Abstract

κατά τη διάγνωση, η πλειονότητα των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος παρόν με προχωρημένη νόσο, όταν θεραπευτική εκτομή δεν είναι είναι πλέον εφικτή και τρέχουσες θεραπευτικές αγωγές είναι σε μεγάλο βαθμό αναποτελεσματική. Μια βελτιωμένη κατανόηση των μοριακών στόχων για την αποτελεσματική παρέμβαση του καρκίνου του παγκρέατος είναι συνεπώς επιτακτική. Το Met κινάσης τυροσίνης υποδοχέα είναι ένας υποψήφιος που εμπλέκονται στον καρκίνο του παγκρέατος. Αξίζει να σημειωθεί ότι, Met υπερεκφράζεται σε ποσοστό έως 80% των καρκίνων του παγκρέατος επεμβατική αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα των πόρων που συσχετίζεται με κακή συνολική επιβίωση των ασθενών και τα αυξημένα ποσοστά υποτροπής μετά από χειρουργική εκτομή. Ωστόσο, η λειτουργικός ρόλος του Met σηματοδότηση σε καρκίνο του παγκρέατος παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Εδώ χρησιμοποιήσαμε παρεμβολής RNA για να εξετάσει άμεσα την τάστασις σημασία της αυξημένης σηματοδότησης Met για τον καρκίνο του παγκρέατος. Δείχνουμε ότι Met knockdown σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα μειωμένη επιβίωση των κυττάρων, των κυττάρων εισβολή, και τη μετανάστευση με κολλαγόνο Ι

in vitro

. Χρησιμοποιώντας ένα ορθοτοπικό μοντέλο για τον καρκίνο του παγκρέατος, παρέχουμε

in vivo

αποδείξεις ότι Met knockdown μειωμένη φορτίο του όγκου που συσχετίζεται με μειωμένη επιβίωση των κυττάρων και την αγγειογένεση όγκου, με ελάχιστη επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων. Αξίζει να σημειωθεί ότι, αναφέρουμε ότι Met σηματοδότηση ρυθμίζει την έκκριση του προ-αγγειογενετική χημειοκίνη ιντερλευκίνη-8 /CXCL8. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι οι ιντερλευκίνης-8 υποδοχείς CXCR1 και CXCR2 δεν εκφράζονται σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, προτείνει μια παρακρινή μηχανισμό με τον οποίο Met σηματοδότηση ρυθμίζει την ιντερλευκίνη-8 έκκριση να αναδιαμορφώσει το μικροπεριβάλλον του όγκου, ένα μυθιστόρημα εύρημα που θα μπορούσε να έχει σημαντικές κλινικές επιπτώσεις για τη βελτίωση της η αποτελεσματικότητα των θεραπειών για τον καρκίνο του παγκρέατος

Παράθεση:. Χιλ KS, Gaziova Ι, Harrigal L, Guerra YA, Qiu S, Sastry SK, et al. (2012) Met Υποδοχέα Κινάσης Τυροσίνης Σηματοδότησης επάγει έκκριση της αγγειογόνου χημειοκίνης ιντερλευκίνη-8 /CXCL8 σε καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 7 (7): e40420. doi: 10.1371 /journal.pone.0040420

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 του Φεβρουαρίου του 2012? Αποδεκτές: 6 Ιούν, 2012? Δημοσιεύθηκε: 17 Ιουλίου του 2012

Copyright: © 2012 Χιλ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας CA-119075 προς Λάε, DK-052067 σε CDL, και το CA-118 405 με SKS K.S.H. υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση της κατάρτισης ΝΙΗ /NCI Διεπιστημονική Εκπαίδευση στο Cancer Research, Τ32 (CA117834-03). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα του πόρου (PDAC) είναι μια επιθετική μορφή καρκίνου με ένα διάμεσο ποσοστό επιβίωσης των ασθενών από λιγότερο από ένα έτος, καθιστώντας την τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας των ασθενών PDAC οφείλεται σε διάφορους παράγοντες. Εν απουσία αποτελεσματικών μεθόδων ελέγχου, 80-85% των ασθενών παρουσιάζει με προχωρημένη νόσο που συχνά εμποδίζει θεραπευτική εκτομή [2]. Επιπλέον, συνήθεις θεραπείες για προχωρημένη νόσο είναι σε μεγάλο βαθμό αναποτελεσματικές [3], [4]. Έτσι, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να κατανοήσουμε τη μοριακή βάση της ανάπτυξης PDAC να εντοπίσει τους στόχους της υψηλής θεραπευτικής αξίας. Πρόσφατη γενετική ανάλυση των όγκων του παγκρέατος εντοπίστηκαν αρκετές γενετικές μεταλλάξεις κοινά σε 75-90% των περιπτώσεων ασθενών σημαντική για την έναρξη PDAC και την επακόλουθη ανάπτυξη της preinvasive παγκρέατος ενδοεπιθηλιακή νεοπλάσματα (PanINs 1-3) [5] – [7]. Σε συμφωνία με αυτό, γενετικά μοντέλα ποντικιού για PDAC έχουν επιβεβαιώσει το ρόλο συγκεκριμένων γενετικών μεταλλάξεων στην έναρξη και εξέλιξη της ασθένειας σε πρώιμο στάδιο. Παραδείγματα είναι PanIN-1 (ενεργοποίηση Kras, απώλεια Notch2) [8], [9], PanIN-2 (απώλεια λειτουργίας λόγω μεταλλάξεων στο ογκοκατασταλτικό ρ53 και p16INK4a) [10] και PanIN-3 (απενεργοποίηση του ρ53, Smad4 /DPC4 και BRCA2) [8], [11], [12]. Σε αντίθεση με αυτά τα πρώτα στάδια preinvasive βλάβες, PDAC έχει έλλειψη καθορισμένων μηχανισμών.

