Αφηρημένο

έκθεση στον καπνό του τσιγάρου διακυβεύει αισθητά την ικανότητα του ανοσοποιητικού συστήματος για την προστασία κατά της εισβολής των παθογόνων και ογκογένεση. Η νικοτίνη είναι ένα συστατικό ψυχοδραστικών των προϊόντων καπνού που δρα όπως και η φυσική νευροδιαβιβαστή, ακετυλοχολίνη, επί νικοτινικούς υποδοχείς (nAChRs). Εδώ έχουμε αποδείξει ότι τα κύτταρα φυσικοί φονείς (ΝΚ) εκφράζουν έντονα nAChR β2. Η νικοτίνη έκθεση μειώνει την ικανότητα των κυττάρων ΝΚ να σκοτώσουν κύτταρα στόχους και την απελευθέρωση κυτοκινών, μια διαδικασία που είναι σε μεγάλο βαθμό καταργείται από ανεπάρκεια β2 nAChR. Περαιτέρω, το νικοτινικό καταστολή του ΝΡ-κΒ που προκαλείται από μεταγραφική δραστικότητα σε κύτταρα ΝΚ εξαρτάται από nAChR β2. Αυτός ο υπότυπος nAChR παίζει επίσης μεγάλο ρόλο στη μεσολάβηση κυττάρων ΝΚ έλεγχο μετάστασης μελανώματος πνεύμονα, σε ένα μοντέλο ποντικού μετάσταση στους πνεύμονες εκτίθενται σε νικοτίνη. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν β2 nAChR ως εξέχων οδό για προκαλείται από τη νικοτίνη απομείωση της αξίας των λειτουργιών των ΝΚ κυττάρων που συμβάλλει στην εμφάνιση των παθολογιών σχετίζονται με το κάπνισμα

Παράθεση:. Hao J, Shi FD, Abdelwahab Μ, Shi SX, Simard Α , Whiteaker P, et al. (2013) νικοτινικό υποδοχέα β2 Καθορίζει ΝΚ εξαρτάται από τα κύτταρα μετάστασης σε ένα μοντέλο ποντικού μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (2): e57495. doi: 10.1371 /journal.pone.0057495

Επιμέλεια: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, Ιταλία

Ελήφθη: 28, Οκτωβρίου, 2012? Αποδεκτές: 21 Ιαν 2013? Δημοσιεύθηκε: 28, Φεβρουαρίου, 2013

Copyright: © 2013 Hao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίζεται εν μέρει από το Διεθνές Επιστημονικό πρόγραμμα συνεργασίας της Κίνας 2006DFB32330 να QHZ? Εθνικό πρόγραμμα βασικής έρευνας της Κίνας 2013CB966900 να FDS? Πρόγραμμα για New Century εξαιρετικά ταλέντα στο Πανεπιστήμιο της Κίνας (NCET 111.067 έως JWH)? NFSC 2010CB529405 να QHZ, 81100887 και 81273287 για να JWH? το Εθνικό Ινστιτούτο των ΗΠΑ Υγείας (R01AI083294 να FDS)? το Έργο Κλειδί του Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Tianjin 12JCZDJC24200 να JWH, και το Έργο Key του κινεζικού υπουργείου Παιδείας (212.005 έως JWH). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

διαταραχές συνδέονται με το κάπνισμα όπως μόλυνση και ογκογένεση έχει συνδεθεί με τους εκτεθειμένους λειτουργίες του ανοσοποιητικού συστήματος στους καπνιστές [1], [2]. Μεταξύ των πολλών ανοσοποιητικό τροποποιητικά συστατικά του καπνού του τσιγάρου, η νικοτίνη έχει δειχθεί ότι έχει σημαντικές επιπτώσεις σε μια σειρά από νικοτινικό υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (nAChR) οποία φέρουν το λευκοκυττάρων από τόσο έμφυτη και προσαρμοστική ανοσοποιητικό σύστημα. Η έκφραση του nAChR α7 σε μακροφάγα και μονοκύτταρα, και την ικανότητά της να αναστέλλει την ανοσοαπόκριση κατά τη διάρκεια συστηματική φλεγμονή και σε ασθένειες οργάνου-ειδική έχουν σχετικά καλά περιγραφεί [3], [4], [5], [6], [7] , [8]. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η νικοτίνη ρυθμίζει την ένταση της ενδοτοξιναιμίας και σήψης [3], [4], [5], και εξασθενεί-ειδικά αυτοάνοσες αποκρίσεις σε ένα nAChR α7-εξαρτώμενο τρόπο [6], [7], [8]. Από την άλλη πλευρά, έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι άλλων υποτύπων nAChR μπορεί να παίζει κάποιο ρόλο στην αντι-φλεγμονώδεις επιδράσεις της νικοτίνης [3], [4], [5], [6], [7], [8]. Στο πλαίσιο αυτό, το προφίλ έκφρασης των πρόσθετων nAChRs σε λευκοκύτταρα και το ρόλο τους στη νόσο είναι σχετικά λιγότερο διερευνηθούν. Κύτταρα

ΝΚ είναι μεγάλα, κοκκιώδη λεμφοκύτταρα που λειτουργούν μέσω κυτταρολυτική δραστικότητα και την έκκριση κυτοκινών. Αυτές οι δύο λειτουργίες ενδυνάμωση ΝΚ κυττάρων σε έμφυτη άμυνα του ξενιστή έναντι ορισμένων μικροβιακών παραγόντων και κύτταρα που υφίστανται κακοήθη μετασχηματισμό. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι οι αριθμοί και οι δραστηριότητες των κυττάρων ΝΚ μειώθηκε σε καπνιστές σε σύγκριση με τους μη καπνιστές [1], [2]. Η έκθεση στον καπνό του τσιγάρου εξασθενεί την κυτταροτοξική δράση και παραγωγή κυτοκίνης ΝΚ κυττάρων σε ανθρώπους και ποντίκια [9], [10], [11], συνδέοντας έτσι τα ελαττώματα των κυττάρων ΝΚ σε αυξημένη μόλυνση και ο καρκίνος. Το κάπνισμα έχει ιδιαίτερα συνδέεται με την εξαιρετικά κακοήθη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα. Ακόμη και μετά από χειρουργική αφαίρεση σε ένα πρώιμο στάδιο, σχεδόν το ήμισυ των ασθενών που πεθαίνουν από μια δευτερεύουσα μετάσταση όγκου. Λαμβάνεται ως δεδομένο ότι αυτό οφείλεται εν μέρει στην ελαττωματική ΝΚ κυτταρική ανοσολογική επιτήρηση επειδή παρεκκλίνουσα λειτουργία ΝΚ κυττάρων στους καπνιστές αυξάνει την επανεμφάνιση του τραχήλου της μήτρας μετάστασης του καρκίνου [12].

