Abstract

Thiacremonone (2, 4-διυδροξυ-2, 5-διμεθυλο-θειοφαινο-3-όνη) είναι ένα αντιοξειδωτικό ουσία ως μία νέα ένωση θείου που παράγεται από υψηλής θερμοκρασίας-υψηλής πίεσης που έλαβαν σκόρδο. Peroxiredoxin 6 (PRDX6) είναι ένα μέλος της υπεροξειδάσες, και έχει γλουταθειόνης υπεροξειδάσης και ασβέστιο-ανεξάρτητη φωσφολιπάση Α2 (iPLA2) δραστηριότητες. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι PRDX6 διεγείρει την ανάπτυξη των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα μέσω της αύξησης της δραστικότητας της γλουταθειόνης υπεροξειδάσης. Ένα μοντέλο σύνδεσης μελέτη και τραβήξτε προς τα κάτω ανάλυση έδειξε ότι thiacremonone ταιριάζει απόλυτα στην ενεργή θέση (Cys-47) της γλουταθειόνης υπεροξειδάσης της PRDX6 και αλληλεπιδρά με PRDX6. Έτσι, ερευνήσαμε αν thiacremonone αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων με το φράξιμο της γλουταθειόνης υπεροξειδάσης των PRDX6 στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, Α549 και ΝΟΙ-Η460. Thiacremonone (0-50 μg /ml) ανέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, μέσω επαγωγής αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο συνοδεύεται από επαγωγή της διασπασμένης κασπάσης-3, -8, -9, Bax, p21 και p53, αλλά μείωση του ΧΙΑΡ , CIAP και έκφραση Bcl2. Thiacremonone περαιτέρω ανέστειλαν δραστικότητα υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Ωστόσο, η ανασταλτική δράση ανάπτυξης κυττάρου του thiacremonone δεν παρατηρήθηκε στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα επιμολύνθηκαν με μεταλλαγμένο PRDX6 (C47S) και υπό την παρουσία διθειοθρεϊτόλης και γλουταθειόνης. Σε μια αλλομοσχεύματος in vivo μοντέλο, thiacremonone (30 mg /kg) επίσης ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου συνοδεύεται με τη μείωση της έκφρασης PRDX6 και δραστικότητα υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης, αλλά αυξημένη έκφραση του διασπασμένη κασπάση 3, -8, -9, Bax, p21 και p53 . Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι thiacremonone αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου μέσω αναστολής της δραστηριότητας της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης του PRDX6 μέσω της αλληλεπίδρασης. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι thiacremonone ενδέχεται να έχουν ευεργετικές επιδράσεις στον καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Jo M, Yun Η-Μ, Πάρκο Κ-R, Πάρκο ΜΗ, Lee DH, Cho SH, et al. (2014) Αντι-καρκίνο Επίδραση του Thiacremonone μέσω του κανονισμού Κάτω από Peroxiredoxin 6. PLoS ONE 9 (3): e91508. doi: 10.1371 /journal.pone.0091508

Επιμέλεια: Peiwen Φέι, Πανεπιστήμιο της Χαβάης Cancer Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Δεκ 2013? Αποδεκτές: 13 του Φλεβάρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 11 Μαρτίου του 2014