Αρκετές οδοί σηματοδότησης είναι πιθανό εμπλέκονται σε PDAC. Ένας υποψήφιος είναι το Met /αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων (HGF) άξονα σηματοδότησης. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, η κινάση Met τυροσίνης υποδοχέα και του προσδέματός του HGF εκφράζονται σε χαμηλά επίπεδα σε παγκρεατικά κυψελοειδή κύτταρα και το στρωματικό διαμέρισμα αντίστοιχα [13] – [15]. δεσμευτική παρακρινής του HGF στα αποτελέσματα Met στη φωσφορυλίωση του υποδοχέα οδηγεί σε αυξημένη κυτταρική επιβίωση και την κινητικότητα [16], [17]. Σε αντίθεση με πνεύμονα και γαστρικό αδενοκαρκινώματα στην οποία ενεργοποίηση μεταλλάξεων παρατείνει Met σηματοδότηση, όπως κέρδος-of-λειτουργία Met μεταλλάξεις έχουν ακόμη να αναγνωρίζονται PDAC. Κανονική παγκρέατος αγωγοί εκφράζουν χαμηλά επίπεδα Met. Αντιστρόφως Met υπερεκφράζεται σε ποσοστό έως 80% των περιπτώσεων PDAC [18], είναι μια ισχυρή ένδειξη για αυξημένα ποσοστά υποτροπής και συνολική κακή PDAC επιβίωση των ασθενών [13], [19] – [22]. Met έκφραση είναι παρούσα σε ποσοστό έως 29 ογκογόνο παγκρεατικών κυτταρικών γραμμών με διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο, συμπεριλαμβανομένων ASPC-1, Panc-1, BxPC-3 και κοστούμι-2 κύτταρα [13], [23]. Μια εξαίρεση είναι η ελάχιστα διαφοροποιημένη κυτταρική γραμμή ΜΙΑ PaCa-2, το οποίο δεν εκφράζει ενδογενή Met [13], [23]. Πρόσφατα, η Met μικρό μόριο αναστολέα SGX523 αναφέρθηκε στη μείωση της ανάπτυξης και της διείσδυσης του υποδόριου παγκρεατικών όγκων [24] αυξάνοντας ενδιαφέρον Met ως δυνητικό θεραπευτικό στόχο για προχωρημένη νόσο. Ωστόσο, ο ακριβής ρόλος του Met σηματοδότηση για PDAC παραμένει άλυτο.

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε παρεμβολής RNA για να μειωθεί Met σηματοδότηση σε ανθρώπινα παγκρεατικά ξενομοσχεύματα χρησιμοποιώντας ένα

in vivo

ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού. Met νοκ ντάουν κύτταρα (MetKD) παρέμεινε αρμόδια για τη διαμόρφωση ορθοτοπική όγκους του παγκρέατος

in vivo

? Ωστόσο, η προκύπτουσα MetKD ξενομοσχεύματα ήταν σημαντικά ανάπτυξη ανέστειλαν σε σχέση με τους όγκους που προκύπτουν από κύτταρα ελέγχου που εκφράζουν ένα μη στόχευση (ΝΤ) shRNA. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των MetKD ξενομοσχευμάτων έδειξαν αυξημένη απόπτωση των κυττάρων που συνοδεύεται από μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων και η μέση πυκνότητα αγγείων (MVD στην περιφέρεια του MetKD ξενομοσχεύματα. Σύμφωνα με αυτό το σενάριο, δείχνουμε ότι Met knockdown μειώνει έκκριση ιντερλευκίνης-8 /CXCL8 (IL-8) , ένας ισχυρός προ-αγγειογενετική χημειοκίνης που λειτουργεί ως παρακρινείς ρυθμιστής του πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων, έναν ενεργοποιητή ουδετερόφιλων και χημειοελκτικό για ινοβλάστες και άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού [25]. η ανακάλυψή μας ότι το Met είναι ένα ανάντη ρυθμιστή της έκκρισης IL-8 είναι σημαντικός και προτείνει ένα μηχανισμό με τον οποίο Met σηματοδότηση θα μπορούσε να ρυθμίσει τον καρκίνο του παγκρέατος

in vivo

, ένα μυθιστόρημα εύρημα που μπορεί να παρέχει μοναδικές ευκαιρίες για κλινικές παρεμβάσεις.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα ζώα φροντίζονται σύμφωνα με την Υπηρεσία για την Προστασία από την έρευνα Κίνδυνοι (OPRR) και τις κατευθυντήριες γραμμές νόμου καλή μεταχείριση των ζώων στα πλαίσια του πρωτοκόλλου των ζώων που εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήσης. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήσης.