Εδώ, εξετάσαμε διεξοδικά την κυτταρική και μοριακά αποτελέσματα της νικοτίνης ως ένα από τα συστατικά του καπνού των τσιγάρων σε κύτταρα ΝΚ. Εμείς προφίλ nAChR έκφραση στα κύτταρα ΝΚ και προσδιορίζονται β2 nAChR ως καθοριστικό παράγοντα για τη νικοτίνη μεσολάβηση απομείωση των λειτουργιών των κυττάρων ΝΚ. Περαιτέρω, έχουμε αποδείξει ότι το νικοτινικό αναστολή των λειτουργιών των ΝΚ κυττάρων μέσω nAChR β2 αυξάνει σημαντικά μετάστασης μελανώματος σε ένα ξενογενές μοντέλο.

Υλικά και Μέθοδοι

Ζώα

Θηλυκά ποντίκια C57BL /6 (6-8 εβδομάδων), RAG2

– /-, RAG2

– /- γ

γ

– /-, όλα σε ένα C57BL /6 υπόβαθρο, αγοράστηκαν από την Taconic Farms. α7 και β2 ποντίκια ΚΟ [13], πέρασε επίσης να C57BL /6 υπόβαθρο, ευγενικά από τον Dr Allan C. Collins. Τα ποντίκια διατηρήθηκαν κάτω από συνθήκες χωρίς παθογόνα. Το Διοικητικό Συμβούλιο Έρευνας Δεοντολογίας Ζώων του Tianjin Ιατρικό Πανεπιστήμιο και το Νοσοκομείο του Αγίου Ιωσήφ και Ιατρικό Κέντρο εγκριθεί όλα τα πειράματα που περιγράφονται στην παρούσα μελέτη.

mRNA Καθαρισμός και αντίστροφης μεταγραφής PCR

mRNA καθαρίστηκε από φρέσκο ​​οξεία -isolated κύτταρα (-1.5 × 10

6 κύτταρα ανά δείγμα) με χρήση του κιτ απομόνωσης μMACS mRNA (Miltenyi Biotec), σύμφωνα με το παρεχόμενο πρωτόκολλο. Αντίστροφη μεταγραφή εκτελέστηκε με το κιτ SuperScript III First Strand cDNA Synthesis (Invitrogen, USA) ακολουθώντας το παρεχόμενο πρωτόκολλο. Ολίγο-dT αλληλουχίες χρησιμοποιήθηκαν για να εκκινήσουν την αντίστροφη μεταγραφάση. PCR ήταν συνέχεια διεξήχθη ακολουθώντας καθιερωμένα πρωτόκολλα, χρησιμοποιώντας μια ποικιλία από εκκινητές που είναι ειδικές για κάθε mRNA στόχο (Πίνακας 1). Primer ζεύγη σχεδιάστηκαν με τη χρήση του εργαλείου «Primer-έκρηξη» PubMed του (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Για κάθε ζεύγος, προς τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές ειδικοί για τις διάφορες εξόνια, έτσι ώστε τυχόν μόλυνσης DNA θα μπορούσε να αποκλειστεί. PCR πραγματοποιήθηκε με χρήση του κιτ RedTaq PCR (Sigma, USA), σύμφωνα με το παρεχόμενο πρωτόκολλο. Οι εκκινητές πάντοτε δοκιμάστηκαν με συνολικό cDNA εγκεφάλου (θετικός έλεγχος), και η βέλτιστη θερμοκρασία ανόπτησης (Tm) προσδιορίστηκε εμπειρικά (με τη χρήση ενός θερμοκυκλοποιητή κλίση θερμοκρασίας), διατηρώντας παράλληλα συνθήκες υψηλής αυστηρότητας. Ένας αρνητικός έλεγχος (κανένα πρότυπο cDNA), συμπεριελήφθη σε κάθε σετ αντιδράσεων. Τα προϊόντα της PCR για κάθε ζεύγος εκκινητών από θετικούς μάρτυρες υποβλήθηκαν σε αλληλούχιση, προκειμένου να εξασφαλιστεί η ακρίβεια των αποτελεσμάτων μας.

Η

Συνολικά nAChR Έκφραση οποία αξιολογείται από Ραδιοσυνδετήρας δέσμευση κορεσμού

Επιβατιδίνη, η οποία είναι επιλεκτική για β2- και β4 nAChRs περιέχουν (η οποία μπορεί να συναρμολογήσει με α4, α5, α6 και υπομονάδες β3), χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η ποσότητα του nAChRs β2 που περιέχουν, όπως γίνεται προηγουμένως [14], [15]. Για να μεγιστοποιηθεί η ευαισθησία της δοκιμασίας, χρησιμοποιήσαμε υψηλή ειδική δραστηριότητα [

125I] επιβατιδίνης (Ι-Epi? 2200 Ci mmol

-1? ΡΕ Life Sciences, Waltham, ΜΑ). Για το σκοπό αυτό, καθαρισμένα κύτταρα ΝΚ χρησιμοποιήθηκαν αμέσως μετά την απομόνωση. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ισότονο ρυθμιστικό σύνδεσης (mM: NaCl, 144? KCl, 2? CaCl

2, 2? MgSO

4, 1? HEPES 20? ΡΗ = 7,5), συμπληρωμένο με αλβουμίνη βόειου ορού (0,1% (w /v)). Οι επωάσεις διεξήχθησαν στους 22 ° C για 2 ώρες σε πλάκες 96 φρεατίων. Τα δείγματα επωάστηκαν με μια σειρά από οκτώ συγκεντρώσεις (6,25 – 800 ρΜ) του Ι-Epi σε συνολικό όγκο 30 μΙ συμπληρωμένου ισότονο ρυθμιστικό πρόσδεσης. Σύνολο (χωρίς προσθήκη πεπτιδίου) και μη-ειδική σύνδεση (που ορίζεται με τη χρήση 100 mM καρβαμυλχολίνη) μετρήθηκαν σε κάθε συγκέντρωση εις τριπλούν. Για να διαφοροποιηθούν β2- από nAChRs β4 που περιέχει 10 ηΜ A85380 προστέθηκε σε conjuncton με 200 ρΜ Ι-Epi [14]. τερματίστηκαν και πλύθηκαν με διήθηση χρησιμοποιώντας ένα 96-θέση πολλαπλής αντιδράσεις δέσμευσης. κλάσματα σωματιδίων συλλέχθηκαν σε ενιαία στρώματα Inotech 0,75 μm φίλτρα ινών υάλου κατακράτηση εμποτισμένο σε 0.5% πολυαιθυλενοϊμίνη. Bound ραδιοσυνδέτη ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μετρητή Microbeta πλάκα (PerkinElmer Life Sciences, Wellesley, ΜΑ).