Copyright: © 2014 Jo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από την κυβέρνηση της Κορέας (MSIP) (Αρ MRC, 2008 – 0062275). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Peroxiredoxins (PRDXs) είναι μια οικογένεια υπεροξειδάσες όπως αντιοξειδωτικών ενζύμων [1] – [2]. Η οικογένεια PRDX περιλαμβάνει έξι μέλη. Αυτά χωρίζονται σε δύο κατηγορίες [3]. Το 2-Cys ομάδα περιλαμβάνει PRDX1-5, ενώ PRDX6 είναι μόνο ένα μέλος της ομάδας 1-Cys. PRDXs είναι μια οικογένεια υπεροξειδασών που καταστρέφουν υπεροξείδια χρησιμοποιώντας διατηρημένα υπολείμματα κυστεϊνης στον καταλυτικό κέντρο [4]. Μεταξύ των έξι μέλη των θηλαστικών της οικογένειας αυτής, PRDX6 είναι το μόνο μέλος που έχει υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης και ασβέστιο-ανεξάρτητη φωσφολιπάση Α2 (iPLA2) δραστηριότητες [5]. Ενώ άλλες PRDXs χρησιμοποιούν θειορεδοξίνης ως φυσιολογική αναγωγικό, PRDX6 χρησιμοποιεί γλουταθειόνη [6]. PRDX6 προστατεύει τα κύτταρα από μεμβράνη, DNA, πρωτεΐνη ζημιές, και λιπιδική υπεροξείδωση [7]. Το αντιοξειδωτικό στοιχείο απόκρισης (ARE) στην περιοχή prdx6 υποκινητή, ένα

cis-δράσης

στοιχείο ρυθμιστής, ενεργοποιείται από το οξειδωτικό στρες [8]. Η μεταγραφή του γονιδίου PRDX6 ρυθμίζεται από πυρηνικό παράγοντα ερυθροειδή 2 παράγοντες που συνδέονται με 1, 2, και 3 (Nrf1, Nrf2, και Nrf3) ως παράγοντες μεταγραφής μέσω δέσμευσης στην ARE [9]. Μεταξύ των Nrfs, Nrf2 ρυθμίζει θετικά τη μεταγραφή του γονιδίου PRDX6 [10].

Όπως PRDXs είναι αντιοξειδωτικά, υποστηρίζουν την επιβίωση και συντήρηση του όγκου με προστασία των κυττάρων από το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από απόπτωση [11]. Σε μια πρόσφατη μελέτη, πάνω από την έκφραση του PRDX 6 εξασθενεί σισπλατίνη απόπτωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [12]. Αντίθετα, η μείωση της έκφρασης PRDX6 αυξημένη υπεροξείδιο κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος [13]. Η εισβολή και η μετάσταση που προωθούν δράσεις PRDX6 έχει βρεθεί σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα μέσω ενεργοποίησης της Akt μέσω ενεργοποίησης του phosphoinositiede 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) και ρ38 κινάσης [4], [14]. Η δραστικότητα των PRDX6 συμβάλλει στην μεταστατική ικανότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα με διέγερση συστατικών εισβολή συμπεριλαμβανομένων ΡΙ3Κ, Akt, και υΡΑ [4]. Αναφέρθηκε επίσης ότι η έκφραση PRDX6 σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα ήταν σημαντικά σχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου [15].

Το σκόρδο έχει χρησιμοποιηθεί στην παραδοσιακή ιατρική ως συστατικό τροφίμου για την πρόληψη της ανάπτυξης του καρκίνου [16]. Thiacremonone (2,4-διυδροξυ-2,5-διμεθυλο-θειοφαινο-3-όνη) είναι ένα αντιοξειδωτικό ουσία, ως μία νέα ένωση θείου, που παράγεται από υψηλής θερμοκρασίας-υψηλής πίεσης (HTHP) κατεργασμένα σκόρδο [17]. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η επίδραση κατά του καρκίνου του thiacremonone μέσω της αναστολής της δραστικότητας υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης μέσω αλληλεπίδρασης σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Εκχύλιση και χαρακτηρισμός του thiacremonone

