Αφηρημένο

Up-ρυθμίζονται sirtuin 1 (SIRT1), ένα NAD

+ – εξαρτάται από την κατηγορία ΙΙΙ αποακετυλασών των ιστονών, αποακετυλιώνει p53 και αναστέλλει μεταγραφική δραστηριότητα, οδηγώντας σε κυτταρική επιβίωση. SIRT1 υπερέκφραση έχει αναφερθεί να προβλέψει κακή επιβίωση σε ορισμένες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του στομάχου. Ωστόσο, η αντικαρκινική επίδραση της αναστολής SIRT1 παραμένει ασαφής σε γαστρικό καρκίνο. Εδώ, ερευνήσαμε τους μηχανισμούς κατά των όγκων ενός αναστολέα sirtuin, tenovin-6, σε επτά ανθρώπινη κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (τέσσερις κυτταρικές σειρές με άγριου τύπου

TP53

, δύο με μεταλλαγμένο τύπου

TP53

, και ένα με μηδενική

TP53

). Είναι ενδιαφέρον ότι, tenovin-6 επήγαγε απόπτωση σε όλες τις κυτταρικές σειρές, όχι μόνο αυτούς με άγριου τύπου

ΤΡ53,

αλλά επίσης μεταλλαγμένο τύπου και null εκδόσεις, συνοδευόμενη από τα πάνω ρύθμιση του υποδοχέα θανάτου 5 (DR5). Στην KatoIII κυτταρική γραμμή (

ΤΡ53

-null), DR5 σίγασης που εμφανώς εξασθενημένο tenovin-6-επαγόμενη απόπτωση, υποδηλώνοντας ότι η περιστροφική μηχανισμός πίσω από αντικαρκινική δράση του βασίζεται στην ενεργοποίηση της οδού σήματος υποδοχέα θανάτου. Αν και ενδοπλασματικό δίκτυο στρες που προκαλείται από τους αναστολείς sirtuin αναφέρθηκε ότι επάγει DR5 πάνω ρύθμιση σε άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές, δεν μπορέσαμε να βρούμε αξιοσημείωτη ενεργοποίηση των σχετικών μορίων του, όπως ATF6, PERK, και CHOP, σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με tenovin- 6. Tenovin-6 σε συνδυασμό με ντοσεταξέλη ή SN-38 που ασκείται ελαφρά έως μέτρια συνεργική κυτταροτοξικότητα έναντι γαστρικών καρκινικών κυττάρων. Συμπερασματικά, tenovin-6 έχει ισχυρή αντικαρκινική δράση έναντι του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου κύτταρα μέσω DR5 πάνω ρύθμιση. Τα αποτελέσματά μας πρέπει να είναι χρήσιμες για τη μελλοντική κλινική ανάπτυξη της sirtuin αναστολέων

Παράθεση:. Hirai S, Endo S, Saito R, Hirose Μ, Ueno Τ, Suzuki H, et al. (2014) Αντικαρκινική Συνέπειες της Sirtuin αναστολέα, Tenovin-6, κατά του καρκίνου γαστρικά κύτταρα μέσω του θανάτου του υποδοχέα 5-Up κανονισμού. PLoS ONE 9 (7): e102831. doi: 10.1371 /journal.pone.0102831

Επιμέλεια: Αντρέι Λ Gartel, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Οκτώβρη του 2013? Αποδεκτές: 23 Ιούνη 2014? Δημοσιεύθηκε: 17, Ιούλ 2014

Copyright: © 2014 Hirai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις-in-Aid από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας (στο IH). Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικό καρκίνο είναι μία από τις κύριες αιτίες θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1], [2]. Αν και έχουν αναπτυχθεί διάφορες χημειοθεραπείες για προχωρημένο καρκίνο του στομάχου, η πρόγνωση παραμένει φτωχή χρειάζονται και τα νέα αντικαρκινικά φάρμακα για τον καρκίνο του στομάχου. Γαστρικό καρκίνος είναι ένα βιολογικά και γενετικά ετερογενή καρκίνου που περιλαμβάνει πολυάριθμες γενετικές μεταλλάξεις και επιγενετικές εναλλαγές [3]. Μεταξύ αυτών, οι ανωμαλίες του

ΤΡ53

ογκοκατασταλτικό γονίδιο να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση [4], [5]. Περίπου το 30% των ασθενών με καρκίνο του στομάχου έχουν

TP53

μετάλλαξη [6]. Ακόμη και σε καρκινικά κύτταρα με άγριου τύπου (wt)

ΤΡ53

, έχει αναφερθεί ότι η λειτουργία του

ΤΡ53

καταστέλλεται από αρνητική ρύθμιση συμπεριλαμβανομένων ουβικιτινίωση, μεθυλίωση, και αποακετυλίωση [7], [8]. Στο πλαίσιο αυτό, θα ήταν μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική να υποθέσουμε ότι η αναστολή αυτών των αρνητικών ρυθμιστών οδηγεί σε ενίσχυση της κατά του όγκου αποτελέσματα μέσω της ενεργοποίησης των ρ53 σε βάρος

ΤΡ53

καρκίνους. Ποντικού διπλό λεπτό 2 (MDM2) είναι μια σημαντική φυσιολογική ανταγωνιστή του p53 [7]. Αναφέραμε προηγουμένως ότι ένας αναστολέας MDM2, νουτλίνη-3, έδειξε ισχυρή δράση κατά των όγκων έναντι του γαστρικού καρκινικών κυττάρων μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού ρ53 [9]

