Αφηρημένο

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν μια τεχνολογία αντίθετης φοράς, «φορείς snoMEN», για στοχευμένες knock-down του mRNA που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που χρησιμοποιούν ανθρώπινα snoRNAs διαμορφωθεί για να περιέχει σύντομη περιοχές της συμπληρωματικότητας αλληλουχίας με το στόχο mRNA. Εδώ χαρακτηρίζουν τη χρήση των φορέων snoMEN να στοχεύσετε το knock-down του micro RNA πρωτογενούς μεταγραφές. Έχουμε τεκμηριώσει την ειδική knock-down της miR21 σε κύτταρα HeLa χρησιμοποιώντας φορείς πλασμιδίου που εκφράζει miR21 στοχευμένες snoMEN RNAs και να δείξει αυτό προκαλεί απόπτωση. Knock-down εξαρτάται από την παρουσία των συμπληρωματικών αλληλουχιών στο φορέα snoMEN και την επαγωγή της απόπτωσης μπορεί να κατασταλεί από την υπερβολική έκφραση των miR21. Επιπλέον, έχουμε επίσης αναπτύξει λεντοϊών για την παράδοση των snoMEN RNAs και δείχνουν αυτό αυξάνει την αποτελεσματικότητα της μεταγωγής του φορέα σε πολλές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές που είναι δύσκολο να διαμολύνουν με πλασμιδικούς φορείς. Μεταγωγή φορείς λεντοϊών που εκφράζουν snoMEN στοχεύει PRI-miR21 επάγει απόπτωση σε κύτταρα ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, τα οποία εκφράζουν υψηλά επίπεδα miR21, αλλά όχι σε ανθρώπινα πρωτογενή κύτταρα. Δείχνουμε ότι snoMEN μεσολάβηση καταστολή της έκφρασης των miRNAs εμποδίζεται από siRNA knock-down της ago2, αλλά όχι με νοκ-κάτω της ago1 ή Upf1. snoMEN RNAs colocalise με ago2 στους πυρήνες των κυττάρων και πυρηνίσκοι και μπορεί να συν-ανοσοκαταβυθίστηκε από πυρηνικά εκχυλίσματα από αντισώματα ειδικά για ago2

Παράθεση:. Ono Μ, Yamada Κ, Avolio F, Afzal V, Bensaddek D, Lamond AI (2015) Στοχευμένες Knock-Down των miR21 Πρωτοβάθμιας μεταγραφές Χρησιμοποιώντας snoMEN Φορείς επάγει την απόπτωση σε ανθρώπινα καρκινικά Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 10 (9): e0138668. doi: 10.1371 /journal.pone.0138668

Επιμέλεια: Christophe Antoniewski, CNRS UMR7622 & amp? Πανεπιστήμιο Paris 6 Pierre-et-Marie-Curie, ΓΑΛΛΙΑ

Ελήφθη: 24 Ιουνίου, 2015? Αποδεκτές: 2 του Σεπτέμβρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 25 Σεπτεμβρίου 2015

Copyright: © 2015 Ono et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η χρηματοδότηση για την έρευνα αυτή δόθηκε από ένα Wellcome Trust Grant πρόγραμμα AIL (Κωδ: 073980 /Z /03 /Ζ) (https://www.wellcome.ac.uk/) και από ένα βραβείο MRC Milstein να A.I.L. (Κωδ: G0801738) (https://www.mrc.ac.uk/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

snoMEN (snoRNA διαμορφωτής του γονιδίου έκφρασης) φορείς παρέχουν μια μορφή τεχνολογίας αντινοηματικού για τη διαμόρφωση της έκφρασης των γονιδίων στόχων με βάση συμπληρωματικές αλληλεπιδράσεις ζευγαρώματος βάσεων, ανάλογες με τις πιο οικεία συστήματα φορέα siRNA /shRNA [1]. Η τεχνολογία διάνυσμα snoMEN δημιουργείται από το χειρισμό του ανθρώπινου θέση Γ /Δ μικρό πυρηνισκικός RNA (snoRNA) HBII-180C. Αυτή η κατηγορία snoRNAs περιέχουν μια εσωτερική αλληλουχία (Μ κιβώτιο) που μπορεί να μεταβληθεί ώστε να είναι συμπληρωματικό προς RNA στόχους. snoRNAs είναι μια οικογένεια συντηρημένη πυρηνικά RNA συγκεντρώνονται στην πυρηνίσκους όπου είτε η λειτουργία στην τροποποίηση του ριβοσωματικού RNA (rRNA), ή να συμμετέχουν στην επεξεργασία rRNA κατά τη σύνθεση του ριβοσώματος υπομονάδας [2-5]. Box C /D snoRNAs είναι το όνομά του από ένα κοινό μοτίβο RNA σε αυτήν την υποοικογένεια που χρησιμεύει ως θέση δέσμευσης για μια ομάδα πρωτεϊνών κουτί C /D, συμπεριλαμβανομένων NOP56, NOP58, 15.5K και την εξαιρετικά διατηρημένη πρωτεΐνη fibrillarin, η οποία έχει την ειδική 2 «δραστηριότητα -O-μεθυλάσης. Τα περισσότερα snoRNAs κωδικοποιούνται εντός των αλληλουχιών ιντρονίου, είτε βρίσκονται στις πρωτογενείς μεταγραφές γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, ή σε ειδικά μεταγραφές που περιέχουν οι επάλληλες συστοιχίες πολλαπλών snoRNAs. Η ενδογενής snoRNAs είναι ιδιαίτερα άφθονα πυρηνικά RNA που είναι αποτελεσματικά σε επεξεργασία από πρωτογενείς μεταγραφές. Έτσι, την επεξεργασία και την παράδοση του snoMEN RNAs είναι ομοίως αποτελεσματική και δεν είναι επιρρεπείς σε κορεσμό των μηχανημάτων επεξεργασίας κύτταρο ξενιστή όταν εκφράζονται snoMEN από εξωγενείς φορείς.