Η δομή μιας ένωσης θείου που απομονώνεται από σκόρδο (που ονομάζεται thiacremonone) παρουσιάζεται στα αποτελέσματα (Εικ. 1Α). Το σκόρδο (Allium sativum L) θερμάνθηκε σε θερμοκρασίες από 130 ° C για 2 ώρες. Τα θερμαινόμενα δείγματα juiced και στη συνέχεια διηθείται σε χοάνη Buchner υπό κενό. Θερμαινόμενη χυμός σκόρδου κατανεμήθηκε διαδοχικά σε μια διαχωριστική χοάνη με τη χρήση οξικού αιθυλεστέρα. Απομόνωση των ενώσεων από το στρώμα οξικού αιθυλεστέρα του θερμαινόμενου χυμός σκόρδου υποβλήθηκε σε χρωματογραφία στήλης επί πυριτικής πηκτής. Αυτό το κλάσμα που περιέχει thiacremonone καθαρίστηκε με παρασκευαστική RP-HPLC σε μία Younglin SP930D μέσο [17]. Thiacremonone επιλύθηκε σε 0,01% διμεθυλοσουλφοξείδιο, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία σε συγκεντρώσεις 10, 20, και 50 μg /ml σε κύτταρα καλλιέργειας.

(Α) Δομή του thiacremonone, ένα sulfurcompound απομονώνεται από το σκόρδο. (Β) Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη του PRDX6 επωάστηκε με thiacremonone-συζευγμένο Sepharose 4Β. (C) Ολόκληρο κυτταρολύματα των ΝΟΙ-Η460 επωάστηκαν με thiacremonone-συζευγμένο Sepharose 4Β. Μετά την καταβύθιση, τα επίπεδα του δεσμευμένου PRDX6 παρακολουθήθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western. (Δ) Μετά την καταβύθιση με thiacremonone-συζευγμένο Sepharose 4Β, τα επίπεδα των δεσμευμένων PRDX6 ή μεταλλαγμένων C47S PRDX6 παρακολουθήθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western. μοντέλο (Ε) εκπροσώπηση Κορδέλα σύνδεσης των thiacremonone με PRDX6 (F) μοντέλο σύνδεσης εκπροσώπηση Μοριακή επιφάνεια του thiacremonone με PRDX6.

Η

Cell Culture

Το Α549 και NCI-Η460 του καρκίνου του πνεύμονα γραμμές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Η CCD-18Co παχέος εντέρου φυσιολογική κυτταρική γραμμή και LL24 πνεύμονα φυσιολογική κυτταρική σειρά αγοράστηκαν από την κορεατική τράπεζα κυτταρική σειρά (Σεούλ, Κορέα). φυσιολογικά κύτταρα NCI-H460 και LL24 καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (100 U /ml). Α549 και CCD-18Co φυσιολογικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (100 U /ml). Οι κυτταρικές καλλιέργειες στη συνέχεια διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Για τον προσδιορισμό των αριθμών κυττάρων, Α549 και ΝΟΙ-Η460 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα ή CCD- 18Co κόλου φυσιολογική κυτταρική γραμμή και LL24 πνεύμονα φυσιολογική κυτταρική σειρά καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων (5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο). κύτταρα Υποσυρρέουσες στη συνέχεια σε επεξεργασία με thiacremonone (10, 20, και 50 μg /ml) για 72 ώρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις 1500 rpm, επαναιωρήθηκε σε 5 ml αλατούχου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS), και 0,1 ml 0,2% trypan blue προστέθηκε στο καρκινικό κύτταρο εναιώρημα σε καθένα από τα διαλύματα (0.9 ml το καθένα). Στη συνέχεια, μία σταγόνα αιωρήματος τοποθετήθηκε σε ένα θάλαμο Neubauer και τα ζωντανά καρκινικά κύτταρα μετρήθηκαν. Τα κύτταρα που έδειξαν σημάδια χρώσης θεωρήθηκαν νεκροί, ενώ εκείνοι που εξαίρεσαν κυανούν του τρυπανίου θεωρήθηκαν βιώσιμες. Κάθε δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν.