Sirtuin 1 (SIRT1), ένα NAD

+ -. Εξαρτώμενη δεακετυλάσης ιστόνης (HDAC), έχει μια ποικιλία λειτουργιών που εμπλέκονται στη χρωματίνη αποσιώπηση, τη μακροζωία, και γονιδιωματική σταθερότητα. Βρίσκεται στον πυρήνα και δρα ως αισθητήρας του κυττάρου μεταβολικής κατάστασης στην επιβίωση και γήρανση υπό γονοτοξικές και οξειδωτικού στρες [10], [11]. Εκτός απακετυλίωση ιστόνης, οι λειτουργίες αυτές εξαρτώνται εν μέρει από την αποακετυλίωση των διαφόρων μη-ιστόνης πρωτεΐνες που περιλαμβάνουν μεταγραφικούς παράγοντες: p53, κουτί forkhead (FOXO) οικογένεια πρωτεϊνών, κΒ πυρηνικό παράγοντα, c-myc, Ν-myc, E2F1, και υποξία επαγόμενου μεταγραφικοί παράγοντες (HIF) 1α /2α? χρωματίνη σχετιζόμενα ένζυμα: ακετυλοτρανσφεράσης ιστόνης, p300, DNA-εξαρτώμενη κινάση υπομονάδας Κυ80, και ΤΙΡ60? στοιχεία επιδιόρθωση του DNA: Ku70, RAD51 και NBS1? και κυττάρου-σηματοδότησης παράγοντες: STAT3, β-κατενίνης, και Smad7 [11] – [13]. SIRT1 αλληλεπιδρά φυσιολογικώς με ρ53 και εξασθενεί τις λειτουργίες του μέσω αποακετυλίωσης στο C-τερματικό υπόλειμμα Lys382 της [12]. Η υπερέκφραση του SIRT1 βρέθηκε σε πολλούς καρκίνους, όπως του στομάχου και του παχέος εντέρου [10], [14], και αναφέρεται ότι λειτουργεί ως προαγωγός όγκων. SIRT2 είναι ένα από τα κυτταροπλασματικά NAD

+ – εξαρτώμενη αποακετυλασών ιστόνης και αποακετυλιώνει ιστόνης Η3 λυσίνη 56 (H3K56) και α-τουμπουλίνης. Μοιράζεται επίσης μη-ιστόνης υποστρώματα FOXO1, FOXO3 και p53 με SIRT1 [11]. Ωστόσο, ο ακριβής ρόλος της SIRT2 παραμένει άπιαστο στη βιολογία του καρκίνου.

Σε αυτό το πλαίσιο, ερευνήσαμε αν tenovin-6, μια ένωση μικρού μορίου που αναστέλλει τις λειτουργίες SIRT1 και SIRT2 [15], [16], που ασκείται αντικαρκινική επιδράσεις μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού ρ53 σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι η SIRT αναστολείς πάνω ρυθμισμένα τον υποδοχέα θανάτου 5 (DR5), ένα μέλος της οικογένειας υποδοχέα παράγοντα νέκρωσης όγκου, σε μερικούς καρκίνους [17], [18]. Μελετήσαμε επιπλέον την εμπλοκή αυτού του υποδοχέα στην αντικαρκινική δραστικότητα του tenovin-6 για καρκίνο του στομάχου. Επιπλέον, εξετάσαμε την συνέργεια των tenovin-6 με τα συμβατικά κυτταροτοξικά φάρμακα για τη μελλοντική κλινική ανάπτυξη σε καρκίνο του στομάχου.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Επτά γαστρικού καρκίνου κυτταρική σειρές χρησιμοποιήθηκαν: τέσσερις κυτταρικές σειρές με wt

ΤΡ53

(ΜΚΝ-45, NUGC-4, STKM-2, SNU-1), δύο κυτταρικές σειρές με μεταλλαγμένο τύπου (mt)

ΤΡ53

(NUGC-3, STKM-1), και μία κυτταρική σειρά με μηδενική

TP53

(KatoIII) [19] – [21]. Κυτταρικές σειρές με wt

ΤΡ53

(MCF-7 καρκίνου του μαστού, ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα ΗΕΚ293) και MRC-5 φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών συμπεριλήφθηκαν ως έλεγχοι σε αυτή τη μελέτη. ΜΚΝ-45, NUGC-4, KatoIII, και MRC-5 κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από RIKEN BRC Τράπεζας Κυττάρων (Tsukuba, Japan). SNU-1 και MCF-7 κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD). κυτταρικές σειρές NUGC-3 και ΗΕΚ293 ελήφθησαν από την Υγεία Science Research Τράπεζα Πόρων (Osaka, Japan). STKM-2 κυτταρικές σειρές STKM-1 και ευγενικά από τον Dr. Σουνσούκε Yanoma (Yokohama City University, School of Medicine, Ιαπωνία).

Χημικά

Tenovin-6 αγοράστηκε από την Cayman Chemical Η εταιρεία (Ann Arbor, MI). Docetaxel, SN-38, σισπλατίνη, 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), η δοξορουβικίνη και θαψιγαργίνη ελήφθησαν από την Wako (Osaka, Japan). Αυτά διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) σε συγκέντρωση 20 mM και δείγματα φυλάχθηκαν στους -20 ° C. Στοκ διαλύματα αραιώθηκαν στις επιθυμητές τελικές συγκεντρώσεις με μέσο ανάπτυξης πριν από την χρήση.

