό το έργο

oxLDL δεν έχει κυτταροτοξικότητα επιδράσεις σε μοντέλα καρκίνου του προστάτη κυτταρικών

Αρχίζοντας από την οξείδωση της φυσικής LDL από εξομαλύνσεως της λιπιδαιμίας ασθενή λάβαμε ένα κλάσμα του μέσου επιπέδου οξειδωμένης LDL (oxLDL), το οποίο ελέγχθηκε με δημιουργία συζυγιακά διένια και βορικό νάτριο ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης σε 1% αγαρόζη (Σχ. 2Α). Για να καθοριστεί αν η oxLDL ελήφθη είχε κάποια κυτταροτοξική δράση επωάσαμε τα μοντέλα κυττάρων καρκίνου του προστάτη με oxLDL (25 έως 150 μg /mL) κατά την διάρκεια 12 ωρών. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν κανένα κυτταροτοξικά αποτελέσματα oxLDL σε οποιοδήποτε από τα μοντέλα των κυττάρων του προστάτη για την περιοχή συγκεντρώσεων που ελέγχθηκε (Σχ. 2Β). Ωστόσο, παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των C4-2, C4-2 /​​GFP, C4-2 /​​LvEmpty και C4-2 /​​LOX-1 (+) κυτταρικά μοντέλα για όλες τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται oxLDL, σε σύγκριση με το ίδιο μη επεξεργασμένο μοντέλα των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Επιπλέον, μία σημαντική αύξηση στον πολλαπλασιασμό κυττάρου παρατηρήθηκε σε C4-2 /​​LOX-1 (+) σε σύγκριση με τον C4-2, ή την υπερέκφραση και knockdown ελέγχου για όλες τις συγκεντρώσεις oxLDL αναλύθηκαν. Ωστόσο, η πολλαπλασιαστική επίδραση παρεμποδίστηκε εντελώς στο /LOX-1 C4-2 (-) μοντέλο των κυττάρων, πάνω από όλες τις συγκεντρώσεις που αναλύθηκαν (Σχήμα 2Β).

Α) oxLDL που λαμβάνεται από ανθρώπινο πλάσμα, οξειδώθηκε με 7. υΜ του CuSO

4, παρακολουθείται με φασματοφωτομετρία στα 243 nm λ και ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτές αγαρόζης 1% με ρυθμιστικό βορικού νατρίου. Β) Δοκιμασία κυτταροτοξικότητας των μοντέλων των καρκινικών κυττάρων του προστάτη σε επεξεργασία με 25, 50, και 100 μg /mL oxLDL διάρκεια 12 ωρών. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και αναλύθηκαν στατιστικώς χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA και μετα-τεστ του Dunnett (* ή #

p ≤ 0,05

).

Η

Ο συνδετήρας oxLDL αυξάνει την έκφραση προ-αγγειογενετική δείκτες

ο καρκίνος του προστάτη κυτταρική γραμμή C4-2 επωάστηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις oxLDL (25, 50, 100 μg /mL) κατά την διάρκεια 12 ωρών και η έκφραση της προ-αγγειογόνο δείκτες VEGF , ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν μια σημαντική αύξηση στην έκφραση του VEGF, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, αναλογικά με τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται oxLDL, με ένα αντίστοιχο 3,5-πλάσια, 2.5-, και 3-πλάσια αύξηση, όταν 100 μg /mL της oxLDL ήταν μεταχειρισμένος. Επιπλέον, LOX-1 έκφραση επίσης αναλογικά αυξάνεται με τις συγκεντρώσεις των oxLDL χρησιμοποιείται, που δείχνει ένα 3-πλάσια αύξηση στα 100 μg /mL (Εικ. 3).

Σχετική ποσοτικοποίηση της LOX-1, VEGF, ΜΜΡ -2, και ΜΜΡ-9 έκφραση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη κυτταρική γραμμή C4-2 επωάζονται με αυξανόμενη συγκέντρωση oxLDL (25, 50, 100 μg /mL) για 12 ώρες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± Τ.Α. από τρία ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και αναλύθηκαν στατιστικώς χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης και Dunnet μετα-τεστ? (***

p≤0.001

, **

p≤0.01

, *

p ≤ 0,05

).