Αντισώματα, κυτταρικές γραμμές και Συντήρηση

Ένα αντίσωμα έναντι του C-τελικό άκρο της Met (C-28 ) αγοράστηκε από την Santa Cruz Biotechnology. Ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι β-ακτίνης αγοράστηκε από τη Sigma. αντισώματα αντι-φωσφο τυροσίνης τοπο-ειδικό για Met Y1234 /1235 ήταν από την Upstate. Ένα αντίσωμα ειδικό για την εξωκυτταρική περιοχή του Met (αντι-hHGFR) αγοράστηκε από την R &? D Systems, Inc. Αντισώματα έναντι Κί67 αγοράστηκαν από την Abcam, διασπασμένη κασπάση 3, ERK1 /2, και φωσφο ERK1 /2 T202 /Y204 ( pERK) αντισώματα, ΑΚΤ και φωσφο ΑΚΤ (S473) ήταν από τη Cell Signaling. αντισώματα CD31 αγοράστηκαν από PharMingen και ανασυνδυασμένη ανθρώπινη και μυοειδούς HGF από την PeproTech. κύτταρα ASPC-1, BxPC-3 και ΜΙΑ PaCa-2 αγοράσθηκαν από την ATCC και τα δακτυλικά αποτυπώματα του DNA για κάθε γραμμή επαληθεύεται με τοπο-ειδική PCR (Seqwright). BxPC-3 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Gibco) με 10% Εμβρυϊκό Βόειο Ορό (FBS) και 1 χ πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. κύτταρα ASPC-1 διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagles Dulbecco (DMEM: Gibco) με 10% FBS και 1 χ πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Οι ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά εξωγενές άγριου τύπου Met έχουν περιγραφεί αλλού [23]. 293FT κύτταρα (Invitrogen) συν-επιμολύνθηκαν με βραδέος ιού περίβλημα (pMD2G), συσκευασίας (psPAX2), και shRNA πλασμίδια κατευθύνεται έναντι του ανθρώπινου Met (Sigma) για την παραγωγή φακοϊούς κωδικοποιεί το shRNA κατασκευάσματα. Με κυτταρομετρία ροής σε διαλογή τέσσερα λεντοϊού πλασμίδια τα οποία κωδικοποιούνται μοναδικές αλληλουχίες shRNA που κατευθύνονται έναντι της περιοχής κωδικοποίησης ή του 3’UTR της ανθρώπινης Met και εξέτασε την ικανότητα τους να knockdown έκφραση Met. Ταυτοποιήσαμε δύο ιοί shRNA (# 2, Sigma NM_000245.2-3702s1c1 και # 5, Sigma NM_000245.2-4462s1c1) που συνήθως είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη έκφραση Met (δεν φαίνεται). BxPC-3 και τα κύτταρα ASPC-1 επιστρώθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας ιστού μολύνθηκαν με σειριακές αραιώσεις του λεντοϊού που κωδικοποιεί MetKD shRNA-2 (5′-CCGGAGACTCATAATCCAACTGTAACTCGAGTTACAGTTGGATTATGAGT CTTTTTTG-3 ‘), MetKD shRNA-5 (5′-CCGGGCACTATTATAGGACTTGTATCTCGAGATACAAGTCTTATAATAGTGCTTTG-3′) ή ελέγχου NT shRNA (5’-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG-3 ‘), με την παρουσία 8 μg /mL βρωμιούχο εξαδιμεθρίνης πριν από την επιλογή με 5 μg /mL πουρομυκίνη για 7 ημέρες, και οι αποικίες διατηρήθηκαν σε μέσα που περιείχαν 2,5 μg /mL πουρομυκίνη για 2 μήνες. pCDNA πλασμίδια που κωδικοποιούν CXCR1 και CXCR2 ήταν ένα είδος δώρο από τον Xavier Navarro, UTMB Γκάλβεστον.

κυτταρομετρίας ροής

1-2 × 10

6 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας ιστού 10 cm και ακόλουθη προσκόλληση ήταν άνευ ορού όλη τη νύκτα. Η κυτταρομετρία ροής για τα επιφανειακά χρωματισμένο Met εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας Array BD FACS, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23].

Anchorage Ανεξάρτητοι δοκιμασίες ανάπτυξης

Ένα κάτω στρώμα του 1% αγαρόζη αραιώνονται σε μέσο που περιέχει 1% FBS με ή χωρίς 100 ng /mL HGF (PeproTech) αποτέθηκε επί 4 πλάκες ιστοκαλλιέργειας καλά. Μετά το κάτω στρώμα στερεοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, 5 × 10

3 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο που περιέχει 1% FBS με ή χωρίς 100 ng /mL HGF και μία τελική συγκέντρωση 0.4% αγαρόζης. Το κύτταρο και μίγμα αγαρόζης αποτέθηκε πάνω στις πλάκες καλλιέργειας ιστού που περιέχει 1% αγαρόζη και αφέθηκε να στερεοποιηθεί στους 4 ° C για 10 λεπτά. Μόλις στερεοποιηθεί, προστέθηκε μέσα που περιέχουν 1% FBS με ή χωρίς HGF και κύτταρα αναπτύσσονται για 6 εβδομάδες σε επωαστήρα 37 ° C με 5% CO

2. Media συμπληρωμένο με HGF αλλάχθηκε κάθε 2-3 ημέρες.

εισβολής κυττάρων και μετανάστευση Δοκιμασίες

δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης και εισβολής διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Επούλωσης τραυμάτων δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση μιας έκλειψης TE2000-U ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Nikon) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας MetaMorph v7.3.1. (Molecular Devices). Για τα ζώντα μετανάστευση κυττάρων σε κολλαγόνο Ι, τα κύτταρα ορό εξαντλημένο όλη τη νύκτα (1% FBS) και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν πάνω σε πλάκες καλλιέργειας με γυάλινο πάτο ιστού 35 mm προ-επικαλυμμένα με 15 μg /ml κολλαγόνο ουράς αρουραίου Ι (BD Bioscience) όλη τη νύκτα στους 4 ° ΝΤΟ. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν για 1 ώρα πριν από τη θεραπεία με μέσα που περιέχουν 1% FBS μόνο του ή με 100 ng /mL HGF. Οι πλάκες τοποθετήθηκαν σε ένα ζωντανό κύτταρο BioStation Imaging System (Nikon) και η θερμοκρασία του θαλάμου αφέθηκε να ισορροπήσει για 20 λεπτά, μετά την οποία εικόνες του κάθε πεδίου συλλέχθηκαν κάθε 2 min για τουλάχιστον 2 ώρες. μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε ως το συνολικό μήκος της διαδρομής σε μικρόμετρα ταξίδεψε και την ταχύτητα των κυττάρων (μικρά /min) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας NIS Στοιχεία Λογισμικού (AR3.10).

Ποντίκια και ορθοτοπική Μελέτες όγκων

ASPC -1 (5 × 10

5) ή BxPC-3 (1 × 10

6) NT, MetKD-2 ή MetKD-5 κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν ισοδύναμα επίπεδα λουσιφεράση πυγολαμπίδας, εγχύθηκαν σε 50 μΙ PBS σε το σώμα του παγκρέατος ηλικίας 5-6 εβδομάδων αρσενικών αθυμικών γυμνών ποντικών (NCI-Charles River) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. απεικόνισης βιοφωταύγεια διεξήχθη κάθε 10 ημέρες με τη χρήση ενός κρυογονικά ψύξη σύστημα απεικόνισης IVIS 100 σε συνδυασμό με την απόκτηση δεδομένων υπολογιστή σε λειτουργία Living Λογισμικό εικόνας (Xenogen Corp) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Κάθε ζώο κανονικοποιήθηκε ως προς την ένταση του σήματος του την ημέρα 10 για την προσαρμογή για τις διακυμάνσεις στην αρχική σπορά του όγκου και αναφέρεται ως το πτυσσόμενο αύξηση του όγκου του όγκου μετρήθηκε ως ο αριθμός των φωτονίων που εκπέμπονται από τον όγκο ανά δευτερόλεπτο ανά cm

2. Κατά την νεκροψία, οι πρωτογενείς όγκοι αφαιρέθηκαν χειρουργικά και ζυγίστηκαν, και τους ιστούς είτε σταθεροποιήθηκαν με φορμαλίνη για ιστολογική εκτίμηση ή φλας καταψύχθηκε για περαιτέρω ανάλυση.

Ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής

Flash κατεψυγμένα ξενομοσχεύματα ομογενοποιήθηκαν σε ΤπζοΙ αντιδραστήριο (Invitrogen) και το ολικό RNA απομονώθηκε σύμφωνα με κατασκευάζει κατευθύνσεις. 500 ng του RNA μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας iScript cDNA σύνθεσης (BioRad) με τυχαία εναύσματα εξαμερούς. 2 μL του cDNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για τη σχετική ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). πράσινο SYBR ενσωμάτωση μετρήθηκε πάνω από 40 κύκλους των 95 ° C για 30 sec, 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 1 λεπτό χρησιμοποιώντας αλληλουχίες εκκινητή για Met (προς τα εμπρός 5 ‘TAAGTGCCCGAAGTGTAAGC -3′ και αντίστροφη 5’-CTTGCCATCATTGTCCAACAAAGTCCC -3 ‘) και GADPH (προς τα εμπρός 5-CAATGACCCCTTCATTGACCTC-3′ και αντίστροφη 5’-AGCATCGCCCCACTTGATT-3 ‘). Το επίπεδο της Met mRNA καθορίστηκε με την ομαλοποίηση της C

T αξία στο C

T ανθρώπινου GAPDH χρησιμοποιώντας τη συγκριτική C

T (ΔΔ

C

T) μέθοδος, όπως περιγράφεται από τους κατασκευαστές (Applied Biosystems). Για μελέτες που χρησιμοποιούν κυτταρικές σειρές, το cDNA συνετέθη από το ολικό RNA χρησιμοποιώντας Accuscript (Stratagene) και PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση AmpliTaq Gold PCR κύριο μείγμα (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες ομάδες εναρκτήρα για ανθρώπινη CXCR1, 5′-TGGGAAATGACACAGCAAAA-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5’-AGTGTACGCAGGGTGAATCC-3 ‘(αντίστροφο), ανθρώπινο CXCR2, 5′-ACTTTTCCGAAGGACCGTCT-3′ (προς τα εμπρός) και 5’-GTAACAGCATCCGCCAGTTT-3 ‘(αντίστροφο), ανθρώπινο GADPH, 5′-ACGCATTTGGTCGTATTGGG-3′ (προς τα εμπρός) και 5’-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3 ‘(αντίστροφος) χρησιμοποιήθηκαν. Τα ενισχυμένα προϊόντα διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 2% που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο και απεικονίστηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα τεκμηρίωσης γέλης AlphaInnotech (AlphaInnotech).

ανοσοϊστοχημεία.

ορθοτοπική όγκοι υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανοσοϊστοχημεία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26] [27], με τη χρήση αντισωμάτων κατά της Met (C-28), Κί67 ή διασπασμένη κασπάση-3. Όλα τα πλακίδια με αιματοξυλίνη, και τύφλωσε έτσι ώστε σκορ έγινε κατά τρόπο αμερόληπτο. Πολλαπλασιασμό και την απόπτωση ποσοτικοποιήθηκαν με τον προσδιορισμό του ποσοστού των κυττάρων που ήταν θετικά για Κί67 και διασπασμένη κασπάση 3, αντίστοιχα. Τρία τυχαία πεδία ανά τμήμα όγκου, όπου απεικονίζονται με τη χρήση ενός στόχου 40 × σε ένα Zeiss Axiovert 200 μικροσκόπιο με μια έγχρωμη κάμερα Zeiss MRC5. Ο αριθμός των θετικώς χρωματισμένο (C

P) και αρνητικό μη χρωματισμένα κύτταρα (C

N) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας MetaMorph v7.3.1 (Molecular Devices). Το ποσοστό των θετικών χρώσης (% Ρ) κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση:% P = (C

P /(C

P + C

N)) * 100. Το ποσοστό νέκρωσης (% N) προσδιορίστηκε σε Η &? Ε δειγμάτων όγκου χρωματίζονται ξενομόσχευμα απεικονίζονται χρησιμοποιώντας ένα 5 × αντικειμενική και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας MetaMorph v7.3.1. Το ποσοστό νέκρωσης (% N) για κάθε δείγμα όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση% N = (Α

N /A

Τ) * 100, όπου το Α

N και Α

T αντιπροσωπεύουν η νεκρωτικές και το σύνολο των περιοχών, αντίστοιχα. CD31 /αιμοπεταλίων μόριο προσκόλλησης ενδοθηλιακών κυττάρων 1 χρώση (PECAM-1) αξιολογήθηκε σε κατεψυγμένα παγκρεατικά ιστούς που κόπηκαν (8-10 μm), τοποθετημένα σε θετικά φορτισμένες πλάκες και ξηραίνεται στον αέρα για 30 λεπτά και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας CD31 αντισωμάτων όπως περιγράφεται προηγουμένως [28]. Τα δείγματα ελέγχου που εκτίθενται σε ένα δευτερεύον αντίσωμα μόνο δεν έδειξε καμία ειδική χρώση. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της μέσης πυκνότητας των αγγείων (MVD) στα τμήματα χρωματίστηκαν για CD31, 3 πεδία ανά τμήμα όγκου απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας μία αντικειμενική 20 × σε Zeiss Axiovert 200 μικροσκόπιο και ο αριθμός των διακριτών CD31 θετικών αγγείων ανά πεδίο βαθμολογήθηκαν.