Αντισώματα και ανάλυση Western blot

ηλεκτροφόρηση SDS-polyaclylamidegel και κηλίδωση Western έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Τα πρωτεύοντα και δευτερεύοντα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως ακολούθως. Πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι SIRT1 (D739), ακετυλιωμένο (Ac) -ρ53 (Lys382), φωσφορυλιώνεται (Phospho) -ρ53 (Ser15), Bcl-2, Ac-α-τουμπουλίνης (Lys40), υποδοχέα θανάτου 5 (DR5), Fas αντισώματα -associated περιοχή θανάτου (FADD), διασπάται πολυ (ADP) ριβόζης πολυμεράσης (PARP) (Asp214), και μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι ρ21

Waf /Cip1

(DCS60), ιστόνης Η3 (96C10) , β-ακτίνη (8H10D10), α-τουμπουλίνης (DM1A) και Ο /ΕΒΡ ομόλογο πρωτεΐνης (CHOP) (L63F7), και μονοκλωνικά αντισώματα κουνελιού εναντίον TRAIL (C92B9), κασπάσης-3 (8G10), ινοσιτόλη-απαιτώντας ένζυμο (IRE ) 1α (14C10), και φωσφο-RNA-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση που μοιάζει ενδοπλασματικό κινάσης δίκτυο (PERK) (16F8) ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού για ρ53 (BP53-12) αγοράστηκε από την Cell Science (Canton, ΜΑ), αντι-SIRT2 (4B11) μονοκλωνικό αντίσωμα ήταν από τη Sigma-Aldrich. (St. Louis, ΜΟ), και αντι-παράγοντα ενεργοποίησης μεταγραφής μονοκλωνικού αντισώματος 6 (ATF6) (70B1413.1) ήταν από Enzo Life Science (Farmingdale, ΝΥ). Κουνέλι πολυκλωνικό αντίσωμα προς Ac-ιστόνης Η3 (Lys18) ήταν από την Merck Millipore (Billerica, ΜΑ). Τόσο υπεροξειδάση (HRP) αντι-ποντικού IgG προβάτου και αντι-κουνελιού γαϊδάρου IgG οροί ήταν από GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). σύνδεση αντισώματος ανιχνεύθηκε με τη χρήση ενός ECL Prime Western Blotting Σύστημα Ανίχνευσης (GE Healthcare), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ένταση του σήματος ήταν ποσοτικά με τη χρήση Ez-σύλληψη II σύστημα απεικόνισης χημειοφωταύγειας (Atto, Tokyo, Japan).

Real-time ποσοτική PCR για την ανάλυση των

SIRT1

και

SIRT2

έκφραση γονιδίων

δείγματα RNA που εξάγεται από κυτταρικό λύμα χρησιμοποιώντας ένα υψηλής καθαρότητας κιτ απομόνωσης RNA (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αφού το γενωμικό DNA απομακρύνθηκε με DNase, παρασκευάστηκε cDNA χρησιμοποιώντας ένα υψηλής χωρητικότητας RNA-to-cDNA kit (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα Applied Biosystems 7500 Fast PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Εκκινητές και ανιχνευτή TaqMan για

SIRT1

και

SIRT2

ελήφθησαν από την Applied Biosystems (Δοκιμασία ID: Hs01009005 και Hs00247263, αντίστοιχα), καθώς και εκείνα για

18S ριβοσωμικού RNA (18S rRNA)

σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν από την Sigma-Aldrich ήταν ως εξής: 5′-AACCCGTTGAACCCCATTCG (εμπρόσθιος εκκινητής), 5′-CGGGCGGTGTGTACAAAGG (αντίστροφο εκκινητή), 5′-AACGCAAGCTTATGACCCGCACTTACTGG (ανιχνευτή). Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν κάτω από πρότυπες συνθήκες θερμικού κύκλου χρησιμοποιώντας 30 ng του cDNA, 900 ηΜ εκκινητών, 250 ανιχνευτές ηΜ, και μια έκφραση Taqman Gene Master Mix (Applied Biosystems), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

RNAs εκχυλίζεται από τα κύτταρα αναλύθηκαν για τις σχετικές ποσότητες του γονιδίου-στόχου (

SIRT1, SIRT2

) και το γονίδιο αναφοράς (

18S rRNA

) με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου.

δοκιμασίες WST-8 κυτταρικής βιωσιμότητας

WST-8 χρωματομετρικές δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο Μετρώντας Kit-8 (Dojin Laboratories, Kumamoto, Japan), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο με 100 μΙ μέσου καλλιέργειας για 24 ώρες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με tenovin-6 επί 72 ώρες, επωάστηκαν παρουσία του WST-8, και στη συνέχεια αναλύθηκαν με έναν αναγνώστη μικροπλάκας iMark (Bio-Rad, Hercules, CA).

Ανάλυση απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πιάτα 60-mm σε πυκνότητα 5 × 10

5 ανά πιάτο. Μετά την επώαση με tenovin-6 (10 μΜ) ή ισοδύναμη ποσότητα DMSO για 72 ώρες, τα κύτταρα ήπια άρση με Accutase (US Biotechnologies, Parker Ford, ΡΑ) σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν μία φορά με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό. Τα αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με διπλή χρώση με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) -σημασμένου αννεξίνης V χρησιμοποιώντας ένα αννεξίνης V-FITC Apoptosis Detection Kit (Beckman Coulter, Brea, CA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια με μια ροή FACS Calibur κυτταρομετρητή (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) και το λογισμικό CELLQuest (BD Biosciences).

siRNA που στοχεύει

DR5

Η

siRNA DR5 στόχευσης σχεδιάσθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό siDirect (https://sidirect2.rnai.jp/), όπως έχει ήδη αναφερθεί [22]. siRNA διαμόλυνση διεξήχθη χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Έλεγχος siRNA ήταν μια τεχνητή αλληλουχία σχεδιάζεται για να έχει το λιγότερο ομολογία με την ανθρώπινη και ποντικού γονίδια. Οι νόημα και αντινόημα κλώνους του siRNA που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν ως ακολούθως: DR5, 5′-CCGUUUGUGCGUACUUUGAGA-3 ‘(νοηματικό), 5′-UCAAAGUACGCACAAACGGAA-3′ (antisense)? ελέγχου siRNA, 5’-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3 ‘(νοηματικό), 5′-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3’ (antisense).