Η επιμόλυνση

πνεύμονα καρκινικά κύτταρα (5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και επιμολύνθηκαν παροδικά με PRDX6 siRNA ( Santa Cruz Biotechnology) ή pcDNA-PRDX6, (πλούσια δώρα από DR. Jhang Ho Pak, Πανεπιστήμιο Ουλσάν College of Medicine χρησιμοποιώντας ένα μείγμα Prdx6 siRNA ή pcDNA-Prdx6 και την WelFect-EX PLUS αντιδραστήριο OPTI-MEN, σύμφωνα με το τις προδιαγραφές του κατασκευαστή (WelGENE, Σεούλ, Κορέα).

λουσιφεράσης Δοκιμασία Δραστηριότητα

Α549 και ΝΟΙ-Η460 καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου πνεύμονα επιμολύνθηκαν με prdx6 προαγωγό-Luc πλασμίδιο χρησιμοποιώντας ένα μίγμα πλασμιδίου και το WelFect αντιδραστήριο EX PLUS σε ΟΡΤΙ-άνδρες, σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή (WelGENE, Σεούλ, Κορέα). Μετά από 6 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με thiacremonone. η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε με τη χρήση του κιτ δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega, Wisconsin, USA) σύμφωνα με με τις οδηγίες του κατασκευαστή (WinGlow, Bad Wildbad, Germany)

Ανάλυση Western Blot

Η μεμβράνη επωάστηκε για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με ειδικά αντισώματα:. πολυκλωνικά κουνελιού για PRDX6 και cIAP2 (1 :1,000 αραίωση, Abcam, plc. Cambridge UK), ΧΙΑΡ, Bcl2, κασπάσης-3, κασπάσης-9 (1:1,000 αραίωση, Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, ΜΑ), Βαχ (1:500 αραίωση, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) και μονοκλωνικά ποντικού για την p53, και κασπάσης-8 (1:1,000 αραίωση, Cell Signaling Technology, Inc.), ρ21 (1:500 αραίωση, Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Η κηλίδα στη συνέχεια επωάστηκε με το αντίστοιχο συζευγμένο αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού ανοσοσφαιρίνη G-υπεροξειδάσης αρμορακίας (1:2,000 αραίωση, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western ECL σύστημα ανίχνευσης.

υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης Δοκιμασία Δραστηριότητα

μίγμα GPx συν-υπόστρωμα, περιλαμβανομένου του φωσφορικού δινουκλεοτιδίου νικοτιναμιδίου-αδενίνης (NADPH), γλουταθειόνη, και η γλουταθειόνη αναγωγάση, χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της δραστικότητας της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης in vitro. Μία δοκιμασία GPx Kit αγοράστηκε από την Cayman Chemical (Michigan, USA) και οι διαδικασίες έγιναν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά την αγωγή των κυττάρων, αυτά ομογενοποιήθηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία, και μετρήθηκε η τιμή απορρόφησης στα 340 nm και κανονικοποιήθηκε ως προς τη συγκέντρωση πρωτεΐνης.

Molecular Modeling

Η κρυσταλλική δομή του PRDX6 (ΠΠ κωδικός 1prx) χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη σύνδεσης. Η thiacremonone χτίστηκε χρησιμοποιώντας ένα πάνελ κατασκευής Maestro. Η ένωση ελαχιστοποιηθούν χρησιμοποιώντας τη μονάδα επιπτώσεων της Maestro στην Σουίτα Πρόγραμμα Schrödinger. Η έναρξη συντεταγμένη της PRDX6 τροποποιήθηκε περαιτέρω για πρόσδεση πρόβλεψη του μοντέλου. Η δομή της πρωτεΐνης ελαχιστοποιείται με τη χρήση της πρωτεΐνης Wizard Προετοιμασία με την εφαρμογή ενός δυναμικού πεδίου OPLS. Για την παραγωγή αυτών πλέγμα, η θέση δέσμευσης ορίστηκε ως το κέντρο βάρους της Cys 47 εις την καταλυτική θέση του PRDX6. docking συνδέτη μέσα στην καταλυτική περιοχή της PRDX6 διεξήχθη χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα σύνδεσης Schrödinger, Glide. Η ελαχιστοποιείται διαμόρφωση του thiacremonone ήταν αγκυροβολημένο στο έτοιμο δίκτυο υποδοχέα. Οι καλύτερες-αγκυροβολημένο πόζες επιλέχθηκαν ως το αρχικό ομοιοπολικό μοντέλο του Cys 47 στην καταλυτική θέση του PRDX6 με thiacremonone. Οι ομοιοπολικούς συγκροτήματα περαιτέρω ελαχιστοποιηθούν χρησιμοποιώντας την πιο απότομη κάθοδο αλγόριθμο. Μοριακή γραφικών για το μοντέλο της thiacremonone ομοιοπολική σύνδεση δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας ένα πακέτο PyMol (https://www.pymol.org).

