Αφηρημένο

Ingenol-3-angelate (Ι3Α) είναι ένας μη-όγκου προώθηση φορβολεστέρα-όπως ένωση που ταυτοποιείται στο σφρίγος της

Euphoria peplus.

Παρόμοια με την προώθηση του όγκου εστέρες φορβόλης, Ι3Α είναι ένα διακυλογλυκερόλη (DAG) αναλόγου που συνδέεται με υψηλή συγγένεια με τα C1 τομείς PKCs, στρατολογεί PKCs να κυτταρικές μεμβράνες και προωθεί την ενεργοποίηση του ενζύμου. Πολυάριθμες δραστηριότητες κατά του καρκίνου έχουν αποδοθεί σε Ι3Α και αποδίδονται σε επιδράσεις Ι3Α για PKCs. Δείχνουμε εδώ ότι Ι3Α δεσμεύει επίσης και ενεργοποιεί μέλη της οικογένειας RasGRP του Ras ενεργοποιητών που οδηγεί σε ισχυρή ανύψωση της Ras-GTP και εμπλοκή του καταρράκτη κινάσης Raf-Mek-Erk. Σε απάντηση προς Ι3Α, ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες που αποτελούνται από GFP συγχωνευμένο χωριστά προς πλήρους μήκους RasGRP1 και RasGRP3 ταχέως προσλαμβάνονται σε κυτταρικές μεμβράνες, σύμφωνη με την άμεση σύνδεση της ένωσης με τον τομέα C1 RasGRP του. Στην περίπτωση της RasGRP3, θεραπεία IA3 οδήγησε σε θετικό ρυθμιστικό φωσφορυλίωσης επί T133 και ενεργοποίηση του υποψηφίου ρυθμιστικής κινάσης ΡΚΟδ. επεξεργασία Ι3Α επιλεγμένων Β μη-Hodgkin λεμφώματος κυτταρικών σειρών οδήγησε σε ποσοτικές και ποιοτικές αλλαγές στην Bcl-2 πρωτεϊνών μέλος της οικογένειας και την επαγωγή της απόπτωσης, όπως αποδείχθηκε προηγουμένως με το αναλογικό Δ.Σ.Ε. βρυοστατίνη 1 και συνθετικό ανάλογο pico της. Τα αποτελέσματά μας προσφέρει περαιτέρω γνώσεις σχετικά με τις αντικαρκινικές ιδιότητες του Ι3Α, υποστηρίζουν την ιδέα ότι RasGRPs αντιπροσωπεύουν το δυναμικό του καρκίνου θεραπευτικούς στόχους μαζί με την PKC, και να επεκτείνει την γνωστή γκάμα των συνδετήρων για ρύθμιση RasGRP

Παράθεση:. Song Χ, Lopez- Campistrous Α, Sun L, Dower NA, Kedei Ν, Yang J, et al. (2013) RasGRPs Οι στόχοι του Αντικαρκινικού Agent Ingenol-3-Angelate. PLoS ONE 8 (8): e72331. doi: 10.1371 /journal.pone.0072331

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center pg=2). Pep005 έχει αποδειχθεί αποτελεσματική στη θεραπεία της ακτινικής κεράτωσης [2] και αναπτύσσεται για τη θεραπεία του καρκινώματος βασικών κυττάρων και πλακώδες καρκίνωμα [1]. Σε διαφορετικά πειραματικά μοντέλα, μπορούν να επάγουν Ι3Α των καρκινικών κυττάρων πρωτογενούς νέκρωσης [3], η απόπτωση [4] και γήρανση [5]. Όγκου κυττάρου-εξωγενή αντικαρκινικές επιδράσεις του Ι3Α περιλαμβάνουν διατάραξη της αγγείωσης του όγκου [6], ογκοκτόνο πρόσληψη ουδετερόφιλων [7] και η παραγωγή κυτταροτοξικών Τ κυττάρων με όγκου σε παλινδρόμηση [8]. Ι3Α δεσμεύεται με καθαρισμένο κλασική και τα νέα ισόμορφα PKC

in vitro

[9]. θεραπεία Ι3Α καλλιεργημένων κυττάρων έχει σαν αποτέλεσμα την ταχεία μετατόπιση αυτών των ενζύμων σε κυτταρικές μεμβράνες [9]. Έτσι, μερικές από τις βιολογικές επιδράσεις πιθανόν να προκύψουν από την ενεργοποίηση Ι3Α της PKCs στα ζωντανά κύτταρα.

Αν και οι πρώτες έρευνες για Δ.Σ.Ε. και DAG ανάλογα επικεντρώθηκε στην ρύθμιση τους των μελών της οικογένειας PKC, είναι πλέον σαφές ότι η πρόσθετη οικογένειες των πρωτεϊνών υπάρχουν με ομόλογο DAG περιοχές δέσμευσης C1 και ότι αυτές οι οικογένειες εξυπηρετούν κρίσιμες βιολογικούς ρόλους [10], [11]. Οι RasGRPs είναι θετικοί ρυθμιστές της μικρής ΟΤΡάσης Ras. Οι chimerins λειτουργούν ως αρνητικοί ρυθμιστές της μικρής Rac ΟΤΡάσης, το οποίο ρυθμίζει τον κυτταρικό σκελετό ακτίνης. MRCK (μυοτονική δυστροφία κινάση που σχετίζονται δέσμευσης κινάσης Cdc42) σήματα προς τα κάτω του μικρού ΟΤΡάσης Cdc42, τον έλεγχο του σχηματισμού filopodia και επηρεάζουν την εισβολή του όγκου. Munc13 μέλη της οικογένειας ρυθμίζουν σύντηξης συναπτική μεμβράνη κυστιδίων και τη δραστηριότητα των συνάψεων. τα μέλη της οικογένειας D πρωτεϊνική κινάση διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη βιωσιμότητα. DAG κινάσες μετατρέπουν DAG να φωσφατιδικό οξύ, εξασθένιση σηματοδότηση μέσω των ανωτέρω οικογένειες πρωτεϊνών DAG αποκρίνονται καθώς και πιθανώς ενισχύοντας μονοπάτια σηματοδότησης φωσφατιδικό οξύ αποκρίνονται. Η κατανόηση της επιλεκτικότητας των θεραπευτικών παραγόντων που στοχεύουν σε DAG δέσμευσης C1 τομείς αυτών των άλλων κατηγοριών DAG-συνδετικές πρωτεΐνες είναι επομένως σημαντική για την κατανόηση θεραπευτικό δυναμικό τους και τους μηχανισμούς δράσης τους.