Η νικοτίνη Θεραπεία in vivo και in vitro

Για ίη νίνο παράδοση, ένα διάλυμα 100 mg /ml που περιέχει (-) διτρυγική νικοτίνη (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) σε αλατούχο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) ή ένα διάλυμα PBS μόνο ήταν πρόσφατα παρασκευασμένο 24 ώρες πριν από την εμφύτευση αντλίας και φορτώθηκαν σε Alzet® ωσμωτικές μικροαντλίες (μοντέλο 2006, Durect Corporation, Cupertino, CA, USA). Οι αντλίες εμφυτεύτηκαν υποδορίως στη δεξιά πλευρά της πλάτης του ποντικού και συνεχώς παραδίδονται είτε PBS ή άλας νικοτίνης σε 3,6 μΙ /d για 6 εβδομάδες, και στη συνέχεια απομακρύνθηκαν αντλιών. Αυτό εξισώνεται με την παράδοση των 0,39 mg νικοτίνης ελεύθερης βάσης ανά ποντίκι ανά ημέρα. Για μια ~ 30 gm ποντίκι, το οποίο βρίσκεται στο άνω άκρο του βάρους για τα ζώα που χρησιμοποιούνται στη μελέτη, αυτό ισοδυναμεί με περίπου 13 mg νικοτίνης ελεύθερης βάσης /kg /d ή ~0.54 mg νικοτίνης ελεύθερης βάσης /kg /hr. επίπεδα νικοτίνης στο πλάσμα σε ποντικούς ~ 100-200 ng /ml (~0.6-1.2 mM) μετά την έγχυση του ~2-4 mg /kg /hr φαρμάκου και -45 ng /ml (~280 ηΜ) μετά την έγχυση σε ~ 0,5 mg /kg /hr. Για σύγκριση, η ανθρώπινη καπνιστές έχουν μέγιστα επίπεδα νικοτίνης στο πλάσμα του 10-50 ng /ml (~60-310 ηΜ). Συνεπώς, τα επίπεδα νικοτίνης στο πλάσμα (παρέκταση να είναι ~49 ng /ml ή ~ 300 ηΜ) των ποντικιών που χρησιμοποιήθηκαν στις μελέτες είναι συγκρίσιμες με εκείνες στο πλάσμα της ανθρώπινης καπνιστές. Μερικά ποντίκια ελέγχου έλαβαν PBS με απευθείας ενέσεις και όχι μέσω μίνι αντλίες, αλλά είτε η μέθοδος παράδοσης παρόμοια αποτελέσματα. Για τους in vitro πειράματα, 0.1-100 μΜ /ml νικοτίνης προστέθηκαν στις κυτταρικές καλλιέργειες.

Β16 Μελάνωμα κυτταρική γραμμή και Tumor Πρόκληση

Β16-Ρ10-luc2 (Β16) είναι μια λουσιφεράσης που εκφράζουν κυτταρική γραμμή από μελάνωμα ποντικού (δαγκάνα Life Sciences, Alameda, CA, USA). Τα ποντίκια των υποδεικνυόμενων γονότυπων προκλήθηκαν i.v. με Β16 κύτταρα σε 0,2 ml PBS μέσω της φλέβας της ουράς. Οι αριθμοί των κυττάρων που χρησιμοποιούνται και οι χρόνοι της θυσίας που αναφέρεται προηγουμένως καθιερωμένα πρωτόκολλα [9], [15], [16] και συγκεκριμένα στην ενότητα αποτελέσματα. Τα ζώα αναισθητοποιούνται και ευθανασία μέσω αφαιμάξεις μέσα στην κοιλιακή χώρα της διάτρησης της φλέβας. Οι πνεύμονες αφαιρέθηκαν και τοποθετήθηκαν σε PBS. οζίδια όγκων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανατομικό μικροσκόπιο από ερευνητή τυφλωμένο προς τις ομάδες θεραπείας. Σε ορισμένες περιπτώσεις, οι πνεύμονες εμβαπτίζονται σε ένα αιθανόλης 67%, 9% φορμαλδεΰδη, και 4% διάλυμα κρυσταλλικού οξικού οξέος και ο αριθμός των εστιών του όγκου απαριθμήθηκαν 24-48 ώρες αργότερα.

Απομόνωση μονοπύρηνων Lung Cells

Lung μονοπύρηνα κύτταρα απομονώθηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [17]. Εν συντομία, οι πνεύμονες διαποτίστηκαν με προθερμανθέν HBSS από τη δεξιά κοιλία. Τα κυτταρικά εναιωρήματα από εκτομή όργανα δημιουργήθηκαν με πέψη κολλαγενάσης και ακολουθούμενη από μηχανική κιμά. Τα κυτταρικά θραύσματα απομακρύνθηκαν με διαβίβαση μέσω νάϋλον πλέγματος. Τα κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε HBSS. Μη παρεγχυματικών κύτταρα απομονώθηκαν με βαθμιαίας πυκνότητας φυγοκέντρηση με Lympholyte-Μ (Cedarlane Laboratories).