Τραβήξτε προς τα κάτω Δοκιμασία

Thiacremonone ήταν συζευγμένο με βρωμιούχο κυάνιο ( CNBr) ενεργοποιημένα Sepharose 4Β (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Εν συντομία, thiacremonone (1 mg) διαλύθηκε σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος σύζευξης (0,1 Μ NaHCO3 και 0,5 Μ NaCl, ρΗ 6,0). Η ενεργοποιημένη με CNBr Sepharose 4Β διογκώθηκε και πλύθηκε σε 1 mM HCl διαμέσου ενός πυροσυσσωματωμένου γυάλινου φίλτρου, στη συνέχεια πλένεται με το ρυθμιστικό διάλυμα ζεύξης. σφαιρίδια ΟΝΒΓ-ενεργοποιημένη Sepharose 4Β προστέθηκαν στο thiacremonone που περιέχει ρυθμιστικό σύζευξης και επωάστηκαν στους 4 ° C για 24 ώρες. Η thiacremonone συζευγμένο με Sepharose 4Β πλύθηκε με τρεις κύκλους εναλλασσόμενου ρΗ ρυθμιστικών διαλυμάτων πλύσης (ρυθμιστικό διάλυμα 1, 0,1 Μ οξικού και 0.5 Μ NaCl, ρΗ 4.0? Ρυθμιστικό 2, 0.1 Μ Tris-HCI και 0,5 Μ NaCl, ρΗ 8,0). Thiacremonone-συζευγμένα σφαιρίδια στη συνέχεια εξισορροπηθεί με ένα ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης (0,05 Μ Tris-HCl και 0.15 Μ NaCl, ρΗ 7.5). Οι ελέγχου μη συζευγμένο ΟΝΒΓ-ενεργοποιημένη Sepharose 4Β σφαιρίδια παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω σε απουσία thiacremonone. Το κυτταρόλυμα ή PRDX6 ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη (Abnova, Taipei, Ταϊβάν) αναμίχθηκαν με thiacremonone-συζευγμένο Sepharose 4Β Sepharose 4Β ή στους 4 ° C για 24 ώρες. Τα σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με TBST. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης SDS. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια επιλύονται με SDS-PAGE ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση με αντισώματα έναντι PRDX6 (1:1,000 αραίωση, Abcam, plc. Cambridge, UK).

Ηθική Δήλωση

Όλα τα πειράματα εγκρίθηκαν και πραγματοποιείται σύμφωνα με τον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων [επιτροπής Animal Care του Εθνικού Πανεπιστημίου της Chungbuk, Κορέα (CBNUA-436-12-02)].