Σε προηγούμενες μελέτες δείχθηκε ότι snoMEN φορείς μπορεί να μειώσει τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης με να χτυπήσει τα κάτω την έκφραση της πυρηνικής προ-mRNA, επιτρέποντας την στόχευση των συμπληρωματικών αλληλουχιών εντός ιντρονίου ή /και μη-κωδικοποιητικές 5 ‘και 3’ αλληλουχίες μέσα προδρόμους mRNA (pre-mRNAs) που πλευρίζουν [6]. Αυτό αυξάνει αποτελεσματικά την σειρά των αλληλουχιών στο RNAs στόχου που μπορεί να εξερευνηθεί για να επιτευχθεί ειδική γονιδιακή ανασταλτικά αποτελέσματα. Από κοινού με ενδογενή snoRNAs, snoMEN RNAs αποτελεσματικά μεταγράφονται από RNA πολυμεράση II προαγωγοί, και όχι από την RNA πολυμεράση III υποκινητές που χρησιμοποιούνται για τα πλασμίδια shRNA [7]. Όπως snoMEN RNAs κωδικοποιούνται εντός ιντρονίων, είναι σχετικά εύκολο να σχεδιάσει φορείς που μπορεί να εκφράσει πολλαπλά snoMEN εντός διαφορετικών εσώνια ενός ενιαίου μεταγραφής, το οποίο κωδικοποιεί επίσης ένα ρεπόρτερ πρωτεΐνη. Αυτό διευκολύνει τη δημιουργία είτε παροδική ή σταθερή, το γονίδιο knock-ins, επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας ένα ενιαίο μεταγραφή, οδηγείται από ένα μόνο υποκινητή. Αυτή η προσέγγιση χρησιμοποιώντας φορείς snoMEN έχει έτσι χρησιμοποιηθεί για την δημιουργία του ανθρώπου «αντικατάσταση πρωτεΐνη» σταθερές κυτταρικές σειρές, όπου η έκφραση μιας στοχευμένης πρωτεΐνης μειώνεται κατά snoMEN RNAs και αποτελεσματικά υποκαθίσταται από την έκφραση μιας ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το ίδιο μετάγραφο χρησιμοποιηθούν για να παραδώσουν το snoMEN [6].

Καρκίνος και άλλων πολλαπλασιαστικών ασθενειών (όπως αυτοάνοση ασθένεια και η φλεγμονή) είναι συχνά σχετίζονται με μη φυσιολογική απόπτωση, ή τον κυτταρικό θάνατο. Στα καρκινικά κύτταρα, για παράδειγμα, οι μηχανισμοί είναι συνήθως διασπώνται ότι επάγουν προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο μετά είτε σοβαρή βλάβη του DNA ή /και ελαττώματα στην κανονική εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, επιτρέποντας έτσι στα καρκινικά κύτταρα να αποφεύγουν την απόπτωση. Μια πιθανή προσέγγιση για την θεραπεία του καρκίνου είναι συνεπώς να προκαλέσει απόπτωση με βρεθεί ένας τρόπος για να αντιμετωπιστούν οι μηχανισμοί που εμποδίζουν τα ενδογενή μονοπάτια σηματοδότησης που διαφορετικά θα οδηγήσει στο θάνατο των καρκινικών κυττάρων. Θεωρείται τώρα ότι ένας από τους μηχανισμούς που συμβάλλουν επιτρέποντας πολλές μορφές των καρκινικών κυττάρων να καταστείλουν την ενεργοποίηση των οδών κυτταρικού θανάτου προκαλείται από υπερέκφραση συγκεκριμένων microRNAs, όπως miR21 [8].

miR21 ήταν ένα από τα πρώτα miRNAs ανιχνεύεται στο ανθρώπινο γονιδίωμα και εμφανίζει ισχυρή εξελικτική διατήρηση σε ένα ευρύ φάσμα από είδη σπονδυλωτών, συμπεριλαμβανομένων, πτηνών και ψαριών κλάδοι θηλαστικών [9]. προφίλ έκφρασης RNA, ανιχνεύθηκε με τη χρήση υψηλής απόδοσης μεταγραφικό προφίλ προσεγγίσεις, οι οποίες συγκρίνουν miRNAs σε όγκους και άλλες κυτταρικές γραμμές που συνδέονται με τον καρκίνο με εκείνη των φυσιολογικών κυττάρων /ιστών, εντυπωσιακά υποδηλώνουν ότι miR21 υπερεκφράζεται στην πλειονότητα των τύπων καρκίνου που αναλύθηκαν [8 ]. Πιο πρόσφατα, μελέτες αντινόημα στόχευσης ώριμη miR21 πρότεινε ότι το κλείδωμα λειτουργία miR21 μπορεί να διεγείρει απόπτωση ενεργοποιώντας την έκφραση του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου 4 πρωτεΐνης (PDCD4) σε ορισμένους τύπους καρκινικών κυττάρων, π.χ. κύτταρα HeLa και κύτταρα MCF-7 [10, 11]. Η αναστολή της miR21 αναφέρθηκε με τη χρήση συνθετικών αντινοηματικών ολιγονουκλεοτιδικών αναλόγων, συμπληρωματικό προς miR21 [12, 13]. Ωστόσο, ενώ miR21 knock-down μέσω αντίθετης φοράς τροποποιημένα ολιγονουκλεοτίδια αναφέρθηκε για να συλλάβει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, τόσο

in vitro

και

in vivo

, ζητήματα παραμένουν σε χρήση αυτής της προσέγγισης για την κλινική θεραπεία, σχετικά με η χαμηλή αποδοτικότητα του συστήματος απελευθέρωσης και των δυνάμει παρενέργειες των αντινοηματικών ολιγονουκλεοτιδίων που πρέπει ακόμη να αντιμετωπιστούν. Η χρήση του siRNA /shRNA ως εναλλακτικό μηχανισμό για στόχευση αναστολή της miRNAs έχει προταθεί ως θεραπευτικό, αλλά περιλαμβάνει επίσης τους δυνητικούς κινδύνους, όπως εκτός στόχου επιδράσεις και διάσπαση του RNA επαγόμενη φίμωση συμπλόκου (RISC) στο κύτταρο [ ,,,0],14-17]. Παρ ‘όλα αυτά, αρκετές μελέτες έχουν περιγράψει την αναστολή της έκφρασης του ώριμου miR21 χρήση siRNA /shRNA, ειδικά επηρεάζει μόνο το 22 βάσης επεξεργασία miRNA αλλά δεν προκαλεί knock-down του πρωτογενούς προϊόντος μεταγραφής miR21 [18].