Η

Η αυξημένη έκφραση της pro-αγγειογενετική δεικτών σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη απαιτεί ενεργοποίηση του LOX-1 μέσω oxLDL

Τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη μοντέλα C4-2 /​​LOX-1 (-) και C4-2 /​​LOX-1 (+) επωάστηκαν με 100 μg /mL oxLDL διάρκεια 12 ωρών και η έκφραση των προ-αγγειογενετική δείκτες (VEGF, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9) αναλύθηκε. Η έκφραση του VEGF, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 στην κυτταρική γραμμή επωάστηκε με C4-2 oxLDL αυξήθηκε σημαντικά (2-, 2-, και 2,5 φορές, αντίστοιχα), σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα C4-2 (Σχ. 4Α ). Είναι ενδιαφέρον ότι η έκφραση των προ-αγγειογενετική δείκτες που επάγεται από oxLDL, εμποδίστηκε στην LOX-1 C4-2 /​​(-) μοντέλο καρκινικού κυττάρου του προστάτη. Από την άλλη πλευρά, η διέγερση της C4-2 /​​LOX-1 (+) με oxLDL αύξησε σημαντικά την έκφραση όλων των προ-αγγειογενετική δείκτες που αναλύθηκαν (VEGF και ΜΜΡ-2, 2-φορές? ΜΜΡ-9 3-πλάσια), σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα C4-2. Η έκφραση του VEGF, ΜΜΡ-2, και τα κύτταρα ΜΜΡ-9 σε C4-2 /​​LOX-1 (+) επίσης αυξήθηκε σημαντικά (1.6-, 1,5-, και 1,4 φορές, αντίστοιχα), ακόμη και εν απουσία του oxLDL διέγερση, και μειώθηκε κατά 20%, 50% και 20% σε C4-2 /​​LOX-1 (-) κύτταρα, σε σύγκριση με τον ενδογενή έκφραση στην κυτταρική γραμμή C4-2 χωρίς oxLDL διέγερση (Σχήμα 4Α).

C4-2, C4-2 /​​LOX-1 (-), και C4-2 LOX-1 (+) μοντέλα κυττάρων καρκίνου ανθρώπινου προστάτη επωάστηκαν με ή χωρίς oxLDL [100 μg /mL] για 12 ώρες. Α) Σχετική ποσοτικοποίηση των VEGF, ΜΜΡ-2, και την έκφραση της ΜΜΡ-9 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και αναλύθηκαν στατιστικώς χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης και Dunnet μετα-τεστ? (***

p≤0.001

, **

p≤0.01

, *

p ≤ 0,05

). Β) κηλίδα Western για έκφραση VEGF (30 kDa). Γ) Ζυμόγραμμα για ΜΜΡ-2 (72 kDa προ-μορφή? 64 kDa ενεργού μορφής) και ΜΜΡ-9 (92 kDa προ-μορφή?. 84 kDa δραστική μορφή) δραστηριότητες σε ρυθμισμένο μέσο

Η

Το προσαρμοσμένο μέσο από τα μοντέλα κυττάρων καρκίνου του προστάτη επωάστηκαν με oxLDL [100 μg /mL] συλλέχθηκαν και συμπυκνώθηκαν. Αργότερα έκφραση VEGF αξιολογήθηκε με ανοσοστύπωση, και η δραστικότητα της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 αναλύθηκε με ζυμογραφία. Τα αποτελέσματά μας παραπεμφθεί ότι η έκφραση του VEGF αυξήθηκε σε κύτταρα που επωάστηκαν με C4-2 oxLDL, κατά τη σύγκριση με τα κύτταρα χωρίς C4-2 oxLDL, ενώ η έκφραση του VEGF εμποδίστηκε σε C4-2 /​​LOX-1 (-) κύτταρα επωάζονται με oxLDL [ ,,,0],100 μg /mL]. Επιπλέον, η έκφραση του VEGF αυξήθηκε σε κύτταρα C4-2 /​​LOX-1 (+) με o χωρίς θεραπεία oxLDL (Σχ. 3Β). Ανάλυση της δραστηριότητας μεταλλοπρωτεϊνάσης έδειξε μια αύξηση στη δραστηριότητα ζελατινάσης ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 στο ρυθμισμένο μέσο από κύτταρα που επωάστηκαν με C4-2 oxLDL και εμποδίστηκε σε ρυθμισμένο μέσο από /LOX-1 C4-2 – κύτταρα () επωάζονται με oxLDL. Επιπλέον, LOX-1 υπερέκφραση σε C4-2 /​​LOX-1 (+) κύτταρα έδειξαν μία αυξημένη δραστηριότητα του ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 με ή χωρίς oxLDL διέγερσης (Σχ. 4C).

