Abstract

Αυξημένα επίπεδα του ανοσορυθμιστικού κυτοκίνης ΤΟΡ-β1 στον καρκίνο και λοίμωξη HIV έχει συνδεθεί με καταστολή της προστατευτικές ανοσοαποκρίσεις. Η μεταγραφική ρύθμιση του TGF-β1 είναι περίπλοκη και ακόμη δεν πλήρως κατανοητός. Αναφέρουμε εδώ για πρώτη φορά ότι ο παράγοντας μεταγραφής GLI2 ρυθμίζει την έκφραση του TGF-β1 σε ανθρώπινο CD4

+ Τ κύτταρα.

Στο silico

εξέταση προέκυψε ότι πέντε νέες πιθανές θέσεις δέσμευσης GLI στο ανθρώπινο

TGF-β1

υποκινητή. Τουλάχιστον δύο από αυτές τις περιοχές μέσα στο ανθρώπινο

TGF-β1

υποστηρικτής ρυθμίζονται από τον ενεργοποιητή GLI2 όπως νοκ ντάουν του

GLI2

στο κανονιστικό CD4

+ CD25

hi Τ κύτταρα, υψηλή παραγωγοί του ΤΟΡ-β1, μειώθηκαν σημαντικά

ΤΟΡ-β1

μεταγραφής. Επιπλέον, αφελείς CD4

+ Τ κύτταρα, χαμηλή παραγωγοί του ΤΟΡ-β1, αυξημένο βασικό επίπεδο της

ΤΟΡ-β1 mRNA μετά

λεντοϊού μόλυνση με GLI2. Η μεταγραφική ρύθμιση του

TGF-β1 από

GLI2 είναι μια νέα επέκταση για Sonic Hedgehog (ΕΛΕΡΠΕ) και

TGF-β1

cross-ρύθμιση και μπορούν να παρέχουν πληροφορίες για την επιζήμια ανύψωση του TGF-β1 οδηγώντας σε παθογένεση του καρκίνου και της HIV λοίμωξης

Παράθεση:. Furler RL, Uittenbogaart CH (2012) GLI2 Ρυθμίζει TGF-β1 στα Ανθρώπινα CD4

+ Τ κύτταρα: Επιπτώσεις στον καρκίνο και τον ιό HIV παθογένεια. PLoS ONE 7 (7): e40874. doi: 10.1371 /journal.pone.0040874

Επιμέλεια: Derya Unutmaz, του Πανεπιστημίου της Νέας Υόρκης, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Ιούλη του 2011? Αποδεκτές: 18 Ιούν, 2012? Δημοσιεύθηκε: 31 Ιούλη 2012

Copyright: © Furler, Uittenbogaart. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας ΑΙ-081636 και ΑΙ-028697 (Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας στο Λος Άντζελες, το Κέντρο Έρευνας για το AIDS), μια Jonsson Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου Seed Grant, και ένα βραβείο Stein Oppenheimer Κληροδότημα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Transforming Growth Factor-β1 (ΤΟΡ-β1) είναι μία πλειοτροπική κυτοκίνη που ρυθμίζει την ανοσολογική απόκριση σε πολλές ασθένειες συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου και HIV λοίμωξης και παίζει σημαντικό ρόλο στην πρόληψη παθογένεση [1] – [5]. Παράγεται από διάφορους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των CD4

+ CD25

hi ρυθμιστικά Τ κύτταρα, μακροφάγα, καθώς επίσης και από τους ινοβλάστες. ΤΟΡ-β1 μειώνει τον πολλαπλασιασμό των Τ και Β λεμφοκυττάρων, λειτουργίες τελεστή πολλών κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος και προκαλεί περιφερική ρυθμιστικά Τ κύτταρα [6]. Παρά το γεγονός ότι ο ΤΟΡ-β1 είναι κρίσιμη σε όλη την ανάπτυξη των θηλαστικών και για την πρόληψη της ανώμαλη ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή, η αυξημένη έκφραση του TGF-β1 μπορεί να αμβλύνουν προστατευτικές ανοσοαποκρίσεις σε όγκους και λοιμώξεις.

Η ανώμαλη υψηλή παραγωγή ΤΟΡ-β1 με κακοήθη κύτταρα απεδείχθη ότι αυξάνει τη μετάσταση, καθώς και για την πρόληψη μια προστατευτική ανοσοαπόκριση ξενιστή σε όγκους [7]. Στην χρόνια λοίμωξη HIV, ΤΟΡ-β1 είναι αυξημένη σε πολλά διαμερίσματα, συμπεριλαμβανομένων λεμφοειδείς ιστούς, αίμα και εγκεφαλονωτιαίο υγρό [8] – [10]. Αυξημένα επίπεδα του ΤΟΡ-β1 μπορεί να προκαλέσει την ανάπτυξη των επαγόμενων (i) Treg παρατηρούνται σε χρόνια λοίμωξη HIV [11], [12], και μπορεί να συμβάλει σε δυσλειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος κατά τη διάρκεια του τελικού σταδίου της νόσου. Η πρωτεΐνη HIV-1 Tat επάγει ΤΟΡ-β1 σε ανθρώπινα λευκοκύτταρα [13] – [15], τα χονδροκύτταρα [16], καθώς επίσης και σε ποντικού CD2

+ Τ κύτταρα ενός Tat-διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού [17]. Οι μηχανισμοί της επαγωγής του όγκου που προκαλείται και Tat μεσολάβηση ΤΟΡ-β1 είναι άγνωστες. Καρκίνο και το AIDS είναι μόνο δύο από τις πολλές ασθένειες στις οποίες ο ΤΟΡ-β1 παίζει ένα ρόλο στην παθογένεση.

Η έκφραση του ενεργού ΤΟΡ-β1 ρυθμίζεται αυστηρά στο μεταγραφικό, μεταφραστικό, και μετα-μεταφραστική επίπεδα. Αν και η έκφραση TGF-β1 υπήρξε το επίκεντρο έντονης έρευνας, είμαστε ακόμη μακριά από την κατανόηση πολύπλοκων κανονισμού, αυτό το κυτοκίνης.