έκφραση υψηλού επιπέδου των RasGRP1 και RasGRP3 δείχνει περιορισμένη κατανομή στους ιστούς, με εξέχουσα έκφραση στα λεμφοκύτταρα [12]. Ένα αυξανόμενο σώμα αποδείξεων υποστηρίζει την υπόθεση ότι ένας βασικός ρόλος αυτών των πρωτεϊνών είναι να λειτουργήσει κατάντη του ανοσοποιητικού υποδοχέων σε Β και Τ κύτταρα [12]. Ανοσολογική διέγερση του υποδοχέα οδηγεί σε ενεργοποίηση φωσφολιπάσης C και συσσώρευση DAG σε μεμβράνες. Δ.Σ.Ε. επηρεάζει RasGRP1 και RasGRP3 μέσω δύο συντονισμένων μηχανισμών. Πρώτον, οι C1 τομείς της RasGRP1 και RasGRP3 δεσμεύουν DAG και φορβολεστέρα [13], [14], προκαλώντας τις RasGRPs να προσληφθούν σε κυτταρικές μεμβράνες όπου συναντούν το υπόστρωμα τους, λιπιδιωμένη Ras. Η διαγραφή του τομέως C1 προκαλεί απώλεια της ανταπόκρισης εστέρα φορβόλης [15]. Επιπλέον, RasGRP1 και RasGRP3 υποβάλλονται σε φωσφορυλίωση ενεργοποίησης από PKC, η ίδια ενεργοποιούνται από DAG [16] – [19]. Ras ενεργοποίηση από RasGRPs είναι σημαντική για τη διαφοροποίηση των θυμοκυττάρων, τη λειτουργία των κυττάρων τελεστή Τ, και την ομοιόσταση λεμφοκυττάρων [12]. RasGRP4, όπως RasGRP1 και RasGRP3, επίσης πιθανό δεσμεύει Δ.Σ.Ε. και ενεργοποιεί το Ras [20], [21], αν και ρύθμιση από PKC δεν έχει τεκμηριωθεί. RasGRP4 δείχνει εξέχουσα έκφραση σε μαστοκύτταρα [21], αλλά βρίσκεται και σε άλλα μυελοειδή καταγωγές και στις αρχές του θύμου [22], [23].

Έχουμε υποστηρίξει ότι RasGRPs θα μπορούσε να αποτελέσει βιώσιμη στόχους φάρμακο που θα μπορούσε να χειριστεί με Δ.Σ.Ε. αναλόγων σε κλινικά ευεργετικά άκρα [24]. Συγκεκριμένα, έχουμε δείξει ότι επιλέξτε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ορισμένες μορφές λεμφώματος Β-μη Hodgkin (Β-NHL) υφίστανται απόπτωση όταν RasGRPs διεγείρονται με DAG ανάλογα όπως βρυοστατίνη 1 ή το συνθετικό ανάλογο «pico». Αρχικά, εστιάσαμε στην DAG αναλογικού-επαγόμενη απόπτωση στην κυτταρική σειρά Toledo, η οποία πιθανόν προέκυψε από ένα βλαστικό κέντρο που προέρχεται κακοήθεια. Δείξαμε ότι η απόπτωση συνέβη μέσα σε 48 ώρες και εμπλέκονται προ-αποπτωτική φωσφορυλίωση του ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνη Bim μέσω της οδού RasGRP-Ras-Raf-Mek-Erk [25]. Πιο πρόσφατα, ανακαλύψαμε ένα δεύτερο μηχανισμό απόπτωση που επάγεται που παρατηρήθηκε σε λέμφωμα του Burkitt (BL) προερχόμενο κυτταρική γραμμή, BL-2, και 5 από τα 6 μανδύα λεμφώματος κυττάρων (MCL) προερχόμενο κυτταρικές γραμμές [26]. Οι περισσότερες από αυτές τις κυτταρικές σειρές ήταν Bim ανεπάρκεια και η αποπτωτική μηχανισμός συνδέθηκε αντ ‘αυτού με ποσοτικές αλλαγές σε άλλα μέλη της οικογένειας Bcl-2: έκφραση της προ-αποπτωτικών ΒΗ3-μόνο μέλος της οικογένειας Bik γενικά αυξήθηκε, ενώ εκείνη του αντι-αποπτωτικά μέλη Bcl -Χι και Mcl-1 μειώθηκε. Αυτό το δεύτερο μηχανισμό προχώρησε πολύ πιο αργά από ό, τι αυτή που παρατηρήθηκε στα κύτταρα Toledo.

Εδώ, δείχνουμε ότι RasGRPs είναι στόχοι του Ι3Α σε καλλιεργημένα κύτταρα. Επιπλέον, η θεραπεία Ι3Α των αντιπροσωπευτικών κυτταρικών σειρών Β-NHL ενεργοποιεί τα δύο τεκμηριωθεί προηγουμένως RasGRP συνδυασμό μηχανισμών που οδηγούν στην απόπτωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Τα πειράματα σε ζώα έγιναν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκε από την επιτροπή Επιστημών Υγείας Πολιτικής και Ευημερίας των ζώων του Πανεπιστημίου της Αλμπέρτα, σύμφωνα με το καναδικό Συμβούλιο για τις κατευθυντήριες γραμμές φροντίδα των ζώων.