ΝΚ κυτταροτοξικότητα κυττάρων Δοκιμασίες

ΝΚ κυτταροτοξικότητα κυττάρων αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία απελευθέρωσης χρωμίου χρησιμοποιώντας

51Cr- επισημασμένο κυτταρική γραμμή λεμφώματος YAC-1 ποντικού [18] ή καρκινικά κύτταρα Β16. Προσφάτως καθαρισμένα κύτταρα ΝΚ επωάστηκαν με

51Cr-σημασμένα κύτταρα-στόχους (5 × 10

3) σε διάφορες αναλογίες κύτταρο κύτταρο τελεστή /στόχο. Μετά από 4 ώρες επώασης, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και

51Cr-απελευθέρωσης μετρήθηκε με γ-μετρητή (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ). Το ποσοστό της ειδικής λύσης υπολογίζεται σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: (πειραματική απελευθέρωση – αυθόρμητη απελευθέρωση) /(μέγιστη απελευθέρωση – αυθόρμητη απελευθέρωση) χ 100. δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας έγιναν εις τριπλούν [18]

ΝΚ Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού. Δοκιμασίες

ΝΚ κύτταρα απομονώθηκαν από την σπλήνα των ποντικών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με νικοτίνη ή PBS. Τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει τροποποίηση του Dulbecco του μέσου Eagle (Gibco, Paisley, UK) συμπληρωμένο με 1% (ν /ν) ελάχιστο βασικό μέσο (Gibco), 2 mM γλουταμίνη (Laboratory Flow, Irvine, CA, USA), 50 IU /ml πενικιλίνη, 50 mg /ml στρεπτομυκίνη, και με 10% (ν /ν) FCS (όλα από την Gibco). 4 × 10

5 κύτταρα σε 200 μΐ μέσου καλλιέργειας τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο των 96 φρεατίων, πλάκες μικροτίτλου στρογγυλού πυθμένα (Nunc, Κοπεγχάγη, Δανία). Για τους in vitro πειράματα έκθεσης νικοτίνη, νικοτίνη (0.1-100 μΜ) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας εκτός από LPS (10 μg /ml). Μετά από 3 ημέρες επώασης, τα κύτταρα σημάνθηκαν για 18 ώρες με δείγματα 10 μΐ που περιέχει 1 μθΐ

3Η-methylthymidine (ειδική δραστικότητα 42 Ci /mmol? ΜΡ Biomedicals, Irvine, CA, USA) ανά φρεάτιο. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε φίλτρα γυάλινων ινών και ενσωμάτωση θυμιδίνης ανάλογη του βαθμού του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετρήθηκε στη συνέχεια. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μετρήσεις ανά λεπτό (cpm).

FACS Ανάλυση

εναιωρήματα μονών κυττάρων (10

6 κύτταρα) παρασκευάστηκαν από τη σπλήνα ή τους λεμφαδένες, και χρωματίστηκαν με fluorochrome- συζευγμένων αντισωμάτων. Όλα τα αντισώματα αγοράστηκαν από την BD Biosciences ή eBioscience εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Αντισώματα άμεσα επισημασμένο με μία από τις ακόλουθες ετικέτες φθορισμού: FITC, ΡΕ, PerCP, αλλοφυκοκυανίνη (APC), PC5, ή PC7. Τα ακόλουθα αντισώματα αντι-ποντικού χρησιμοποιήθηκαν: CD3 (145-2C11), NKG2A (20d5), NKG2D (CX5), Ly49 Ι (ΥΛΗ-90), ΝΚ1.1 (ΡΚ136), περφορίνη (eBioOMAK-D) και γράνζυμο Β (16G6). δεδομένων κυτταρομετρίας ροής συλλέχθηκαν σε FACSAria

TM κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, Mountain View, MD) και αναλύθηκαν με Diva

λογισμικού TM. αρνητικός mAbs ελέγχου που ταιριάζουν στον ισότυπο χρησιμοποιήθηκαν για όλους τους λεκέδες. Για να προσδιοριστεί το ποσοστό των κυττάρων που παράγουν επιλεγμένα κυτοκίνες, τιμές που λαμβάνονται με ελέγχους ισοτύπου αφαιρέθηκαν από εκείνους με ειδικό mAb.

όγκου in νίνο Απεικόνιση

Η βιοφωταύγεια εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα IVIS Σύστημα Απεικόνισης 200 Series (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, ΜΑ). Για

in vitro

απεικόνισης, βιοφωταυγή κύτταρα αραιώθηκαν σειριακά από 10

5 κύτταρα σε πλήρες μέσο σε μαύρο, με διαυγή πυθμένα, 24 φρεατίων (Costar, Acton, ΜΑ, USA). D-λουσιφερίνη (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, ΜΑ.) Στα 150 μg /ml σε μέσο προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο 5-10 λεπτά πριν από την απεικόνιση. χρόνος απεικόνισης ήταν 1 λεπτό /πλάκα. Για

in vivo

απεικόνισης, ποντικοί έλαβαν μια ενδοπεριτοναϊκή ένεση D-λουσιφερίνης 150 mg /kg (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, ΜΑ). Οι ποντικοί στη συνέχεια τοποθετήθηκαν πάνω στην θερμαίνεται στάδιο μέσα στο φως-σφιχτό κουτί κάμερα με συνεχή έκθεση σε 1-2% ισοφλουράνιο. χρόνους απεικόνισης κυμαίνονταν από 1 s έως 3 νομισματοκοπεία. Περιοχές ενδιαφέροντος από προβάλλονται εικόνες εντοπίστηκαν γύρω από τις περιοχές του όγκου και προσδιορίστηκαν ποσοτικά ως συνολικές μετρήσεις φωτονίων ή φωτόνια /s χρησιμοποιώντας το λογισμικό Living Image® (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, ΜΑ).

πειράματα πρόκλησης όγκου διεξήχθησαν με μελανώματος Β16 κύτταρα που εκφράζουν λουσιφεράση. Για ποσοτικοποίηση φορτίο όγκου, σε 10 λεπτά μετά την ενδοπεριτοναϊκή ένεση 3 mg /ποντικό D-λουσιφερίνη (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, ΜΑ), οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν και τοποθετήθηκαν στο φως σφιχτό θάλαμο ενός συστήματος απεικόνισης 200 βιοφωταύγειας IVIS (δαγκάνας Ζωής επιστήμες, Hopkinton, ΜΑ). Τα δεδομένα συλλέχθηκαν ως φωτόνια /sec /cm

2 χρησιμοποιώντας το λογισμικό Living Image® (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, ΜΑ).