Micro RNAs (miRNAs) περιλαμβάνουν μία οικογένεια από σύντομη, ρυθμιστικών RNAs, τυπικά 22 νουκλεοτίδια σε μήκος, το οποίο μπορεί να μετα-μεταγραφικά ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση

in vivo

. Στα θηλαστικά, έχουν αναφερθεί miRNAs να ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση κατά κύριο λόγο από τους μηχανισμούς που αναστέλλουν μετάφραση του μεταγραφών που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, πιθανώς μέσω ζευγαρώματος βάσεων σε συγκεκριμένες αλληλουχίες στόχο στο mRNA 3 ‘αμετάφραστες περιοχές (UTRs) [19]. Σε ορισμένες περιπτώσεις οι miRNAs μεταγράφονται ως ανεξάρτητη μονάδα μεταγραφής που δεν κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη. Ωστόσο, πολλοί miRNAs βρίσκονται εντός των αλληλουχιών ιντρονίου των γονιδίων που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη. Αυτά τα εσώνια που κωδικοποιείται miRNAs είναι επομένως συνεκφράζεται με κωδικεύουσα πρωτεΐνη υποδοχής τους γονίδια [20-25]. Ώριμη miRNAs υποβάλλονται σε επεξεργασία από το πλέον μεταγραφές προ-miRNA, οι οποίες είναι συνήθως ~ 70 νουκλεοτιδίων μήκους, φουρκέτα δομές. Αυτά τα προ-miRNAs με τη σειρά υποβάλλονται σε επεξεργασία από τις αρχικές πρωτογενείς μεταγραφές γονιδίου, που συχνά αναφέρεται ως pri-miRNAs [26].

Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι snoMEN φορείς μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να knock-down miR21 από στόχευση συγκεκριμένων αλληλουχιών εντός pri-miRNA μεταγραφές, με αποτέλεσμα την απόπτωση των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών. Έχουμε διερευνήσει παράγοντες που απαιτούνται για snoMEN μεσολαβεί αναστολή της έκφρασης miRNA και δείχνουν ότι snoMEN μπορεί να παραδοθεί σε κύτταρα από δύο πλασμίδιο και φορείς λεντοϊού.

Αποτελέσματα

snoMEN στόχευση pri-miR21 διεγείρουν απόπτωση σε μετασχηματισμένα κύτταρα

η υπόθεσή μας είναι ότι εάν snoMEN μπορεί να στοχεύεται να προκαλέσει μείωση των επιπέδων του πρωτογενούς μεταγραφήματος miR21 αυτό μπορεί να επάγει απόπτωση σε κύτταρα όγκου των οποίων η επιβίωση εξαρτάται από υψηλά επίπεδα έκφρασης miR21. Ως εκ τούτου, για να ελέγξει αν snoMEN μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να τροποποιήσει την έκφραση miR21, ένας φορέας πλασμίδιο που εκφράζει Μ snoRNAs κουτί τροποποιημένου στοχεύουν σε ενδογενή PRI-miR21 κατασκευάσθηκε (Σχήμα 1Α), με βάση την προηγούμενη μελέτη snoMEN [1]. Αυτός ο φορέας snoMEN (mCherry-pri-miR21 snoMEN) κωδικοποιείται τρεις snoMEN, που κάθε στοχευμένη διαφορετικές περιοχές της αλληλουχίας pri-miR21. Αυτές οι τρεις RNAs snoMEN κωδικοποιούνται η καθεμιά εντός ξεχωριστό εσώνια της ίδιας μεταγραφής RNA ροΙ II, το οποίο επίσης κωδικοποιεί την πρωτεΐνη mCherry που δρα ως δείκτης φθορίζουσα πρωτεΐνη (FP) σε επιμολυσμένα κύτταρα. Μετά την επιμόλυνση του mCherry-pri-miR21 snoMEN πλασμιδιακό φορέα σε κύτταρα HeLa, FISH (φθορισμού

σε situ υβριδισμού

) πειράματα, χρησιμοποιώντας snoMEN-ειδικούς ανιχνευτές, έδειξε μια σταθερή μοτίβο εντοπισμού κατάσταση για τα RNAs snoMEN που ήταν κατά κύριο λόγο πυρηνικά, με συσσώρευση σε πυρηνίσκους (Εικόνα 1Β και άλλα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό το πρότυπο είναι συνεπές με μελέτες έκφρασης προηγούμενη snoMEN [1, 6].

(α) Δομή για στοχευμένη ενδογενή miR21 πρωτογενή μεταγραφή (mCherry-pri-miR21 snoMEN) και σχηματικό διάγραμμα του miR21 οδού ωρίμανσης. Αυτό το κατασκεύασμα έχει τρεις snoMEN RNAs (μπλε πεντάγωνα) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [1], εκτός από το ότι εδώ οι αλληλουχίες κουτί M είναι συμπληρωματικές προς συγκεκριμένες αλληλουχίες εντός του ενδογενούς πρωτογενούς μεταγραφής miR21. (Β) Επικύρωση της έκφρασης snoMEN από φθορίζοντος in situ υβριδισμού (FISH) ανάλυση. Κάθε snoMEN RNA ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας ένα κουτί M ειδικό RNA ανιχνευτή επισημασμένο με Cy3 (Cy3). DNA βάφονται με DAPI (DAPI). μπαρ κλίμακα είναι 10 μm. (Γ) ανάλυση RNA. Ολικό RNA από κύτταρα HeLa συλλέχθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και qRT-PCR για τον εντοπισμό προδρόμων μορίων miR21 χρησιμοποιώντας πρόδρομη miR21 ειδικούς εκκινητές (προ-miR21). Μετά τη σύνθεση cDNA, qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ωριμάσει ειδικό εκκινητή miR21 και καθολική αστάρι που παρέχονται από το κιτ Perfecta SYBR Green qPCR (Quanta Βιοεπιστημών, δείτε επίσης τις μεθόδους) (Ωριμάζουν-miR21). U3 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Γραφική παράσταση απεικονίζει μέση και τυπική απόκλιση από το ελάχιστο των 5 ανεξάρτητων πειραμάτων. (Δ) κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με pri-miR21-snoMEN /ελέγχου για 24 ώρες πριν από την συνολική εκχύλιση RNA και ανάλυση κηλιδώσεως Northern.