Σε silico

ανάλυση της περιοχής του ΤΟΡ-β1 υποκινητή δείχνει διάφορες πιθανές θέσεις πρόσδεσης των γνωστών παραγόντων μεταγραφής. Ορισμένοι από αυτούς τους παράγοντες μεταγραφής, όπως και Sp-1 και Zf9, έχουν προηγουμένως βρεθεί να διαμεσολαβούν

ΤΟΡ-β1

μεταγραφής, αλλά αυτοί οι παράγοντες από μόνες τους δεν είναι επαρκείς για να επάγουν την έκφραση του mRNA [18], [19]. Συνεπώς ερευνήσαμε το οποίο άλλους παράγοντες μεταγραφής επάγουν ΤΟΡ-β1 mRNA.

Βρήκαμε έξι πιθανές θέσεις σύνδεσης (πέντε προηγουμένως λαθραίας) για τους παράγοντες μεταγραφής του ανθρώπου GLI από

in silico

ανάλυση του ανθρώπινου

ΤΟΡ-β1

υποκινητή. Ο παράγοντας μεταγραφής GLI2 είναι ένας από τους κύριους κατάντη δράστες της οδού Sonic hedgehog (SHH), η οποία φαίνεται να παίζουν ένα ρόλο στη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος προσαρμοστικού [20], [21]. Το μονοπάτι ΕΛΕΡΠΕ διαμορφώνει ενεργοποίησης [22], του πολλαπλασιασμού [23], [24], και τον κανονισμό κυτταροκινών [25] σε CD4

+ Τ κύτταρα. Δεδομένου ότι υπάρχουν διάφορες αλληλεπιδράσεις μεταξύ του TGF-β1 και τα μονοπάτια ΕΛΕΡΠΕ (Πίνακας 1), επικεντρωθήκαμε στην ρύθμιση των TGF-β1 από τα μέλη της οικογένειας ΕΛΕΡΠΕ οδού, δηλαδή GLI πρωτεΐνες, στο ανοσοποιητικό σύστημα.

Η

παρέχουν αποδείξεις ότι τουλάχιστον δύο από τις έξι πιθανές θέσεις GLI δέσμευσης απαιτούνται για GLI2 μεσολάβηση μεταγραφική ρύθμιση του ανθρώπινου

ΤΟΡ-β1

υποκινητή. Τουλάχιστον μία από αυτές τις δύο θέσεις θα πρέπει να είναι λειτουργική για να παρατηρήσουν ρύθμιση ΤΟΡ-β1 με GLI2. Επιπλέον, από το να χτυπήσει κάτω

GLI2

σε ανθρώπινο CD4

+ CD25

hi Treg, δείχνουμε ότι GLI2 είναι αναγκαία για την έκφραση TGF-β1. Η μεταγραφική ρύθμιση του

TGF-β1 από

GLI2 δεν έχει ακόμη περιγραφεί και αυξάνει την κατανόησή μας για τις πολυπλοκότητες του

TGF-β1

ρύθμιση.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η χρήση των ανώνυμων μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος για την απόκτηση Τ κυττάρων και την επιθηλιακών 293Τ κυτταρική γραμμή εξετάστηκε από το συμβούλιο UCLA Institutional Review (IRB), η οποία κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η δραστηριότητα αυτή δεν συνεπάγεται ανθρώπινα υποκείμενα, και ως εκ τούτου δεν απαιτούν IRB εξέταση ή πιστοποίηση.

in silico Screening

Έλεγχος για πιθανές θέσεις δέσμευσης GLI στο ανθρώπινο

TGF-β1

υποστηρικτές έγινε από

in silico

ανάλυση χρησιμοποιώντας το MatInspector πρόγραμμα λογισμικού (https://www.genomatix.de). Μια σειρά από είκοσι κιλοβάσεις που περιβάλλει το πρώτο ανθρώπινο

ΤΟΡ-β1

υποκινητή χρησιμοποιήθηκαν για τη διαλογή για τις θέσεις πρόσδεσης υποθετικού παράγοντα μεταγραφής. Και οι έξι πιθανές θέσεις πρόσδεσης GLI εντός του πρώτου kilobase του

ΤΟΡ-β1

προαγωγό # 1 (πέντε πιθανές θέσεις) ή υποκινητή # 2 (μία πιθανή θέση) είχαν μία μήτρα βαθμολογίας ομοιότητας ίσο ή μεγαλύτερο από 0,8. θέσεις σύνδεσης που βρίσκονται μέσα στην πρώτη περιοχή εγγύς υποκινητή είναι νέα και είναι το επίκεντρο αυτής της μελέτης

λουσιφεράσης & amp.? Υποστηρικτής Μελέτες

Το ανθρώπινο

TGF-β1

υποκινητή-λουσιφεράση κατασκευάσματα δημοσιογράφος, phTG5 και phTG1, ευγενικά παρέχεται από S.J. Kim [18]. Το κατασκεύασμα phTG5 άγριου τύπου είχε μεταλλαχθεί σε putatitve GLI θέσεις πρόσδεσης (περιοχή Α, Β, ή Α και Β) χρησιμοποιώντας τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση (SITE A: 5′-CAGCCCCCCCATGCC-3 ‘σε 5′-CAGCaaCaaaATGC-3′, SITE Β: 5’-GAGCCCGCCCACGCGA-3 ‘προς 5′-GAGCaaGaaaACGCGA-3′, μεταλλαγμένες βάσεις με μικρά γράμματα). Το κατασκεύασμα phTG1 άγριου τύπου μεταλλάχθηκε σε υποθετικές GLI δέσμευσης του δικτυακού τόπου E χρησιμοποιώντας τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση (SITE E: 5’-CCCACCACCCACGAA-3 ‘να 5’CCaAaaAaaaACGAA-3’, μεταλλαγμένες βάσεις με μικρά γράμματα). Ο υποκινητής άγριου τύπου, οι μεταλλαγμένες υποκινητές, ή ένα pGL3 ελέγχου κενός-φορέα μεμονωμένα συν-επιμολύνθηκαν με το φορέα pGLI2ΔN συστατική ενεργοποιητή (ευγενώς από τους Ε Roessler [26]) ή τον pcDNA3 ελέγχου με Lipofectamine 2000 με τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών σε 293Τ κύτταρα, μια ανθρώπινη επιθηλιακή κυτταρική γραμμή που περιέχει αδενο και SV-40 αλληλουχίες DNA του ιού, που λαμβάνεται από την American Type Culture Collection (ATCC). Το πλασμίδιο pGLI2ΔN περιέχει ένα ιδιοσυστατικά ενεργό γονίδιο GLI2 οφείλεται σε μια αμινο-τερματική κολόβωση. Η αμινο τερματική περιοχή του γονιδίου της ανθρώπινης GLI2 έχει μια κατασταλτική λειτουργία, και είναι η απομάκρυνση έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει την μεταγραφή των γονιδίων-στόχων κατάντη όπως GLI1 [26]. Η κυτταρική σειρά 293Τ επιλέχθηκε λόγω της αποτελεσματικότητας της επιμόλυνσης και χαμηλά επίπεδα έκφρασης GLI1, η οποία είναι ένδειξη μας για την ενεργοποίηση GLI2. Η έκφραση λουσιφεράσης μετρήθηκε στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση

κελί απομόνωσης, Πολιτισμού, & amp.? Διέγερση

Naïve CD4

+ Τ κύτταρα, που εκφράζουν CD4, CD31, CD45RA, και CD62L, καθαρίστηκαν και απομονώθηκαν από ανθρώπινο μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) χρησιμοποιώντας αρνητική επιλογή. CD4

+ CD25

hi ρυθμιστικά Τ κύτταρα εμπλουτίστηκαν από ανθρώπινο αίμα χρησιμοποιώντας RosetteSep και Robosep κιτ από την Stem Cell Technologies. Πρωτογενή κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο άνευ ορού αποτελούμενο από Τροποποιημένο Μέσο του Dulbecco του Iscove συμπληρωμένο με απολιπιδωμένο BSA (Sigma-Aldrich) σε 1100 μg /mL, η ανθρώπινη τρανσφερίνη (Sigma-Aldrich) σε 85,5 μg /mL, 2 mM γλουταμίνη, και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη σε 25 U /25 μg /mL. Όλες οι συνθήκες διέγερση πρωτογενών Τ κυττάρων έγιναν με αCD3 /αCD28 επικαλυμμένα Μ-450 σφαιρίδια από την Invitrogen. κυτταρική επιφάνεια και ενδοκυτταρική ανοσοφαινότυπους επικυρώθηκαν με κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Για την ανίχνευση της ενδοκυτταρικής FoxP3, τα κύτταρα πρώτα κηλιδώθηκαν για δείκτες κυτταρικής επιφάνειας, σταθερό και διαπερατά με eBioscience συνιστώμενη ρυθμιστικά ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, στη συνέχεια επωάστηκαν με FITC ή eFluor 450 συζευγμένα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι FoxP3 (eBioscience, κλώνος pCH101).

siRNA Knockdown

Νοκ ντάουν του

GLI2

στην πρωτογενή ανθρώπινα ρυθμιστικά Τ κύτταρα έγινε χρησιμοποιώντας Accell siRNA σχεδιαστεί και επικυρωθεί από ThermoFisher /Dharmacon. Ένα μη-στόχευσης siRNA χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Μια θετική siRNA ελέγχου για GAPDH χρησιμοποιήθηκε για την επαλήθευση νοκ ντάουν. Εξόντωση GLI2 έγινε χρησιμοποιώντας ένα διαθέσιμο στο εμπόριο και να επικυρωθούν siRNA από Dharmacon (Α-006468-14 – Target ακολουθία – 5 ‘GGUUUGAAUCUGAAUGCUA 3’). Ένα ξεχωριστό ανεξάρτητο αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιώντας μια ομελέτα

GLI2

ακολουθία siRNA (5′-AAGGUAUGCGCUUAAUUU-3 ‘) χρησιμοποιήθηκε για την αντιμετώπιση των off-στόχου αποτελέσματα.

GLI2

νοκ ντάουν επιβεβαιώθηκε από την αξιολόγηση

GLI1

έκφρασης του mRNA μετά από διέγερση. GLI1 έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι ρυθμίζεται transciptionally από GLI2 και είναι ο θετικός έλεγχος για

GLI2

νοκ ντάουν.

Τα καθαρισμένα CD4

+ CD25

hiFoxP3

+ ρυθμιστικά Τ κύτταρα επωάστηκαν με το siRNA και μεσαίου Accell άνευ ορού (Dharmacon) για 72 ώρες πριν από την διέγερση με αCD3 /αCD28 επικαλυμμένα σφαιρίδια. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά τη διέγερση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για να μετρηθεί

ΤΟΡ-β1

επίπεδα mRNA με RT-PCR. επίπεδα TGF-β1 ομαλοποιήθηκαν σε

18S rRNA

και σε σύγκριση με μη διεγερμένα κύτταρα.

RT-PCR

Taqman Gene Expression σύνολα εκκινητών /ανιχνευτή για

TGF-β1 , GLI1

, 18S rRNA, και

GAPDH

από την Applied Biosystems Inc. χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση των επιπέδων μεταγραφές σε διάφορες συνθήκες. Η έκφραση του

ΤΟΡ-β1, GLI1

, και

GAPDH

κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα 18S rRNA και σχετική έκφραση μεταξύ συνθήκες υπολογίσθηκε να εκτιμήσει αυξορρύθμιση /αρνητική ρύθμιση της μεταγραφής.

λεντοϊού Λοιμώξεις

το

GLI2ΔN

διαγονιδίου τοποθετήθηκε σε ένα τρίτης γενιάς HIV-1 φορέα στο UCLA Vector Core. Η πλειοψηφία της αλληλουχίας ιικής κωδικοποιητικής HIV αφαιρέθηκε και αντικαταστάθηκε από το διαγονίδιο. Οι LTRs τροποποιήθηκαν για να είναι «αυτο-απενεργοποίησης» και η μεταγραφή του γονιδιώματος του φορέα στα κύτταρα συσκευασίας οδηγείται από έναν υποκινητή. Virus μη HIV έγινε χρήση κυττάρων 293Τ που συν-επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο φορέα και τρεις άλλες πλασμίδια που κωδικοποιούν α) τα ιικά ένζυμα και δομικές πρωτεΐνες, εκτός Εην, Β) Rev, η οποία εμπλέκεται στην μεταφορά του RNA του HIV, και C) VSV γλυκοπρωτεΐνη, η οποία είναι μια φάκελος παν-tropic που επιτρέπει την είσοδο του ιού σε σχεδόν οποιοδήποτε τύπο κυττάρου. Naïve CD4