Η αγγειογένεση Συστοιχίες και ELISA

3 × 10

6 κύτταρα σπάρθηκαν επί πλάκας καλλιέργειας ιστού 10 cm και τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα σε 37 ° C υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2. Τα κύτταρα πλύθηκαν σε μέσα με 1% FBS και ορό εξαντλημένο τη διάρκεια της νύχτας πριν από τη θεραπεία με DMEM που περιείχε 1% FBS και μόνο (χωρίς συνδέτη) ή με 100 ng /mL HGF για 48 ώρες. Ρυθμισμένα μέσα συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν για την απομάκρυνση τυχόν κυτταρικών θραυσμάτων προ της αναλύσεως. Ανθρώπινη Αγγειογένεση Πίνακες, VEGF (R &? D Systems, Inc) και ανθρώπινο IL-8 ELISAs (BD Biosciences) διενεργήθηκαν σε ρυθμισμένα μέσα όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή. Για να ποσοτικοποιηθεί VEGF όγκου και IL-8 επιπέδων, snap κατεψυγμένα δείγματα όγκου επεξεργάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. ELISA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας πρωτεΐνη 10 μg αραιωμένο σε 100 μL με ρυθμιστικό RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 0,1% SDS, 1% ΝΡ-40 (Igepal), 0,5% δεοξυχολικό οξύ) που περιέχει πρωτεάση (2 mg /ml απροτινίνη, αναστολείς 2 mg /mL πεπστατίνη Α, και 2 mg /ml λευπεπτίνη) και φωσφατάσης (10 mM NaF, 2 mM Na

3νο

4). Οι VEGF και IL-8 πρωτεΐνη επίπεδα που ανιχνεύθηκαν σε ξενομοσχεύματα με ELISA αναφερόμενη ως pg IL-8 ή VEGF ανά λύμα μg πρωτεΐνης (BCA Assay, Pierce).

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism (V4), χρησιμοποιώντας ανάλυση ενός ή δύο τρόπος της διακύμανσης (ANOVA) με Bonferroni post-hoc ανάλυση για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ των ομάδων.

Αποτελέσματα

Σταθερό νοκ ντάουν του Met

φαρμακολογική αναστολείς

υποστηρίξει μια ογκογόνο ρόλο για την αύξηση της Met σηματοδότηση σε πολλές συμπαγείς όγκους. Ωστόσο, άμεσα αποδεικτικά στοιχεία που υποστηρίζουν την παθολογική σημασία των αυξημένων επιπέδων Met για PDAC παραμένει άλυτο. Συνεπώς, χρησιμοποιήσαμε παρεμβολή RNA για knockdown Met στα ανθρώπινα παγκρεατικά κυτταρικές σειρές BxPC-3 και ASPC-1, όπως αυτές που προέρχονται από πρωτογενή ανθρώπινα καρκίνων του παγκρέατος και εκφράζουν υψηλά επίπεδα άγριου τύπου Met. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η BxPC-3 κύτταρα άγριου τύπου για Kras και ρητή p53 μεταλλαγμένα κύτταρα ASPC-1 είναι μεταλλαγμένο για Kras και p53, το κλειδί μεταλλάξεις σημαντική για την κυτταρική μεταμόρφωση και η έναρξη της ασθένειας σε πρώιμο στάδιο [30]. Δύο πολυκλωνικά πληθυσμοί κυττάρων Met knockdown (MetKD) που εκφράζουν διαφορετικές ειδικές αλληλουχίες shRNA Met (MetKD-2 και MetKD-5) καθορίστηκαν χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένη φακοϊούς. Πολυκλωνικά πληθυσμοί ASPC-1 ή BxPC-3 κύτταρα που εκφράζουν ένα ΝΤ shRNA χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Western ανάλυση επιβεβαίωσε σταθερά νοκ ντάουν του συνολικού Met και HGF ενεργοποιηθεί Met στο BxPC-3 και MetKD-2 και MetKD-5 κύτταρα ASPC-1 σε σχέση με τα κύτταρα NT. pERK ανιχνεύθηκε μόνο σε HGF επεξεργασμένα BxPC-3 κύτταρα, σύμφωνα με τον άγριο τύπο κατάσταση Kras αυτών των κυττάρων. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα χαμηλότερα επίπεδα του HGF διεγερμένα pERK ανιχνεύθηκαν σε BxPC-3 κύτταρα MetKD όταν συγκρίνονται με κύτταρα που εκφράζουν NT (Σχήμα 1Α). Αντιστρόφως, ανάλυση Western ανιχνεύθηκαν υψηλά επίπεδα pERK σε HGF επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα ASPC-1 Met KD και NT κύτταρα συνεπής με την ογκογόνο κατάσταση Kras από αυτές τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Β). Συγκρίσιμα επίπεδα ρΑΚΤ ρουτίνας ανιχνεύθηκαν σε απόκριση σε HGF σε κύτταρα MetKD και ΝΤ. Κυτταρομετρία ροής ανάλυση επιβεβαίωσε μειωμένη έκφραση της κυτταρικής επιφάνειας Met στην MetKD BxPC-3 και τα κύτταρα ASPC-1 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου NT (σχήμα 1Γ & amp? 1D).

BxPC-3 (Α) ή ASPC- 1 κύτταρα (Β) μολυσμένα με ανασυνδυασμένο φακοϊό εκφράζουν Met knockdown τα siRNAs (2 ή 5) ή ένα μη στόχευση (ΝΤ) shRNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς (-) ή με (+) HGF και εξετάστηκαν με ανάλυση Western για pMet (Y1234 /1235) , Met, pErk1 /2, Erk1 /2, ρΑΚΤ, ΑΚΤ και β-ακτίνης επίπεδα (n = 3). Η κυτταρομετρία ροής ανιχνεύεται μειωμένη έκφραση επιφανείας Met σε BxPC-3 (C) και ASPC-1 (D) MetKD κυττάρων σε σχέση με τα κύτταρα NT. Οι τιμές εκφράζονται ως ο μέσος όρος +/- SEM λειτουργία (*** ρ & lt? 0,001? ANOVA, η = 3). Μειωμένη αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη από BxPC-3 (Ε) και κύτταρα ASPC-1 (F) MetKD σε μαλακό άγαρ σε σχέση με τα κύτταρα NT (*** ρ & lt? 0,001? ANOVA, η = 3). Συναντήθηκε νοκ ντάουν είχε ελάχιστη επίδραση στην ανάπτυξη των BxPC-3 (G) και τα κύτταρα ASPC-1 (H) MetKD σε σχέση με τα κύτταρα NT.