Για την ανάλυση των αποτελεσμάτων της siRNA επί της κυτταρικής ανάπτυξης και βιωσιμότητας, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα (1 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο) σε πλάκες 96 φρεατίων που περιέχουν 100 μΐ μέσου ΚΡΜΙ1640 με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Sigma-Aldrich). Η βιωσιμότητα των επιμολυσμένων κυττάρων εκτιμήθηκε 72 και 120 ώρες μετά την επιμόλυνση με WST-8 δοκιμασία.

δείκτη συνδυασμού

Για να καθοριστεί εάν tenovin-6 μπορεί να ενισχύσει τα αποτελέσματα κατά του όγκου των συμβατικών χημειοθεραπευτικών παραγόντων, μπορούμε χρησιμοποίησαν ένα δείκτη συνδυασμού (CI) και ένα ισοβολόγραμμα που υπολογίζεται χρησιμοποιώντας το λογισμικό CalcuSyn (Cambridge, UK), σύμφωνα με την αρχή μέσου αποτελέσματος των Chou και Talalay [23]. Σε αυτή την ανάλυση, CI & gt? 1.3 υποδεικνύει ανταγωνισμό? CI = 1,1-1,3 μέτρια ανταγωνισμό? CI = 0,9-1,1 προσθετικό αποτέλεσμα? CI = 0,8-0,9 μικρή συνέργεια? CI = 0,6-0,8 μέτρια συνέργεια? CI = 0,4-0,6 συνέργεια? και CI = 0,2-0,4 ισχυρή συνέργεια.

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). Η σημασία των διαφορών προσδιορίστηκε με t-test του Student και δοκιμής Dunnett.

ρ-τιμές

& lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

Έκφραση των SIRT1, SIRT2, και ακετυλιωμένα (Ac) -ρ53 σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου

.

Κατ ‘αρχάς, εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης του SIRT1, SIRT2, και Ac-p53 σε επτά κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Χρησιμοποιήσαμε ΗΕΚ293 κυττάρων για τον θετικό μάρτυρα της SIRT1 /2, και τα κύτταρα MCF-7 σε επεξεργασία με δοξορουβικίνη για τον θετικό μάρτυρα Ac-p53 [24]. Όλες οι κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, εκτός από NUGC-4 και τα κύτταρα STKM-1 εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του SIRT1 πρωτεΐνης, και τα επίπεδα έκφρασης SIRT2 ήταν χαμηλά σε όλες τις κυτταρικές σειρές εκτός από τα ΜΚΝ-45 κύτταρα (Σχήμα 1Α). επίπεδα έκφρασης Ac-p53 ήταν πολύ χαμηλές σε όλες τις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου με wt

ΤΡ53

Η

Α:. Η έκφραση του SIRT1, SIRT2, ρ53, Ac-p53, και φωσφο-53 σε επτά κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και MRC-5 ινοβλάστες εξετάστηκε με κηλίδωση Western. Ημι-ποσοτικοποίηση της πυκνομετρίας κηλίδωση Western εμπλέκονται ομαλοποίηση σε β-ακτίνη επίπεδα. MCF-7 *: MCF-7 κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με δοξορουβικίνη (1 μΜ, 24 ώρες). Β: Έκφραση του

SIRT1

mRNA και

SIRT2

mRNA σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Επίπεδα

SIRT1

mRNA και

SIRT2

mRNA προσδιορίστηκαν σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα και MRC-5 ινοβλάστες μέσω ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου και κανονικοποιήθηκε ως προς το επίπεδο του

18S rRNA

. Τα επίπεδα mRNA φαίνονται σε σχέση με εκείνες του MRC-5 ινοβλάστες.

Η

Εμείς αναλύσαμε την έκφραση γονιδίων του

SIRT1

και

SIRT2

με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR. ΜΚΝ-45 κύτταρα εμφάνισαν

SIRT1

γονιδιακής έκφρασης που ήταν περίπου 2,5 φορές υψηλότερη από ότι σε ινοβλάστες, αλλά και άλλες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου όχι (Εικόνα 1Β). Σε NUGC-4 κύτταρα, το επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης του

SIRT1

ήταν χαμηλή, καθώς ήταν πρωτεΐνη SIRT1. ΜΚΝ-45 κύτταρα έδειξαν ελαφρώς υψηλό

SIRT2

γονιδιακής έκφρασης, ενώ άλλες κυτταρικές σειρές έδειξαν μάλλον χαμηλά επίπεδα έκφρασης.