Η

Στις 24 ώρες μετά τη παροδική επιμόλυνση του πλασμιδίου snoMEN mCherry-πρω- miR21 σε κύτταρα HeLa, τα οποία πολύ ρητή miR21 [27], παρατηρήσαμε ~ 65% και ~ 45% knock-down για προ-miR21 και ωρίμασε miR21, αντίστοιχα, σε σύγκριση με ένα αρνητικό snoMEN ελέγχου (Control) φορέα, όπως κρίνεται από τα δύο qRT-PCR (Σχήμα 1 C) και ανάλυση στύπωσης Northern (Σχήμα 1 D). Περαιτέρω, κύτταρα επιμολυσμένα με το mCherry-PRI-miR21 snoMEN πλασμιδίου έδειξαν υψηλά επίπεδα απόπτωσης (Εικόνα 2Α βέλος). Σε αντίθεση, τα κύτταρα επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο ελέγχου snoMEN (Control), το οποίο δεν έχει καθόλου ως στόχο ενδογενή γονίδια, δεν έδειξαν σημάδια απόπτωσης (Εικόνα 2Α). Πολλαπλές δείκτες απόπτωσης ελέγχθηκαν σε κάθε περίπτωση, συμπεριλαμβανομένης μιας ανάλυσης αννεξίνης-ν χρησιμοποιώντας FACS (ενεργοποιούμενη με φθορισμό ταξινόμηση κυττάρων) (Εικόνα 2Β), μια ανάλυση ανοσοφθορισμού της διασπασμένης κασπάσης-3 (Σχήμα 2C), κηλίδωση Western ανάλυση για διασπασμένου PARP1 και Διασπασμένη κασπάση 3 (Εικόνα 2D). Όλες αυτές οι δοκιμασίες έδειξαν τα πάνω ρύθμιση της απόπτωσης ειδικώς σε κύτταρα επιμολυσμένα με το πλασμίδιο mCherry-PRI-miR21 snoMEN. Ωστόσο, συν-επιμόλυνση των πλασμιδίων miR21 shRNA-pLVX (που εκφράζει προ-miR21) και mCherry-PRI-miR21 snoMEN, οδήγησε σε μικρή ή καθόλου κυτταροτοξικότητα και απόπτωση, σε σύγκριση με συν-επιμόλυνση των κυττάρων με mCherry-pri-miR21 snoMEN και ο αρνητικός μάρτυρας ΕΟΡΡ- pLVX (που εκφράζουν EGFP πρωτεΐνη μόνο) πλασμίδια έκφρασης (Σχήμα 3Α και 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η απόπτωση που προκαλείται από snoMEN μεσολάβηση εξάντληση miR21 μπορούν να διασωθούν από εξωγενές miR21 πάνω έκφραση.

(α) μικροφωτογραφίες που δείχνουν παραδείγματα επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με pri-miR21-snoMEN. Εικόνες ελήφθησαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα βέλη υποδεικνύουν τα κύτταρα δείχνει ένα φαινότυπο απόπτωσης. μπαρ κλίμακα είναι 10 μm. (Β) γραφική παράσταση δείχνει μία χρονική πορεία των αλλαγών στον πληθυσμό των αννεξίνης-V (δείκτης απόπτωσης) θετικών κυττάρων μετά από επιμόλυνση με είτε pri-miR21-snoMEN (Green), ή ελέγχου (κόκκινο). Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας FACS. σήμα αννεξίνη-V ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο νεξίνη γκουάβα (τεχνολογίες γκουάβα). (Γ) Οι εικόνες δείχνουν μοτίβο εντοπισμού του DNA (DAPI, Μπλε), ένα επιμόλυνση FP-δείκτη είτε pri-miR21-snoMEN /Ελέγχου (mCherry, κόκκινο) και ένα δείκτη απόπτωσης (Διασπασμένη κασπάση-3, πράσινο). Αιχμές βελών δείχνουν απόπτωση δείκτη θετικά κύτταρα. μπαρ κλίμακα είναι 10 μm. (Δ) στύπωμα Western που δείχνει πρωτεΐνες maker σε κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με pri-miR21-snoMEN /Ελέγχου για 24 ώρες πριν από την εκχύλιση των πρωτεϊνών. Λύματα ολόκληρων κυττάρων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

(α) μικροφωτογραφίες που δείχνουν πείραμα διάσωση της επαγωγής απόπτωσης με συν-επιμόλυνση με pri-miR21-snoMEN (mCherry) και προ-miR21 πλασμίδιο έκφρασης (GFP + miR21) /Ελέγχου πλασμίδιο που εκφράζει πρωτεΐνη GFP μόνο (GFP). Εικόνες ελήφθησαν 72 ώρες που ακολουθείται μετά την επιμόλυνση. μπαρ κλίμακα είναι 10 μm. (Β) ανάλυση RNA. Ολικό RNA από κύτταρα HeLa συλλέχθηκε 24 ώρες μετά την συν-επιμόλυνση με pri-miR21-snoMEN (mCherry) και πλασμίδιο έκφρασης προ-miR21 (miR21) /Ελέγχου πλασμιδίου που εκφράζουν πρωτεΐνη GFP μόνο (GFP) και qRT-PCR πραγματοποιήθηκε για τον εντοπισμό miR21 πρόδρομα μόρια χρησιμοποιώντας miR21 πρόδρομα ειδικούς εκκινητές (προ-miR21, κόκκινο). Μετά τη σύνθεση cDNA, qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ωριμάσει ειδικό εκκινητή miR21 και καθολική αστάρι που παρέχονται από το κιτ Perfecta SYBR Green qPCR (Quanta Βιοεπιστημών, δείτε επίσης τις μεθόδους) (Ωριμάζουν-miR21, πράσινο). U3 snoRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Γραφική παράσταση απεικονίζει μέση και τυπική απόκλιση από το ελάχιστο των 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) Μικρογραφίες δείχνουν την πρόληψη της επαγωγής μη απόπτωση με την επιμόλυνση με pri-miR21-snoMEN mut, η οποία έχει 3 αναντιστοιχίες βάση σε κάθε κουτί M συμπληρωματική αλληλουχία σε pri-miR21. Εικόνες ελήφθησαν 72 ώρες που ακολουθείται μετά την επιμόλυνση. μπαρ κλίμακα είναι 10 μm. (Δ) ανάλυση RNA. Ολικό RNA από κύτταρα HeLa συλλέχθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με είτε pri-miR21-snoMEN mut ή ελέγχου. Μετά τη σύνθεση cDNA, qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ωριμάσει ειδικό εκκινητή miR21 και καθολική αστάρι που παρέχονται από το κιτ Perfecta SYBR Green qPCR (Quanta Βιοεπιστημών, δείτε επίσης τις μεθόδους). U3 snoRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Γράφημα απεικονίζει μέση τιμή και την τυπική απόκλιση από το ελάχιστο των 4 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Για τη διερεύνηση της σχέσης μεταξύ της αλληλουχίας της περιοχής κουτί M του snoMEN και το pri-miR21 αλληλουχίας στόχου, μια μεταλλαγμένη εκδοχή του mCherry-pri-miR21 snoMEN πλασμίδιο (pri-miR21 snoMEN mut), η οποία περιελάμβανε τρεις αναντιστοιχίες στην pri-miR21 συμπληρωματική αλληλουχία, έγινε και αναλύθηκαν για τη μέτρηση των δύο knock-down επίπεδα και τυχόν φαινότυπο απόπτωση (Σχήμα 3C και 3D). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι 3 μεταλλάξεις βάσης αναντιστοιχία στο παράθυρο Μ εξαλείψει αποτελεσματικά τόσο το φαινότυπο απόπτωσης και δραστικότητα knock-down, συγκρίσιμη με τον φορέα snoMEN αρνητικό μάρτυρα (Σχ 3C και 3D). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι miR21 knock-down και η προκύπτουσα φαινότυπο απόπτωσης παρατηρείται με το φορέα mCherry-pri-miR21 snoMEN εξαρτάται από τη συμπληρωματικότητα αλληλουχίας μεταξύ της περιοχής κουτί M και την στοχευμένη περιοχή των pri-miR21.

Επίσης, κατασκευάστηκε και δοκιμαστεί ένα άλλο φορέα snoMEN, mCherry-προ-miR21 snoMEN, η οποία στοχεύει πρόδρομος miR21 ακολουθίες (Σχήμα Α στο S1 αρχείου). Παροδική επιμόλυνση του mCherry-προ-miR21 snoMEN πλασμιδίου σε κύτταρα HeLa είχε ως αποτέλεσμα miR21 knock-down και επαγωγή της απόπτωσης, παρόμοια με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν παραπάνω με το πλασμίδιο mCherry-PRI-miR21 snoMEN. Τα αποτελέσματα για mCherry-προ-miR21 snoMEN και mCherry-pri-miR21 πλασμίδια snoMEN ήταν παρόμοια σε σχέση με την ανάλυση FISH, η δοκιμασία αννεξίνης-V χρησιμοποιώντας FACS και knock-down επίπεδα miR21, όπως αναλύθηκε από qRT-PCR, (Σχ BD σε S1 File). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι snoMEN φορείς μπορεί πράγματι να στοχεύουν miRNA πρωτοβάθμια μεταγραφές, η οποία παρέχει μεγαλύτερη ευελιξία στο σχεδιασμό των φορέων knock-down από τη στόχευση μόνο μικρό (~ 22 βάση), ώριμες ακολουθίες miRNA.

Στη συνέχεια, ελέγξαμε εάν snoMEN φορείς θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη στόχευση άλλων miRNAs, διακριτή από miR21. Έτσι, snoMEN φορείς σχεδιάστηκαν για να στοχεύσουν τέσσερις προηγουμένως καλά χαρακτηρισμένο miRNA πρωτογενή μεταγραφές [27-30], δηλαδή, pri-miR31, pri-ας-7g, PRI-miR132 και pri-miR210, και knock-down δραστηριότητά τους μετράται με τη χρήση qRT -PCR μετά από παροδική επιμόλυνση σε κύτταρα HeLa (Εικόνα 4Α). Αυτό έδειξε συγκεκριμένες και να αναπαραχθούν knock-down και για τις τέσσερις στοχευμένες miRNAs, σε σύγκριση με τα αρνητικά snoMEN ελέγχου, όπως κρίνεται από qRT-PCR. Επιπλέον, για κάθε μία από τις στοχοθετημένες miRNAs στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η ειδικότητα των miRNA knock-down από τους φορείς snoMEN. Για να το κάνετε αυτό χρησιμοποιήσαμε qRT-PCR για να μετρήσει και να συγκρίνει τα επίπεδα της αντίστοιχης στοχευμένα και μη στοχευμένα micro RNAs κατά την έκφραση του, είτε ενός miRNA στοχευμένη snoMEN RNA, ή ο αρνητικός μάρτυρας snoMEN RNA (Σχήμα 4Β). Αυτό έδειξε, για παράδειγμα, ότι η έκφραση του mCherry-PRI-miR21 snoMEN προκάλεσε ειδική μείωση στα επίπεδα miR21 με ελάχιστα ή καθόλου επιδράσεις εκτός στόχου για τα επίπεδα των άλλων τεσσάρων μικρο RNAs που δοκιμάστηκαν. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για κάθε ένα από τα διανύσματα snoMEN απευθύνονται στους τέσσερις άλλους miRNAs δοκιμάστηκαν παραπάνω, δηλαδή, pri-miR31, pri-ας-7g, PRI-miR132 και pri-miR210.

φορείς (α) snoMEN απευθύνονται σε πρόσθετες miRNAs. Ολικό RNA από κύτταρα HeLa συλλέχθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και μετά από τη σύνθεση cDNA, qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ωριμάσει miRNAs στοχεύουν ειδικούς εκκινητές, δηλαδή miR31, αφήστε-7g, miR132, miR210 και καθολική αστάρι που παρέχονται από το κιτ Perfecta SYBR Green qPCR (Quanta βιοεπιστήμες, βλέπε επίσης τις μεθόδους) (Ωριμάζουν-miRNA, πράσινο). U3 snoRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Γραφική παράσταση απεικονίζει μέση και τυπική απόκλιση από το ελάχιστο των 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Ανάλυση της ειδικότητας στόχευσης miRNA knock-down χρήση φορέων snoMEN. qPCR διεξήχθη για 5 διαφορετικές miRNAs (miR21, miR-31, ας-7g, miR132, miR-210) για τον έλεγχο πιθανής off επιπτώσεις στόχο της snoMEN φορείς στόχευσης pri-miRNAs, δηλαδή pri-miR21 snoMEN, pri-miR31 snoMEN, pri του- επιτρέψτε-7g snoMEN, pri-miR132 snoMEN, pri-miR210 snoMEN. Το γράφημα δείχνει μέσος λόγος σήματος για τρία ανεξάρτητα πειράματα συγκρίνοντας ειδικών στοχοθετημένων snoMEN με έλεγχο snoMEN επιμόλυνση (Ελέγχου, Κόκκινο). Κάθε σήμα ομαλοποιήθηκε σε σύγκριση με το επίπεδο U3 snoRNA.

Η

Η έκφραση της snoMEN από ένα φορέα λεντοϊού

Για να βελτιωθεί η ευελιξία της παράδοσης snoMEN μέσα στα κύτταρα, ιδίως με στόχο τη βελτίωση της παροχής του snoMEN σε κυτταρικές γραμμές που δείχνουν χαμηλή αποτελεσματικότητες επιμόλυνσης για φορείς πλασμιδίου, επιδιώξαμε να κατασκευάσει φορείς λεντοϊών που μπορεί να εκφράσει snoMEN (Σχήμα 5Α). Τα περισσότερα κύτταρα θηλαστικών είναι επιρρεπή σε λοίμωξη οφειλόμενη σε φακοϊό, συμπεριλαμβανομένων τόσο διαιρούμενα και μη διαιρούμενα κύτταρα, βλαστικά κύτταρα, και πρωτογενή κύτταρα [31]. Συγκρίναμε λεντοϊού έκφραση των pri-miR21 snoMEN είτε σε πρωτογενή ή καρκινικών κυττάρων, που προέρχονται από ανθρώπινους ιστούς. Δύο ξεχωριστές λεντοϊού snoMEN φορείς κατασκευάστηκαν, δηλαδή, lenti-mCherry-PRI-miR21 snoMEN και lenti-mCherry-προ-miR21 snoMEN, οι οποίες στοχεύουν διαφορετικές περιοχές του πρωτογενούς προϊόντος μεταγραφής miR21 (Σχήμα 5Α και επίσης βλέπε Σχ Α στο S1 File). Τόσο pri-miR21 snoMEN & amp? προ-miR21 snoMEN κωδικοποιούν επίσης mCherry cDNA ως δείκτης έκφρασης για επιμολυσμένα κύτταρα. Όπως φαίνεται από την ανάλυση FISH, κάθε ένα από τα lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN, lenti-mCherry-προ-miR21 snoMEN και αρνητικό μάρτυρα lenti-mCherry-Control snoMEN (EGFP στοχευμένες), εκφράζουν snoMEN RNAs που συσσωρεύονται στην πυρηνίσκους, παρόμοια με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται όταν snoMEN RNAs εκφράζονται από επιμολυσμένα φορέων πλασμιδίου (Σχ Ε σε S1 αρχείων και Σχήμα 1Β) [1]. Η έκφραση του snoMEN RNAs από τα ιικά οχήματα επιβεβαιώθηκε επίσης με ανάλυση κηλίδος Northern (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(α) Δομή του λεντοϊού snoMEN κωδικοποιεί διάνυσμα στοχεύουν προς το ενδογενές πρωτογενή μεταγραφή miR21 (Lenti-mCherry-pri -miR21 snoMEN). Αυτό το κατασκεύασμα έχει τρεις snoMEN RNAs (μπλε πεντάγωνα) και μία cDNA FP-δείκτη mCherry όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1Α, εκτός του ότι το ένθετο υπο-κλωνοποιήθηκε εντός ενός φορέα που θα παράγει το φακοϊό σωματιδίου (pLVX-puro, Clontech). (Β) Μικρογραφίες δείχνουν την επαγωγή απόπτωσης με μεταγωγή είτε με Lenti-mCherry-pri-miR21-snoMEN, ή σωματίδια του ιού Lenti-mCherry-Control-snoMEN. Εικόνες ελήφθησαν 72 ώρες μετά την μεταγωγή. μπαρ κλίμακα είναι 10 μm. (Γ) Ολικό RNA από ανθρώπινο πνεύμονα πρωτογενή κύτταρα (ATCC-CCL-75) και τον καρκίνο του πνεύμονα (ATCC-CRL-5868) συλλέχθηκε 24 ώρες μετά την μεταγωγή. Μετά την σύνθεση cDNA, qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας τόσο μια ωριμάσει ειδικό εκκινητή miR21 και ένα καθολικό εκκινητή που παρέχεται από το κιτ Perfecta SYBR Green qPCR (Quanta Biosciences, βλέπε επίσης μέθοδοι). GAPDH χρησιμοποιήθηκε σαν ένας έλεγχος. Γραφική παράσταση απεικονίζει μέση και τυπική απόκλιση από το ελάχιστο των 4 ανεξάρτητα πειράματα. (Δ) Διάγραμμα δείχνει μια χρονική πορεία των αλλαγών στον πληθυσμό αννεξίνης-V θετικά κύτταρα σε μεταγωγή είτε με lenti-pri-miR21-snoMEN (Πράσινο), lenti-προ-miR21-snoMEN (Μπλε) ή Control (Κόκκινο). Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας FACS. Το σήμα αννεξίνη-V ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο γκουάβα νεξίνη (τεχνολογίες γκουάβα).

Η

Στη συνέχεια, lenti-mCherry-pri-miR21 ιοί μετήχθησαν είτε σε WI-38 (ATCC-CCL-75) της ανθρώπινης ινοβλάστες πνεύμονα (που απομονώνεται από ένα έμβρυο σε 3 μήνες κύησης), τα οποία εκφράζουν χαμηλά επίπεδα miR21, ή σε ανθρώπινα κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, που ιδρύθηκε από έναν άνθρωπο ασθενή (ηλικία 55 ετών, στάδιο 2), το οποίο ιδιαίτερα ρητή miR21 (Εικ F σε S1 Αρχείο). Αυτό το επίπεδο έκφρασης miR21 δεν άλλαξε μετά την μεταγωγή ενός φορέα Lenti-mCherry-Control snoMEN (Σχήμα ΣΤ στο S1 αρχείου). Αυτά τα κύτταρα είναι δύσκολο να διαμολύνουν με πλασμίδια DNA χρησιμοποιώντας γενικές αντιδραστήρια μορφομετατροπής. Περισσότερο από το 90% των πρωτογενών και τόσο τα καρκινικά κύτταρα έδειξαν έκφραση mCherry 24 ώρες μετά την μεταγωγή φακοϊό. Πρωτογενή κύτταρα που μετατρέπονται είτε pri-miR21 snoMEN, ή προ-miR21 snoMEN, συνέχισε να αυξάνεται και συνέχισε να εκφράσουν mCherry (Σχήμα 5Β και Σχήμα G αριστερό πάνελ σε S1 αρχείου). Ωστόσο, οι lentivirus μεταδιηγερμένα κύτταρα πνεύμονα αδενοκαρκινώματος έδειξε μια ισχυρή κυτταροτοξική φαινότυπο εντός 3 ημερών από την μεταγωγή (Σχήμα 5Β μεσαίο πλαίσιο και το Σχήμα G δεξιά πάνελ σε S1 File). Ενώ αυτό καρκινικό κύτταρο ειδικών κυτταροτοξικών φαινοτύπου παρατηρήθηκε μετά την μεταγωγή είτε με το lenti-mCherry-PRI-miR21 snoMEN, ή τον φορέα Lenti-mCherry-προ-miR21 snoMEN, μεταγωγή με τον αρνητικό φορέα λεντοϊού ελέγχου που εκφράζουν snoMEN στόχευσης EGFP (lenti-mCherry -Έλεγχος snoMEN?. όχι ενδογενής στόχου), δεν έδειξε κυτταροτοξικά φαινότυπο είτε στην πρωτογενή, ή αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα κυττάρων (Σχήμα 5Β δεξί πάνελ)

Μεταγωγή είτε lenti-mCherry-PRI-miR21 snoMEN, ή lenti-mCherry-προ-miR21 snoMEN, σε κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, το οποίο πολύ ρητή miR21, είχε ως αποτέλεσμα σε κάθε περίπτωση σε ~ 25% μείωση στα επίπεδα των ώριμων miR21 RNA, σε σύγκριση με τα κύτταρα μετάγονται με τον αρνητικό μάρτυρα, lenti-mCherry- φορέα ελέγχου snoMEN, όπως κρίνεται από qRT-PCR (Σχ 5C και Σχήμα η στο S1 File). Επιπλέον, η δοκιμασία αννεξίνης-ν, χρησιμοποιώντας FACS, παρουσίασαν αυξορρύθμιση αννεξίνης-ν στα κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα εξής μεταγωγή είτε με lenti-mCherry-PRI-miR21 snoMEN, ή lenti-mCherry-προ-miR21 snoMEN, αλλά όχι μετά από μεταγωγή με τον αρνητικό έλεγχο λεντοϊού snoMEN φορέα (Σχήμα 5D).

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι οι φορείς λεντοϊών σε θέση να εκφράσουν snoMEN RNAs μπορούν να μεταχθούν σε κύτταρα θηλαστικών με υψηλή απόδοση. Παράδοση snoMEN στοχεύουν αλληλουχίες στο pri-miR21 επάγει απόπτωση σε κύτταρα ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, αλλά όχι σε μη μετασχηματισμένα ανθρώπινου πνεύμονα πρωτογενή κύτταρα.

σύγκριση siRNA /shRNA και snoMEN pri-miRNA παρεμβολή

Έχοντας φαίνεται από τα παραπάνω ότι το Μ snoRNAs κουτί τροποποιημένου μπορεί να μειώσει την έκφραση των ενδογενών miRNAs σε ανθρώπινα κύτταρα όταν στοχεύει σε μία αλληλουχία εντός του πρωτεύοντος προϊόντος μετεγγραφής ενός miRNA που δεν υπάρχει στο ώριμο miRNA, έχουμε την επόμενη συνέκριναν την ικανότητα του siRNA ολιγοριβονουκλεοτιδίων να knock-down έκφραση του miR21 όταν εστιάζονται στις ίδιες αλληλουχίες πρωτογενούς μεταγραφήματος (Σχήμα 6Α). Για την εκτέλεση αυτών των συγκρίσεων, τρία ολιγοριβονουκλεοτίδια siRNA συμπληρωματικά προς τις ίδιες αλληλουχίες πρωτογενούς μεταγραφήματος σε miR21 pri-miRNA ως στόχο των Μ snoRNAs box-τροποποιημένα σε mCherry-pri-miR-21 snoMEN, διαμολύνθηκαν σε κύτταρα HeLa (Σχ 6Α και το Σχ I στο S1 αρχείου). Και οι τρεις pri-miRNA siRNAs (si21M1-3), έδειξε μικρή ή μηδενική knock-down είτε ώριμου-miR21 ή προ-miR21 επίπεδα, όπως έκανε και ένα ακόμη αρνητικό έλεγχο siRNA (Scramble), όπως κρίνεται από qRT-PCR (Σχήμα 6Β αριστερό πάνελ) και με κηλίδωση Northern (Σχήμα 6Β δεξί πάνελ). Ως θετικός έλεγχος, ένα άλλο siRNA στοχεύουν στην ώριμη αλληλουχία miR21 (si21), είχε ως αποτέλεσμα ~ 25% knock-down, ειδικά για τις ώριμες miR21 αλλά όχι για την προ-miR21, σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [12, 13]. Επιπλέον, οι ίδιες αναλύσεις διεξήχθησαν επίσης με χρήση της τεχνολογίας shRNA (Εικ 6Α και 6C και Σχήμα Ι σε S1 File). Έτσι, τρία πλασμίδια έκφρασης shRNA ανά γονίδιο, συμπληρωματικά προς τις ίδιες αλληλουχίες πρωτογενούς μεταγραφήματος σε miR21 ως στόχο των Μ snoRNAs box-τροποποιημένα σε mCherry-pri-miR21 snoMEN, διαμολύνθηκαν σε κύτταρα HeLa (Σχ 6Α και το Σχ Ι σε S1 File) . Και οι τρεις pri-miR21 στοχευμένες Τα siRNAs (sh21M1-3), και πάλι έδειξε μικρή ή μηδενική knock-κάτω στα επίπεδα είτε ώριμες-miR21, ή προ-miR21, όπως έκανε και ένα ακόμη αρνητικό μάρτυρα shRNA, όπως κρίνεται από qRT-PCR ( Σχήμα 6C αριστερό πάνελ) και με κηλίδωση Northern (Σχήμα 6C δεξί πάνελ). Σε αντίθεση, ένας θετικός έλεγχος shRNA πλασμιδίου που εκφράζει ένα shRNA στοχεύουν στην ώριμη ακολουθία miR21 (sh21), οδήγησε σε ~ 70% knock-down του ώριμου miR21.

(α) Οι περιφέρειες στην pri-miR21 RNA στοχεύονται από τον φορέα snoMEN που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη απεικονίζονται σε ένα σχηματικό διάγραμμα (sh /si21M1-Μ3). Οι ίδιοι pri-miR21 ακολουθίες ως στόχο τον φορέα snoMEN ήταν ο αποδέκτης της ολιγοριβονουκλεοτίδια siRNA και πλασμίδια έκφρασης shRNA. (Β) Το γράφημα δείχνει το αποτέλεσμα της qRT-PCR /qPCR. Ολικό RNA από κύτταρα HeLa συλλέχθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και qRT-PCR για τον εντοπισμό προδρόμων μορίων miR21 χρησιμοποιώντας πρόδρομη miR21 ειδικούς εκκινητές (προ-miR21, κόκκινο). Μετά τη σύνθεση cDNA, qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ωριμάσει ειδικό εκκινητή miR21 και καθολική αστάρι που παρέχονται από το κιτ Perfecta SYBR Green qPCR (Quanta Βιοεπιστημών, δείτε επίσης τις μεθόδους) (Ωριμάζουν-miR21, πράσινο). U3 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Γραφική παράσταση απεικονίζει μέση και τυπική απόκλιση από το ελάχιστο των 4 ανεξάρτητα πειράματα. Ο δεξιός πίνακας δείχνει το αποτέλεσμα της ανάλυσης κηλίδος Northern για πειράματα siRNA. Ανίχνευση των ενδογενών επιπέδων miR21 RNA μετά από επιμόλυνση των κυττάρων HeLa χρησιμοποιώντας είτε τον έλεγχο siRNA (αγωνίζομαι: διαδρομή 1), miR21 siRNA (si21: Λωρίδα 2), miR21 Μ κουτί siRNA-1 (si21M1: Λωρίδα 3), miR21 Μ siRNA-2 box (si21M2: lane4), miR21 Μ κουτί siRNA-3 (si21M3: lane5). Μία ισοδύναμη ποσότητα HeLa ολικού RNA φορτώθηκε σε κάθε λωρίδα και το RNA διαχωρίζεται με PAGE, ηλεκτροστυπώθηκαν πάνω μεμβράνη και διερευνήθηκαν τόσο με καθετήρα miR21 και με έναν ανιχνευτή tRNA ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) Η ίδια σειρά πειραμάτων με siRNA επιμόλυνση, όπως περιγράφεται στο Σχ 6β, εκτός πλασμίδια έκφρασης shRNA επιμολύνθηκαν αντί siRNAs.

Η

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι οι φορείς snoMEN μπορεί να προκαλέσει μείωση στην έκφραση των συγκεκριμένων miRNAs με τη στόχευση αλληλουχιών RNA πυρηνικό πρόδρομο που δεν φαίνεται να είναι επιδεκτικά σε knock-down είτε με siRNA ολιγοριβονουκλεοτίδια, ή φορείς shRNA. Σε αντίθεση, κυτταροπλασματική RNAs, συμπεριλαμβανομένων των ώριμων miRNAs, μπορεί να χτυπηθεί κάτω από shRNA φορείς που στοχεύουν τις ίδιες ακολουθίες που χρησιμοποιούνται στους φορείς snoMEN.

Μηχανισμός snoMEN παρεμβολή RNA

Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι ο μηχανισμός με τον οποίο μπορούν να διαμορφώσουν snoMEN το επίπεδο έκφρασης ενός mRNA στόχου απαιτεί Argonaute-2 (ago2), η οποία είναι με τη σειρά του εμπλέκεται στην κύρια οδό της RNAi [32]. Ο μηχανισμός snoMEN μπορεί επίσης να περιλαμβάνει up-πλαισίου-1 (Upf1), η οποία πιστεύεται ότι είναι απαραίτητη για την ανοησία μεσολάβηση αποσύνθεσης (NMD) οδός [6, 33-35]. Ωστόσο, δεν ήταν σαφές εάν snoMEN μεσολάβηση διαμόρφωση του επιπέδου έκφρασης ενός στοχευόμενου μη κωδικοποίησης RNA πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων pri-miRNAs, συνεπάγεται ακριβώς τον ίδιο μηχανισμό. Επομένως, εξετάσαμε αν μεσολάβηση RNAi εξάντληση αρκετών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένου ago2, θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ικανότητα των φορέων snoMEN να μεταβάλλουν την έκφραση του miRNAs (Σχήμα 7). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η snoMEN εξαρτώμενη knock-down του PRI-miR21 επίπεδα εμποδίστηκε ειδικώς σε κύτταρα εξαντλούνται από ago2 με επεξεργασία siRNA, σε σύγκριση με τα κύτταρα σε επεξεργασία με ένα περιπλεγμένο siRNA αρνητικού μάρτυρα (Εικόνα 7Α και 7Β). Πρόσθετοι έλεγχοι έδειξαν ότι το επίπεδο της έκφρασης του RNA snoMEN δεν επηρεάστηκε από siRNA επιμολύνσεις (Σχήμα J σε S1 File). Αυτό συνεπάγεται ότι ago2 μπορεί να εμπλέκεται, είτε άμεσα είτε έμμεσα, στο μηχανισμό του snoMEN μεσολάβηση καταστολή των επιπέδων miRNA πρωτογενούς μεταγραφήματος. Ωστόσο, βρήκαμε εδώ ότι ούτε το siRNA μεσολάβηση εξάντληση των Upf1, η οποία είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι επηρεάζει την ικανότητα του snoMEN να knock-down που κωδικοποιούν πρωτεΐνες RNAs [6], ούτε ago1, η οποία, όπως ago2 [32], μπορεί να συνδέσει με snoRNAs, εμπόδισε την αναστολή της έκφρασης miR21 από snoMEN.