Ενεργοποίηση του LOX -1 με oxLDL προάγει την παραγωγή βλαστάρι στο ποντίκι αορτικών δακτυλίων

Αναλύσαμε C4-2 μοντέλο κύτταρα επωάζονται με oxLDL να καθοριστεί αν η γενιά των ενδοθηλιακών λάχανα μπορούσε να διεγερθεί στη δοκιμασία αορτικού δακτυλίου με τη διαφορική έκκριση pro-αγγειογενετική δείκτες. Η C4-2, C4-2 /​​LOX-1 (-) και C4-2 /​​LOX-1 (+) μοντέλα κυττάρου επωάστηκαν με 100 μg /mL του oxLDL κατά την διάρκεια 12 ωρών και το εμπλουτισμένο μέσο συνελέγη, συμπυκνώθηκε και που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της αορτικών δακτυλίων ποντικών.

Η διέγερση των αορτικών δακτυλίων με ρυθμισμένα μέσα από C4-2 και κύτταρα επεξεργασμένα με oxLDL C4-2 /​​LOX-1 (+) ενίσχυσε σημαντικά την παραγωγή του σε σύγκριση με τα λάχανα το μη επεξεργασμένο κυτταρική σειρά C4-2. Ωστόσο, οι διαφορές μεταξύ του αορτικού γενιά δαχτυλίδι βλαστάρι χρησιμοποιώντας ρυθμισμένα μέσα από C4-2 /​​LOX-1 (-) με ή χωρίς oxLDL διέγερση, δεν ήταν σημαντικές. Ετσι, υπερ-έκφραση του LOX-1 προωθείται γενιάς λάχανα με ή χωρίς oxLDL διέγερσης (Σχ. 5Α).

Α). Μικροφωτογράφηση αορτικής ποντίκι δακτυλίων και ποσοτικοποίηση των βλαστών ανά δακτύλιο επωάζονται με ρυθμισμένο μέσο από καρκίνο του προστάτη C4-2, C4-2 /​​LOX-1 (-), και τα κύτταρα C4-2 LOX-1 (+) προηγουμένως διεγερθεί με ή χωρίς oxLDL [100 μg /mL]. Β) LOX-1 ενεργοποίηση από oxLDL προάγει την αγγειογένεση των όγκων σε μοντέλα ξενομοσχεύματος καπάκι σε χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη των εμβρύων κότας. Μικροφωτογράφηση και ποσοτικοποίηση των αιμοφόρων αγγείων του όγκου σε ξενομοσχεύματα C4-2, C4-2 /​​LOX-1 (-), και (+) κύτταρα C4-2 LOX-1, προηγουμένως επωάστηκαν με ή χωρίς oxLDL [100 μg /mL], σε χοριοαλλαντοϊκές μεμβράνες των 10-ημερών-old έμβρυα κοτόπουλου. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης με μετα-τεστ Dunnett (***

p≤0.001

, **

p≤0.01

, *

p ≤ 0,05

).

η

Ενεργοποίηση του LOX-1 από oxLDL προάγει την αγγειογένεση σε ξενομοσχεύματα κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη των εμβρύων κότας

για μελέτες αγγειογένεση επί χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη (CAM) εμβρύων κοτόπουλων, ο καρκίνος του προστάτη κυτταρικοί κλώνοι C4-2, C4-2 /​​LOX-1 (-), και C4-2 LOX-1 (+) προ-επωάστηκαν με oxLDL 100 μg /mL για 2 ώρες. Περίπου 1 × 10

6 κύτταρα στη συνέχεια εμβολιάστηκαν σε CAM 10-ημερών-old έμβρυα κοτόπουλου. Πέντε ημέρες μετά τον εμβολιασμό, οι όγκοι που εξάγονται από τα CAMs και η έκταση της αγγείωσης του όγκου αναλύθηκε. C4-2 κύτταρα προ-επωάστηκαν με oxLDL παρουσίασαν σημαντική αύξηση του όγκου αγγείωση σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα C4-2. Περαιτέρω, LOX-1 υπερέκφραση σε C4-2 /​​LOX-1 (+) κύτταρα έδειξαν επίσης αυξημένη αγγείωση του όγκου όταν τα κύτταρα επωάστηκαν με ή χωρίς oxLDL σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα C4-2. Αξιοσημείωτα, C4-2 /​​LOX-1 (-) κύτταρα κατεργασμένα με oxLDL δεν έδειξαν σημαντικές μεταβολές σε αγγείωση του όγκου, σε σύγκριση τόσο με C4-2 και C4-2 /​​LOX-1 (-) μη επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 5Β).

η

olr1

γονίδιο υπερεκφράζεται σε δημόσια σύνολα δεδομένων πίνακα από μεταστατικό καρκίνο του προστάτη

με στόχο να καθοριστεί εάν οι παρατηρούμενες επιδράσεις στην αγγειογένεση του όγκου που προκαλείται από oxLDL /LOX-1 σε C4-2 κυττάρων καρκίνου του προστάτη είχαν καμία κλινική σημασία σε ασθενείς, χρησιμοποιήσαμε NCBI Gene Expression Omnibus βάση δεδομένων (GEO) για να προσδιοριστεί η έκφραση

olr1

υποδοχέα στο σύνολο δεδομένων GDS2545, το οποίο έχει διαφορετικά στάδια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη . Αυτά τα δεδομένα επιτρέπει τη συγκριτική ανάλυση των ανθρώπινων μεταστατικών όγκων του προστάτη, πρωτογενείς όγκους του προστάτη και φυσιολογικό ιστό του δότη. Σε αυτό το πλαίσιο, η έκφραση του

ΟΦ-1

βρέθηκε να αυξηθεί σημαντικά σε πρωτογενείς όγκους του προστάτη και μεταστατικών όγκων του προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό του προστάτη (Εικ. 6).

Η έκφραση του

olr1

σε διάφορα στάδια της προόδου του όγκου καρκίνου του προστάτη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το δημόσιο GDS2545 βάση δεδομένων στο NCBI Gene Expression Omnibus (GEO). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± S.E. ανθρώπινου φυσιολογικού ιστού δότη n = 17, πρωτοπαθείς όγκους του προστάτη n = 64 και μεταστατικών όγκων του προστάτη n = 50, τα οποία αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας ένα

t

δοκιμή (

* p ≤ 0,05

).

η

Συζήτηση

στην εργασία αυτή αποδεικνύει, για πρώτη φορά, ο ρόλος του υποδοχέα LOX-1 και η ενεργοποίηση του χρησιμοποιώντας oxLDL, στον πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση των ανθρώπινων C4- 2 κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Συγκεκριμένα, δείχνουν ότι μια αύξηση στις συγκεντρώσεις oxLDL προώθησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και σημαντικά και αναλογικά αυξάνει την έκφραση του VEGF προ-αγγειογενετική δείκτες, και οι μεταλλοπρωτεϊνάσες ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9. Επιπλέον, η κυτταρική διέγερση του LOX-1 με oxLDL αύξησε επίσης την έκφραση του υποδοχέα LOX-1, παράγοντας ένα θετικό ανατροφοδοτεί-βρόχο του LOX-1 έκφρασης.

Η ένωση του LOX-1 και oxLDL με νόσους , όπως η ενδοθηλιακή δυσλειτουργία, η αθηροσκλήρωση, το οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου, εγκεφαλικό επεισόδιο, διαβήτης, υπέρταση, το μεταβολικό σύνδρομο και η παχυσαρκία, έχει μελετηθεί εκτενώς [3], [5], [24]. Η παχυσαρκία, η ίδια, έχει επίσης συνδεθεί ως ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για αθηροσκλήρωση, τύπου 2 σακχαρώδη διαβήτη και τον καρκίνο, καθώς και άλλων ασθενειών [25]. Κλινικές μελέτες δείχνουν μια σχέση μεταξύ υψηλές συγκεντρώσεις στον ορό oxLDL και αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του παχέος εντέρου [26]. Επιπλέον, οι συγκεντρώσεις oxLDL έχουν επίσης αποδειχθεί ότι αυξάνουν σε παχύσαρκους ασθενείς [27].

Σύμφωνα με αυτά τα ευρήματα, οι προηγούμενες εκθέσεις είχε δείξει ότι η παχυσαρκία σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο για ανάπτυξη εξαιρετικά κακοήθη και μεταστατικό καρκίνο του προστάτη [21 ], [28]. Επιπλέον, στα διαγονιδιακά αδενοκαρκινώματος του προστάτη ποντικού (TRAMP) μοντέλο ποντικού, σίτιση των ποντικών με ένα υπερθερμιδικές διατροφή, αυξάνει την ιστολογική βαθμολογία των όγκων του προστάτη, τον αριθμό των μεταστάσεων, μάζας του όγκου, και ο βαθμός της αγγείωσης, σε σύγκριση να TRAMP ποντίκια που τρέφονταν με κανονική διατροφή [29].

υπάρχει ένα ειδικό ενδιαφέρον στη σχέση μεταξύ της χοληστερόλης και του καρκίνου του προστάτη, επειδή οι ανδρογόνων και άλλων στεροειδών ορμονών που συντίθενται από τη χοληστερόλη, και είναι θεμελιώδεις για την ανάπτυξη και συντήρηση του καρκίνου του προστάτη [30]. Υπό φυσιολογικές συνθήκες τα ανδρογόνα εμπλέκονται στην απόκτηση των δευτερογενών σεξουαλικών χαρακτηριστικών, την ανάπτυξη και τη φυσιολογική ανάπτυξη του προστάτη. Ωστόσο, έχουν επίσης συσχετιστεί με την εξέλιξη του όγκου στον καρκίνο του προστάτη [31]. Έτσι, πολλοί από τους καρκίνους του προστάτη πυρίμαχων να στέρηση ανδρογόνου, η πρόσληψη χοληστερόλης αύξηση, η οποία είναι η κύρια υπόστρωμα για τη σύνθεση των ανδρογόνων [31], [32]. Από την άποψη αυτή, η κύρια πηγή της χοληστερόλης για τα κύτταρα του όγκου είναι LDL, η οποία endocyted κυρίως από τους υποδοχείς LDL (LDLR) [33], [34]. Ωστόσο, θεωρούμε ότι το οξειδωτικό και προ-φλεγμονωδών μικροπεριβάλλον του όγκου πλούσια σε ROS [35] θα μπορούσε να είναι η προώθηση τροποποίησης της LDL από υπεροξείδωση των λιπών [36], αποφεύγοντας την αναγνώριση από LDLR και ευνοεί την πρόσληψη του από τους υποδοχείς οδοκαθαριστών της oxLDL. Σύμφωνα με αυτό, αναλύσαμε την έκφραση της καθαριστών υποδοχείς για τροποποιημένες λιποπρωτεΐνες και την έκφραση του υποδοχέα της LDL στο σύνολο δεδομένων GDS2545, που ελήφθη από την δημόσια βάση δεδομένων (προφίλ GEO) [37]. Εκεί, παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση στην έκφραση των υποδοχέων καθαριστή

olr1, μαντίλι

και

scarb1

σε πρωτογενείς όγκους και μετάσταση του καρκίνου του προστάτη, και μια σημαντική αύξηση στην έκφραση του

CD36

και

olr1

υποδοχέα σε μετάσταση καρκίνου του προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό του προστάτη. Είναι ενδιαφέρον ότι η έκφραση του LDLR έδειξαν μια σημαντική μείωση στην έκφραση της σε μετάσταση όγκου και δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ πρωτογενών όγκων του προστάτη και φυσιολογικό προστάτη ιστών (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Λαμβάνοντας υπόψη αυτό, οι υψηλές συγκεντρώσεις των κυκλοφορούντων LDL σε παχύσαρκους ασθενείς με καρκίνο του προστάτη θα μπορούσε να συμβάλει στην εξέλιξη του όγκου μέσω LOX-1 ενεργοποίηση με οξείδωση τροποποιημένη LDL (oxLDL) που παράγεται στο οξειδωτικό μικροπεριβάλλον, που υπάρχει στο στρώμα του όγκου του προστάτη. Από αυτή την άποψη, δημιουργήσαμε ένα μέσο επίπεδο οξειδωμένης LDL, η οποία θα πρέπει να είναι αντιπροσωπευτικό της παρούσας oxLDL στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η oxLDL που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη δεν έχει κυτταροτοξική επίδραση σε καμία από τις C4-2 κυττάρων καρκίνου του προστάτη μοντέλα δοκιμάστηκαν. Από αυτή την άποψη, έχει αναφερθεί ότι oxLDL έχει ένα διαφορικό κυτταροτοξικό αποτέλεσμα αναλόγως του τύπου του κυττάρου. Τα καρκινικά κύτταρα γραμμές Κ562 /AO2 (λευχαιμία) και EC9706 (καρκίνωμα του οισοφάγου) που έλαβαν θεραπεία με oxLDL παρουσιάζουν ένα υψηλότερο ποσοστό βιωσιμότητας των κυττάρων σε σύγκριση Γουίτ μη καρκινικά κύτταρα όπως HUVEC (ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφαλικής φλέβας) [38].

Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό του C4-2, C4-2 /​​GFP, C4-2 /​​LvEmpty και C4-2 /​​LOX-1 (+) κυτταρική μοντέλα, σε όλο το εύρος των συγκεντρώσεων oxLDL προσδιορίστηκαν σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κυτταρικές γραμμές. Επίσης, το μοντέλο κύτταρο C4-2 /​​LOX-1 (+) έδειξε μια υψηλότερη πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου μοντέλα C4-2, C4-2 /​​GFP, και C4-2 /​​LvEmpty, για όλες τις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν. Ωστόσο, η πολλαπλασιαστική επίδραση του oxLDL εμποδίστηκε στην LOX-1 C4-2 /​​(-) μοντέλο των κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι αυτή η επίδραση είναι στενά συνδεδεμένη με την ενεργοποίηση του υποδοχέα LOX-1 με oxLDL. Με αυτή την έννοια, η πολλαπλασιαστική επίδραση που προωθούνται από oxLDL /LOX-1 έχει περιγραφεί σε μυϊκά κύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα και πρόσφατα σε καρκινικά κύτταρα του μαστού μέσω οδών ενεργοποίησης που εμπλέκουν p38 (ΜΑΡΚ), ρ44 /42 ΜΑΡΚ, και ΝΡ-κΒ [6 ], [39]. Ωστόσο, τα πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα επί καρκινικών κυττάρων του προστάτη δεν είχε ακόμη περιγραφεί.

In vitro

μελέτες έχουν δείξει ότι oxLDL διέγερση των ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων ομφάλιας φλέβας (HUVECs) ενεργοποιεί την έκφραση του LOX -1 υποδοχέα, δημιουργώντας μια υπερέκφραση των μορίων προσκόλλησης, φλεγμονώδεις πρωτεΐνες, και οι ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 μεταλλοπρωτεϊνάσες, [8], [40], [41]. Επιπλέον, τα ενδοθηλιακά κύτταρα από βόεια αορτή σε επεξεργασία με οχ-LDL προάγουν σχηματισμό τριχοειδών που ρυθμίζονται από LOX-1, και την ενεργοποίηση του ΝΑϋΡΗ οξειδάσης /MAPKinase /NF-kappa Β, με μια αύξηση στην έκφραση του VEGF [9], [42]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση του VEGF, και η ενεργοποίηση των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, συνδέεται στενά διαμεσολαβείται από oxLDL /LOX-1 σε C4-2 προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή.

Μπορούμε επίσης να επιβεβαιώσει, με τη χρήση η δοκιμασία αορτικού δακτυλίου και το μοντέλο CAM εμβρύου όρνιθας ξενομοσχεύματος, ότι η αύξηση του VEGF, ΜΜΡ-2 και την έκφραση ΜΜΡ-9 διαμεσολαβείται από LOX-1 /oxLDL έχει όγκων αγγειογενετική δράση τόσο

in vivo

και

ex vivo

σε C4-2 κύτταρα καρκίνου του προστάτη μοντέλα. Αυτό είναι σύμφωνο με τις προηγούμενες

ex vivo

μελέτες, όπου προ-αγγειογενετικών παραγόντων, όπως της αγγειοτενσίνης ΙΙ δεν προκάλεσε σχηματισμό τριχοειδών φυτρώνουν σε δακτυλίους αορτής απομονώνονται από

ΟΦ-1 KO

ποντίκια [10]. Ομοίως, η εκτομή του

ΟΦ-1

γονίδιο μειώθηκε αισθητά την χοριοειδική νεοαγγειοποίηση σε μοντέλα ποντικών που προκαλείται από λέιζερ τραυματισμό [43]. Σηματοδότηση που προκαλείται από oxLDL /LOX-1 θα μπορούσε να έχει έναν κρίσιμο ρόλο στη διαδικασία της αγγειογένεσης των όγκων, επειδή η πυκνότητα μικροαγγείων είναι ένας σημαντικός προγνωστικός δείκτης του καρκίνου του προστάτη, και σχετίζεται με το κλινικό στάδιο, εξέλιξη, μετάσταση, και την επιβίωση του καρκίνου του προστάτη [44], [45].

Εν κατακλείδι, έχουμε αποδείξει την άμεση σχέση μεταξύ των παραγόντων της παχυσαρκίας, όπως LOX-1 /oxLDL και την ενίσχυση της έκφρασης του πολλαπλασιασμού και της προ-αγγειογενετική δείκτες, που έχουν βιολογική επίδραση στην αγγειογένεση του όγκου

ex vivo

και

in vivo

σε C4-2 κύτταρα καρκίνου του προστάτη μοντέλα. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι LOX-1 θα μπορούσε να είναι ένα ουσιαστικό ρυθμιστή σε καρκινικά κύτταρα προστάτη, με την ικανότητα να ενισχύσει την αγγειογένεση όγκων προς κακοήθεια και μετάσταση σε παχύσαρκους ασθενείς.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

Ανθρώπινο C4-2 καρκίνου του προστάτη [46], [47] και ΗΕΚ-293 FT κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 και μέσο ϋΜΕΜ αντίστοιχα, συμπληρωμένο με 2 mM L-γλουταμίνη (Hyclone), 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) και 1% στρεπτομυκίνη πενικιλίνη (Gibco).

Ζώα

Αρσενικά ποντίκια BALB /c ελήφθησαν από Harlan Winkelmann GmbH (Borchen, Γερμανία) και στεγάστηκαν υπό ελεγχόμενες και αποστειρωμένο περιβάλλον συνθήκες. Τέσσερα ποντίκια (8-12 εβδομάδων) χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα.

Αυγά

Gallus gallus domesticus

ελήφθησαν από τον ISP (Instituto de Salud Pública, Χιλή), πλύθηκαν με 7 μΜ διάλυμα θειικού χαλκού για την πρόληψη μυκητιακής μόλυνσης, και επωάστηκαν στους 37,5 ° C και 80% σχετική υγρασία για 10 ημέρες. Τα αυγά είχαν γυρίσει περιοδικά με ένα αυτόματο διπλού Turner (GQF Hova-Μπατόρ Manufacturing Co. USA) για την πρόληψη της προσκόλλησης και ρήξη του CAM από το χόριο. Τα έμβρυα που εμβολιάστηκαν με τα κύτταρα μοντέλα C4-2 επωάστηκαν στους 37,5 ° C, 80% υγρασία και 5% CO

2 για 5 ημέρες.

Όλες οι μελέτες που περιλαμβάνουν πειραματισμό με ζώα ήταν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές και οι συστάσεις του Οδηγού ΝΙΗ για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου (τρέχουσα έκδοση) και ακολούθησε τις πολιτικές που αναγράφονται στο εγχειρίδιο της Χιλής Βιοασφάλεια των CONICYT (Εθνική Υπηρεσία για την Επιστήμη και την Τεχνολογία). Τα πειραματικά πρωτόκολλα που συντάσσονται από τους συγγραφείς και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας Θεσμικών. Σε όλες τις περιπτώσεις, η εποπτεία των κτηνιατρικών αρχών από τη Σχολή Βιολογικών Επιστημών, Universidad de Concepción, Χιλή, ήταν εγγυημένη. Όταν τα ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για πειραματισμό, που στεγάζονταν σε ξεχωριστά δωμάτια και κατάλληλη διατροφή, την ύδρευση και την παρακολούθηση της υγείας οριστικά παρέχονται. Τα ζώα υποβάλλονται σε ευθανασία ήταν ανθρωπίνως χειρισμός. Υποβλήθηκαν σε αρχική αναισθησία και ενέσιμο χλωριούχο κάλιο ενδοφλεβίως για την αποφυγή ταλαιπωρίας.

Προετοιμασία

ox-LDL

Τα δείγματα αίματος (20 ml) λήφθηκαν από τέσσερις εθελοντές, οι οποίοι υπέγραψαν μια γραπτή συγκατάθεση. Αυτό το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Universidad de Concepción, Χιλή. Ανθρώπινη LDL (1.019 να 1,063 g /ml) απομονώθηκε από το πλάσμα του αίματος των υγιών ανθρώπινων υποκειμένων με διαδοχική υπερφυγοκέντρηση στους 4 ° C. LDL υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι ρυθμιστικού διηθείται (0.45-μm) LDL (150 mmol /L NaCl? 0,24 mmol /L EDTA? ΡΗ 7,4), άλλαξε τρεις φορές, για 36 ώρες στους 4 ° C. Μετά από εκτεταμένη διαπίδυση έναντι PBS, με 3 αλλαγές, για 36 ώρες στους 4 ° C, οξειδωμένη LDL παρασκευάσθηκε με επώαση καθαρίστηκε LDL με 7 μΜ θειικό χαλκό

4 για 3 ώρες στους 37 ° C. Τροποποίηση των LDL παρακολουθήθηκε με φασματοφωτομετρία μέσω της παραγωγής συζυγών διενίων σε λ 243 nm, και στη συνέχεια ένα ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα 1% αγαρόζης σε ρυθμιστικό διάλυμα βορικού νατρίου πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η μεταβολή στην ηλεκτροφορητική μετανάστευση των oxLDL σε σύγκριση με LDL. Το πήγμα κηλιδώνεται με 0,25% Coomassie Blue R-250, κατά τη διάρκεια 2 ωρών και αποχρωματίζονται κατά την διάρκεια 4 ώρες χρησιμοποιώντας 5% MeOH, 7.5% HOAc, 87.5% Η

2O. Οι ταινίες της LDL και oxLDL αναλύθηκαν με το όργανο Οδύσσεια CLX (LI-COR, EEUU).

Η κυτταροτοξικότητα

αξιολόγηση

Τα μοντέλα καρκίνου του προστάτη κυττάρων επωάστηκαν με 25, 50, και 100 μg /mL oxLDL διάρκεια 12 ωρών. Μετά από αυτό, το μέσο απομακρύνθηκε, οι καλλιέργειες πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό, και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με επώαση των καλλιεργειών με 10 mg /ml του 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) 2,5- διφαινυλο τετραζόλιο βρωμίδιο (ΜΤΤ) σε 37 ° C για 30 λεπτά, και μετρώντας την απορρόφηση στα 570 nm σε διαλυτοποιημένη κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα UV-ορατού SPECTROstar

Nano

φασματόμετρο (BMG LABTECH, Germany).

Οι φορείς λεντοϊών που εκφράζουν ORL-1 ή shRNA έναντι olr1

Η ανθρώπινη αλληλουχία LOX-1 υπο-κλωνοποιήθηκε στον φορέα λεντοϊού pLCW, παράγοντας το κατασκεύασμα pLCW-LOX-1.