MRI πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια 7Τ μικρό ζώο, 30 cm οριζόντια διαμετρήματος μαγνήτη και φασματόμετρο Biospec Avance III (Bruker, Billerica, ΜΑ) με ένα σύνολο 116 χιλιοστά υψηλής ισχύος κλίση (600 mT /m) και ένα 72 χιλιοστά σε ολόκληρο το σώμα του ποντικιού μετάδοσης /επιφάνειας λάβετε διαμόρφωση του πηνίου. Αξονικές και στεφανιαίες Τ1 (MSME? ΤΕ 10.5 ms, TR 322 ms, πάχος τομής 0,5 χιλιοστά, μήτρα 256 × 256, οπτικό πεδίο (FOV) 2,8 εκατοστών, οκτώ κατά μέσο όρο, 40 στεφανιαία φέτες, το χρόνο σάρωσης 22 λεπτών και 20 αξονική φέτες, χρόνος σάρωσης 16 λεπτά) και το λίπος-κατέστειλε turbo σπιν ηχούς Τ2 (σπάνια? ΤΕ1 14.5 ms, ΤΕ2 65,5 ms, TR 4500 ms, πάχος τομής 0,5 χιλιοστών, Matrix 256 × 256, FOV 2,8 εκατοστά, οκτώ κατά μέσο όρο, 40 στεφανιαία φέτες, το χρόνο σάρωσης 28 λεπτών και 20 αξονικές φέτες, το χρόνο σάρωσης 28 λεπτών) εικόνες αποκτήθηκαν, που καλύπτουν τον όγκο του εγκεφάλου από τον οσφρητικό βολβό /μετωπιαίο λοβό σχισμή στο αυχενικό νωτιαίο μυελό. MRI δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού MEDx3.4.3 (Medical Αριθμών, Βιρτζίνια, ΗΠΑ) σε ένα σταθμό εργασίας LINUX.

κυτοκίνης Ποσοτικοποίηση

Πρότυπο ELISA για την εκτίμηση της απελευθέρωσης κυτοκινών από τα κύτταρα ΝΚ (IFN -γ, MIP1α, και GM-CSF) διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το κιτ BD OptEIA ELISA (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση συγκέντρωση κυτοκίνης (pg /ml) ± SEM.

Για τη χρώση ενδοκυτταρικής κυτοκίνης, εναιωρήματα μονών κυττάρων παρασκευάστηκαν και επωάστηκαν στους 37 ° C για τέσσερις ημέρες σε στρογγυλού πυθμένα πλάκες (2 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο), και διεγείρονται με ένα μείγμα από ΡΜΑ (20 ng /ml), ιονομυκίνη (1 μg /ml), και brefeldin Α (5 μg /ml) για άλλες 5 ώρες στους 37 ° C. Μετά τη συγκομιδή, τα κύτταρα χρωματίστηκαν για επιφανειακούς δείκτες, σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά με κιτ Cytofix /Cytoperm (BD Biosciences), στη συνέχεια βάφτηκαν με αντι-ΙΡΝ-γ mAb (XMG 1.2) συζευγμένο με Alexa 647. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν σε ένα FACSAria

TM χρησιμοποιώντας Diva

λογισμικού TM.

qRT-PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη από εναιωρήματα κυττάρων του νωτιαίου μυελού, χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). Πρώτου κλώνου cDNA από κάθε δείγμα συντέθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ αντίστροφης μεταγραφής (Invitrogen). RT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως, χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ΑΒΙ Prism 7900-ΗΤ αλληλουχίας (Applied Biosystems) με την Πράσινη PCR kit QuantiTect SYBR (QIAGEN), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: ΝΡ-κΒ εμπρός, 5′-ATTTGAAACACTGGAAGCACGG-3 ‘? NF-kB αντίστροφη, 5’-CCGCCTTCTGCTTGTAGATAGG -3 ‘? ΙΚΚα προς τα εμπρός, 5’-TGCACACCGTGCAGAGTCA -3 ‘? ΙΚΚα αντιστραφεί, 5’-TGCTTGCAGCCCAACAACT -3 ‘? υποξανθίνης-γουανίνης (HPRT) προς τα εμπρός, 5’-AGCCTAAGATGAGCGCAAGT-3 ‘? και HPRT αντίστροφη, 5’-TTACTAGGCAGATGGCCACA-3 ‘. Το γονίδιο HPRT ενισχύθηκε και υπηρέτησε ως ενδογενή έλεγχο. 1 μΙ πρώτου κλώνου προϊόν cDNA ενισχύθηκε με Taq πολυμεράση πλατίνα (Invitrogen) και ζεύγη εκκινητών γονιδίου. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν και τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές. Οι σχετικές ποσότητες του mRNA υπολογίστηκαν με γραφική παράσταση της Ct (αριθμός κύκλου), και η μέση σχετική έκφραση καθορίζεται από το 2

-ΔΔCt συγκριτική μέθοδο.

Αποτελέσματα

Έκφραση nAChR Προφίλ για ΝΚ κύτταρα και επιβεβαίωση από Ligand Binding Δοκιμασίες

για να προσδιοριστεί η έκφραση του mRNA nAChR σε κύτταρα ΝΚ, εμείς ταξινομημένα κύτταρα ΝΚ από συγκεντρωμένα σπληνοκύτταρα από RAG2

– /- ποντίκια C57BL /6 που στερούνται Τ κυττάρων, ΝΚΤ κύτταρα και Β κύτταρα. mRNA εκχυλίστηκε από υψηλής καθαρότητας κύτταρα ΝΚ (Σχήμα 1Α) και προφίλ έκφρασης nAChR προσδιορίσθηκε με PCR. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα κύτταρα ΝΚ εκφράζουν nAChR α4, α5, α6, β2 και β3, αλλά δεν α3, α7, α9? ούτε β4. Επιπλέον η έκφραση του β2 ήταν ιδιαίτερα ισχυρή (Σχήμα 1Β). Στη συνέχεια διερευνήθηκε κατά πόσον nAChR πρωτεΐνες ικανούς να ασχοληθούν με το νικοτινικό δεσμευτική συναρμολογούνται στα κύτταρα ΝΚ, χρησιμοποιώντας ένα

125Ι-επισημασμένο επιβατιδίνης (Ι-Epi) δοκιμασία σύνδεσης (200 μ.μ.-Epi +/- 100 mM καρβαμυλχολίνης) ραδιοσυνδέτη, όπως περιγράφεται αλλού [14], [19], [20], [21]. ΝΚ κύτταρα (~ 1 εκατομμύριο) καθαρίστηκαν με FACS, και ομογενοποιημένο εγκέφαλο ποντικού φλοιού χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Ειδικά I-Epi σύνδεση ήταν 99 fmol /mg πρωτεΐνης σε κύτταρα ΝΚ, περίπου ίση με συγκεκριμένα επίπεδα πρόσδεσης στο ποντίκι ολόκληρο τον εγκέφαλο (Σχήμα 1 C). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι τα κύτταρα ΝΚ εκφράζουν σημαντικά οι αριθμοί των συναρμολογημένων nAChRs (καθώς και mRNAs υπομονάδα του nAChR όπως φαίνεται προηγουμένως) σε επίπεδα που μπορεί να προσδιοριστεί ποσοτικά με αυτή τη δοκιμασία. Από I-Epi προσδένεται σε αμφότερες τις β2- και περιέχουν β4-nAChRs [14], ανταγωνιστική δέσμευση με το nAChR ένωση β2-επιλεκτικός A85380 χρησιμοποιήθηκε για τη διάκριση μεταξύ αυτών των δύο υποτύπων υποδοχέα. Βρήκαμε ότι A85380 καταργείται σε μεγάλο βαθμό I-Epi δέσμευσης, καταδεικνύοντας ότι η συντριπτική πλειοψηφία των nAChRs που υπάρχει στα κύτταρα ΝΚ περιέχουν το β2 υπομονάδα (Σχήμα 1 C). Συλλογικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι τα κύτταρα ΝΚ εκφράζουν μια σειρά από nAChR mRNAs και ότι οι περισσότερες από αυτές τις υπομονάδες συναρμολογούνται σε nAChRs β2-περιέχουν. Η ισχυρή έκφραση του nAChR β2 σε κύτταρα ΝΚ, τόσο στο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης δείχνουν ότι nAChRs β2 περιέχουν είναι υποψήφιοι για μεσολάβηση των αποτελεσμάτων της νικοτίνης στη δραστηριότητα κυττάρων ΝΚ.

σπλήνας, ή λήφθηκαν κυτταρικά εναιωρήματα λεμφαδένα RAG2

– /- ποντίκια, και FACS πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

τμήμα. Τα Α Εκπρόσωπος οικόπεδα dot των κυτταρικών πληθυσμών πριν και μετά τη διαλογή φαίνεται στο πάνελ αριστερά και δεξιά, αντίστοιχα. Η καθαρότητα των κυττάρων ΝΚ έφθασαν & gt? Καθαρότητα 98% μετά τη διαλογή. Β mRNA καθαρίστηκε από τα ταξινομημένα κύτταρα ΝΚ, και cDNA συντέθηκε με αντίστροφη μεταγραφή. PCR πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για κάθε nAChR υπομονάδα ποντικού. Ένας θετικός μάρτυρας (+), χρησιμοποιώντας cDNA ολόκληρο εγκέφαλο ποντικού, και ένας αρνητικός έλεγχος (-), χωρίς cDNA, συμπεριλήφθηκαν σε κάθε αντίδραση. Για κάθε υπομονάδα του nAChR, ταινίες από το θετικό μάρτυρα και τουλάχιστον ένα δείγμα από κάθε κυτταρικό τύπο αλληλουχήθηκαν και επιβεβαιώνεται ως η σωστή προϊόν PCR. έκφραση Γ nAChR αξιολογούνται από δέσμευσης κορεσμού ραδιοσυνδέτη. Τα δεδομένα που απεικονίζονται είναι αντιπροσωπευτικά 2 με 3 ξεχωριστά πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Επίδραση του nAChR β2 Ανεπάρκεια στην έκφραση των υποδοχέων των κυττάρων ΝΚ και Δραστικών Μορίων

Οι λειτουργίες των κυττάρων ΝΚ υπαγορεύονται από διεγερτική και ανασταλτικοί υποδοχείς επί κυττάρων ΝΚ. Τα σήματα ενεργοποίησης παράγονται μέσω ΝΚ ομάδα 2 μέλος (NKG2D), τα οποία αναγνωρίζουν το στρες που επάγεται από τα μόρια των πρωτεϊνών αλυσίδας που σχετίζονται με MHC τάξης Ι (MICA και MICB) και οι-16-δέσμευσης UL πρωτεΐνες 1-4 (ULBP1-4), και γνωστή ως πρωτεΐνες RAET, ή μέσω φυσικής υποδοχέων κυτταροτοξικότητα (ΕΚΕΦΕ) που αναγνωρίζουν ιικό αιμαγλουτινίνης και ακόμη απροσδιόριστο σχετίζονται με όγκους συνδετήρα. Τα ανασταλτικά σήματα που παράγονται μέσω σύνδεσης των μορίων MHC τάξης Ι σε υποδοχείς που μοιάζουν με ανοσοσφαιρίνη φονικών κυττάρων (ΚΙΚ) στον άνθρωπο, ή να Ly49 σε ποντίκια, εκτός από το ετεροδιμερές CD94 /NKG2A και στα δύο είδη [22], [23]. Συγκρίναμε την έκφραση αρκετών από αυτούς τους υποδοχείς σε κύτταρα σπλήνας που απομονώθηκαν από ΝΚ nicotine- ή με PBS εκτεθειμένα ποντίκια και διερευνήθηκε η επίδραση, αν υπάρχει, της ανεπάρκειας β2 nAChR. Η έκφραση του ανασταλτικού υποδοχέα NKG2A δεν μεταβάλλεται σημαντικά σε ΝΚ κύτταρα από τη νικοτίνη? ενώ η έκφραση του NKG2D και Ly49I μειώθηκαν σε ποντικούς που έλαβαν νικοτίνη, και οι μειώσεις αυτές είναι σε μεγάλο βαθμό καταργήθηκε το nAChR β2

– /- ποντίκια (Εικόνα 2Α) [13]. Ελήφθησαν Παρόμοια ευρήματα σχετικά με την έκφραση του τελεστή κυττάρων ΝΚ μοριακό Granzyme Β και περφορίνης (Σχήμα 2Β). Παρατηρήσαμε επίσης ότι η νικοτίνη έχει παρόμοια επίδραση επί των πνευμόνων που προέρχεται από το προφίλ και τελεστές μόρια υποδοχέα κύτταρα ΝΚ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

άγριου τύπου (β2

+ /+) ή nAChR β2 knock-out ( β2

– /-) ποντικοί έλαβαν νικοτίνη (Nic) ή PBS για 21 ημέρες πριν από τη scarified. Ενιαία εναιωρήματα κυττάρων παρασκευάστηκαν από σπλήνες. Συχνότητα και φαινοτύπους των ΝΚ κυττάρων εντός των μονοπύρηνων κυττάρων αναλύθηκαν με FACS. Α Έκφραση NKG2D, NKG2A και Ly49I σε περιφραγμένο NK1.1

+ CD3

– κύτταρα. B. Η έκφραση της περφορίνης και γρανζύμου Β που εκκρίνεται από περιφραγμένο NK1.1