Πείραμα ζώων

12- C57BL /6J-Tg (Prdx6) ποντικούς εβδομάδων αγοράστηκαν από την Jackson Lab (Maine, USA) και 12-εβδομάδων C57BL /6 ποντίκια αγοράστηκαν από Koatech (Pyeongtaek, Κορέα). Οι ποντικοί χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες. Lewis πνεύμονα καρκίνωμα κυττάρων (LLC) ενέθηκαν s.c. (1.2 × 10

6 καρκινικά κύτταρα /0,1 ml PBS /ζώο) με μια βελόνα 27 gauge. Μετά από 10 ημέρες, δύο ομάδες ποντικών (n = 10) ήταν ί.ρ. ένεση με thiacremonone (30 mg /kg σε PBS και 0,01% DMSO) δυο φορές την εβδομάδα για 3 εβδομάδες. Η ομάδα ελέγχου ποντικών (η = 20) υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα [PBS και 0,01% DMSO (ε.π.)]), δύο φορές την εβδομάδα για 3 εβδομάδες. Για υποδόρια όγκων το μέγιστο επιτρεπόμενο μέγεθος είναι 20 mm σε διάμετρο για ένα ποντίκι, έτσι μπορούμε θυσίασε όλα τα ποντίκια πριν διεξήχθη φθάνοντας το μέγιστο μέγεθος Εξάρθρωση για την ευθανασία.

Η ανοσοϊστοχημεία

Όλα τα δείγματα ιστού μονιμοποιήθηκαν σε φορμόλη και παραφίνη κλειστό για εξέταση. Τμήματα πάχους 4 μm βάφηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η , p , p & lt?. 0,05, σημαντικά διαφορετικά μεταξύ θεραπεία κυττάρων με thiacremonone και συν-επεξεργασμένα κύτταρα με DTT ή GSH και thiacremonone

thiacremonone ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου ίη νίνο αλλομοσχεύματος

Για να διευκρινιστεί η επίδραση κατά του όγκου των thiacremonone in vivo, την ανάπτυξη του όγκου σε αλλομοσχεύματος φέρουν ποντικούς μετά thiacremonone θεραπείες διερευνήθηκε. Σε μελέτες αλλομοσχεύματος LLC, thiacremonone χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά δύο φορές την εβδομάδα για 3 εβδομάδες σε ποντικούς. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε σε εβδομαδιαία βάση, και όλα τα ποντίκια θανατώθηκαν στο τέλος του πειράματος, όταν αποκόπηκαν και σταθμίζονται όγκους. Η ανασταλτική επίδραση του thiacremonone επί της ανάπτυξης όγκου πνεύμονα ήταν σημαντική και στα δύο μοντέλα αλλομοσχεύματος χρησιμοποιώντας C57BL /6J ποντικούς καθώς PRDX6 υπερεκφράζονται ποντίκια. Η σχετική ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε μετά τη θεραπεία του thiacremonone (30 mg /kg, η = 10). Η ανάπτυξη του όγκου σε C57BL /6J (όγκος όγκου? 8000,4 ± 2000,7 mm

3, όγκος ζυγίζουν? 4.7 ± 0.82 g) ποντικούς ήταν σημαντικά μειώθηκε κατά thiacremonone (όγκος όγκου? 4543,6 ± 731,1 mm

3, το βάρος του όγκου? 3,45 ± 0,31 g, Σχ. 6Α). Αυτή η ανασταλτική επίδραση βρέθηκε σε PRDX6 υπερεκφράζεται ποντίκια (όγκος του όγκου? 10.060,5 ± 1039,6 χιλιοστά

3 (Tg-έλεγχος) έναντι 5.048,9 ± 737,9 χιλιοστά

3 (Tg-thiacremonone), το βάρος του όγκου? 4,9 ± 0,21 g (Tg -Έλεγχος) έναντι 3,44 ± 0,78 g (Tg-thiacremonone), Σχ. 6Β). Η ανάλυση ανοσοϊστοχημείας του τμήματος του όγκου με Η &? Ε, και από αντιγόνα πολλαπλασιασμό κατά χρώση PCNA αποκάλυψε ότι thiacremonone ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου, αλλά εκτιμήσεις των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, Βαχ και διασπασμένη κασπάση 3 με IHC αποκάλυψε πιο συχνά σε thiacremonone επεξεργασμένο LLC φέρουν C57BL /6J ποντικούς και PRDX6 υπερεκφράζεται ποντίκια (Σχ. 6C και D).