Tenovin-6 ανέστειλε την ανάπτυξη των γαστρικών καρκινικών κυττάρων

Για να επιβεβαιώσει tenovin-6 δραστηριότητα, μελετήσαμε αν tenovin-6 επηρέασαν την ακετυλίωση της ιστόνης Η3 και α-τουμπουλίνης. Tenovin-6 αύξησε την ακετυλίωση της ιστόνης σε τρία (ΜΚΝ-45, NUGC-4, και KatoIII) των τεσσάρων γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, υποδεικνύοντας την αναστολή της δραστηριότητας αποακετυλίωσης SIRT1 (Σχήμα 2Α). Ac-α-τουμπουλίνης αυξήθηκε μόνο σε μία κυτταρική σειρά (ΜΚΝ-45) κατεργάζεται με tenovin-6, ως εκ τούτου, η αναστολή της δραστικότητας αποακετυλίωσης SIRT2 δεν μπορούσε να αποδειχθεί οριστικά στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα

Α:. Γαστρικό καρκινικά κύτταρα ήσαν καλλιεργήθηκαν με tenovin-6 (10 μΜ) για διάφορες χρονικές περιόδους και αναλύθηκε για τα επίπεδα των SIRT1, SIRT2, Ac-Η3, και Ac-α-τουμπουλίνης με κηλίδωση Western. Β: Tenovin-6 ανέστειλε την ανάπτυξη των γαστρικών καρκινικών κυττάρων, ανεξάρτητα από το

ΤΡ53

κατάστασης. Όλα τα πειράματα αξιολογήθηκε με WST-8 δοκιμασία και εκτελούνται εις τριπλούν. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. C: WST-8 δοκιμασία πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα MRC-5 για να συγκριθεί η τοξικότητα των tenovin-6 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Η αναστολή της ανάπτυξης των tenovin-6 στο NUGC-4 κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε κύτταρα MRC-5. Η σημασία των διαφορών εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας t-test του Student.

Η

Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε τη δυνητική επίδραση κατά του όγκου του tenovin-6 έναντι του γαστρικού καρκινικών κυττάρων. Κάθε γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή εκαλλιεργήθη παρουσία tenovin-6 (0.2, 1, 5, 10, 20, και 50 μΜ) επί τρεις ημέρες. Δόση εξαρτώμενη αναστολή της ανάπτυξης παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές, όχι μόνο εκείνους με wt

ΤΡ53

αλλά επίσης mt και μηδενική εκδόσεις (Σχήμα 2Β). IC

50 τιμές τους κυμαίνονταν 2,34 έως 4,28 μΜ. Επιπλέον, WST-8 δοκιμασία πραγματοποιήθηκε στη ανθρώπινη κυτταρική σειρά ινοβλαστών MRC-5 (IC

50: 6.09 μΜ) για να συγκριθεί η τοξικότητα των tenovin-6 σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Η βιωσιμότητα των NUGC-4 κύτταρα κατεργασμένα με tenovin-6 ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των MRC-5 κυττάρων, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2C.

Tenovin-6 που προκαλείται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α και S1, tenovin-6 η κατεργασία αύξησε την έκφραση της ρ53 και ρ21 σε βάρος

ΤΡ53

κύτταρα (ΜΚΝ45 και NUGC-4). Up-ρύθμιση του Ac-ρ53 φαίνεται στο ΜΚΝ-45 κύτταρα, αλλά όχι σε NUGC-4 κύτταρα. Αυξημένη έκφραση p21 παρατηρήθηκε επίσης σε mt

TP53

κύτταρα (NUGC-3). Αντίθετα, η έκφραση Bcl-2 δεν άλλαξε σχεδόν σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Αυξήσεις της τάξης του DR5 και διασπασμένης PARP έκφραση παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Τα επίπεδα της έκφρασης του TRAIL, η οποία λειτουργεί ως συνδέτης σε σηματοδότηση θανάτου σύζευξης, ήταν ελαφρώς αυξήθηκε σε όλες τις κυτταρικές γραμμές, αν και η έκφραση του ΡΑϋϋ, ένα σημαντικό προσαρμογέα, δεν επηρεάστηκε από tenovin-6.

Α : ανάλυση χρονική πορεία της έκφρασης του p53, p21 κατάντη μόριο του

Waf /Cip1

, και την απόπτωση που σχετίζονται με μόρια στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με tenovin-6 (10 μΜ). Σχετική ένταση της έκφρασης των πρωτεϊνών »παρουσιάζεται στο Σχήμα S1. Tenovin-6 που προκαλείται από την έκφραση του Ac-p53 και p21

Waf /Cip1

, αλλά όχι bcl-2. έκφραση DR5 έντονα επάγεται από tenovin-6. TRAIL, και διασπασμένη PARP αυξήθηκαν ελαφρά, αλλά η έκφραση FADD δεν επηρεάστηκε. Μια διπλή DR5 δείχνει προδρόμου του (άνω ζώνη) και ώριμα ισομορφές (κάτω ζώνη). Β: Τέσσερις κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με tenovin-6 (10 μΜ) ή ένα μάρτυρα φορέα για 72 ώρες, διπλή-χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-αννεξίνης V και ΡΙ, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας t-test του Student. *

σ

& lt? 0,01? **

σ

& lt?. 0.05

Η

Εμείς εξέτασε κατά πόσον tenovin-6 μείωσε τη βιωσιμότητα των γαστρικών καρκινικών κυττάρων μέσω της επαγωγής της αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Τα καρκινικά κύτταρα εκτέθηκαν σε αυτό σε συγκέντρωση 10 μΜ ή μία ισοδύναμη ποσότητα οχήματος ελέγχου (DMSO) για 72 ώρες, και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-αννεξίνης V και ΡΙ. Αυτά αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής: Κύτταρα αρνητικά τόσο για αννεξίνη V και ΡΙ θεωρήθηκαν ως μη αποπτωτικά κύτταρα θετικά για αννεξίνη V μόνο θεωρήθηκαν πρώιμων αποπτωτικών και τα κύτταρα θετικά τόσο για αννεξίνη V και ΡΙ θεωρήθηκαν να είναι αργά αποπτωτικών ή νεκρωτικές. Η έκθεση των ΜΚΝ-45 κυττάρων σε tenovin-6 αύξησε τις κλάσματα πρώιμης και όψιμης φάσεις της απόπτωσης από 2,8% έως 52,1% και από 1,8% έως 18,5%, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β). Παρόμοιες αυξήσεις στους πληθυσμούς σε πρώιμη και όψιμη φάσεις της απόπτωσης παρατηρήθηκαν σε άλλες κυτταρικές γραμμές (NUGC-4, NUGC-3, και KatoIII). Tenovin-6 απόπτωση που επάγεται σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, ανεξάρτητα από το

TP53

κατάσταση.