+ CD3

– κύτταρα. Τα δεδομένα οικόπεδο αντιπροσωπεύει αποτελέσματα από δύο ξεχωριστά πειράματα (η = 3-4 ποντικοί /ομάδα). τιμές P, το Φοιτητικό

t-test

, * ρ & lt?. 0.05

Η

nAChR β2 Ανεπάρκεια Αντιστρέφει τις ανασταλτικές επιδράσεις της νικοτίνης στο ΝΚ κυττάρων Λειτουργίες

Για να κατανοήσουμε το βιολογικές συνέπειες της αλλαγμένης έκφρασης του υποδοχέα ΝΚ κυττάρων που προκαλείται από την έκθεση σε νικοτίνη, ερευνήσαμε την επίδραση της νικοτίνης στην ΝΚ κυτταρική μεσολάβηση θανάτωση κυττάρων στόχων, καθώς και απελευθέρωση κυτοκινών από τα κύτταρα ΝΚ. ΝΚ κύτταρα κανονική αντιπροσωπεύουν το 5-10% των μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος σε ανθρώπινο και 1-3% των μονοκυττάρων σε σπλήνα ποντικού ή λεμφαδένα. Για τα κύτταρα ΝΚ για την εκτέλεση των καθηκόντων τους, τα κύτταρα αυτά πρέπει να πολλαπλασιάζονται κάτω από παθολογικές καταστάσεις. Έτσι, αξιολογούνται πρώτα την επίδραση της νικοτίνης επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΝΚ και διαπίστωσε ότι η νικοτίνη μειώνεται πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΝΚ και αριθμούς (Σχήμα 3Α, Β). nAChR β2 ανεπάρκεια αποκαταστάθηκε σε μεγάλο βαθμό την ικανότητα των ΝΚ κυττάρων να πολλαπλασιάζονται και αριθμούς με την παρουσία της νικοτίνης (Σχήμα 3Α, Β).

ΝΚ κύτταρα διαλέχθηκαν από σπληνοκυττάρων αιωρήματα μονών κυττάρων άγριου τύπου (β2

+ /+) ή nAChR β2 knock-out (β2

– /-). A. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων της νικοτίνης (0.1, 1, 10 ή 100 μΜ), και [

3Η] θυμιδίνης μετρήθηκε (10

3 cpm + SEM? Τεταγμένη). οι αριθμοί των κυττάρων Β ΝΚ εκτιμήθηκαν από β2

+ /+ ή β2

– /- ποντίκια σε παρουσία ή απουσία της νικοτίνης. (Ν = 6-8 ανά ομάδα? Φοιτητών

t-test

, * ρ & lt? 0,05). Γ

51Cr-labbed κυττάρου στόχου YAC-1 επωάστηκαν με κύτταρα ΝΚ που προέρχονται από β2

+ /+ ή β2

– /- ποντίκια σε παρουσία ή απουσία της νικοτίνης, στην ενδεικνυόμενη τελεστή /στόχου αναλογία των κυττάρων. Η θανάτωση των κυττάρων-στόχων μετράται με τη δοκιμασία απελευθέρωσης

51Cr. κύτταρα D. Β16 επωάστηκαν με κύτταρα ΝΚ που προέρχονται από β2

+ /+ ή β2

– /- ποντίκια σε παρουσία ή απουσία της νικοτίνης. D-λουσιφερίνης προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και η πλάκα απεικονίζεται για να ληφθεί φωτόνια /s ανά κύτταρο. Wells με κύτταρα μόνο (χωρίς νικοτίνη) ή κύτταρα (προστιθέμενη νικοτίνη) συμπεριλήφθηκαν ως έλεγχοι. Η θανάτωση των κυττάρων Β16 μετρώνται μέσω απεικόνισης βιοφωταύγεια. Τα δεδομένα ενός πειράματος από δύο εκτελούνται δεικνύεται, η = 3-4 ποντικοί /ομάδα. τιμές P, Μαθητή

t-test

, * ρ & lt? 0,05. Ε παραγωγή της ΙΡΝ-γ μετρήθηκε με χρώση ενδοκυτταρικής κυτοκίνης. Dot οικόπεδα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ξεχωριστά πειράματα (n = 6-18 ποντίκια). F. Παραγωγή της ΙΡΝ-γ, TNF-α, GM-CSF, ΜΙΡ-1α και ΜΙΡ-β από ταξινομημένα κύτταρα ΝΚ μετρήθηκε με ELISA. τιμές P, Μαθητή

t-test

, * ρ & lt?. 0.05

Η

Στη συνέχεια, αξιολόγησε την επίδραση της νικοτίνης για ΝΚ δραστηριότητα των κυττάρων λυτική και δυναμικό ρόλο για nAChR β2. Σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου που έλαβαν PBS, τα κύτταρα ΝΚ από ποντίκια νικοτίνη αγωγή παρουσίασαν μειωμένη κυτταροτοξικότητα εναντίον YAC-1, ένα κλασικό ΝΚ κυττάρου στόχου με χαμηλότερο MHC τάξης Ι έκφρασης (Σχήμα 3C). Πρωτογενής ανθρώπινες κυτταρικές σειρές μελανώματος και ποντίκι, ή, από κοινού έκφραση προσδεμάτων για τους υποδοχείς φυσικών κυτταροτοξικότητα (ΕΚΕΦΕ) και DNAX βοηθητικό μόριο-1 (DNAM-1), οι δύο αναδυόμενων υποδοχείς κυττάρων ΝΚ κλειδί για την αναγνώριση του καρκίνου [15]. Περαιτέρω, αυτά τα κύτταρα έχουν χαμηλή MHC τάξης Ι έκφραση [15]. Τα κύτταρα ΝΚ είναι έτσι σε θέση να αναγνωρίσει και να λύουν ανθρώπινα και μελάνωμα ποντικού κυττάρων in vitro και in vivo, και για την πρόληψη της μετάστασης μελανώματος σε θετή πειράματα μεταφοράς [24]. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται το Β16 κυτταρική γραμμή ποντικού, που προέρχεται από αυθόρμητες μελάνωμα ποντικού, και απέδειξαν ότι τα κύτταρα ΝΚ σκοτώνουν άμεσα τα καρκινικά κύτταρα Β16, και ότι αυτό το αποτέλεσμα ήταν σημαντικά μειωμένη όταν εκτίθενται σε νικοτίνη (Σχήμα 3C, D). Για να διερευνήσουν τις συνεισφορές του υποδοχέα β2 nAChR να μεσολαβήσει τις επιδράσεις της νικοτίνης, εκτελούμε αυτές πειράματα χρησιμοποιώντας nAChR β2

– /- κύτταρα ΝΚ (Σχήμα 3C, D). Σε όλα τα πειράματα, nAChR ανεπάρκεια β2 καταργηθεί σημαντικά τις επιδράσεις της νικοτίνης.