(Α) Tumor όγκοι, τα βάρη και τις εικόνες των φυσιολογικών ποντικών. (Β) Ο όγκος των όγκων, τα βάρη και τις εικόνες των PRDX6 υπερεκφράζεται ποντίκια. Οι τιμές (Α και Β) είναι μέσες ± Τ.Α. * P & lt? 0,05 διαφέρει σημαντικά από τα μη θεραπευμένα ποντίκια. τμήματα (C) Tumor φυσιολογικών ποντικών αναλύθηκαν με Η &? Ε λεκέ και έκφραση πρωτεϊνών με ανοσοϊστοχημεία. Τα προκύπτοντα ιστοί αναπτύχθηκαν με DAB, και αντίθετα με αιματοξυλίνη. τμήματα (D) Tumor του PRDX6 υπερεκφράζεται ποντικών αναλύθηκαν με Η &? Ε λεκέ και έκφραση πρωτεϊνών με ανοσοϊστοχημεία. Τα προκύπτοντα ιστοί αναπτύχθηκαν με DAB, και αντίθετα με αιματοξυλίνη. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, 200 κύτταρα σε τρία τυχαία επιλεγμένα περιοχές αξιολογήθηκαν, και η ειδική πρωτεΐνη θετικώς χρωματισμένο κύτταρα μετρήθηκαν. μπαρ κλίμακας δείχνει 50 μm.

Η

Επίδραση των Thiacremonone στην έκφραση και τη δραστηριότητα των PRDX6, και πρωτεϊνών του κυττάρου Θάνατος Ρυθμιστική

Για να καταλάβουμε την έκφραση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών PRDX6 και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο από thiacremonone, η έκφραση των πρωτεϊνών διερευνήθηκαν με Western blots. PRDX6 μειώθηκε με κατεργασία του thiacremonone τόσο σε φυσιολογικά όσο και PRDX6 υπερεκφράζονται ποντίκια ιστό του όγκου. Η έκφραση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, διασπασμένης Βαχ και μορφή της κασπάσης-3, -8, -9, καθώς και p21 και p53 αυξήθηκε, ενώ οι εκφράσεις του Bcl2, ΧΙΑΡ, και cIAP2 μειώθηκαν με επεξεργασία του thiacremonone τόσο κανονική και PRDX6 υπερεκφράζεται ποντίκια ιστούς όγκων (Σχήμα S2A). Όπως φαίνεται στο Σχήμα S2B, thiacremonone ανέστειλε επίσης δραστικότητα υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης των PRDX6 υπό κανονικές συνθήκες και οι δύο PRDX6 υπερεκφράζεται ιστούς ποντικών όγκου.

Συζήτηση

Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι τα φρέσκα εκχυλίσματα σκόρδου, ηλικίας σκόρδο, το σκόρδο λάδι και ειδικών organosulfur ενώσεις που παράγονται από σκόρδο επεξεργασία θα μπορούσε να μεταβάλει τον μεταβολισμό καρκινογόνο, αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω της επαγωγής του διακοπή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, και την πρόληψη της προώθησης και της αγγειογένεσης [20] – [21] σε μια ποικιλία κυτταρικών σειρών καρκίνου συμπεριλαμβανομένου ηπατώματος, του τραχήλου της μήτρας, του προστάτη, του πνεύμονα, του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα [22] – [26]. Διαλλυλ τρισουλφιδίου (ϋΑΤ), μια σουλφάνιο ένωση που περιέχει θείο έδειξε την ισχυρότερη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και τη μέγιστη επαγωγή της δραστικότητας κασπάσης-3 σε κύτταρα HepG2 [23]. DATs καταστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων του ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα, προκαλώντας G2-M διακοπή του κυτταρικού κύκλου φάση ακολουθείται από Bax απόπτωση που διαμεσολαβείται [26]. Διαλλυλ σουλφίδιο (DAS) επάγει αναστολή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης μέσω της ρ53, caspase- και μιτοχόνδρια οδών που εξαρτώνται σε HeLa ανθρώπινου τραχηλικού καρκινικά κύτταρα [25]. Allicin (διαλλυλ thiosulfinate) επάγει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [22]. Thiacremonone απομονώθηκε σαν sulfurcompound από ένα εκχύλισμα ζεστού νερού του σκόρδου, και βρήκαν ότι η ένωση αυτή θα μπορούσε να έχει επίδραση κατά του καρκίνου του παχέος εντέρου για τον καρκίνο [27]. παρόντα δεδομένα μας έδειξαν ότι μια ώρα θεραπεία εβδομήντα δύο του thiacremonone επαγόμενο κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα με IC