+ Τ κύτταρα μολύνθηκαν με 100 ng ρ24 ανά εκατομμύριο κύτταρα σε μέσο άνευ ορού για 96 ώρες. Το RNA απομονώθηκε για τον προσδιορισμό των μεταβολών στη γονιδιακή έκφραση με τη χρήση RT-PCR α. φακοϊό GFP που περιέχει χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός ελέγχου, καθώς και για τη μέτρηση της αποτελεσματικότητας της λοίμωξης.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (chip) θα

ανάλυση ChIP έγινε για να διαπιστωθεί αν GLI2 συνδέεται με το

TGF-β1

υποκινητή. Ρυθμιστική CD4

+ CD25

hi Τ κύτταρα αρνητικά απομονώθηκαν όπως περιγράφηκε παραπάνω. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με αCD3 /αCD28 επικαλυμμένα σφαιρίδια όλη τη νύκτα. Το κιτ GLI2 ExactaChIP (R & amp? D Systems) χρησιμοποιήθηκε για χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, υποβλήθηκαν σε λύση, και υφίσταται κατεργασία με υπερήχους πριν από την επώαση είτε με αGLI2 επικαλυμμένα ή σφαιρίδια αγαρόζης αIgG-επικαλυμμένων ελέγχου. PCR έγινε μετά από τσιπ για να αξιολογήσει GLI σύνδεση με το

TGF-β1

υποκινητή. Υποθετικές GLI2 θέση σύνδεσης «Ε» (Σχήμα 1) ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας σχεδιασμένους εκκινητές (5′-CTGGGGTCAGCTCTGACAGT-3 ‘και 5′-CAGTTGGCGAGAACAGTTGG-3’? 290 bp θραύσμα). Η

Bcl2

περιοχή υποκινητή ανιχνεύθηκε ως θετικός έλεγχος GLI δέσμευσης χρησιμοποιώντας εκκινητές από το κιτ ExactaChIP. Μια περιοχή 238 bp του

IL-10

υποκινητή οποίο δεν περιείχε κανένα υποθετική θέση σύνδεσης GLI2 μετρήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (5′-TGATTTCCTGGGGAGAACAG-3 ‘και 5′-CCCACCCCCTCATTTTTACT-3’).

υπάρχουν δύο αναφερθεί υποστηρικτές στο ανθρώπινο

TGF-β1

γονίδιο.

Σε silico

ανάλυση του ανθρώπινου

ΤΟΡ-β1

περιοχές εγγύς υποκινητή με τη χρήση του προγράμματος λογισμικού Genomatix αποκάλυψε πέντε προηγουμένως αγνώστων υποθετικές θέσεις GLI-δέσμευσης (Α έως Ε) σε ένα εξαιρετικά διατηρημένη περιοχή του ανθρώπινο γονιδίωμα. Ιστοσελίδα F στο δεύτερο υποκινητή έχει προηγουμένως εντοπιστεί και μελετηθεί [28]. Sites Α και Β (η οποία επικαλύπτεται με C), όλα βρίσκονται εντός του phTG5 κατασκεύασμα αναφοράς λουσιφεράσης που χρησιμοποιούνται στις μελέτες μεταλλαξογένεσης υποκινητή. Του δικτυακού τόπου E είναι παρούσα στο μόρφωμα phTG1. Οι προσεγγιστικές θέσεις ζευγών βάσεων των θέσεων δέσμευσης δυναμικό GLI εμφανίζονται σε σχέση με τα δύο που αναφέρθηκαν έναρξης της μεταγραφής χώρων για την ανθρώπινη

TGF-β1

γονίδιο.

Η

συνανοσοκαθίζησης

Co-immunopreciptation διεξήχθη για να αξιολογηθεί η σύνδεση των ανθρώπινων GLI2 προς HIV-1 Tat. Διπλή επιμολύνσεις έγιναν σε κύτταρα 293Τ χρησιμοποιώντας τρία διαφορετικά σύνολα πλασμιδίων: (GLI2-6xMYC + HIV-1 Tat-FLAG), (GLI2-6xMYC + pcDNA3 έλεγχος), (HIV-1 Tat-FLAG + έλεγχος pCDNA3). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν και τα απελευθερώνονται πρωτεΐνες συλλέχθηκαν για συν-ΠΕ (Pierce Co-IP Kit από Thermo Scientific). Η ρητίνη αγαρόζης επικαλύφθηκε με ένα από τα τρία αντισώματα: Sigma F1804 αντι-FLAG Μ2 αντίσωμα (να δεσμεύεται Tat να χάντρα), CST 71D10 αντίσωμα anti-myc (να δεσμεύεται GLI2 να χάντρα), ή ένα αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου. Μετά από συν-IP, οι εκλούσεις σε πηκτή SDS-PAGE που ακολουθείται από κηλίδωση Western.

Στατιστικά

Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν από το UCLA Ινστιτούτου AIDS Βιοστατιστική πυρήνα ή με GraphPad Prism 5 Λογισμικό . Οι μεταβλητές εκφράσθηκαν ως μέσο με το πρότυπο σφάλμα του μέσου. ANOVA και δίπλευρη δοκιμή αθροίσματος Wilcoxon Rank, ζεύγη κατά περίπτωση, χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των διαφορών μεταξύ των πληθυσμών. Μία τιμή ρ μικρότερη ή ίση με 0,05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

τοποθεσίες Δεσμευτική Έξι Υποθετικά GLI βρίσκονται εντός του Ανθρώπου

TGF-β1

υποψήφιοι

μέσω

in silico

ανάλυση με τη χρήση MatInspector (https://www.genomatix.de) βρήκαμε έξι πιθανές θέσεις δέσμευσης GLI εντός δύο αναφερθεί ανθρώπινη

TGF-β1

υποστηρικτές, συμπεριλαμβανομένου ενός προηγουμένως αναφερθεί θέση εντός του δεύτερου προαγωγέα [28] εκτός από πέντε περιοχές που ήταν προηγουμένως άγνωστος. Και τα δύο προγράμματα λογισμικού Genomatix και UCSC γονιδίωμα (www.genome.ucsc.edu) δείχνουν έναν υψηλό βαθμό διατήρησης της αλληλουχίας που περιβάλλει την

ΤΟΡ-β1

περιοχή προαγωγού σε θηλαστικά που υποδηλώνει τη λειτουργική συνάφεια του ανθρώπινου

ΤΟΡ -β1

υποστηρικτές. Η ακολουθία συναίνεσης δέσμευσης για τους παράγοντες μεταγραφής GLI έχει ταυτοποιηθεί ως 5′-TGGGTGGTC-3 ‘[29], [30]. Οι έξι πιθανές θέσεις πρόσδεσης GLI αναφέρθηκαν σε αυτή τη μελέτη έχουν μια υψηλή βαθμό ομοιότητας μήτρα

43 και παρατίθενται στο Σχήμα 1. Η αφθονία των πιθανών θέσεων πρόσδεσης GLI εντός των πρώτων χιλιάδες ζεύγη βάσεων της θέσης έναρξης της μεταγραφής του

TGF-β1

υποστηρικτής προτείνει ότι αυτή η περιοχή εγγύς υποκινητή μπορεί να ρυθμίζεται από τους παράγοντες μεταγραφής GLI.