Η

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον Met σηματοδότηση επηρεάζει το ογκογόνο δυναμικό του BxPC- 3 και ASPC-1 κύτταρα, πραγματοποιήσαμε αγκύρωση ανεξάρτητες δοκιμασίες ανάπτυξης σε μαλακό άγαρ. κύτταρα ΝΤ και MetKD σπάρθηκαν σε 0.4% αγαρόζη σε παρουσία ή απουσία HGF και ο αριθμός των αποικιών που προκύπτει, όπως ορίζεται ως ένα σύμπλεγμα τριών ή περισσότερων κυττάρων βαθμολογήθηκε. Σε κυτταρικές σειρές NT, θεραπεία HGF οδήγησε σε μια σημαντική αύξηση στον αριθμό των αποικιών που υπάρχουν στο μαλακό άγαρ συνεπής με ένα ρόλο για Met σηματοδότηση στο Anchorage ανεξάρτητη ανάπτυξη των κυττάρων. Αντιστρόφως, HGF επεξεργασμένα κύτταρα MetKD έδειξε μειωμένη ικανότητα να αναπτύσσονται κατά ανεξάρτητον της αγκυρώσεως τρόπον σε μαλακό άγαρ (Εικόνα 1 Ε & amp? 1F). Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της Met knockdown στον πολλαπλασιασμό επαγόμενο από HGF κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι, HGF-επαγόμενο πολλαπλασιασμό δεν επηρεάστηκε από Met knockdown σε BxPC-3 και τα κύτταρα (Σχήμα 1G & amp? 1Η) 1 ASPC-.

Η επίδραση της Met knockdown σε επαγόμενο από HGF μετανάστευση κυττάρων εξετάστηκε χρησιμοποιώντας μια τραυμάτων δοκιμασία επούλωσης. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 2Α & amp? Β (Υποστήριξη Πληροφορίες S1), κύτταρα MetKD συνέπεια, επέδειξαν μειωμένη επαγόμενο από HGF κινητικότητα σε σύγκριση με τα κύτταρα NT. Χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία εισβολή Matrigel που βασίζεται, δείχνουμε επίσης ότι η απώλεια του Met σημαντικά σηματοδότησης μείωσε την επεμβατική φαινότυπο BxPC-3 κύτταρα MetKD (Σχήμα 2C). PDAC χαρακτηρίζεται από μια άφθονη δεσμοπλαστικό στρώμα που είναι πολύ εμπλουτισμένο σε συστατικά εξωκυτταρικής μήτρας που συμπεριλαμβάνει κολλαγόνο Ι Ως αποτέλεσμα, πραγματοποιήσαμε ζώντων μελέτες απεικόνισης κύτταρο για τη μέτρηση των διαφορών σε επαγόμενο από HGF μετανάστευση κυτταρικών σειρών ASPC-1 NT και MetKD σπάρθηκαν σε κολλαγόνο Ι (Σχήμα 2D). Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν για 1 ώρα σε κολλαγόνο Ι πριν από τη θεραπεία με HGF, μετά από την οποία ζουν κυτταρική μετανάστευση εξετάστηκε με μέτρηση του συνολικού μήκους διαδρομής από μεταναστεύοντα κύτταρα σε περίοδο 2 ωρών. Εν απουσία HGF, συγκρίσιμο μεταναστευτικά μήκη διαδρομής ανιχνεύθηκαν για ASPC-1 MetKD και κυττάρων NT (NT: 87.2 μm +/- 12,0? MetKD-2: 112.1 μm +/- 12,3? MetKD-5: 76.5 μm +/- 7.0) (Εικόνα 2D). Η θεραπεία με HGF αύξησε το μήκος της διαδρομής των κυττάρων APSC-1 ΝΤ (216,7 μm +/- 13.1), συσχετίζοντας με αυξημένη ταχύτητα κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αντίθετα, η θεραπεία HGF της MetKD-2 και MetKD-5 κύτταρα δεν οδήγησε σε αυξημένο μήκος διαδρομής (Ταινία S1, S2 Ταινία, Ταινία S3). Κατά συνέπεια, Met knockdown ως αποτέλεσμα τη μειωμένη μετανάστευση ASPC-1 κυττάρου επί κολλαγόνου Ι

Serum-εξαντλημένο, συρρέουσες NT ή MetKD BxPC-3 (Α) ή ASPC-1 κύτταρα (Β) τραυματίστηκαν με μηδέν, έξι περιοχές που σημειώνονται, και αμέσως απεικόνιση (0 ώρες) πριν από τη θεραπεία με HGF. Ταυτόσημες περιοχές κατά μήκος του μηδέν απεικονίστηκαν μετά από 3, 9, 18, και 24 ώρες και οι τιμές ομαλοποιήθηκαν προς το αρχικό μέγεθος του μηδέν σε 0 hr. μετανάστευση των κυττάρων αναφέρεται ως το κλείσιμο% διάκενο σε κάθε χρονικό σημείο (*** ρ & lt? 0,001? ANOVA, η = 3). MetKD μειώνει BxPC-3 εισβολή κυττάρων σε απόκριση σε HGF σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (C). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν την πτυχή αλλαγή στον αριθμό των κυττάρων /πεδίου και αναφέρονται ως η μέση τιμή +/- SEM (*** ρ & lt? 0,001? ANOVA, η = 3). Ζωντανά απεικόνιση κυττάρων του ASPC-1 κύτταρα MetKD απλώθηκαν σε κολλαγόνο Ι επικαλυμμένο γυαλί πυθμένα πιάτα κυτταρικής καλλιέργειας εμφανίζουν μειωμένη κυτταρική μετανάστευση σε απόκριση σε 100 ng /mL HGF (D). Εικόνες συλλέχθηκαν κάθε 2 λεπτά για ένα σύνολο 120 λεπτών και τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο μήκος διαδρομής +/- SEM ανά συνθήκη (*** ρ & lt? 0,001? ANOVA, Ν & gt? 30 κύτταρα).