50 αξία των 46 μg /ml σε κύτταρα Α549, και 42 μg /ml σε κύτταρα ΝΟΙ-Η460, αντίστοιχα. ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα ήταν σημαντικά μειώθηκε κατά DATs από τη συγκέντρωση και χρονοεξαρτώμενο τρόπο με IC

50 & lt? 3,6 μg /ml [26], και με IC

50 7,3 μg /ml με DADS [34]. Το IC

50 S-allylcysteine ​​(SAC) για την ανθρώπινη μεταστατικά κύτταρα ήταν περίπου 5,3 mg /ml την ημέρα 3 [28]. Μετά την κατεργασία για 24 ώρες, η κυτταρική ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη με 9 μg /ml σουλφοραφάνη (SFN) ήταν 10,2 ± 3,1% σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα ελέγχου (100%) [29]. Ακόμα κι αν οι συγκεντρώσεις των ενώσεων που οδηγούν τον καρκίνο αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης είναι διαφορετικά, αυτό εξαρτάται από τον τύπο του κυττάρου και ενώσεις κατεργάζονται, που προέρχεται από ενώσεις σκόρδο συμπεριλαμβανομένων thiacremonone έχουν αντικαρκινικό αποτέλεσμα. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί δράσης είναι ακόμα ασαφής.

Όπως PRDX6 σαρώνουν το υπεροξείδιο, όπως μικρές H

2O

2, υποστηρίζει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και τη διατήρηση του όγκου [30]. Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει ότι PRDX6 προάγει εισβολή και μετάσταση μιας ποικιλίας καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των πνευμόνων, του μαστού και του καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα [4], [12], [31]. PRDX6 εκφράζεται σε όλα τα κύρια όργανα, με ένα ιδιαίτερα υψηλό επίπεδο στον πνεύμονα [32]. Επιπλέον, PRDX6 βρέθηκε σε υψηλότερα επίπεδα σε ασθενείς πνεύμονα πλακώδες καρκίνωμα [33]. Η υπερέκφραση του PRDX6 αυξημένης ανάπτυξης καρκίνου του πνεύμονα μέσω δραστικότητα PRDX6 [4]. Έτσι, η στόχευση PRDX6 με ορισμένες ενώσεις θα μπορούσαν να είναι αποτελεσματικές για την ανάπτυξη των όγκων του πνεύμονα αναστολής όπως χημειοθεραπευτικά. PRDX6 έχει διπλή δραστηριότητες ένζυμο όπως υπεροξειδάση της γλουταθειόνης και iPLA2 [32]. Η γλουταθειόνη υπεροξειδάση προωθεί την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω αναστολής της απόπτωσης και μεγαλύτερη πιθανότητα ή υποτροπών, συμπεριλαμβανομένων των πνευμόνων μετάστασης και τοπικές υποτροπές [34]. Η γλουταθειόνη υπεροξειδάση αναστέλλει σισπλατίνη απόπτωση που επάγεται μέσω της προς τα κάτω ρύθμιση Bcl2 σε ΝΟΙ-Η460 ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων [35].