GLI2 Ενεργοποιεί το πρώτο ανθρώπινο

TGF-β1

Ανάδοχος μέσω τουλάχιστον δύο από Η υποθετική GLI-δεσμευτική τοποθεσίες

Η υποθετική θέση δέσμευσης GLI στο δεύτερο ΤΟΡβ-1 προωθητής έχει αναφερθεί ότι είναι μη-αποκρίσιμα σε Shh διέγερση από Eichenmuller

et al.

[28]. Ωστόσο, οι πέντε πιθανές θέσεις στο πρώτο προαγωγέα δεν έχουν προηγουμένως αναφερθεί ότι ρυθμίζεται από GLI πρωτεΐνες. Χρησιμοποιήσαμε ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή που περιέχει τα πρώτα 500 ζεύγη βάσεων του υποκινητή της ανθρώπινης ΤΟΡ-β1 η οποία είχε τοποθετηθεί ανοδικά του γονιδίου της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας από τον Kim

et al.

(PhTG5) [18]. Αυτός ο φορέας έκφρασης συν-διαμολύνθηκε σε κύτταρα 293Τ μαζί με μια συστατική ενεργοποιητή GLI κατασκευάσει pGLI2ΔN [26] ή ένα πλασμίδιο pcDNA3 ελέγχου για την αξιολόγηση GLI2 μεσολάβηση ρύθμιση του προαγωγέα του γονιδίου της ανθρώπινης ΤΟΡ-β1.

Η ανθρώπινο

ΤΟΡ-β1

περιοχής προαγωγού τοποθετήθηκε μέσα σε ένα φορέα λουσιφεράσης pGL3-βασικό. (Α) Οι τρεις θέσεις σύνδεσης GLI εντός αυτής της περιοχής (τοποθεσίες Α, Β, και C) μεταλλάχθηκαν ξεχωριστά ή μαζί (WT = αγρίου τύπου

ΤΟΡ-β1

υποκινητή phTG5, MUT-Α = θέση Μια μετάλλαξη , MUT-Β = sites B /C μετάλλαξη, MUT-Α /Β = sites Μια μετάλλαξη /B /C, pGL3 = φορέα ελέγχου). Αυτά

ΤΟΡ-β1

υποκινητή: λουσιφεράσης κατασκευάσματα διαμολύνθηκαν ταυτόχρονα σε κύτταρα 293Τ με την συστατική ενεργοποιητή GLI (GLI2dN) και ομαλοποιήθηκε ως προς τον αρνητικό μάρτυρα (pcDNA3). Ο ενεργοποιητής GLI προκάλεσε μία τετραπλάσια αύξηση της δραστικότητας λουσιφεράσης σε phTG5 πάνω από τον έλεγχο. Μετάλλαξη και των δύο θέσεων δέσμευσης GLI (phTG5AB) κατήργησε αυτήν την επαγωγή (η = 10, ρ = * 0.0011, ** ρ = 0.0033). (Β) Η υποθετική θέση σύνδεσης GLI Ε μεταλλάχθηκε στο πλασμίδιο ανταποκριτή phTG1 (WT = αγρίου τύπου ΤΟΡ-1 phTG1 υποκινητή, MUT-Ε = θέση Ε μετάλλαξης, pGL3 = φορέα ελέγχου). Ο ενεργοποιητής GLI προκάλεσε μία έξι-φορές αύξηση της δραστικότητας λουσιφεράσης σε phTG1 πάνω από τον έλεγχο. Μετάλλαξη του GLI δέσμευσης τόπου E μειώθηκε Αυτή η επαγωγή σχεδόν δύο φορές (η = 12, *** p = 0,0025).

Η

Μετά συν-επιμόλυνση των GLI2ΔN και phTG5 σε κύτταρα 293Τ, παρατηρήσαμε μια περίπου 4-πλάσια αύξηση της έκφρασης λουσιφεράσης πάνω από το χειριστήριο (Εικόνα 2). Καθώς η περιοχή προαγωγού του phTG5 περιέχει τρεις από τις έξι πιθανές θέσεις πρόσδεσης GLI (Α, Β, & amp? C) χρησιμοποιήσαμε τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση να μεταλλάσσονται θέσεις δέσμευσης ξεχωριστά ή σε συνδυασμό αυτών υποθετικό GLI (συμβολίζεται phTG5A, phTG5B, και phTG5AB αντίστοιχα ). Παρά το γεγονός ότι η μετάλλαξη ενός μόνο site μόνο μείωσε ελαφρώς την έκφραση λουσιφεράσης, η μετάλλαξη και των δύο χώρων μειωμένη έκφραση του γονιδίου αναφοράς σε επίπεδα ελέγχου. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι GLI2 μπορεί να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή στον ανθρώπινο

ΤΟΡ-β1

υποκινητή και ότι η σύνδεση με τουλάχιστον μία από αυτές τις περιοχές είναι απαραίτητη για να συμβεί αυτό. Μετάλλαξη στο τόπου E, το οποίο βρίσκεται ανάντη περαιτέρω της θέσης έναρξης μεταγραφής, έγινε για να αξιολογηθεί ο ρόλος του στην έκφραση του ΤΟΡ-β1 GLI2 επαγόμενη. Χρησιμοποιήσαμε ένα λουσιφεράσης phTG1 κατασκεύασμα ανταποκριτή που περιέχει -1362 να +11 βάσεις πλησίον της θέσης έναρξης μεταγραφής του υποκινητή της ανθρώπινης ΤΟΡ-β1 [18]. Μετά μετάλλαξη του πιθανή θέση GLI-δέσμευσης, η έκφραση λουσιφεράσης μειώθηκε περίπου δύο φορές μετά συνεπιμόλυνση με την συστατική ενεργοποιητή GLI2. Θα χρειαστεί περαιτέρω ανάλυση για να εξεταστεί αν υποθετικές GLI περιοχές εκτός των θέσεων πρόσδεσης Α, Β και Ε είναι επίσης λειτουργικά.