Αντιδραστήρια

Ingenol-3-angelate αγοράστηκε από την Calbiochem (La Jolla, CA) και διαλύθηκε σε DMSO σε 1 mM. Το απόθεμα αραιώθηκε σε μία τελική συγκέντρωση των 100 ηΜ σε μέσο εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά και σε σύγκριση με το DMSO παρομοίως αραιωμένο. Mek αναστολείς και τα αντιδραστήρια για τη μελέτη της απόπτωσης έχουν περιγραφεί προηγουμένως [25], [26]. PMA ήταν από τα εργαστήρια LC (Woburn, MA), Gö6983, κοκτέιλ πρωτεάσης που 1 και NP-40 ήταν από την Calbiochem (Billerica, ΜΑ).

Cell Culture

Rat2 κύτταρα τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν ο φορέας ρετροϊού pBaBepuro ή τα παράγωγα φορέα που περιέχει cDNA που κωδικοποιούν RasGRP1, RasGRP3 ή RasGRP4 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. κύτταρα Rat2 καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου συμπληρωμένο με πενικιλλίνη, στρεπτομυκίνη και γλουταμίνη (Gibco, Burlington, ΟΝ, Canada). Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές λεμφώματος καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco) συμπληρωμένο όπως παραπάνω. Οι προέλευση των κυτταρικών γραμμών έχουν δημοσιευθεί [25], [26]. Η κυτταρική γραμμή Ramos Β, LNCaP κυτταρική σειρά προστάτη και ΗΕΚ-293 κύτταρα που εκφράζουν GFP-RasGRP3 [28] αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και 2 mM γλουταμίνη (ATCC, Manassas, VA).

ποντίκια

Rasgrp1 – /- ποντίκια έχουν

έχουν περιγραφεί προηγουμένως [27] και διατηρήθηκαν στο C57BL /6J φόντο. C57BL /6J ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες άγριου τύπου.

Ι3Α in vitro Μελέτες δέσμευσης

συγγένειες δέσμευσης Ι3Α στον τομέα RasGRP1 C1 και να RasGRP3 προσδιορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13], [ ,,,0],14]. Η θερμοκρασία επώασης, βελτιστοποιημένη για σταθερότητα των πρωτεϊνών υπό συνθήκες δέσμευσης, ήταν 37 ° C για τον τομέα RasGRP1 C1 και 18 ° C για RasGRP3.

ανάλυση των πρωτεϊνών με ανοσοκηλίδωση

Ανάλυση των ενεργών και συνολική Ras, pErk1 /2, τα μέλη της Erk1 /2 και Bcl-2 οικογένειας, εκτός εάν σημειώνεται διαφορετικά, περιγράφηκε νωρίτερα [25], [26]. Για την ανάλυση της φωσφορυλίωσης RasGRP3, κύτταρα Ramos υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΡΜΑ, Ι3Α ή φορέα DMSO ελέγχου όπως υποδεικνύεται για 30 λεπτά μετά την οποία συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (1% ΝΡ-40 σε PBS με αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ που 1). Σε μερικές περιπτώσεις, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία επί 30 λεπτά με τον αναστολέα παν-PKC Gö6983 (5 μΜ). Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28] χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντισώματα: pRasGRP3T133 (Epitomics ab124823), RasGRP3 (Cell Signaling, # 3334), ΡΚΟδ (Santa Cruz, sc-937), pPKCδ Ser299 (Epitomics ab133456), pErk1 /2 ( T202 /Y204, Cell Signaling, # 9106), Erk1 /2 (Cell Signaling, # 9102), β-ακτίνη (Santa Cruz, SC-47778). Μετά την ανάπτυξη των σημάτων με ECL (ενισχυμένη χημειοφωταύγεια), οι ταινίες σαρώθηκαν και ποσοτικοποίηση του σήματος διεξήχθη χρησιμοποιώντας ImageJ (National Institutes of Health).

Ομοεστιακή Μικροσκοπία

μετατόπιση του GFP- RasGRP1 σε κύτταρα LNCaP αξιολογήθηκε όπως περιγράφεται [29]. 60.000 κύτταρα LNCaP απλώθηκαν σε ibidi μ-πιάτα (Ibidi LLC, Verona, WI) και στη συνέχεια επιμολύνονται 48 ώρες αργότερα με RasGRP1 κωδικοποιεί πλασμίδιο GFP-tagged χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine σε συνδυασμό με Plus αντιδραστηρίου ανάλογα με τον κατασκευαστή (Invitrogen, Carlsbad, CA ) συστάσεις. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1,000 ηΜ ΡΜΑ ή Ι3Α σε συνεστιακό μέσο (κατά Dulbecco Modified Eagle Medium χωρίς ερυθρό φαινόλης συμπληρωμένο με 1% FBS), και time-lapse εικόνες συλλέχθηκαν κάθε 30 s χρησιμοποιώντας το λογισμικό Zeiss AIM. Απεικόνισης ήταν με ένα ομοεστιακό σύστημα μικροσκόπιο Zeiss LSM 510 ή Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss, Inc.) με Axiovert 100 Μ αντεστραμμένο μικροσκόπιο που λειτουργεί με ένα λέιζερ αργού 25 mW συντονισμένοι σε 488 nm. Ένα 63 × 1.4 NA Zeiss Plan-Αχρωματικός ελαιοκαταδυτικό αντικειμενικό χρησιμοποιήθηκε μαζί με ποικίλες ζουμ (1,4 έως 2 φορές). Για να δημιουργηθεί ένας φορέας για τις μελέτες αυτές hRasGRP1 (NM-005739) εισήχθη εντός του φορέα pQB125-FN1 με κλασσική κλωνοποίηση χρησιμοποιώντας

Nhe Ι

διάσπασης ενζύμου περιορισμού. Οι αλληλουχίες DNA των κατασκευασμάτων επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση αλληλουχίας (DNA, Minicore, CCR, NCI, ΝΙΗ).