Η

Met Νοκ ντάουν μειώνει

in vivo

Tumor ανάπτυξης

Σας ζητείται να εξεταστεί η συνέπεια της διακοπής Met στην αύξηση του όγκου

in vivo

, χρησιμοποιώντας ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού για καρκίνο του παγκρέατος . Δεδομένου ότι οι διαφορές σταυρό είδη στην αλληλεπίδραση του ποντικού HGF με ανθρώπινη Met έχει αναφερθεί [31], χρησιμοποιήσαμε πρώτα ανάλυση Western για να επιβεβαιωθεί η ενεργοποίηση του ανθρώπινου Met με HGF ποντικού σε BxPC-3 και τα κύτταρα ASPC-1. Χρησιμοποιώντας συνθήκες που έχουν ως αποτέλεσμα τη μέγιστη φωσφορυλίωση Met με ανθρώπινο HGF, δείχνουμε ότι η ανθρώπινη Met ενεργοποιήθηκε με τη ποντικού και ανθρώπου συνδέτη χρησιμοποιώντας τοπο ειδικών αντι-Met αντισώματα φωσφο-τυροσίνη και ανάλυση Western (Σχήμα 3Α & amp? 3Β). Υπό αυτές τις συνθήκες ανθρώπινου HGF ήταν 3-5 φορές πιο αποτελεσματικό από το μυϊκό HGF στη διέγερση φωσφορυλίωσης Met, σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές ότι ποντικού HGF είναι λειτουργικά ενεργό προς τον ανθρώπινο υποδοχέα

αν και

με χαμηλότερη συγγένεια [32], [ ,,,0],33].

Δυτική ανάλυση επιβεβαίωσε ότι ποντικού (mHGF) και την ανθρώπινη HGF (hHGF) ενεργοποιούν την ανθρώπινη Met στο BxPC-3 (Α) και ASPC-1 (Β) κυτταρικές σειρές NT. Αριθ ενεργοποίηση Met παρατηρήθηκε απουσία συνδέτη. Οι τιμές εκφράζονται ως μέση σχετική πυκνότητα του pMet /Met +/- SEM (** ρ & lt? 0,01 *** ρ & lt? 0,001? ANOVA, δύο ξεχωριστά πειράματα). Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε 10 ημέρες χρησιμοποιώντας

in vivo

bioluminescent απεικόνισης για BxPC-3 (C) ή ASPC-1 (D) κύτταρα μετά την ένεση και αναφέρονται ως μέσο μέγεθος του όγκου σε φωτόνια /sec /cm

2 (* ρ & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01? ANOVA). Αντιπροσωπευτικά bioluminescent εικόνες παρουσιάζονται αμέσως πριν από τη νεκροψία στις 30 ημέρες (BxPC-3) ή 45 ημέρες (ASPC-1). Το βάρος και η συνολική συχνότητα εμφάνισης (%) του BxPC-3 πρωτογενείς όγκους (Ε) και ASPC-1 (F) είναι πρωτογενείς και μεταστατικούς όγκους που αναφέρονται. Σταθερό knockdown του Met mRNA σε BxPC-3 (G) και ASPC-1 (Η) MetKD ξενομοσχεύματα επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν σε GADPH και αναφέρονται σε σχέση με τον αντίστοιχο έλεγχο NT (** & lt? P0.01? *** P & lt? 0.001? ANOVA, n = 2).

Η

Για να εξεταστεί η επίδραση του Met knockdown στην ανάπτυξη PDAC, χρησιμοποιήσαμε BxPC-3 και ASPC-1 κύτταρα προ-επισημάνθηκαν με λουσιφεράση πυγολαμπίδας να ακολουθήσει το φορτίο του όγκου με μη επεμβατικό τρόπο [26]. Ίσοι αριθμοί από MetKD και κυττάρων ελέγχου ΝΤ εγχύθηκαν εντός του σώματος του παγκρέατος αθυμικών γυμνών ποντικών και το φορτίο του όγκου ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας

in vivo

βιοφωταύγεια [26]. Η ισχυρή αύξηση του όγκου ανιχνεύθηκε σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα ελέγχου που εκφράζουν το ΝΤ shRNA (Σχήμα 3C & amp? 3D). Αντιστρόφως, συχνότητα εμφάνισης όγκου και βάρος μειώθηκε σημαντικά σε ποντικούς που ενέθηκαν με MetKD BxPC-3 ή ASPC-1 κύτταρα. Κατά τη νεκροψία (40 και 45 ημέρες για τις BxPC-3 και ASPC-1 με ένεση ποντικούς, αντιστοίχως), μικροί όγκοι μάζες ανιχνεύθηκαν εύκολα σε παγκρέατα ένεση με κύτταρα BxPC-3 MetKD-2, αλλά όχι με BxPC-3 MetKD-5 κύτταρα (Σχήμα 3C και 3Ε). Αυτό δεν οφείλεται σε προβλήματα με την σπορά του όγκου, ως μικρά πεδία όγκου ανιχνεύθηκαν εύκολα μικροσκοπικώς σε Η &? Ε τομές όγκων MetKD συνεπής με τα δεδομένα βιοφωταύγειας (Υποστηρικτικά Πληροφορίες S2). Σε ποντικούς που ενέθηκαν με ASPC-1 κύτταρα, κύτταρα MetKD δείχνουν μειωμένη μέγεθος πρωτογενούς όγκου στο ορθοτοπικό μοντέλο σε σύγκριση με ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα NT (Σχήμα 3D), συσχετίζοντας με μειωμένη συχνότητα εμφάνισης τοπικών (ήπαρ) και μακρινό (πνεύμονα) μετάσταση όγκου (Σχήμα 3F). qRT-PCR επιβεβαίωσε μειωμένα επίπεδα Met mRNA σε όγκους MetKD σε σύγκριση με τους όγκους NT (Εικόνα 3G & amp? 3Η). Έτσι, η απώλεια του Met σηματοδότηση σε BxPC-3 και ASPC-1 κύτταρα εξασθενίζει το φορτίο του όγκου

in vivo

.