Τέλος, εξετάζουμε την επίδραση της νικοτίνης στην παραγωγή κυτοκινών από τα κύτταρα ΝΚ. Σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου, IFN-γ, GM-CSF, ΜΙΡ-1α, ΜΙΡ-1β και έκκριση ΤΝΡ-α μειώθηκαν σε ποντίκια έλαβαν νικοτίνη (Σχήμα 3Ε, F). Και πάλι, αυτές οι παράμετροι αντιστράφηκαν σε μεγάλο βαθμό σε nAChR β2

– /- ποντίκια. Συλλογικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η νικοτίνη παρεμποδίζει τις λειτουργίες των κυττάρων ΝΚ που συμπεριλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό, κυτταροτοξικότητα προς YAC-1 κυττάρων και κυττάρων όγκου Β16, και την παραγωγή κυτοκινών. Τα ευρήματά μας δείχνουν επίσης ότι, παρά έκφραση πολλαπλών nAChRs, nAChR β2 προέκυψε ως μεσολαβητής κλειδί για νικοτινικούς αποτελέσματα επί κυττάρων ΝΚ, όπως η ανεπάρκεια του nAChR α7 αποτυγχάνει να μεταβάλλει σημαντικά την επιρροή της νικοτίνης στα κύτταρα ΝΚ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

η νικοτίνη αναστέλλει την NF-κΒ Μετενεργοποίησης σε κύτταρα ΝΚ μέσω nAChR β2

Κινητοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ είναι ένα ουσιαστικό βήμα για την ενεργοποίηση των κυττάρων ΝΚ και προχωρά cytotoxicic δραστηριότητα και την παραγωγή των κυτοκινών του. Για να αξιολογηθεί η επίδραση της νικοτίνης επί της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα ΝΚ, εμείς ταξινομημένα κύτταρα ΝΚ από σπλήνα RAG2

– /- ποντίκια, και καλλιεργήθηκαν των απομονωμένων κυττάρων ΝΚ μόνο του ή με νικοτίνη για 24 ώρες. Πραγματοποιήσαμε μία σειρά από πραγματικού χρόνου PCR πειράματα κοιτάζοντας αλλαγές στη μεταγραφή αφθονία, και είδε ότι η προσθήκη της νικοτίνης κατέστειλε γονιδιακής μεταγραφής του ΝΡ-κΒ, και ΙΚΚα, μια εναλλακτική ρυθμιστής του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα ΝΚ (Σχήμα 4). Για να προσδιορίσετε αν nAChR β2 εμπλέκεται, διασχίζουμε φυλής RAG2

– /- με nAChR β2

– /- ποντίκια για να δημιουργήσετε διπλά knockout ποντικών. Όταν χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα ΝΚ που προέρχονται από αυτά τα ποντίκια, η επίδραση της νικοτίνης επί NF-κΒ και ΙΚΚα μεταγραφή γίνεται ελάχιστο (Σχήμα 4). Έτσι, nAChR β2 διαμεσολαβεί τις επιδράσεις της νικοτίνης στα γονίδια της μεταγραφής ΝΚ κυττάρων που είναι κρίσιμα για τις λειτουργίες τους

ΝΚ κύτταρα ταξινομήθηκαν από σπληνοκυττάρων αιωρήματα απλών κυττάρων RAG2

-. /- Και RAG2

– /-β2

– /- ποντίκια. NF-κΒ και ΙΚΚα mRNA των διαλεγμένων κυττάρων ΝΚ σε β2

+ /+ ή β2

– /- ποντικοί έλαβαν νικοτίνη (Nic) μετρήθηκε με qRT-PCR. Τα δεδομένα ενός πειράματος από δύο εκτελούνται δεικνύεται, η = 3-4 ποντικοί /ομάδα. τιμές P, το Φοιτητικό

t-test

, * ρ & lt?. 0.05

Η

Η νικοτίνη έκθεσης Προωθεί μετάσταση στους πνεύμονες, μια διαδικασία που εξαρτάται από nAChR β2

Ο καπνός του τσιγάρου έχει πειραματικά αποδειχθεί ότι αυξάνει πνεύμονα μεταστατικό φορτίο του όγκου [11]. Όπως πολλαπλές χημικές ουσίες που περιέχονται στον καπνό του τσιγάρου μπορεί να έχει αυτό το αποτέλεσμα, επιδιώξαμε να αντιμετωπίσει συγκεκριμένα τον ρόλο της έκθεσης νικοτίνης σε αυτή τη διαδικασία. Για το σκοπό αυτό, υιοθετήσαμε τη ποντικού Β16 κυτταρική γραμμή που προέρχεται από αυθόρμητες μελάνωμα ποντικού. Επειδή τα καρκινικά κύτταρα B16 έχουν πιθανή μετάσταση υψηλή πνεύμονα και τέτοια μετάσταση μπορεί να ανασταλεί από τα κύτταρα ΝΚ, το μοντέλο αυτό είναι ιδανικό για την αντιμετώπιση του ρόλου της νικοτίνης και των υποδοχέων της σε αυτή παθολογική διαδικασία. Για το σκοπό αυτό, C57BL /6 RAG2

– /- ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με νικοτίνη ή PBS μέσω οσμωτικής εμφύτευσης αντλία για 14 ημέρες και μετά. Η επιλογή της δόσης βασίζεται σε καπνιστές και δικαιολογείται λεπτομερώς στο τμήμα μέθοδοι και σε προηγούμενες δημοσιεύσεις μας [7], [8]. Αυτοί οι ποντικοί στη συνέχεια προκλήθηκαν i.v. με 1 × 10

6 B16- κύτταρα του μελανώματος. Με βάση τη βιβλιογραφία [11], [15], [16], κάναμε πειράματα παρασκεύασμα στο οποίο το φορτίο του όγκου και της επιβίωσης ποσοστά συγκρίθηκαν σε ποντικούς που λαμβάνουν 1 × 10

5, 2,5 × 10

5, 5 × 10

5, 1 × 10

6 και 2,5 × 10

6 Β16 κύτταρα.