κύτταρα Membrane Κλασμάτωση

ΗΕΚ-293 που εκφράζουν GFP-RasGRP3 [28] υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΡΜΑ ή Ι3Α (1000 ηΜ ή 100 ηΜ) για 30 λεπτά ή DMSO ως έλεγχος του οχήματος. Στο τέλος της θεραπείας τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS, απομακρύνονται από τις πλάκες με απόξεση και κατακρημνίστηκαν με φυγοκέντρηση χαμηλής ταχύτητας (5000 rpm για 5 λεπτά σε ένα ψυχόμενο μικροφυγόκεντρο Eppendorf). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε υπερήχους (3 χ 6 sec) σε PBS συμπληρωμένο με αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ που 1 και στη συνέχεια φυγοκεντρείται σε χαμηλή ταχύτητα όπως παραπάνω για να απομακρυνθούν τα μη σπασμένα κύτταρα. Δείγματα αυτού του υπερκειμένου που αντιπροσωπεύουν «συνολική πρωτεΐνη» προορίζονταν για ανάλυση. Το υπόλοιπο του υπερκείμενου στη συνέχεια υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση υψηλής ταχύτητας (100.000 χ g για 1 ώρα) για να αποδώσει ένα υπερκείμενο «κυτταροπλασματικό κλάσμα». Το σφαιρίδιο υψηλής ταχύτητας πλύθηκε, διαλύθηκε σε 1% Triton-Χ 100, και απορρυπαντικό αδιάλυτο υλικό απομακρύνθηκε με φυγοκέντρηση υψηλής ταχύτητας, όπως παραπάνω. Το προκύπτον τελικό υπερκείμενο αντιπροσωπεύει το «κλάσμα μεμβράνης». Κλάσματα του συνόλου, κυτταροπλασματικής και μεμβράνη πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση SDS πολυακρυλαμιδίου και ανοσοκηλιδώσεως, με την ίδια πρωτεΐνη φορτώθηκε σε κάθε λωρίδα.

Απόπτωση και Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Δοκιμασίες

Οι μέθοδοι για τη μελέτη φάρμακο απόπτωση και η δοκιμασία ΜΤΤ για συσσώρευση βιώσιμων κυττάρων έχουν δημοσιευθεί [26].

Αποτελέσματα

η σύνδεση του Ι3Α σε RasGRP1 και RasGRP3 in vitro

Τόσο η RasGRP1 και ο RasGRP3 C1 domains είχαν προηγουμένως δειχθεί ότι δεσμεύουν DAG αναλόγων συμπεριλαμβανομένων των εστέρων φορβόλης [13], [14]. Μοντελοποίηση υποδεικνύει ότι ingenol 3-εστέρων δεσμεύονται με C1 τομείς με παρόμοιο τρόπο σε εστέρες φορβόλης και DAG [30]. Κατά συνέπεια, εκτιμάται η πρόσδεση του Ι3Α χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ανταγωνισμού με τη χρήση [

3Η] φορβολεστέρα 12,13-διβουτυρικό, με την παρουσία 100 μg /ml φωσφατιδυλσερίνης (Πίνακας 1). RasGRP1 (C1 τομέα) και RasGRP3 (πλήρους μήκους) δεσμευμένο Ι3Α με 2- και 9- φορές μεγαλύτερη συγγένεια, αντίστοιχα, από ό, τι δεσμεύονται τον εστέρα φορβόλης PDBu. Σε σύγκριση με ΡΚΟα, RasGRP1 και RasGRP3 δεσμεύεται Ι3Α με περίπου παρόμοιες συγγένειες, που δείχνει ότι δεν υπήρξε καμία επιλεκτικότητα μεταξύ αυτών των δύο οικογενειών των στόχων, τουλάχιστον

in vitro

.

Η

Ι3Α Ενεργοποιεί RasGRPs σε καλλιεργημένα ινοβλάστες και Jurkat Τ κύτταρα

Rat2 ινοβλάστες δεν ανιχνεύσιμα ρητή ενδογενή RasGRPs. Έτσι, τα κύτταρα Rat2 τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν επιμέρους RasGRPs, σε σύγκριση με τα κύτταρα τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν τον κενό φορέα, παρέχουν ένα βολικό σύστημα για να καθοριστεί αν ένα ανάλογο DAG μπορεί να ενεργοποιήσει RasGRPs. Σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν τον κενό φορέα, κύτταρα Rat2 που εκφράζουν RasGRP1 έδειξε ισχυρή ενεργοποίηση της Ras, όπως εκτιμάται χρησιμοποιώντας μία pull-down δοκιμασίας που ανακτήθηκαν Ras-GTP δεσμεύονται στα Ras-πεδίο σύνδεσης του Raf1 (Εικ. 1Α). Ι3Α ήταν εξίσου αποτελεσματικό με PMA σε αυτή τη δοκιμασία. Παρομοίως, η έκφραση της RasGRP3 σε κύτταρα Rat2 παρείχε την ικανότητα να ενεργοποιούν Ras σε απόκριση σε δύο αναλόγων DAG (Εικ. 1Β). Jurkat Τ κύτταρα εκφράζουν ενδογενώς RasGRP1 αλλά όχι σημαντικές ποσότητες του RasGRP3 ή RasGRP4. θεραπεία Ι3Α προκάλεσε επαναλήψιμα αναπαραγώγιμη ενεργοποίηση Ras σε Jurkat Τ κύτταρα, παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε με ΡΜΑ (Εικ. 1 C).

A. Καλλιέργειες κυττάρων Rat2 μηχανικής είτε με κενό φορέα ή RasGRP1 cDNA που εκφράζουν φορέα υποβλήθηκαν σε αγωγή με Ι3Α ή ΡΜΑ επί 10 λεπτά και σε σύγκριση με τον έλεγχο καλλιεργειών χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό pull-down Ras-GTP. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. B. Σε ένα μόνο πείραμα κύτταρα Rat2 που εκφράζουν RasGRP3 cDNA παρομοίως αναλύθηκαν. Γ Jurkat Τ κύτταρα αναλύθηκαν για DAG ενεργοποίηση αναλογικής επαγόμενη Ras σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. D. Ένας ίσος αριθμός C57BL /6J (WT, άγριου τύπου) και

Rasgrp1

– /- (KO, νοκ-άουτ) θυμοκύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (αρνητικός έλεγχος), Ι3Α ή ΡΜΑ όπως υποδεικνύεται για 10 λεπτά και πρωτεΐνη λύματα συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό σηματοδότησης φωσφο-ΕΚΚ. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά των διπλών πειραμάτων. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των αναλογιών των RasGTP /Ras ή ρ-Erk1 /2 /Erk1 /2 παρουσιάζονται παρακάτω επιμέρους πάνελ.

Η

προηγουμένως έδειξαν ότι RasGRP1 ήταν απαραίτητη για DAG αναλογικών επαγόμενη ενεργοποίηση της Ras σε θυμοκύτταρα ποντικιού?

Rasgrp1

– /- θυμοκυττάρων ήταν τελείως ελαττωματικό, ενώ άγριου τύπου (C57Bl /6J) θυμοκυττάρων παρουσίασαν ισχυρή ενεργοποίηση Ras [27]. Επειδή είχαμε περιορισμένο αριθμό των κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε την πιο ευαίσθητη δοκιμασία φωσφο-ΕΚΚ ως υποκατάστατο για την ενεργοποίηση Ras. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα μεταλλαγμένα θυμοκύτταρα έδειξαν πολύ μειωμένη σηματοδότηση προς ERK μετά είτε ΡΜΑ ή θεραπεία Ι3Α (Σχ. 1D). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Ι3Α, όπως PMA, μπορεί να ενεργοποιήσει RasGRP1 και RasGRP3. Ένα υψηλό βασικό επίπεδο Ras-GTP σε μη επεξεργασμένα κύτταρα απογοητευμένοι παρόμοια πειράματα με στόχο την αξιολόγηση RasGRP4 στα κύτταρα Rat2. Ωστόσο, χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία κυτταρικής μορφολογίας συλλέξαμε έμμεσες αποδείξεις που Ι3Α και PMA καθένα μπορεί να ενεργοποιήσει RasGRP4 στα κύτταρα Rat2. RasGRP4 κύτταρα που εκφράζουν Rat2 επωάστηκαν για 48 ώρες σε ΡΜΑ ή Ι3Α υποτεθεί μια μεταμορφωμένη μορφολογία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως για τα κύτταρα που εκφράζουν RasGRP1 Rat2 [15]. Αυτή η δράση δεν παρατηρήθηκε με τα κενά κελιά φορέα ή ακατέργαστο RasGRP4-κύτταρα που εκφράζουν Rat2 (τα δεδομένα δεν φαίνονται)

αναλόγων DAG ενεργοποιούν RasGRPs με φωσφορυλίωση PKC μεσολάβηση καθώς και με άμεση πρόσληψη στο κυτταρικές μεμβράνες [16]. – [19]. Χρησιμοποιώντας την κυτταρική γραμμή Ramos Β, προσδιορίσαμε την δόση εξάρτηση του Ι3Α και ΡΜΑ για την επαγωγή της φωσφορυλίωσης του ενδογενούς RasGRP3 επί T133. Παράλληλα, εξετάσαμε τόσο την ενεργοποίηση του ΡΚΟδ, η οποία θα μπορούσε να εκτιμηθεί από την κατάσταση της φωσφορυλίωσης στο S299 [31], καθώς και η κατάντη απόκριση της φωσφορυλίωσης Erk. Για κινάσες όπως PKC τα οποία υπόκεινται σε αλλοστερική και θέσης ρύθμισης, οι μετρήσεις της δραστηριότητας του απομονωμένου κινάσης δεν αποτελούν αξιόπιστο μέτρο του επιπέδου των

in vivo

δραστηριότητα. Για ΡΚΟδ, φωσφορυλίωση σε S299 φαίνεται να αναφέρουν εξαρτάται από συνδέτη ενεργοποίηση της [31]. Δυστυχώς, τα αντισώματα δεν είναι εμπορικά διαθέσιμα για θέσεις φωσφορυλίωσης που αντικατοπτρίζει την ενεργοποίηση άλλων ισομορφών PKC, όπως διακρίνεται από τα πολλά αντισώματα εκθέσεων σχετικά φωσφορυλίωση PKCs στο βρόχο ενεργοποίησης, γυρίστε μοτίβο, και υδρόφοβα μοτίβο. Αυτά τα τελευταία θέσεις που εμπλέκονται στην ωρίμανση του PKC καθιστά ικανό να ενεργοποιείται κατά τη δέσμευση συνδέτη. Εξετάσαμε ως εκ τούτου μόνο η ενεργοποίηση του ΡΚΟδ σε απόκριση προς Ι3Α και ΡΜΑ. Άλλες ισομορφές PKC αναφερθεί για τα κύτταρα Ramos περιλαμβάνουν ΡΚΟα, β, ε, και θ [32].

Σε αυτό το κυτταρικό σύστημα, παρατηρήσαμε ότι Ι3Α και ΡΜΑ έδειξαν περίπου ίσες ικανότητες για την ενεργοποίηση της PKC δ και για Erk ( Σχ. 2Α). φωσφορυλίωση RasGRP3 στο T133 ήταν ανιχνεύσιμη σε ελαφρώς χαμηλότερη συγκέντρωση είτε συνδέτη, υποδηλώνοντας την εμπλοκή άλλων ισομορφών PKC εκτός από ΡΚΟδ. Για να επιβεβαιωθεί η συμμετοχή της PKC στη φωσφορυλίωση RasGRP3, εξετάσαμε την ικανότητα του γενικού αναστολέα PKC Gö6983 να εμποδίσει αυτά τα γεγονότα φωσφορυλίωσης (Εικ. 2Β). Από μόνη της, η προθεραπεία με Gö6983 είχε μικρή επίδραση. Αντίθετα, οι αποκρίσεις σε θεραπεία με Ι3Α ή ΡΜΑ είχαν δραματικά μειώθηκαν. Ειδικότερα, φωσφορυλίωση RasGRP3 στο T133 ήταν σχεδόν πλήρως καταργηθεί, συνεπής με την αναστολή της φωσφορυλίωσης ΡΚΟδ, όπως ήταν η κατάντη απάντηση της φωσφορυλίωσης Erk. Ομοίως, σε Jurkat Τ κύτταρα το τηγάνι αναστολέας PKC δις-indolemaleimide μου κατάργησε την κατάντη απάντηση Ι3Α φωσφορυλίωσης Erk (Σχ. 2C). Επιπλέον, επιβεβαίωσε ότι αυτό PKC αναστολέα μειωθεί σημαντικά το σχηματισμό Ras-GTP σε απόκριση Ι3Α, αποδεικνύοντας άμεσα ότι η επίδραση του Ι3Α επί της φωσφορυλίωσης Erk ήταν ανοδικά της Ras και σύμφωνα με τη γνωστή απαίτηση για PKC διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της RasGRP1 επιπροσθέτως με την απαίτηση για δέσμευση συνδέτη με τον τομέα RasGRP1 C1 [15], [18], [19].

A. κύτταρα Ramos υποβλήθηκαν σε αγωγή για 30 λεπτά με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις Ι3Α ή ΡΜΑ ακολουθούμενη από ανάλυση των κυτταρολύματα με ανοσοκηλίδωση. DMSO υποδεικνύει τη ελέγχου του οχήματος. Μπάρες δείχνουν ποσοτικοποίηση (μέση ± SEM) των αποτελεσμάτων από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Μια αντιπροσωπευτική ανοσοαποτύπωση απεικονίζεται. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αν και το αντίσωμα RasGRP3 δεν στρέφεται κατά μία θέση φωσφορυλίωσης RasGRP3, παράγει με συνέπεια κάποια αύξηση στο σήμα υπό συνθήκες φωσφορυλίωσης RasGRP3. κύτταρα Β Ramos υποβλήθηκαν σε αγωγή με 3 ηΜ Ι3Α ή ΡΜΑ, σε ορισμένες περιπτώσεις, μετά από προθεραπεία με Gö6983 (5 μΜ για 40 λεπτά), και αναλύθηκε ως ανωτέρω. Μπάρες δείχνουν ποσοτικοποίηση (μέση ± SEM) των αποτελεσμάτων από δύο ανεξάρτητα πειράματα. Μια αντιπροσωπευτική ανοσοαποτύπωση απεικονίζεται. Ένα επιπλέον πείραμα εκτελέστηκε υπό παρόμοιες συνθήκες έδωσε παρόμοια αποτελέσματα. Γ Jurkat Τ κύτταρα διεγέρθηκαν σε ένα απλό πείραμα με Ι3Α για 10 λεπτά με ή χωρίς 10 λεπτά προ-επώαση με τον αναστολέα παν-PKC bisindolymaleimide Ι (4,6 μΜ), που ακολουθείται από ανάλυση του Ras-GTP, σύνολο Ras, pErk1 /2 και τα συνολικά επίπεδα Erk1 /2.

η

Ι3Α Ενεργοποιεί RasGRPs Επέλεξε Β-NHL κυττάρων Lines

Είμαστε στο παρελθόν έδειξαν ότι Δ.Σ.Ε. ανάλογα όπως βρυοστατίνη 1 και το συνθετικό ανάλογο pico θα μπορούσαν να ενεργοποιήσουν RasGRPs σε κυτταρικές σειρές Β-NHL που έχουν χαρακτηριστεί ως ευαίσθητα σε επαγωγή απόπτωσης με αυτές τις ίδιες ενώσεις [25], [26]. Έχοντας επιβεβαιώσει παραπάνω ότι Ι3Α ενήργησε ως αναλογική DAG για RasGRP1 /3, θελήσαμε να διερευνήσει λεπτομερέστερα την ικανότητα αυτής της ένωσης να προκαλέσει την ενεργοποίηση Ras σε αντιπροσωπευτικό αναλογικό Δ.Σ.Ε. ευαίσθητες κυτταρικές σειρές Β-NHL. Σύντομη θεραπεία του BL2 (λέμφωμα Burkitt), Jeko-1, Z138 (τόσο λέμφωμα κυττάρων μανδύα) και Toledo (βλαστικού κέντρου λέμφωμα) οδήγησε σε ισχυρή ενεργοποίηση της Ras (Εικ. 3).

Σε ένα μόνο πείραμα, κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ηΜ Ι3Α ή DMSO ελέγχου για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από ανάλυση των Ras-GTP με τη δοκιμασία τραβήξει προς τα κάτω. Η αναλογία των Ras-GTP /Ras προσδιορίστηκε ποσοτικά.

Η

Ι3Α θεραπεία Αιτίες Η ενδοκυτταρική ανακατανομή των RasGRP1 και RasGRP3

ανάλογα Δ.Σ.Ε. δεσμεύονται σε μια υδρόφιλη σχισμή στον τομέα C1, ολοκληρώνοντας μια υδρόφοβη επιφάνεια και με αυτόν τον τρόπο οδήγησης εισαγωγή μεμβράνης της ανάλογης DAG – συγκρότημα τομέως C1 [33]. DAG και DAG ανάλογα συμβάλλουν έτσι στην ενεργοποίηση RasGRP εν μέρει από προκαλώντας αυτές τις πρωτεΐνες για την εκ νέου εντοπίσετε σε κυτταρικές μεμβράνες όπου μπορούν να αλληλεπιδρούν φυσικά με λιπιδιωμένη Ras [34]. Ως εκ τούτου, εξέτασε την ικανότητα του Ι3Α να προκαλέσει πρωτεΐνη αναδιανομή χρησιμοποιώντας τόσο

in situ

και υποκυτταρικής προσεγγίσεις κλασματοποίηση.

Για

in situ

μελέτες, GFP-RasGRP1 εκφράστηκε σε LNCaP κύτταρα. Μετά τη θεραπεία με Ι3Α ή ΡΜΑ, μεταβολές στο ενδοκυτταρικό πρότυπο των σημασμένων πρωτεϊνών έγιναν ορατές με συνεστιακή μικροσκοπία. LNCaP κύτταρα επελέγησαν επειδή καλά εξαπλωθεί μορφολογία τους διευκολύνει απεικόνισης. Είναι εύκολο να επιμολύνει και είχαμε μεγάλη εμπειρία με τις επιπτώσεις των διαφόρων φορβόλης εστέρων σε PKC μετατόπιση σε αυτό το σύστημα [29]. Πριν από τη θεραπεία, GFP-RasGRP1 διανεμήθηκε σε όλο το κυτταρόπλασμα (Εικ. 4). Κατά PMA (1000 ηΜ) Επιπλέον, GFP-RasGRP1 μετατοπίζεται προς τη μεμβράνη του πλάσματος εντός 2 λεπτών. Ι3Α που προκαλείται επίσης μια ταχεία απάντηση, αλλά το μοντέλο ήταν πολύ διαφορετική, με έντονη ομαδοποίηση σε εσωτερικές θέσεις.

Τα κύτταρα που εκφράζουν GFP-RasGRP1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1000 nM PMA ή Ι3Α. Το μοτίβο μετατόπιση εξετάσθηκε σε ζώντα κύτταρα ως συνάρτηση του χρόνου. Τα αποτελέσματα των διπλών πειραμάτων με Ι3Α απεικονίζεται. Οι εικόνες που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει 10 μm.

Η

Ως συμπληρωματική προσέγγιση, εκφράσαμε GFP-RasGRP3 στα κύτταρα ΗΕΚ-293, που έλαβαν θεραπεία με Ι3Α ή PMA, υποβάλλονται τα κύτταρα να υποκυτταρική κλασματοποίηση, και εξέτασε τις μεταβολές στην κατανομή της GFP-RasGRP3 μεταξύ κυτταροπλασματικής και της μεμβράνης κλάσματα (Εικ. 5). GFP-RasGRP3 ανιχνεύθηκε τόσο με ένα αντίσωμα που κατευθύνεται εναντίον του ίδιου RasGRP3 καθώς και με ένα αντίσωμα έναντι του tag GFP. Για σύγκριση, εξετάσαμε επίσης μετατοπίσεις στην κατανομή του ενδογενούς ΡΚΟδ.

ΗΕΚ-293 κύτταρα που εκφράζουν GFP-RasGRP3 υποβλήθηκαν σε αγωγή για 30 λεπτά με ΡΜΑ ή Ι3Α στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. κατεργασίας με υπερήχους των κυττάρων υποβλήθηκαν σε υποκυτταρική κλασματοποίηση και τα επίπεδα των ΡΚΟδ και RasGRP3 αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση. Για RasGRP3, έκφραση ανιχνεύθηκε τόσο με ένα αντίσωμα αντι-RasGRP3 και με ένα αντίσωμα έναντι του tag GFP. Μπάρες δείχνουν ποσοτικοποίηση (μέση ± SEM) των αποτελεσμάτων από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Μια αντιπροσωπευτική ανοσοκηλίδα απεικονίζεται.

Η

Η θεραπεία με Ι3Α προκάλεσε μία σαφή αύξηση στο επίπεδο του GFP-RasGRP3 ανακτήθηκε στο κλάσμα μεμβράνης, που ανιχνεύεται είτε με αντίσωμα, που μοιάζει με την απόκριση που παρατηρείται με ΡΜΑ. Η απώλεια της GFP-RasGRP3 από την κυτταροπλασματική κλάσμα ήταν λιγότερο εμφανής, αλλά τα αποτελέσματα αυτά θα πρέπει να μετριάζονται από την παρατήρηση ότι η πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε στο συνολικό δείγμα πρωτεΐνης ελαφρώς αυξημένα σε DAG αγωγή αναλογικών δειγμάτων, για άγνωστους λόγους. Στο ίδιο πείραμα, τόσο Ι3Α και ΡΜΑ επαγόμενη αναδιανομή του ΡΚΟδ στο κλάσμα μεμβράνης.

Ι3Α μεταχείριση επηρεάζει Bcl-2 πρωτείνες Επέλεξε Β-NHL Κυτταρικές Γραμμές

Σε προηγούμενες μελέτες μας σε σύγκριση το αναλογικό ευαίσθητη κυτταρική σειρά Δ.Σ.Ε. Τολέδο με RL, ένα ανάλογο ανθεκτικό βλαστικό κέντρο τύπου κυτταρική γραμμή Β-NHL Δ.Σ.Ε. [25]. Έχουμε αναφερθεί ότι η απόπτωση που επάγεται από τα ανάλογα DAG σε κύτταρα Toledo Β-NHL εξηρτάτο από την προ-αποπτωτικά ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνη Bim [25]. Στα κύτταρα Τολέδο Β-NHL, η θεραπεία με βρυοστατίνη 1 ή pico οδήγησε σε RasGRP-Erk σηματοδότησης και φωσφορυλίωση Bim σε προ-αποπτωτική περιοχή που είναι κοινά σε δύο BimEL και μορφών ματίσματος BimL. Δείξαμε επίσης ότι η αντι-αποπτωτική φωσφορυλίωσης σε ιστοσελίδες μοναδική για BimEL οδήγησε στην αποτελεσματική πρωτεόλυση σε πρωτεοσώματα τρόπο που εξαρτάται από το DAG αναλογικό ανθεκτική RL κυτταρική γραμμή. Ωστόσο, αυτή η αντι-αποπτωτικό μηχανισμό ήταν λιγότερο εμφανής στο Τολέδο. παρόντα αποτελέσματα μας με Ι3Α δείχνουν ακριβώς το ίδιο μοτίβο: BimL θεωρείται μειωμένη ηλεκτροφορητική κινητικότητα, ενδεικτικό της φωσφορυλίωσης, μετά τη θεραπεία Ι3Α τόσο RL και Τολέδο (Σχήμα 6Α.). Ι3Α προκάλεσε επίσης φωσφορυλίωση της BimEL τόσο RL και το Τολέδο. Ωστόσο, BimEL ρύθμιση προς τα κάτω στο Τολέδο ήταν σχετικά αναποτελεσματική μετά τη θεραπεία Ι3Α (Εικ. 6Α), ακριβώς όπως ανακαλύψαμε προηγουμένως για βρυοστατίνη 1 και pico [25].

Τα υποδεικνυόμενα κυτταρικές γραμμές χωρίς θεραπεία ή θεραπεία για 3 ημέρες (BL2, UPN1, Z138) ή για 24 ώρες (RL και Toledo). προϊόντα λύσης πρωτεΐνης αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση με αντισώματα προς τις δεικνυόμενες πρωτεΐνες. Πάνελ Α και Β προέρχονται από διπλές γέλες. Erk χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Πιο πρόσφατα δείξαμε ότι η αγωγή pico επαγόμενη απόπτωση σε κυτταρική γραμμή λεμφώματος του Burkitt BL2 της και σε 5 από τα 6 κυτταρικού λεμφώματος κυτταρικές γραμμές μανδύα, τα περισσότερα από τα οποία ήταν Bim- ανεπαρκή [26]. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η απόπτωση συνδέεται με αυξημένη έκφραση του Bik και μειωμένη έκφραση MCL1 και Bcl-XL. Στις παρούσες μελέτες, βρήκαμε ότι Bik προκλήθηκε με αγωγή Ι3Α σε BL2 και Z138, εκπρόσωπο λέμφωμα κυττάρων μανδύα κυτταρική γραμμή (Σχ. 6Β). Ειδικά σε BL2, ένα μεγάλο μέρος της εκφρασμένης Bik είχε αυξηθεί ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Το φαινόμενο αυτό, το οποίο μπορεί να αντανακλά εναλλακτικό μάτισμα mRNA ή μετα-μεταφραστική τροποποίηση, είχε προηγουμένως παρατηρηθεί σε κύτταρα pico-αγωγή [26]. Σε αντίθεση, η DAG αναλόγου ανθεκτική κυτταρική γραμμή UPN1 MCL δεν δεικνύουν Ι3Α επαγόμενη έκφραση Bik. Τόσο BL2 και Z138 έδειξε Ι.Α.3 επαγόμενη μειωμένη έκφραση MCL1 και Bcl-XL, αλλά αυτές οι επιδράσεις δεν ήταν τόσο εμφανής στα UPN1 κύτταρα (Σχ. 6Β). Από κάθε άποψη, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται εδώ με Ι3Α παράλληλα εκείνα που λαμβάνονται με βρυοστατίνη 1 και αναλογική pico της σε προηγούμενες μελέτες μας [25], [26].

Ι3Α προκαλεί απόπτωση Επέλεξε Β-NHL Γραμμές κυττάρων

για να καθοριστεί εάν Ι3Α μπορεί να διεγείρει απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές Β-NHL δειχθεί προηγουμένως να είναι ευαίσθητοι σε βρυοστατίνη 1 και /ή αναλόγου pico της, χρησιμοποιήσαμε τρία διαφορετικά πρωτόκολλα σήμανσης κυττάρων και κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25], [26]. Εκτός από τις κυτταρικές σειρές που αναφέρθηκαν παραπάνω, συμπεριλάβαμε στην ανάλυση των προηγουμένως χαρακτηριζόμενη DAG-αναλόγου ευαίσθητη MCL κυτταρικές γραμμές Mino, REC 1, και Sp53 και η ανθεκτική του Burkitt λεμφώματος κυτταρική γραμμή Daudi. Η αδυναμία των κυττάρων να συσσωρεύονται TMRE (τετραμεθυλοροδαμίνης αιθυλεστέρας) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση απώλειας της μιτοχονδριακής δυναμικού εξωτερικής μεμβράνης (Σχ. 7Α). Σε ορισμένες περιπτώσεις, περιλαμβάνονται οι αναστολείς U1026 Mek ή PD184352 την αξιολόγηση του ρόλου της κανονικής οδού σηματοδότησης Ras στην απόπτωση. Μια φθορίζουσα κασπάσης ψευδο-υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει την παγκόσμια δραστηριότητα κασπάσης (Εικ. 7Β). DNA τέλος σήμανση χρησιμοποιώντας dUTP και τερματικής τρανσφεράσης (TUNEL) χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση του κατακερματισμού πυρηνικό DNA (Σχ. 7C). Αντιπροσωπευτικά ευρήματα που παρουσιάζονται στο Σχήμα 7 και τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Σε γενικές γραμμές, Ι3Α επάγεται εκτεταμένη απόπτωση σε DAG αναλογικού-ευαίσθητα κύτταρα γραμμών (Toledo, BL2, Jeko-1), αλλά πολύ λιγότερο σε ανθεκτικά κύτταρα γραμμές (RL , UPN1 και Daudi). Απώλεια χρώσης TMRE επάγεται από Ι3Α σε κύτταρα Toledo ήταν σε μεγάλο βαθμό καταργήθηκε από αναστολείς ΜΕΚ (Σχ. 7Α), αλλά αυτό το αποτέλεσμα ήταν λιγότερο δραματική σε μερικές από τις κυτταρικές σειρές MCL (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

A. RL και Toledo κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 24 ώρες, επωάστηκαν με TMRE, και αναλύθηκαν για πρόσληψη λεκέ με κυτταρομετρία ροής. Σε ορισμένες περιπτώσεις, οι καλλιέργειες επωάστηκαν είτε με U0126 ή PD184352 να αξιολογήσει τις επιπτώσεις της αναστολής Mek. Β UPN1 και τα κύτταρα Jeko-1 επωάστηκαν με DMSO ή 100 ηΜ Ι3Α για 4 ημέρες και στη συνέχεια αναλύθηκαν με CaspACE ™ για την ανίχνευση της ενεργοποίησης της κασπάσης.