Met Σηματοδοσίας αναδιαμορφώνει το αγγειακό σύστημα του όγκου

ορθοτοπική ASPC-1 όγκων απομακρύνθηκαν και υπέστησαν επεξεργασία για περαιτέρω ανάλυση. Ανοσοκαταβύθιση και ανάλυση Western των ανθρώπινων Met στις ορθοτοπική όγκους επιβεβαίωσε την ενεργοποίηση της ανθρώπινης Met με HGF ποντικού

in vivo

(Σχήμα 4Α), σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες μας δείχνουν την ενεργοποίηση των ανθρωπίνων Met με ανασυνδυασμένη HGF ποντικού (βλέπε Εικόνα 3Α & amp? 3Β). Όπως αναμένεται χαμηλότερα επίπεδα φωσφο-Met ανιχνεύθηκε στους όγκους Met KD σε σχέση με ξενομοσχεύματα NT (Σχήμα 4Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι όγκοι που παράγονται από κύτταρα ASPC-1 MetKD περιέχεται συνήθως εκτεταμένες περιοχές της κεντρικής νέκρωσης (Σχήμα 4Β) σε σύγκριση με τα μεγαλύτερα καρκινώματα που προκύπτουν από κύτταρα ASPC-1 NT. Ποσοτικοποίηση ανίχνευσε μια αύξηση κατά 5-φορές σε νεκρωτικές περιοχές εντός των μικρότερους όγκους που προέρχονται από MetKD-2 και MetKD-5 κύτταρα σε σύγκριση με όγκους ελέγχου NT (Σχήμα 4Β). Η αυξημένη νέκρωση όγκου παρατηρείται σε MetKD ASPC-1 ξενομοσχευμάτων θα μπορούσε να οφείλεται στην ταχεία ανάπτυξη του όγκου που υπερβαίνει το αγγειακό σύστημα του όγκου, αυξημένο κύτταρο όγκου απόπτωση ή μειωμένη αγγειογένεση όγκου. Για να γίνει διάκριση ανάμεσα σε αυτές τις δυνατότητες, έχουμε τομές όγκου ASPC-1 MetKD και NT για Ki67 ή διασπαστεί κασπάσης-3 για να αξιολογήσει το επίπεδο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης, αντίστοιχα. Η μορφομετρική ανάλυση της χρώσης Κί67 σε όγκους τμήματα που προέκυψαν από κύτταρα που MetKD αποκάλυψε λιγότερα θετικά κύτταρα Κί67 ανά πεδίο σε σύγκριση με τους όγκους NT (Σχήμα 4C). Εξετάζοντας τομές όγκων για διασπασμένης χρώση κασπάσης-3 αποκάλυψε υψηλότερους αριθμούς διασπασμένη κασπάση 3 θετικών κυττάρων σε όγκους MetKD σε σχέση με τους όγκους NT (Εικόνα 4D), υποδεικνύοντας ότι η απώλεια του Met σηματοδότηση θα μπορούσε να οδηγήσει σε αυξημένη ευπάθεια σε απόπτωση. Η αυξημένη απόπτωση και νέκρωση παρατηρήθηκε σε όγκους MetKD θα μπορούσε να αποδοθεί σε μειωμένη αγγειογένεση όγκου. Για να ελεγχθεί αυτό, προσδιορίσαμε την μέση πυκνότητα δοχείου (MVD) σε ΝΤ και MetKD-όγκων με ανοσοϊστοχημική χρώση με τη χρήση αντισωμάτων έναντι CD31, έναν δείκτη για τα ενδοθηλιακά κύτταρα [28]. Σύμφωνα με τα δεδομένα μας που δείχνουν αυξημένη νέκρωση στα MetKD-2 και MetKD-5 όγκους, MVD μειώθηκε σημαντικά στην περιφέρεια του MetKD όγκων σε σύγκριση με ΝΤ-προερχόμενο παγκρεατικών ξενομοσχεύματα (Σχήμα 4Ε). Δεν ανιχνεύθηκε σήμα εντός του κεντρικού μάζα των ιστών ξενομοσχεύματος, σύμφωνα με εκθέσεις για τα ανθρώπινα και ποντικού μοντέλα καρκίνου του παγκρέατος [34]. Έτσι η απώλεια της Met σηματοδότηση σε κύτταρα ASPC-1 μειώνει το φορτίο όγκου σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού, πιθανότατα ως αποτέλεσμα της μειωμένης κυτταρικής επιβίωσης και της αγγειογένεσης του όγκου.

Ανοσοκαθίζηση και ανάλυση Western ανιχνεύθηκε ισχυρή φωσφορυλιωμένη Met (pMet) σε NT όγκους σε σχέση με τα χαμηλά επίπεδα pMet σε όγκους MetKD (Α). Διαδοχικές τομές των όγκων εγκλεισμένους σε παραφίνη είτε ήταν Η &? Ε χρώση (Β) ή επεξεργασμένα για Ki67 (C), δραστική κασπάση-3 (D) και κατεψυγμένες τομές για CD31 χρώση (Ε). μορφομετρική ανάλυση δείχνει μια σημαντική αύξηση της νέκρωσης και διασπάστηκε χρώσης κασπάσης-3 με αντίστοιχη μείωση των Ki67 και CD31 χρώση ανά υψηλής ισχύος πεδίου (HPF) σε όγκους MetKD σε σχέση με τους όγκους NT (** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001 ? ANOVA). Αντιπροσωπευτικά εικόνες πεδίο που φαίνεται.

Η

Met Σηματοδοσίας Προωθεί την έκκριση αγγειογόνων παραγόντων

Met σηματοδότηση έχει αποδειχθεί ότι προάγουν την αναδιαμόρφωση του αγγειακού συστήματος του όγκου σε όγκους του μαστού και της μήτρας μέσω της προς τα πάνω ρύθμιση του VEGF και κάτω ρύθμιση θρομβοσπονδίνης-1 (TSP-1) [35]. Ο VEGF είναι ένας ισχυρός αγωνιστής της αγγειογένεσης που ενεργοποιεί τόσο πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων και τη μετανάστευση. Σε αντίθεση, TSP-1 καταστέλλει την αγγειογένεση μέσω της αναστολής του πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων και την επαγωγή απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων.