Αφηρημένο

Πρόσφατα, δείξαμε ότι η ογκολυτικού ιός ευλογιάς GLV-1h68 έχει ένα σημαντικό θεραπευτικό δυναμικό στην αντιμετώπιση μεταστάσεων λεμφαδένα του καρκινώματος του προστάτη ανθρώπινο PC-3 σε ξενομοσχεύματα όγκου. Σε αυτή τη μελέτη, αναλύθηκαν υποκείμενους μηχανισμούς του ιού μεσολάβηση μείωση μεταστάσεων. Ανοσοϊστοχημεία απέδειξαν ότι ο ιός-αγωγή κατέληξε σε μια δραστικά μειώσει αίματος και των λεμφικών αγγείων, που αντιπροσωπεύουν βασικές διαδρομές για PC-3 κυτταρική μετανάστευση, και στις δύο όγκων και μεταστάσεων. Έτσι, GLV-1h68 μειωθεί δραστικά βασικές οδούς για την μεταστατική εξάπλωση του PC-3 κύτταρα. Επιπλέον, η ανάλυση των ιικών διανομής σε GLV-1h68 ένεση ποντικών που φέρουν όγκο με δοκιμασίες πλάκας, αποκάλυψε σημαντικά υψηλότερους τίτλους ιού σε σύγκριση με μεταστάσεις συμπαγών όγκων. Να διευκρινίσει τους όρους δυνητικά μεσολάβηση του προτιμησιακού ιογενή αποικισμό και την εξάλειψη των μεταστάσεων, μικροπεριβάλλον συστατικά των μη μολυσμένων όγκων και μεταστάσεων συγκρίθηκαν με μικροσκοπική μελέτες. Αυτές οι αναλύσεις αποκάλυψαν ότι PC-3 λεμφαδενικές μεταστάσεις έδειξαν αυξημένη αγγειακή διαπερατότητα, υψηλότερη κατάσταση πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, όπως προσδιορίζεται με BrdU- και Ki-67 προσδιορισμούς και μικρότερο νέκρωση του PC-3 κύτταρα από συμπαγείς όγκους. Παρατηρήθηκε Επιπλέον, ένας αυξημένος αριθμός των κυττάρων του ανοσοποιητικού (MHCII

+ /CD68

+ μακροφάγα, MHCII

+ /CD19

+ Β λεμφοκύτταρα) σε συνδυασμό με ένα επάνω ρυθμισμένη έκφραση των προ-φλεγμονωδών κυτοκινών σε μεταστάσεις σε σύγκριση με πρωτογενή PC-3 όγκους. Προτείνουμε ότι αυτοί οι μικροπεριβάλλον συστατικά με τη μεσολάβηση της μεταστατικής τροπισμό του GLV-1h68. Ως εκ τούτου, ιό δαμαλίτιδας που βασίζεται ογκολυτική ιοθεραπείας θα μπορούσαν να προσφέρουν μια νέα θεραπεία του μεταστατικού καρκινώματος του προστάτη σε ανθρώπους

Παράθεση:. Donat U, Weibel S, Hess Μ, Stritzker J, Hartl Β, Sturm JB, et al. (2012) Προνομιακή αποικισμός των μεταστάσεις από Oncolytic Ιός Στέλεχος GLV-1h68 σε μια ανθρώπινη PC-3 καρκίνου του προστάτη μοντέλο σε άτριχα ποντίκια. PLoS ONE 7 (9): e45942. doi: 10.1371 /journal.pone.0045942

Επιμέλεια: Maciej Σ Lesniak, Το Πανεπιστήμιο του Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25, Ιουνίου του 2012? Αποδεκτές: 23 Αυγούστου 2012? Δημοσιεύθηκε: 25 Σεπτεμβρίου 2012 |

Copyright: © Donat et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. δρχ. Jochen Stritzker, Nanhai Γ Chen, Ιβάιλο Gentschev και Aladár Α Szalay είναι υπάλληλοι της Genelux Corporation και έχουν οικονομικά συμφέροντα σε Genelux Corporation. Ο Δρ Μπάρμπαρα Hartl είναι υπάλληλος της Genelux GmbH. Genelux Corporation παρείχε επίσης μια Grant Υπηρεσία στο Πανεπιστήμιο του Würzburg. Ο Δρ Ulrike Donat και ο Δρ Στέφανι Weibel είναι αποδέκτες μεταδιδακτορικός υπότροφος. Ο Δρ Τζούλια Sturm και ο κ Michael Hess είναι αποδέκτες τους αποφοίτους υποτροφία από το Πανεπιστήμιο του Würzburg. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων και αναλύσεις, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας ή τα προϊόντα στην ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Σύμφωνα με τις τρέχουσες μελέτες, πάνω από το 90 % των ασθενών με καρκίνο πεθαίνουν λόγω άμεσων ή έμμεσων επιπτώσεων των μεταστάσεων. πρόγνωση ασθενούς είναι ως εκ τούτου να συνδεθεί αμέσως στο μεταστατικό στάδιο του καρκινώματος [1]. Μεταστατικά κύτταρα όγκου διεισδύουν υγιείς ιστούς και σταυρό εμπόδια σκάφος για να αποκτήσετε πρόσβαση σε λεμφικό ή την κυκλοφορία του αίματος. Η τάση ενός κυττάρου όγκου να εισέλθουν λεμφικό ή τα αιμοφόρα αγγεία εξαρτάται από την ικανότητα να προσκολλώνται σε συγκεκριμένες δομές, όπως δικτυωτό ινών στην subcapsular κόλπων της αποστράγγισης λεμφαδένα ή ενδοθηλιακά κύτταρα που ευθυγραμμίζουν τα αιμοφόρα αγγεία [2].

Ο καρκίνος του προστάτη είναι γνωστό ότι μετάσταση στα οστά, τους πνεύμονες και τους λεμφαδένες [3], [4]. Αντιπροσωπεύει την δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τους άνδρες. Από καρκίνο του προστάτη προχωρά ασυμπτωματικά, η διάγνωση γίνεται συχνά όταν έχουν ήδη σχηματιστεί μεταστάσεις. Οι τρέχουσες στρατηγικές θεραπείας για μεταστάσεις είναι παρόμοιες με εκείνες που χρησιμοποιούνται για πρωτογενείς όγκους [1]. Θεραπεία του προχωρημένου καρκινώματος του προστάτη πραγματοποιείται μέσω συμβατικών χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία. Δυστυχώς, αυτές οι θεραπείες έχουν συχνά ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη ανθεκτικών όγκων και μεταστάσεων [5], [6]. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι η διατήρηση της ανάπτυξης του στερεού όγκου στον κόλπο μπορεί να προωθήσει παρά την καταστολή του σχηματισμού μεταστάσεων [7]. Καταπολέμηση της τόσο το σχηματισμό και την ανάπτυξη των μεταστάσεων είναι, επομένως, το κλειδί της επιτυχίας στη θεραπεία του καρκίνου

Κατά συνέπεια, ογκολυτικής ιοθεραπείας είναι ένα από τα πιο ελπιδοφόρα νέα στρατηγική για την καταπολέμηση δύο:. Συμπαγών όγκων και μεταστάσεων. Oncolytic ιοί είναι σε θέση να αναπαράγουν επιλεκτικά στα καρκινικά κύτταρα, με αποτέλεσμα την καταστροφή του ιστού του όγκου, αλλά αφήνοντας υγιείς ιστούς αβλαβής [8]. Το 2007, Zhang

et al.

Περιγράφηκε για πρώτη φορά το εξασθενημένο ανασυνδυασμένο ιό ευλογιάς GLV-1h68 [9], [10]. Η ογκολυτική επίδραση αυτού του ιού έχει αποδειχθεί σε ξενομοσχεύματα καρκίνου του μαστού, του παγκρέατος και του προστάτη [10] – [12]. Επιπλέον, Gentschev

et al.

Καταδειχθεί, κατ ‘αρχήν, η μεγάλη θεραπευτική δυνατότητα του GLV-1h68 στη θεραπεία μεταστάσεων λεμφαδένα που προέρχονται από τον προστάτη κυτταρική γραμμή καρκινώματος PC-3 [11].

Σε αυτή τη μελέτη, η οποία χαρακτηρίζεται των υποκείμενων μηχανισμών της μείωσης των μεταστάσεων ιού μεσολάβηση. Για λεπτομερή ανάλυση, οπτικοποιείται πρώτα μεταστατική εξάπλωση του PC-3 κύτταρα στο λεμφικό σύστημα γυμνών ποντικών εισάγοντας το

mRFP1

-γονίδιο που κωδικοποιεί την κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη υπό τον έλεγχο του υποκινητή CMV στο γονιδίωμα του κυττάρου του όγκου . Κατά ιική ένεση σε ποντικούς που φέρουν όγκο PC-3-RFP, αποδείξαμε ότι η θεραπεία του ιού μειώθηκε δραστικά την ποσότητα του αίματος και των λεμφικών αγγείων, τα οποία είναι απαραίτητα διαδρομές για μεταστατική εξάπλωση των κυττάρων όγκων, σε όγκους καθώς και σε μεταστάσεις [13] , [14]. Επιπλέον, ανιχνεύονται σημαντικά υψηλότερους τίτλους ιού σε μεταστάσεις PC-3 λεμφαδένα σε σχέση με συμπαγείς όγκους και δείξαμε ότι η νεφρική λεμφαδενικές μεταστάσεις είχαν αποικίσει σε ακόμη μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι οσφυϊκή αυτά. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή η ιική τροπισμό μεταστάσεων έχει, μέχρι στιγμής, δεν έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία. Ως εκ τούτου, στόχος μας ήταν να αναλύσει τους μηχανισμούς που οδηγούν στην προνομιακή ιογενή αποικισμό. Στο πλαίσιο αυτό, αρκετές μικροπεριβάλλοντος πτυχές, όπως όγκων και μεταστάσεων αγγείωση και αιμάτωση, πολλαπλασιαστική κατάσταση και την έκταση των PC-3 κυτταρικής νέκρωσης, το ανοσοποιητικό βάρος κυττάρων καθώς και την έκφραση κυτοκίνης σε πρωτογενείς όγκους και μεταστάσεις λεμφαδένων αναλύθηκαν.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές Γραμμές

Ο ανθρώπινου προστάτη κυτταρική γραμμή καρκινώματος PC-3 (DSMZ ACC465) καλλιεργήθηκε σε RPMI 1640 (ΡΑΑ Laboratories, Cölbe, Γερμανία) συμπληρωμένο με 10% FCS (ΡΑΑ Laboratories, Cölbe, Γερμανία) και 1% διάλυμα πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης (ΡΑΑ Laboratories, Cölbe, Γερμανία). κύτταρα PC-3-RFP καλλιεργήθηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες με εξαίρεση την προσθήκη 10 μg /ml βλαστισιδίνη. Η αφρικανικού πράσινου πιθήκου νεφρό κυτταρική σειρά ινοβλαστών CV-1, που λαμβάνεται από την American Type Culture Collection (ATCC CCL-70), καλλιεργήθηκε σε ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης (ΡΑΑ Laboratories, Cölbe, Γερμανία) συμπληρωμένο με 10% FCS και 1% πενικιλίνη στρεπτομυκίνη διάλυμα. ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα νεφρού (293FT) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον Ρ λόφου (University of Nottingham, αρχικά λαμβάνεται από την Invitrogen) και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FCS και 2 mM Ε-γλουταμίνη (ΡΑΑ Laboratories, Cölbe, Γερμανία).

γενιά των PC-3-RFP Cells

Η cDNA αλληλουχία της κόκκινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (

mRFP1

) εισήχθη στο γονιδίωμα PC-3 κυττάρου χρησιμοποιώντας Vira Ισχύς ™ λεντοϊών Σύστημα έκφρασης Kit (Invitrogen GmbH, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η

mRFP1

-Κωδικοποίηση πλασμίδιο pCR-ΤΚ-SEL-mRFP παρέχονται από Q. Zhang (Genelux Corporation, San Diego) και χρησιμοποιείται για να δημιουργήσει το

mRFP1-

περιέχουν φορείς λεντοϊών όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Ανίκανος αναδιπλασιασμού

mRFP1

-Κωδικοποίηση φακοϊούς παράχθηκαν σε 293FT κύτταρα με συν-επιμόλυνση των πλασμιδίων pLP1, pLP2, pLP /VSVG που παρέχουν βραδέος δομικές πρωτεΐνες και αναδιπλασιασμό και την έκφραση pLenti6 /V5-DEST-mRFP πλασμίδιο χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη

TM2000. Μετά την μεταγωγή του PC-3 κύτταρα με mRFP κωδικοποίησης φακοϊούς και βλαστισιδίνη (10 μg /ml) επιλογής, επιλέχθηκε ένας σταθερός RFP που εκφράζουν PC-3 κλώνου και RFP-έκφραση σε & gt? 98% όλων των κυττάρων επιβεβαιώθηκε με κυτταρομετρία ροής .

στέλεχος ιού

Το εξασθενημένο στέλεχος του ιού της ευλογιάς GLV-1h68 κατασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως από τον Zhang

et al.

[10]. Τρεις κασέτες έκφρασης που κωδικοποιούν για το

Renilla

λουσιφεράσης-GFP πρωτεΐνη σύντηξης, β-γαλακτοσιδάση, ή β-γλυκουρονιδάση ανασυνδυάστηκαν στο

F14.5L

,

J2R

και

A56R

τόπους, αντίστοιχα, του γονιδιώματος του ιού LIVP γονική. GLV-1h68 πολλαπλασιάστηκε σε κύτταρα CV-1 και καθαρίζεται μέσω βαθμίδων σακχαρόζης.

Tumor Εμφύτευση και του ιού της Διοίκησης

Οι όγκοι που παράγονται από την εμφύτευση 2 χ 10

6 PC-3 ή PC -3-RFP κύτταρα σε 100 μΙ PBS υποδορίως στην λαγόνα τη δεξιά κοιλιακή 6-8 εβδομάδων θηλυκών αθυμικών γυμνών

Foxn1

nu

ποντικούς (Harlan Winkelmann GmbH, Borchen, Germany). Μία εφάπαξ δόση των 1 × 10

7 σχηματισμού πλάκας μονάδες (pfu) GLV-1h68 σε 100 μΙ PBS εγχύθηκε ενδοφλεβίως (ί.ν.). Για τη μελέτη της ιογενούς αποικισμό των μεταστάσεων PC-3-RFP, GLV-1h68 χορηγήθηκε μετά από μεταστάσεις κόμβο κοιλιακό λεμφαδένες ήταν ψηλαφητή? συνήθως 45-60 ημέρες μετά την εμφύτευση των κυττάρων PC-3-RFP, να μιμούνται το προχωρημένο στάδιο καρκίνου του προστάτη. Δεδομένου ότι το προχωρημένο στάδιο της νόσου σχετίζεται με την απώλεια βάρους ανεξάρτητα από ιογενή λοίμωξη, το βάρος μετρήθηκε δύο φορές την εβδομάδα και τα ποντίκια θυσιάστηκαν πριν από την υπέρβαση αποκοπή συντελεστές. Οι περίοδοι αγωγής που αναλύθηκαν δεν υπερβαίνει τις 14 ημέρες. Μετά την ένεση του ιού η κατάσταση της υγείας των ποντικών δεν άλλαξε.

Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την κυβέρνηση του Unterfranken, Γερμανία (αριθμός πρωτοκόλλου Α-Ω 55.2-2531.01-17 /08) και /ή ιδρυματική φροντίδα των ζώων και της Επιτροπής Χρήση (IACUC) της Explora Biolabs, που βρίσκεται στο Σαν Ντιέγκο Science Center (San Diego, USA) (αριθμοί πρωτοκόλλου: EB08-003? EB11-25).

Ανίχνευση του Ανθρώπου PC-3 κύτταρα σε Λεμφικό κόμβοι μέσω RT-PCR

Η παρουσία PC-3 κύτταρα ανθρώπου διευρυμένη οσφυϊκή και νεφρικών λεμφογαγγλίων αναλύθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές για την ανθρώπινη β-ακτίνη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Μια λεμφαδένα ορίστηκε να διευρυνθεί όταν η μέγιστη διάμετρος ξεπέρασε τα 2 mm.

φθορισμού απεικόνιση των όγκων και των λεμφαδένων μεταστάσεις

Εικόνες της GLV-1h68 ή PBS αγωγή PC-3-RFP όγκου οποία φέρουν το ποντίκια ελήφθησαν είτε με την εκ σύστημα Maestro Imaging (δαγκάνα, Hopkinton, MA, USA) ή με MZ16 FA Stereo-φθορισμού μικροσκόπιο (Leica, Wetzlar, Γερμανία). Για την απεικόνιση των ποντικών με το Σύστημα Απεικόνισης Maestro EX, τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 2-3% ισοφλουράνιο. Ψηφιακές εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το Photoshop 7.0 (Adobe Systems, Mountain View, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Ανάλυση της Viral τίτλοι σε όγκους και μεταστάσεις

Η ποσότητα των σωματιδίων του ιού σε προϊόντα λύσης του όγκου και των μεταστάσεων προσδιορίστηκε από πρότυπες δοκιμασίες πλάκας. Ως εκ τούτου, PC-3 όγκων και μεταστάσεων αποκόπηκαν 3, 7 και 14 ημέρες μετά την GLV-1h68 ένεση, κιμά και 2 όγκους ρυθμιστικού λύσης (50 mM Tris-HCl με 2 mM EDTA, ρΗ 7.4) συμπληρωμένο με 2 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο και προστέθηκαν αναστολέα πρωτεϊνάσης κοκτέιλ (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Γερμανία). Τα δείγματα ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Fastprep Shredder (Thermo Scientific, Karslruhe). Μετά από 3 κύκλους ψύξης και απόψυξης ακολουθούμενα μέσω κατεργασίας με υπερήχους σειριακές αραιώσεις τιτλοδοτήθηκαν επί CV-1 κύτταρα συρροής σε πλάκες 24 φρεατίων. Όλα τα δείγματα μετρήθηκαν εις διπλούν.

Ανοσοϊστοχημεία

Για ιστολογία, όγκων και μεταστάσεων αποκόπηκαν και σταθεροποιήθηκαν για 16 ώρες σε 4% παραφορμαλδεϋδη /PBS, ρΗ 7,4. Παρασκευή 100 μm τομές και τις διαδικασίες επισήμανσης διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16] χρησιμοποιώντας το Leica VT1000 Vibratom (Leica, Heerbrugg, Ελβετία). Μετά την επισήμανση, τα τμήματα του ιστού τοποθετήθηκαν σε Mowiol 4-88 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία). Τα δείγματα ιστού τεμαχίσθηκαν (πάχους 10 μm) με κρυοστάτη 2800 Frigocut (Leica, Wetzlar, Germany). Μετά από αφυδάτωση σε 10% και 30% σακχαρόζη (Carl Roth, Karlsruhe, Germany) δείγματα εγκλείστηκαν σε Tissue-Tek® O.C.T. (Sakura Finetek Ευρώπη B.V., Alphen aan den Rijn, Ολλανδία). Κατεψυγμένες τομές φυλάχθηκαν στους -80 ° C και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα για 1 ώρα. Μετά την πλύση με PBS, οι τομές χρωματίστηκαν για 1 ώρα με δευτερογενή αντισώματα και τελικά τοποθετούνται σε Mowiol 4-88.

Αντισώματα και Αντιδραστήρια

Τα ενδοθηλιακά αιμοφόρα αγγεία βάφτηκαν με ένα μονοκλωνικό αντι-χάμστερ CD31 αντίσωμα (Chemicon International, Temecula, USA? MAB1398Z) και ενδοθηλιακή λεμφαγγεία με ένα αντίσωμα κουνελιού πολυκλωνικό αντι-LYVE-1 (Abcam, Cambridge, UK? ab14917). Η μη-ειδική αρουραίου-ΙgG (Jackson Immunoresearch, Pennsylvania, USA? 01200003) χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθεί η διαπερατότητα των αιμοφόρων αγγείων σε όγκους PC-3-RFP και μεταστάσεις. Ως εκ τούτου, 10 mg /kg αρουραίου-IgG ενέθηκαν ενδοφλεβίως (ί.ν.) σε ποντικούς που φέρουν όγκο PC-3-RFP. Έξι ώρες μετά την ένεση οι ποντικοί θυσιάστηκαν και 100 μm τομές όγκων και μεταστάσεων παρασκευάστηκαν. Επισήμανση των κυττάρων που παρουσιάζουν αντιγόνο διεξήχθη με ένα μονοκλωνικό αρουραίου αντι-ΜΗΟ Τάξης II αντισώματος (/Ι-Ε Ι-Α) (eBioscience, San Diego, USA? 14 – 5321). Β κύτταρα βάφτηκαν με ένα αντι-CD19 μονοκλωνικό αντίσωμα αρουραίου (Abcam, Cambridge, UK? Ab25232), τα μακροφάγα με ένα αντι-CD68 μονοκλωνικό αντίσωμα αρουραίου (Abcam, Cambridge, UK, ab53444). Ο δείκτης πολλαπλασιασμού Ki-67 σημάνθηκε με αντι-Ki-67 αντίσωμα κουνελιού πολυκλωνικό (Abcam, Cambridge, UK? Ab15580). Για την ανάλυση ενσωμάτωσης BrdU εντός του ΟΝΑ των κυττάρων PC-3-RFP σε όγκους και μεταστάσεις, 120 mg /kg BrdU εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (ί.ρ.). Τρεις ώρες αργότερα, όγκων και μεταστάσεων αποκόπηκαν και 10 μm τομές παρασκευάστηκαν. Η επισήμανση διεξήχθη χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αρουραίου αντι-BrdU αντίσωμα (Abcam, Cambridge, UK? Ab6326) μετά από 30 λεπτά επώαση με 2 Μ HCl και το πλύσιμο σε PBS. Οι πυρήνες Hoechst 33342-επισημασμένο (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία). DyLight488-, DyLight549- και DyLight 649-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα (γάιδαρος) ελήφθησαν από Jackson ImmunoResearch (Pennsylvania, USA). Όλα τα πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα αραιώθηκαν σε PBS 1:100 στην περίπτωση των 10 μm τομές ή σε PBS /0.3% Triton-X-100 στην περίπτωση των 100 μm τομές.

μικροσκόπιο φθορισμού

μικροσκοπικές μελέτες χρησιμοποιήθηκαν για να συγκριθούν αγγειακό σύστημα του όγκου, την κατάσταση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και των ειδικών κυτταρικών πληθυσμών του ανοσοποιητικού των όγκων, καθώς και των μεταστάσεων. Για την εξέταση των τμημάτων του όγκου και της μετάστασης φθορισμό σημασμένο, χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες μικροσκόπια: Ένα μικροσκόπιο στερεοφωνικό-φθορισμού MZ16 FA (Leica) εφοδιασμένο με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή CCD και το 4,0 λογισμικό Leica IM1000 (1300 × 1030 pixel RGB-έγχρωμες εικόνες), ένα TCS SP2 AOBS ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ (Leica) εφοδιασμένο με το λογισμικό LCS 2.16 (1024 × 1024 pixel RGB-έγχρωμες εικόνες) και μια Axiovert 200 Μ μικροσκόπιο (Zeiss) με Axiovision 4.5 λογισμικό (1388 × 1040 pixel εικόνες κλίμακας του γκρι). Ψηφιακές εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το Photoshop 7.0 (Adobe Systems, USA) και συγχωνεύονται για να δώσουν ψευδο-έγχρωμες εικόνες.

Αναλύσεις ψηφιακών φθορισμού Εικόνες

Για τις αναλύσεις των ψηφιακών εικόνων του όγκου, LN και RN τμήματα, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι υπήρξε μία όγκου ανά ποντικό, αλλά ο αριθμός των οσφυϊκών και νεφρικής μεταστάσεις λεμφαδένα διέφερε από ποντικό σε ποντικό. Στις περισσότερες περιπτώσεις 2 LNs και 2 αριθμών RΕΝ ήταν παρόντες ανά ποντίκι. Ανά όγκο ή μετάσταση εικόνες 2 τμήματα αναλύθηκαν, σύμφωνα με την οποία τα δεδομένα που λαμβάνονται από όλες τις μεταστάσεις κόμβο οσφυϊκής λεμφαδένες συγχωνεύτηκαν σε LN και τα δεδομένα που λαμβάνονται από όλες τις νεφρική λεμφαδένες συγχωνεύτηκαν σε RN.

Μέτρηση της λέμφου και των αιμοφόρων αγγείων πυκνότητας .

λέμφου και των αιμοφόρων αγγείων πυκνότητα μετρήθηκε σε ψηφιακές εικόνες (× 80 και × 100 μεγέθυνση) αντι-LYVE-1 και αντι-CD31 βάφονται 100 μm τομές. Οκτώ εικόνες ανά όγκο, LN και RN αναλύθηκαν ανά χρώση. Ο χρόνος έκθεσης για μεμονωμένες εικόνες προσαρμόστηκε για να εξασφαλιστεί σαφής προβολή όλων των ανιχνεύσιμων αιμοφόρων αγγείων και λέμφου και διακοσμημένα με 8 ισαπέχουσες οριζόντιες γραμμές χρησιμοποιώντας το Photoshop 7.0. Όλες οι λεμφαδένες ή τα αιμοφόρα αγγεία που διασχίζουν αυτές τις γραμμές μετρήθηκαν να αποκτήσει την πυκνότητα σκάφος και ανά τμήμα.

Μέτρηση της διαμέτρου των αιμοφόρων αγγείων.

μέτρηση διαμέτρου των αιμοφόρων αγγείων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ψηφιακών εικόνων (× 100 μεγέθυνση) 100 μm τομές χρωματίστηκαν με αντι-CD31 χρησιμοποιώντας Leica IM1000 4,0 λογισμικού. Εικόνες όγκων και μεταστάσεων λεμφαδένα ελήφθησαν με επιμέρους χρόνους έκθεσης για να πάρει βέλτιστα σήματα CD31 και αποκλείουν σήματος εξαρτώμενη μεταβλητότητα της διαμέτρου δοχείου. Μεμονωμένες εικόνες επικαλύφθηκαν με τρία ισαπέχοντα οριζόντιες γραμμές και μετρήθηκαν οι διάμετροι όλων των αιμοφόρων αγγείων που διασχίζουν αυτές τις γραμμές. διάμετροι των αιμοφόρων αγγείων προσδιορίστηκαν σε 4 εικόνες ανά όγκο, LN και RN.

Ποσοτικοποίηση της επισήμανσης ενότητα.

Για να ποσοτικοποιηθεί η διαπερατότητα των αιμοφόρων αγγείων, ψηφιακές εικόνες (160 × μεγέθυνση) 100 μm τμήματα ιστολογία όγκων και μεταστάσεων αναλύθηκαν. Το συνολικό θετικό για IgG περιοχή (επισημασμένο με αντι-αρουραίου-DyLight488) προσδιορίστηκε σε 16 διαφορετικές περιοχές ανά δείγμα. Η ποσότητα του νεκρωτικού ιστού σε PC-3 όγκων ή μεταστάσεων προσδιορίστηκε σε ψηφιακές εικόνες των 100 μm τομές. Οι πυρήνες σημάνθηκαν με Hoechst 33342. Το κλάσμα ενός τμήματος δεν βάφονται με Hoechst λόγω της υποβάθμισης πυρήνων ορίζεται ως νεκρωτική περιοχή. Στην περίπτωση αυτή, αναλύθηκαν εικόνες 2 ολόκληρα τμήματα ανά δείγμα. Η ποσότητα της ΜΗΟΙΙ, CD19 και CD68 θετικά κύτταρα σε PC-3 όγκων και μεταστάσεων μετρήθηκε σε ψηφιακές εικόνες των 10 μm τομές. Δύο εικόνες ολόκληρο τμήμα ανά δείγμα αναλύθηκαν. Αναλύσεις του ποσού της IgG, νεκρωτικό ιστό και MHC-II-, CD19- και CD68-θετικά κύτταρα σε ψηφιακές εικόνες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij) μετά τη μετατροπή RGB-εικόνες σε 8 -bit εικόνες κλίμακας του γκρι χρησιμοποιώντας Photoshop 7.0.

Μέτρηση της έντασης φθορισμού.

η μέτρηση της έντασης CD31 και Ki-67 έγινε σε ψηφιακές εικόνες των 100 μm και 10 μm τμήματα του PC- 3 όγκων και μεταστάσεων. Για κάθε βαφή, 8 διαφορετικές εικόνες ανά δείγμα αποκτήθηκαν με τις ίδιες ρυθμίσεις. RGB-εικόνες μετατράπηκαν σε 8-bit κλίμακας του γκρι με μια σειρά ένταση 0-255. Η ένταση φθορισμού των CD31 και Ki-67 χρώσεις αντιπροσωπεύει τη μέση φωτεινότητα όλων των εικονοστοιχείων που σχετίζονται με χρώση και μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ImageJ. Εικόνες από χρώση CD31 λήφθηκαν σε 100Χ, εικόνες του Ki-67 σε μεγέθυνση 400χ.

Πρωτεΐνη Απομόνωση και Χαρακτηρισμός

λύματα Πρωτεΐνη όγκων PC-3-RFP, οσφυϊκή και μεταστάσεις κόμβο νεφρικών λεμφογαγγλίων 3 ποντικών 49 ημέρες μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου αναλύθηκαν με ανοσιακής προφίλ πρωτεϊνικό αντιγόνο (RodentMAP® v2.0, κανόνες βασίζονται Medicine, Austin, USA) χρησιμοποιώντας σφαιρίδια αντίσωμα συνδέεται. Τα προϊόντα λύσης εκτελέστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν με βάση τη συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης.

Στατιστική Ανάλυση

t

δοκιμάσει ένα two-tailed Student χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση.

P

τιμές των ≤0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Οι αστερίσκοι δείχνουν μία σημαντική διαφορά μεταξύ των πειραματικών ομάδων. (* Υποδηλώνει p ≤ 0,05? ** Υποδεικνύει p≤0.01? *** Υποδεικνύει p≤0.001)

Αποτελέσματα

Οπτικοποίηση της μεταστατικής εξάπλωσης των PC-3-RFP καρκινικά κύτταρα μέσω του λεμφικού συστήματος σε άτριχα ποντίκια

για να αναλυθεί η μεταστατική εξάπλωση του PC-3 κύτταρα μέσα σε γυμνά ποντίκια, ήταν αναγκαίο να θεσπιστούν πρωτογενείς όγκους με την εμφύτευση 2 × 10

6 RFP που εκφράζουν PC-3 κύτταρα υποδορίως στην δεξιά πλευρά γυμνών ποντικών. Περίπου 70 ημέρες μετά την εμφύτευση θα απεικονιστεί μετάσταση καρκινικών κυττάρων σε οσφυϊκή (LN) και νεφρικών (RN) λεμφαδένες σε ζωντανά PC-3-RFP ποντικούς που φέρουν όγκο (Σχήμα 1α). Εκτός από την ανίχνευση σε οσφυϊκή και νεφρικής λεμφαδένες, τα κύτταρα PC-3-RFP επίσης ορατές σε πλοία που συνδέουν τα ζεύγη των λεμφαδένων (Σχήμα 1β). Για να καταλάβω αν τα σκάφη αυτά είναι λεμφικό ή τα αιμοφόρα αγγεία ανοσοϊστολογικής χρώσεις έγιναν. Επισήμανση των LYVE-1 (λεμφικό δείκτης) και CD31 (δείκτης αιμοφόρων αγγείων) σε τμήματα ιστού αποκάλυψε ξεκάθαρα μια λεμφική προέλευση αυτών των δομών σκάφος που μοιάζει με όγκο κυττάρων που περιέχουν (Σχήμα 1γ).

2 × 10

6 PC-3 ή PC-3-RFP κύτταρα εμφυτεύθηκαν στο δεξί πλευρό γυμνών ποντικών. (Α) σε πραγματικό χρόνο απεικόνιση ενός ζωντανού γυμνό ποντίκι που φέρει έναν όγκο PC-3-RFP 70 ημέρες μετά την εμφύτευση, ραχιαίο και κοιλιακό θέα. Τ, όγκου? LN, οσφυϊκή μεταστάσεις στους λεμφαδένες? RN, νεφρική μεταστάσεις στους λεμφαδένες. (Β) Οσφυϊκή (LN1, LN2) και νεφρού (RN1, RN2) μεταστάσεις λεμφαδένα στην κοιλιά ενός στερεού ποντικού που φέρει όγκο PC-3-RFP 65 ημέρες μετά την εμφύτευση. Δεξιά εικόνα: η μετανάστευση των κυττάρων PC-3-RFP μεταξύ LN και RN. (Γ) 100 μm διατομές του τμήματος μεταξύ LNs και αριθμών RΕΝ χρωματίστηκαν με αντι-CD31 και αντισώματος αντι-LYVE-1, αντίστοιχα. (Δ) Για την ανθρώπινη β-ακτίνη θετικούς λεμφαδένες 21, 28, 35 και 42 ημέρες μετά την εμφύτευση του PC-3 κύτταρα και (ε) την πυκνότητα των λεμφικών αγγείων στον αντίστοιχο πρωτεύον PC-3 όγκους. Οι όγκοι, οσφυϊκή και η νεφρική λεμφαδένες 4 ποντίκια αναλύθηκαν ανά χρονικό σημείο. Για να προσδιοριστεί η πυκνότητα λέμφου σκάφος, 100 μm τομές του PC-3 όγκοι παρασκευάστηκαν και 2 τμήματα χρωματίστηκαν με αντίσωμα αντι-LYVE-1. Τέσσερις εικόνες (χ 80 μεγέθυνση) ανά τμήμα αναλύθηκαν όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 2 mm (β και αριστερά εικόνα C) και 200 ​​μm (δεξιά εικόνες c). Όλες οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά παραδείγματα.

Η

Στο σύνολό τους, θα απεικονιστεί η μεταστατική εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων PC-3-RFP από την καθορισμένη πρωτογενούς όγκου στη δεξιά πλευρά στην περιφερειακή οσφυϊκή και μακρινά νεφρική λεμφαδένες γυμνά ποντίκια.

Επιπλέον, μία με βάση το χρόνο συσχέτιση μεταξύ του σχηματισμού μεταστάσεων λεμφαδένων και την πυκνότητα των λεμφικών αγγείων στις αντίστοιχες PC-3 όγκους δείχθηκε. Με τον καιρό, μια συνεχής αύξηση των λεμφαδένων θετικά για μετάσταση PC-3 κυττάρων παρατηρήθηκε (Σχήμα 1δ). Ταυτόχρονα, λεμφικό πυκνότητα αγγείων σε PC-3 όγκοι αυξήθηκαν (Σχήμα 1ε) που δείχνει τη συνοχή μεταξύ του ποσού των λεμφικών αγγείων σε συμπαγείς όγκους και μεταστάσεις στους λεμφαδένες σχηματισμό.

GLV-1h68 θεραπεία μειώνει δραματικά τις αίματος και της λέμφου σκάφους Πυκνότητα σε PC-3-RFP όγκων και μεταστάσεων

Πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι η θεραπεία GLV-1h68 από PC-3 που φέρουν όγκο ποντικών αποτελέσματα σε σημαντική μείωση των μεταστάσεων λεμφαδένα [11]. Επιπλέον, δείξαμε ότι GLV-1h68 είναι επίσης ένα αποτελεσματικό μέσο για τη θεραπεία PC-3 πνευμονικών μεταστάσεων, οι οποίες κυρίως προέκυψαν από μεταστατική εξάπλωση του PC-3 κύτταρα μέσω της οδού αιματογενής (Σχήμα S1). Για να κατανοήσουμε το θεραπευτικό δυναμικό GLV-1h68, αναλύσαμε την επίδραση της ιικής θεραπείας σχετικά με το αίμα και των λεμφικών αγγείων που σχετίζονται με όγκους αφού αυτοί διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο ως διαδρομές για μεταστατική εξάπλωση σε απομακρυσμένα όργανα και λεμφογάγγλια [13], [14].

για CD31-θετικό αίμα, καθώς και για LYVE-1-θετικός λεμφαγγεία σημαντική μείωση της πυκνότητας των αγγείων σε PC-3 όγκων, LNs και αριθμών RΕΝ παρατηρήθηκε λόγω ενδοφλέβια (IV) ένεση GLV -1h68 (Σχήμα 2). μετρήσεις πυκνότητας των αιμοφόρων αγγείων αποκάλυψε μια μείωση της πυκνότητας κατά 46% σε όγκους και LNs και κατά 60% σε αριθμών RΕΝ σε ποντικούς ιού ένεση δαμαλίτιδας, αντίστοιχα (Σχήμα 2Α και Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για την πυκνότητα λέμφο σκάφος (Σχήμα 2γ και δ) που δείχνει ότι η επίδραση της GLV-1h68 ήταν ισχυρότερη σε νεφρική μεταστάσεις λεμφαδένα.

Η ανάλυση διεξήχθη 57 ημέρες μετά την εμφύτευση 2 χ 10

6 κύτταρα PC-3 και 7 ημέρες μετά την ένεση 1 × 10

7 pfu GLV-1h68. Για να προσδιοριστεί το αίμα και την πυκνότητα σκάφος λέμφου, 100 μm τομές των όγκων, LNs και αριθμών RΕΝ 5 με PBS και 5 ποντικούς GLV-1h68 αγωγή χρωματίστηκαν με αντι-CD31 ή αντίσωμα αντι-LYVE-1. Τα αιμοφόρα αγγεία και το λεμφικό μετρήθηκαν σε 4 εικόνες (100 × μεγέθυνση) από καθένα από 2 τμήματα ανά δείγμα. (Α) πυκνότητα των αιμοφόρων αγγείων σε PC-3 όγκων /μεταστάσεων και (β) αντιπροσωπευτικών εικόνων από χρωματισμένες τομές-CD31 αντι. Τα αιμοφόρα αγγεία εμφανίζονται σε κλίμακα του γκρι, από GLV-1h68 εξέφρασαν GFP στο πράσινο. (Γ) πυκνότητα σκάφος λεμφικού σε PC-3 όγκων /μεταστάσεων και (δ) αντιπροσωπευτικές εικόνες των αντι-LYVE-1 τομών. Τα σκάφη λεμφαδένες εμφανίζονται σε κλίμακα του γκρι, από GLV-1h68 εξέφρασαν GFP στο πράσινο. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 500 μm.

Η

Συνοπτικά, τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι ογκολυτική καταστροφή ιστού όγκου σε PC-3 όγκων και μεταστάσεων ενισχύεται σημαντικά με την εξάλειψη του αγγειακού συστήματος του όγκου, καθώς και λεμφαγγείων.

Προνομιακή αποικισμός των λεμφαδένων μεταστάσεις σε σύγκριση με το Δημοτικό PC-3 όγκοι από GLV-1h68

από το έχουμε παρατηρήσει μια ισχυρότερη μείωση της πυκνότητας του αίματος και της λέμφου σκάφος στη νεφρική μεταστάσεις στους λεμφαδένες σε σύγκριση με πρωτογενείς όγκους , στόχος μας ήταν να διερευνήσει την ιογενή μοτίβα αποικισμού των πρωτοπαθών όγκων, LNs και αριθμών RΕΝ. Για την επίτευξη αυτού του στόχου, PC-3-RFP ποντικούς που φέρουν όγκο ενέθηκαν ε.φ. με 1 × 10

μονάδες σχηματισμού 7 πλάκας (pfu) GLV-1h68. Για να μιμούνται την κατάσταση των ασθενών με καρκίνο σε προχωρημένο στάδιο και για να εξασφαλιστεί η παρουσία των μεταστάσεων στους λεμφαδένες που εγχέεται ιό δαμαλίτιδας στο τελικό στάδιο της νόσου 55 ημέρες μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου. Πολυφασματική απεικόνιση των όγκων και μεταστάσεων έδειξε σαφή μηνύματα GFP σε όγκους, LNs και αριθμών RΕΝ ήδη 3 ημέρες μετά την έγχυση του ιού (dpi). Παραδόξως, η ένταση GFP ήταν η υψηλότερη σε αριθμών RΕΝ, ακολουθούμενη από LNs και, στη συνέχεια, συμπαγείς όγκους (Σχήμα 3α). Με βάση αυτά τα ευρήματα υποθέτουμε μια πιο αποτελεσματική αποικισμό των μεταστάσεων λεμφαδένων από GLV-1h68 σε σύγκριση με πρωτογενή PC-3 όγκους.

1 × 10

7 pfu GLV-1h68 ήταν ε.φ. ένεση σε ποντικούς που φέρουν όγκο PC-3-RFP. (Α) PC-3-RFP ποντικού που φέρει όγκο 3 ημέρες μετά την ένεση του GLV-1h68. (Β) Οι τίτλοι των ιών των όγκων PC-3-RFP, LNs και αριθμών RΕΝ 3, 7 και 14 ημέρες μετά την ένεση του GLV-1h68. ένεση του ιού διεξήχθη 55 ημέρες μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου. Όγκων και μεταστάσεων λεμφαδένα από 6 ποντίκια αναλύθηκαν ανά ομάδα (n = 6). (Γ) 100 μm τομές ενός όγκου PC-3-RFP και μια νεφρική μετάσταση λεμφαδένα 77 ημέρες μετά την εμφύτευση και 7 ημέρες μετά την ένεση του ιού. Τα κύτταρα PC-3-RFP σε κόκκινο χρώμα, από GLV-1h68 εξέφρασαν GFP στο πράσινο. Όλες οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά παραδείγματα. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν το 1 mm (β) και 2 mm (γ).

Η

Για την περαιτέρω ανάλυση, ιογενείς μορφές αποικισμού για όγκους, LNs και αριθμών RΕΝ μελετήθηκαν σε μια χρονική πορεία κατά την ημέρα 3, 7 και 14 μετά την έγχυση του ιού από δοκιμασίες πλάκας. Πράγματι, αποδείχθηκε ότι υπήρχαν σημαντικά υψηλότερα ιικούς τίτλους σε μεταστάσεις λεμφαδένα σε σύγκριση με πρωτογενείς όγκους PC-3-RFP σε όλα τα τρία χρονικά σημεία (Σχήμα 3b). Είναι ενδιαφέρον ότι, στις 3 και 7 dpi αριθμών RΕΝ αποικίστηκαν σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι LNs. Την ημέρα της ένεσης 7 μετά τον ιό 1.4 × 10

9 ρία της GLV-1h68 ανά γραμμάριο ιστού προσδιορίστηκαν σε αριθμών RΕΝ. Σε αντίθεση, μόνο το 28% της συγκέντρωσης του ιού RN ανιχνεύθηκε σε LNs και μόλις 2% σε πρωτογενείς όγκους. Μετά από δύο εβδομάδες, οι αρχικές διαφορές στην ιικούς τίτλους μεταξύ LNs και αριθμών RΕΝ δεν ήταν πλέον ανιχνεύσιμη.

Επιπλέον, μικροσκοπική ανάλυση τομών PC-3-RFP όγκου και μεταστάσεων έδειξε, όπως ήταν αναμενόμενο από την ανώτερη ιικούς τίτλους, επίσης υψηλότερη σήματα GFP σε μεταστάσεις σε αντίθεση με συμπαγείς όγκους 7 ημέρες μετά GLV-1h68 ένεση (Σχήμα 3c). Επιπλέον, δείξαμε ότι η προνομιακή αποικισμός των μεταστάσεων σε σύγκριση με συμπαγείς όγκους με GLV-1h68 δεν περιορίζεται σε οσφυϊκή και νεφρικής μεταστάσεις λεμφαδένα. Υψηλότερες σήματα GFP και οι ιικοί τίτλοι παρατηρήθηκαν επίσης σε βουβωνική (ΙΝ) και του ισχιακού (SN) λεμφαδενικές μεταστάσεις (Εικόνα S2). Επιπλέον, η έρευνα μιας διαφορετικής οδού ένεσης ιού αποκάλυψε παρόμοια ένεση GLV-1h68 μοτίβα αποικισμός 7 ημέρες μετά την ενδο όγκων (ΑΜ) (Σχήμα S3).

Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν μία εξαιρετικά επιλεκτική αποικισμό του μεταστάσεις από GLV-1h68 σε σύγκριση με πρωτογενείς όγκους.

Ανάλυση του μικροπεριβάλλοντος Παράγοντες στην πρωτοβάθμια όγκων και μεταστάσεων Απαραίτητη για ενισχυμένες Viral συγκεντρώσεις σε μεταστάσεις λεμφαδένων

για να βρείτε τους λόγους για την ενισχυμένη ιογενή αποικισμό λεμφαδενικές μεταστάσεις, αναλύσαμε την κατάσταση του PC-3 όγκων και μεταστάσεων πριν από την ένεση του ιού της δαμαλίτιδας συμβεί. Διάφορα διαφορές στο μικροπεριβάλλον των όγκων και των μεταστάσεων που μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για τον ιό να αποικίσουν μεταστάσεις σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι οι όγκοι είχαν θεωρηθεί. Ως εκ τούτου, αγγείωση, πολλαπλασιαστική κατάσταση του PC-3 κύτταρα, την έκταση της νέκρωσης, κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος και την έκφραση κυτοκίνης σε όγκους, LNs και αριθμών RΕΝ αναλύθηκαν σε μη-μολυσμένα ποντίκια που φέρουν όγκο PC-3-RFP. Για να μιμούνται την κατάσταση των ασθενών με καρκίνο σε προχωρημένο στάδιο όταν διάγνωση του καρκίνου εμφανίζεται συνήθως, αναλύσαμε παραμέτρους μικροπεριβάλλοντος στο τελικό στάδιο της ασθένειας μεταξύ 45-60 ημέρες μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου.

Αυξημένη αγγειακή διαπερατότητα σε λεμφαδένα μεταστάσεων.

Πρώτα απ ‘όλα, αναλύσαμε το εάν οι διαφορές συμβαίνουν στο αγγειακό σύστημα όσον αφορά την πυκνότητα και διαπερατότητα των σκαφών μεταξύ όγκων και μεταστάσεων, οδηγώντας σε υψηλότερο αρχικό ποσό ιικών σωματιδίων εντός των διαφόρων ιστών του όγκου. Ιστολογία του PC-3-RFP όγκους, LNs και αριθμών RΕΝ διεξήχθη και τα αιμοφόρα αγγεία επισημάνθηκαν με CD31. Παρά το γεγονός ότι, δεν διαπιστώθηκαν διαφορές στην πυκνότητα των αιμοφόρων αγγείων μεταξύ των όγκων και των μεταστάσεων παρατηρήθηκαν 57 ημέρα εμφύτευση κυττάρων μετα όγκου (Σχήμα 2α ομάδα PBS), η ένταση φθορισμού της χρώσης CD31 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε LNs και αριθμών RΕΝ σε σύγκριση με συμπαγείς όγκους (Σχήμα 4α) . Σε γενικές γραμμές, ο CD31 δείκτης αιμοφόρο αγγείο είναι εξαιρετικά ρυθμίζεται προς τα πάνω σε ενδοθηλιακά κύτταρα σε φλεγμονώδεις ιστούς ή σε θέσεις της συνεχούς διαμετανάστευση λευκοκυττάρων και συνδέεται με υψηλότερα αγγειακή διαπερατότητα [17]. Ως εκ τούτου, μια λεπτομερής μικροσκοπική μελέτη των αιμοφόρων αγγείων που αφορούν διάμετρο του αγγείου και της αγγειακής διαπερατότητας σε όγκους σε σύγκριση με εκείνες στις μεταστάσεις διεξήχθη. Σημαντικά, LNs και αριθμών RΕΝ αποκάλυψαν υψηλότερες διαμέτρους των αγγείων (μέση διάμετρος 15 μm) από συμπαγείς όγκους PC-3-RFP (μέση διάμετρος 10 μm) (Σχήμα 4β). Για να μάθετε αν αυτές οι διαστολή των αιμοφόρων αγγείων συμβάλλει πράγματι στην τριτοβάθμια αγγειακή διαπερατότητα σε μεταστάσεις λεμφαδένων, τα πρότυπα εξαγγείωση των ενδοφλέβια ένεση αρουραίων-IgGs αναλύθηκαν ιστολογικά. Είναι ενδιαφέρον, σημαντικές μεγαλύτερες ποσότητες εξαγγειωμένα IgG ανιχνεύθηκαν σε μεταστάσεις (μέση IgG θετικούς έκταση περίπου 60%) σε σύγκριση με όγκους (μέση IgG θετικούς περιοχή 25%).