Επίδραση του

DR5

νοκ ντάουν για tenovin-6-επαγόμενη απόπτωση

στη συνέχεια, για να εξακριβώσει αν

DR5

σίγηση επηρεάζονται tenovin-6-επαγόμενη απόπτωση, τη βιωσιμότητα των κυττάρων και αποπτωτικών ποσοστό αναλύθηκαν με WST-8 δοκιμασίας και κυτταρομετρία ροής, αντίστοιχα, σε ποσοστό

ΤΡ53

-null κύτταρα KatoIII. Η αναστολή της έκφρασης DR5 με ειδικά siRNA (Σχήμα 4Α) μείωσε σημαντικά tenovin-6-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο και απόπτωση σε κύτταρα KatoIII (Σχήμα 4Β και 4C). Χρησιμοποιήσαμε τρία διαφορετικά siRNAs στο προκαταρκτικό πείραμα μας, και πήραμε τα παρόμοια αποτελέσματα με οποιαδήποτε siRNAs

Α:. Κύτταρα KatoIII επιμολύνονται με 1 ελέγχου ηΜ siRNA ή siRNA εναντίον DR5 mRNA. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ tenovin-6 επί 24 ώρες. Western κηλίδωση έδειξε την προς τα κάτω ρύθμιση του DR5 με siRNA διαμόλυνση. Μια διπλή DR5 δείχνει προδρόμου του (άνω ζώνη) και ώριμα ισομορφές (κάτω ζώνη). Β: Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον έλεγχο 1 ηΜ siRNA ή DR5 siRNA για 48 ώρες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0,2, 1 και 5 μΜ tenovin-6 επί 72 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε μετρήσεις κυτταρικής βιωσιμότητας με WST-8 δοκιμασίας. Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας t-test του Student. *

σ

& lt? 0,01? **

σ

& lt? 0,05. C: Η επίδραση του DR5 knockdown επί tenovin-6 απόπτωση που επάγεται αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας χρώση ΡΙ. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας t-test του Student.

Η

Ερευνήσαμε ενεργοποίηση της οδού στρες ενδοπλασματικό δίκτυο (ER), ο οποίος συνδέεται με DR5 πάνω ρύθμιση, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [ ,,,0],17]. CHOP είναι ένα από τα πιο ισχυρός επαγωγέας του DR5 και ανάντη της απόπτωσης, και συχνά απελευθερώνονται κατά τη διάρκεια στρες ER. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α και 5Β, αν και CHOP ήταν οριακά πάνω ρυθμισμένα με tenovin-6 θεραπεία και στις τέσσερις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, τα αυξημένα επίπεδα ήταν σημαντικά χαμηλότερες από ότι σε κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με θαψιγαργίνη, το οποίο είναι ένας εκλεκτικός αναστολέας της σαρκοπλασματικού /ενδοπλασματικό δίκτυο Ca

2+ – ΑΤΡασών και χρησιμοποιείται ευρέως ως ένα κυτταρικό στρεσογόνο ER [25], [26]. Από την άλλη τα χέρια, IRE1, η οποία είναι ένας αισθητήρας στρες ER και βρίσκεται στο ανάντη του CHOP, ήταν ελαφρώς πάνω-ρυθμίζεται από tenovin-6 θεραπεία σε όλες τις κυτταρικές σειρές, αλλά όχι φωσφορυλιωμένη PERK και ATF6. [27], [28]. Φαινόταν απίθανο ότι tenovin-6 που προκαλείται ER στρες που οδηγεί στην επαγωγή DR5 στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα μας

Α:. Έκφραση πρωτεϊνών που σχετίζονται με το στρες ER σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου πριν και μετά τη θεραπεία με 10 μΜ tenovin-6 . Θαψιγαργίνη στα 3 μΜ χορηγήθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ293 ως μάρτυρας. Μια διπλή DR5 δείχνει προδρόμου της και ώριμη ισομορφών. Β: Σχετική ένταση της έκφρασης του CHOP σε κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν δείχνεται. Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία του Dunnett.

Η

Αντικαρκινική δράση του tenovin-6 σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες

Τέλος, εξετάστηκε εάν tenovin-6 ενίσχυσε την αντινεοπλασματική επιδράσεις χημειοθεραπευτικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων docetaxel, SN-38, σισπλατίνη, και 5-FU, σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Τέσσερις κυτταρικές σειρές με βάρος

TP53

(ΜΚΝ-45, NUGC-4), mt

TP53

(NUGC-3), και μηδενική

TP53

(KatoIII) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυτούς τους παράγοντες μόνο του ή σε συνδυασμό με δύο δόσεις (2 και 5 μΜ) tenovin-6. Οι συγκεντρώσεις ήταν 0.25 ηΜ docetaxel, 1 ηΜ SN-38, 0,5 ή 1 μΜ cisplatin, και 0,25 μΜ 5-FU. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1 (και στο Σχήμα S2), docetaxel και SN-38 παρουσίασε μικρή έως μέτρια συνεργιστική επίδραση στην tenovin-6 θεραπεία σε τρεις κυτταρικές σειρές, και σισπλατίνη με tenovin-6 έδειξε μία μέτρια συνεργιστική δράση σε δύο κυτταρικές σειρές, ενώ 5-FU σε συνδυασμό με tenovin-6 έδειξε ένα χαμηλότερο αποτέλεσμα από τους άλλους παράγοντες. Εξετάσαμε τις εκφράσεις του DR5 μετά από χορήγηση tenovin-6 με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. DR5 πάνω ρύθμιση από tenovin-6 ενισχύθηκε με ένα συνδυασμό της docetaxel σε ΜΚΝ-45 κύτταρα (Σχήμα S3).

Η

Συζήτηση

Έχουμε αποδείξει ότι tenovin-6 παρουσίασαν ισχυρή αντικαρκινική δραστηριότητα συνοδεύεται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο κυττάρων με wt

ΤΡ53

καθώς και εκείνα με mt

ΤΡ53

. Αρκετοί ειδικοί αναστολείς sirtuins, όπως sirtinol, σουραμίνη, salermide, και thiobarbiturates, αναφέρθηκαν να αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων σε διάφορους τύπους καρκίνου [29]. Οι περισσότεροι ερευνητές περιέγραψαν τα αποτελέσματα κατά του όγκου των αναστολέων sirtuin σε κυτταρικές σειρές με wt

ΤΡ53

[15], [29] – [31], και απέδωσαν στην ενεργοποίηση της απόπτωσης μέσω ακετυλίωσης του p53. Εν τω μεταξύ, αρκετές αναφορές έχουν δημοσιευθεί τα τελευταία χρόνια που έδειξε τις αντικαρκινικές δράσεις των αναστολέων sirtuin σε κυτταρικές σειρές με mt

TP53

μέσω p53-ανεξάρτητων οδών [17], [18]. Δείξαμε ότι DR5 knockdown εξασθενημένα τα αποτελέσματα κατά του όγκου του tenovin-6 σε

ΤΡ53

-null γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Η ενεργοποίηση της οδού του σήματος του υποδοχέα θανάτου μέσω up-ρύθμιση του DR5 παίζει κεντρικό ρόλο στην tenovin-6-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, όπως αναφέρεται και σε άλλες εκθέσεις σχετικά με sirtuin αναστολείς.

Έχει αναφερθεί ότι salermide αυξημένη έκφραση του DR5 και απόπτωση που επάγεται σε ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου κυττάρων που φέρουν mt

ΤΡ53

[17]. Στην εν λόγω έκθεση, η ταυτόχρονη αποσιώπηση των

SIRT1

και

SIRT2

καθώς salermide up-ρυθμίζονται DR5, που συνοδεύεται από το up-ρύθμιση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με το στρες ER, όπως ATF4 και ψιλοκόψτε. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ER στρες που εμπλέκονται σε αυτή την πρόκληση DR5. Έχουμε σκεφτεί ότι tenovin-6 οδήγησε επίσης σε αύξηση της έκφρασης DR5 μέσω ενεργοποίησης του ER στρες που προκαλείται από PERK, IRE1, ATF6, και ψιλοκόψτε. Ωστόσο, αντίθετα με τις προσδοκίες, το σηματοδοτικό μονοπάτι του ER στρες ενεργοποιείται από tenovin-6 δεν ήταν προφανώς ανιχνευθεί. Παρ ‘όλα αυτά, υπήρχαν σαφείς ενδείξεις ότι DR5 προκλήθηκε από tenovin-6. Υπάρχουν και άλλα μονοπάτια της CHOP μεσολάβηση DR5 πάνω ρύθμιση: αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), το c-Jun NH

2-τερματικής κινάσης (JNK) μονοπάτι, το ρ38 ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης, και ούτω καθεξής [ ,,,0],32] – [38]. Ωστόσο, δεν εξετάσουμε αυτά τα μονοπάτια εδώ γιατί δεν μπόρεσε να εντοπίσει την ενεργοποίηση CHOP στη μελέτη μας. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι άλλες ρ53- και CHOP-ανεξάρτητες οδούς συμμετέχουν στην έκφραση DR5 tenovin-6 που προκαλείται στη γαστρική καρκινικά κύτταρα.

απέδειξαν ότι tenovin-6 που προκαλείται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού DR5. Ωστόσο, p53 και ψιλοκόψτε μονοπάτια φαινόταν απίθανο να συμμετέχουν σε αυτή την πρόκληση DR5, και ο μηχανισμός του DR5 παραμένει ασαφής πάνω ρύθμιση. Έχουμε, πρόσφατα, διερευνήθηκε κατά του όγκου αποτελέσματα του tenovin-6 σε αρκετές κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου, και βρέθηκε ισχυρή αντικαρκινική δράση του έναντι των περισσότερων από αυτά με τα πάνω ρύθμιση του DR5 καθώς [39]. Ωστόσο, σε CaCo2 καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα (mt

TP53

), αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο από tenovin-6 ήταν λιγότερο εμφανής και της έκφρασης DR5 δεν ήταν έντονα up-ρυθμίζεται. CaCo2 κύτταρο έχουν αναφερθεί ότι εκφράζουν υψηλά επίπεδα πρωτεϊνών θερμικού σοκ είναι γνωστή ως καταστολέας του DR5 [40] – [43]. Αυτή η σχέση θα πρέπει να μελετηθεί περαιτέρω στο μέλλον. SIRT1 μπορεί deacetylate της ιστόνης Η4 λυσίνη 16 (H4K16), καθώς και H3K9, H3K14 και H1K26, οι οποίες συνδέονται στενά με την αδρανοποίηση των γονιδίων [11]. Επιπλέον, έχει πολλές αντίστοιχες μη-ιστόνης υποστρώματα: μεταγραφικών παραγόντων, στοιχεία μηχανήματα επιδιόρθωση του DNA, πυρηνικοί υποδοχείς, ένζυμα ιστόνης τροποποιητικά, και κυτταρικής σηματοδότησης μόρια, όπως περιγράφεται αλλού [11] – [13]. Αυτές οι πολλές και πολύπλοκες ενώσεις της δραστηριότητας SIRT1 που εμπλέκονται σε διάφορες βιολογικές λειτουργίες, όπως η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και επιδιόρθωση του DNA βλάβη. Τα καρκινικά κύτταρα έχουν την τάση να απαιτούν αυτές τις λειτουργίες της SIRT1, προκειμένου να επιβιώσουν, πολλαπλασιάζονται, και την επισκευή καταστροφική γονιδιωματική βλάβη. Πρόσφατες μελέτες έχουν προσδιορίσει την ικανότητα των tenovin-6 να επάγει διαφοροποίηση και αναστέλλουν autophagy ως μέρος της αντι-νεοπλασματικές επιδράσεις του στα κύτταρα λευχαιμίας [44], [45]. Μπορεί να εξαρτάται από τη συμπεριφορά των κυττάρων του καρκίνου του πώς tenovin-6 επηρεάζει την νεοπλασματική δραστηριότητα. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ της tenovin-6-μεσολάβηση της οδού του θανάτου και των πολύπλοκων ρόλους της SIRT1.

εξέτασαν τις επιδράσεις του συνδυασμού docetaxel, SN-38, σισπλατίνη και 5-FU με tenovin -6 επειδή έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη θεραπεία ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του στομάχου [46], [47]. Ελαφρά έως μέτρια συνεργιστικά αποτελέσματα της docetaxel και SN-38 με tenovin-6 στις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, ανεξάρτητα από το

TP53

κατάσταση, βρέθηκαν.

Αν και θεραπείες που περιλαμβάνουν συνδυασμούς της docetaxel και sirtuin αναστολείς δεν έχουν αναφερθεί, έχουν συνδυασμούς docetaxel και άλλων αναστολέων HDAC όπως τριχοστατίνη Α και σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (SAHA) έχουν αναφερθεί ότι έχουν συνεργιστικές επιδράσεις που σχετίζονται με την ενεργοποίηση της κασπάσης ή τουμπουλίνης ακετυλίωση σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές [48] – [50] . Στη μελέτη μας, παραμένει ασαφές εάν η τουμπουλίνης ακετυλίωση από tenovin-6 επηρεαστεί πάντα την αντικαρκινική δράση, επειδή η ακετυλίωση της τουμπουλίνης φάνηκε μόνο σε μία κυτταρική σειρά. SN-38 (η ενεργή μορφή της ιρινοτεκάνης) είναι ένας αναστολέας DNA τοποϊσομεράσης Ι που δρα μόνο κατά τη διάρκεια της φάσης S και αλληλεπιδρά με την αντιγραφή του DNA και την κυτταρική διαίρεση [51], [52]. Οι αναστολείς HDAC επάγουν ακετυλίωση των ιστονών και να χαλαρώσει τη δομή της χρωματίνης, την οποία αναστολέας τοποϊσομεράσης μπορεί πιο εύκολα να έχουν πρόσβαση DNA, διευκολύνοντας την βλάβη του DNA [51], [53]. Επιπλέον, μια αξιοσημείωτη αύξηση της παραγωγής ROS έχει αναφερθεί σε μικρό-κυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων κατά την ταυτόχρονη έκθεση σε SAHA και τοποτεκάνη (ένα παράγωγο της καμπτοθεκίνης) [51]. Η αυξημένη δραστικότητα της θεραπείας συνδυασμού tenovin-6 και SN-38 θα μπορούσε να αποδοθεί σε συνεργατική ρύθμιση της απόκρισης βλάβης του DNA.

Το πλεονέκτημα της συνδυασμένης θεραπείας με tenovin-6 και cisplatin ή 5-FU ήταν μικρότερη από εκείνη με τους άλλους παράγοντες σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα, αν και αρκετές αναφορές έχουν αποδείξει την ενίσχυση της απόπτωσης με συνδυασμένη θεραπεία με σισπλατίνη ή 5-FU και άλλοι αναστολείς HDAC σε άλλους όγκους [54] – [57].

Όσον αφορά το αξιολόγηση της τοξικότητας της tenovin-6, χρησιμοποιήσαμε ένα κυτταρική σειρά ινοβλαστών όπως οι εναλλακτικές μη ογκογόνα κύτταρα για να προβλέψει την τοξικότητα έναντι φυσιολογικών κυττάρων αναφερόμενος στις προηγούμενες εκθέσεις [15], [18]. Ήταν δύσκολο να βρεθεί μια κατάλληλη κανονικό έλεγχο για συγκριτικές μελέτες, και, επομένως, οριστικά απαιτούνται για τη μελέτη της τοξικότητας των tenovin-6 (σε συνδυασμό με αντικαρκινικά φάρμακα)

in vivo

, χρησιμοποιώντας μοντέλα ξενομοσχεύματος ζώων.

Εν κατακλείδι, ένας αναστολέας sirtuin, tenovin-6, έδειξε μια ισχυρή αντικαρκινική δράση κατά των ανθρώπινων γαστρικών καρκινικών κυττάρων. Αυτό ήταν ανεξάρτητο από

ΤΡ53

κατάσταση και επάχθηκε μέσω αυξητική ρύθμιση του DR5. Περαιτέρω μελέτη είναι απαραίτητη για να αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός με τον οποίο tenovin-6 ρυθμίζει την έκφραση του DR5.