Αφελής ανθρώπινο CD4

+ Τ κύτταρα απομονώθηκαν με αρνητική επιλογή και μολύνθηκαν με φακοϊό που περιέχει ένα κατασκεύασμα ενεργοποιητή GLI2ΔN ή ένα στοιχείο ελέγχου GFP. 72 ώρες μετά την μόλυνση, κυτταρικό RNA συλλέχθηκε για να μετρηθεί

ΤΟΡ-β1

μεταγραφές. (Α) Σχετική

ΤΟΡ-β1 mRNA

μετρήθηκε με RT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς 18S rRNA.

ΤΟΡ-β1 mRNA

ήταν σημαντικά αυξημένη (n = 6, p = * 0,0313) σε κύτταρα μολυσμένα με GLI2ΔN σε σύγκριση με κύτταρα μολυσμένα με τον έλεγχο GFP. (Β) Η αποτελεσματικότητα μόλυνσης μετρήθηκε στα 69% με τη χρήση ενός GFP που εκφράζει φακοϊό ελέγχου. (C & amp? Δ) Ο φαινότυπος του αφελή CD4

+ Τ κυττάρων ήταν μεγαλύτερη από το 95% των κυττάρων κατά την Ημέρα 0 του CD4

+ CD45RA

+ Οϋ45ΚΟ

– αφελή Τ κύτταρα. Έκφραση των GLI2ΔN επιβεβαιώθηκε με Western Blot (ένθετο).

Η

Ενεργός GLI2 μπορεί να βελτιώσει το

TGF-β1

Μεταγραφή στο Αφελής CD4

+ Τ κύτταρα

προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση των παραγόντων μεταγραφής GLI σε πρωτογενή κύτταρα, μολύναμε πρωτογενή αφελείς CD4

+ Τ κυττάρων με φορείς λεντοϊού που περιέχει την ιδιοσυστατική GLI2ΔN ενεργοποιητή ή ένα στοιχείο ελέγχου GFP. Η έκφραση του GLI2ΔN επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western (βλέπε ένθετο στο Σχήμα 3). Αφελής CD4

+ Τ κύτταρα δεν ιδιοσυστατικά εκφράζουν υψηλά επίπεδα του ΤΟΡ-β1. Μετρήσαμε το επίπεδο

ΤΟΡ-β1

mRNA με RT-PCR, πριν και μετά τη μόλυνση με τα κατασκευάσματα GLI. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, η υπερέκφραση του συστατικά ενεργοποιημένη GLI2ΔN σε αφελή CD4

+ Τ κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά

ΤΟΡ-β1

έκφραση mRNA (n = 6, p = 0,0313) μετά από διέγερση με αCD3 /αCD28- επικαλυμμένα σφαιρίδια. Προς τα πάνω ρύθμιση

GLI1

mRNA, ένα γνωστό γονίδιο GLI2 μεσολάβηση, υποδεικνύει ότι η πρωτεΐνη GLI2ΔN δραστηριοποιείται μεταγραφή σε αυτά lentivirally μολυσμένα κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η αποτελεσματικότητα μόλυνσης μετρήθηκε με μόλυνση αφελείς CD4

+ Τ κυττάρων με ένα φακοϊό ελέγχου που εκφράζουν GFP (69% απόδοση μόλυνση, Σχήμα 3Β). Ο φαινότυπος των αφελή κύτταρα ήταν CD4

+ CD45RA

+ Οϋ45ΚΟ

– (σχήματα 3C & amp? 3D).

CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ Treg εμπλουτίστηκαν από PBMC και στη συνέχεια επωάστηκαν για 72 ώρες με μη-στόχευσης (ΝΤ) ή

GLI2

siRNA. Τα κύτταρα στη συνέχεια διεγέρθηκαν (1 αCD3 /αCD28 χάντρα: 1 κύτταρο) για επιπλέον 24 ώρες. RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί

ΤΟΡ-β1

επίπεδα mRNA. Σχετική

TGF-β1

ή

GLI1

mRNA ομαλοποιήθηκε στο 18S rRNA. (Α)

GLI2

knockdown σε Treg μειώθηκε σημαντικά

ΤΟΡ-β1

μεταγραφής (η = 7, * ρ = 0,0189). (Β)

GLI1

mRNA μετρήθηκε επίσης ως ένα γονίδιο GLI2-ρυθμίζεται ελέγχου? δείχνοντας ότι knockdown του

GLI2

σε Treg μειωθεί επίσης

GLI1

mRNA (n = 5, ** ρ = 0.0278). (Γ) Η ακολουθία του

GLI2

siRNA ήταν κωδικοποιημένο (scram) ως πρόσθετου

GLI2

siRNA αρνητικός έλεγχος και δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από την μη-στόχευσης ελέγχου.

ρυθμίζει GLI2

TGF-β1

Μεταγραφή στην Πρωτοβάθμια Ανθρώπινα CD4

+ CD25

hi Treg

Αν και η υπερέκφραση των διαγονιδιακών GLI πρωτεΐνες μπορούν να διαμορφώσουν

TGF-β1

μεταγραφή σε αφελή CD4

+ Τ κύτταρα, θέλαμε να εκτιμηθεί η φυσιολογικός ρόλος της ενεργοποίησης GLI2 σε πρωτογενή κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του TGF-β1. Προηγούμενες μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει siRNA σε νοκ ντάουν συγκεκριμένα γονίδια στην πρωτοβάθμια Treg [31], [32]. Νοκ ντάουν του

GLI2

έγινε χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα Dharmacon Accell siRNA να αξιολογήσει τη λειτουργία του στη μεταγραφή TGF-β1 σε πρωτογενή ανθρώπινα Treg.

GLI2

siRNA νοκ ντάουν στον πρωτογενή ανθρώπινα CD4

+ CD25

hi Treg διεγείρονται με αCD3 /αCD28 σφαιρίδια επικαλυμμένα μείωσε την έκφραση του

TGF-β1

mRNA κατά περίπου 5 φορές ( Εικόνα 4Α, p = 0,0189). Για να εκτιμηθεί η knockdown δραστηριότητας GLI2,

GLI1

mRNA έκφραση μετρήθηκε με RT-PCR.

GLI1

μεταγραφής γονιδίων είναι μια γνωστή κατάντη στόχος του ενεργοποιημένου παράγοντα μεταγραφής GLI2. Η μειωμένη έκφραση του

GLI1

mRNA υποστηρίζει το siRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν του

GLI2

(Εικόνα 4Β, p = 0,0278). Ένα ξεχωριστό ανεξάρτητο αρνητικός έλεγχος χρησιμοποιώντας ένα κωδικοποιημένο

GLI2

αλληλουχία siRNA (5′-AAGGUAUGCGCUUAAUUU-3 ‘) χρησιμοποιήθηκε για την αντιμετώπιση εκτός στόχου επιδράσεις (Σχήμα 4C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι GLI2 είναι σημαντική στη ρύθμιση

ΤΟΡ-β1

μεταγραφής σε πρωτογενή ανθρώπινα Treg. Η διαλογή Treg ήταν CD3

+ CD8

-CD4

+ CD25

hiFoxP3

+ Τ κύτταρα. Η καθαρότητα του Treg ήταν περισσότερο από 85% (Εικόνα 4D).

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (chip) θα έγινε για να εκτιμηθεί η δέσμευση του GLI2 στο ανθρώπινο

ΤΟΡ-β1

υποκινητή. Πρωτογενή ανθρώπινα ρυθμιστικές CD4

+ CD25

hi Τ κύτταρα ήταν αρνητικά απομονωμένα και διεγείρονται με αCD3 /αCD28-σφαιρίδια επικαλυμμένα τη διάρκεια της νύχτας. PCR έγινε για να εκτιμηθεί δεσμευτικός GLI2. Ολόκληρο DNA χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για την PCR. GLI2 συνδέεται με το

TGF-β1

υποστηρικτής σε «δικτυακού τόπου E» στην ανθρώπινη

TGF-β1

υποκινητή. GLI2 δεν συνδέεται προς ένα μη στόχευσης περιοχή στον ανθρώπινο

IL-10

προαγωγό (λωρίδα 8).

Η

GLI2 Συνδέεται με την Ανθρώπινη

ΤΟΡ-β1

Ανάδοχος

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα έγινε για να εκτιμηθεί η δέσμευση του GLI2 στο ανθρώπινο

TGF-β1

υποκινητή. Πρωτογενή ανθρώπινα ρυθμιστικές CD4

+ CD25

hi Τ κύτταρα ήταν αρνητικά απομονωμένα και διεγείρονται με αCD3 /αCD28-σφαιρίδια επικαλυμμένα τη διάρκεια της νύχτας. Τα διεγερμένα Treg επωάστηκαν με σφαιρίδια αγαρόζης επικαλυμμένα με αντισώματα ελέγχου αGLI2 ή αIgG. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, GLI2 δεσμεύεται να του

TGF-β1

υποκινητή. GLI2 δέσμευση δείχθηκε να είναι στο ‘Site Ε’ (Εικόνα 5) στο ανθρώπινο

ΤΟΡ-β1

υποκινητή. Ωστόσο GLI2 δεν συνδέεται προς ένα μη στόχευσης περιοχή στον ανθρώπινο

IL-10

προαγωγό (λωρίδα 8).

συνανοσοκαθίζησης χρησιμοποιήθηκε για να δοκιμαστεί η δέσμευση του HIV-1 Tat να ανθρώπινο GLI2. Διπλή επιμολύνσεις έγιναν σε κύτταρα 293Τ (πλασμίδιο συνδυασμούς που φαίνεται στα δεξιά) για να εκφράσει την Tat-FLAG και GLI2-6xMYC πρωτεΐνες (pcDNA3 = κενός φορέας ελέγχου). (Α) σφαιρίδια επικαλύφθηκαν με αντίσωμα αντι-FLAG και επωάστηκε με κυτταρολύματα από επιμολύνσεις # 1-3 εμφανίζεται στην δεξιά πλευρά. Μετά την πλύση και την έκλουση βήματα, η δεσμευμένη πρωτεΐνη υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε γέλη SDS-PAGE που ακολουθείται από κηλίδωση Western για την αξιολόγηση δέσμευσης GLI2. Αντι-myc αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει τη δέσμευση της GLI2 να Tat όταν Tat συνδέθηκε με το σφαιρίδιο. (Β) σφαιρίδια επικαλύφθηκαν με αντίσωμα αντι-myc και επωάστηκαν με κυτταρολύματα από επιμολύνσεις # 1-3 εμφανίζεται στην δεξιά πλευρά. Μετά την πλύση και την έκλουση βήματα, η δεσμευμένη πρωτεΐνη υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε γέλη SDS-PAGE και κηλίδωση Western έγινε για να κοιτάξουμε για δέσμευση HIV-1 Tat. Συγκροτήματα που αναπτύχθηκε σε περίπου 27 kDa. αντίσωμα αντι-σημαία χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει τη δέσμευση της Tat να GLI2 όταν GLI2 συνδέθηκε με το σφαιρίδιο.

Η

HIV-1 Tat Συνδέεται με GLI2

Αυξημένη πλάσμα και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό ( οι) επίπεδα CSF ανοσοκατασταλτικών κυτοκινών όπως ΤΟΡ-β1 που διαπιστώθηκε κατά του HIV-1 την εξέλιξη της νόσου [8] – [10] που οδηγεί σε αύξηση της iTreg [11], [12]. Το HIV-1 διενεργοποιητή και ιική πρωτεΐνη Tat έχει ενοχοποιηθεί ως επαγωγέα του ΤΟΡ-β1 σε αμφότερα

in vitro

καθώς και

in vivo

μοντέλα [13] – [17]. Αν και Tat έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει ΤΟΡ-β1, το υποκείμενο μεταγραφική μηχανισμός δεν έχει ακόμη καθοριστεί με σαφήνεια.

Επειδή βρήκαμε ότι GLI2 ρυθμίζει ΤΟΡ-β1 στο μεταγραφικό επίπεδο, ελέγξαμε αν HIV-1 Tat δεσμεύεται για την ανθρώπινη GLI2 και μπορεί έτσι να αυξήσει ή να σταθεροποιήσει τη μεταγραφή ΤΟΡ-β1 χρησιμοποιώντας συν-immunopreciptation (συν-ΙΡ) για την αξιολόγηση της πρόσδεσης της ανθρώπινης GLI2 προς HIV-1 Tat. Διπλή επιμολύνσεις έγιναν σε κύτταρα 293Τ με τρία διαφορετικά σύνολα πλασμιδίων: (GLI2-6xMYC + HIV-1 Tat-FLAG), (GLI2-6xMYC + pcDNA3 έλεγχος), (HIV-1 Tat-FLAG + έλεγχος pCDNA3). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν και τα απελευθερώνονται πρωτεΐνες συλλέχθηκαν για συν-ΠΕ (Pierce Co-IP Kit από Thermo Scientific). Η ρητίνη αγαρόζης επικαλύφθηκε με ένα από τα τρία αντισώματα: Sigma F1804 αντι-FLAG Μ2 αντίσωμα (να δεσμεύεται Tat να χάντρα), CST 71D10 αντίσωμα anti-myc (να δεσμεύεται GLI2 να χάντρα), ή ένα αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου. Μετά συν-ΠΕ, οι εκλούσεις διεξήχθησαν σε ένα πήκτωμα SDS-PAGE που ακολουθείται από κηλίδωση Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, HIV-1 Tat δεσμεύεται ειδικά με GLI2 οποίο δεσμεύεται σε ένα σφαιρίδιο. Η αντίστροφη αντίδραση έδειξε επίσης εξειδίκευση, δεικνύοντας ότι αυτές οι δύο πρωτεΐνες μπορούν πράγματι να αλληλεπιδράσουν. Η σύνδεση του HIV-1 Tat να GLI2 υποδηλώνει μια πιθανή μηχανισμός για επαγωγή ΤΟΡ-β1 σε μόλυνση από HIV-1. Περαιτέρω πειράματα θα πρέπει να γίνει για να δοκιμαστεί η λειτουργική συνέργεια του HIV-1 Tat και GLI2 να επηρεάσει τη μεταγραφή στον υποκινητή TGF-β1.

Συζήτηση

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η GLI2 παράγοντας μεταγραφής παίζει μια προηγουμένως άγνωστη, αλλά σημαντικό ρόλο στην πολύπλοκη ρύθμιση της μεταγραφής του

TGF-β1.

Μέσω

in silico

ανάλυση διαλογής που αποκάλυψε έξι πιθανές θέσεις GLI-δεσμευτικός ως υποκινητή ανθρώπινο TGF-β1 , πέντε από τα οποία ήταν προηγουμένως άγνωστη. Χρησιμοποιώντας μεταλλακτική ανάλυση του ανθρώπινου

ΤΟΡ-β1

υποκινητή, βρήκαμε που ενισχύει GLI2

ΤΟΡ-β1

μεταγραφής σε τουλάχιστον τρεις από τις πέντε πιθανές θέσεις GLI-δέσμευσης (τοποθεσίες Α, Β, & amp? Ε). Εκτός από τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η μόλυνση των πρωτογενών αφελείς CD4

+ Τ κύτταρα (χαμηλό TGF-β1 κύτταρα που εκφράζουν) με μία ουσιαστικά δραστική ενισχύει GLI2 φακοϊού

TGF-β1

μεταγραφή. Επιπλέον, siRNA νοκ ντάουν του

GLI2

στην πρωτογενή ανθρώπινα CD4

+ CD25

hiFoxP3

+ Treg (υψηλής TGF-β1 κύτταρα που εκφράζουν) μειώθηκε σημαντικά

TGF-β1

μεταγραφή . Δείχνουμε επίσης τσιπ που GLI2 συνδέεται άμεσα με «του δικτυακού τόπου E» στο

TGF-β1

υποκινητή. Αυτό το πρόσφατα εντοπιστεί μηχανισμός GLI2 μεσολάβηση ρύθμιση ΤΟΡ-β1 μπορεί να έχει επιπτώσεις σε ασθένειες όπως ο καρκίνος και το AIDS, όπου τα υψηλά επίπεδα του ΤΟΡ-β1 συμβάλλουν στην παθογένεση.

Αν και ο ρόλος του GLI μεσολάβηση ρύθμιση του

TGF-β1

μεταγραφή δεν έχει προηγουμένως αποδειχθεί, υπάρχει έμμεση απόδειξη γι ‘αυτό το μηχανισμό. Eichenmuller

et al.

Ανακάλυψε ότι

Ptch1

knockout ποντίκια, τα οποία έχουν συστατική ενεργοποίηση της οδού ΕΛΕΡΠΕ, έχει πάνω από 400 φορές αυξημένα επίπεδα

TGF-β1

mRNA μεταγραφές [28]. Αν και οι ερευνητές βρήκαν ότι η θεωρούμενη θέση πρόσδεσης GLI στο δεύτερο υποκινητή δεν ήταν αποκρίνεται σε GLI1, δεν διερεύνηση του ρόλου των GLI2 στη ρύθμιση των πέντε πιθανές θέσεις πρόσδεσης GLI που ανακαλύψαμε στο πρώτο προαγωγέα ΤΟΡ-β1.

Επιπλέον, αρκετές εκθέσεις τονίζουν τη στενή σχέση μεταξύ του TGF-β1 και τις οικογένειές ΕΛΕΡΠΕ /GLI [33], [34]. Liu

et al.

Ανέφεραν την αλληλεπίδραση μεταξύ του SHH μονοπάτι μόριο GLI3 και οι πρωτεΐνες SMAD (παράγοντες μεταγραφής ΤΟΡ-β1 μονοπάτι) [35]. Επιπλέον Dennler

et al.

Ανέφερε ότι GLI2 και GLI1 θα μπορούσε να προκληθεί από μια SMAD μεσολάβηση μηχανισμό [36]. Οι ΤΟΡ-β υπεροικογένειας γονιδίων

ΒΜΡ-2, 4

, & amp?

7

όλα έχουν GLI-στοιχεία απόκρισης σε υποστηρικτές τους [37] – [39]. Lin

et al.

Βρήκε ένα στοιχείο SHH αποκρίνονται στην περιοχή 5′-ανοδικά υποκινητή του

ΤΟΡ-β2

[40].