Αφηρημένο

Ο καρκίνος των βλαστικών κυττάρων (CSC) μοντέλο προϋποθέτει την παρουσία ενός μικρού αριθμού των ΚΕΠ στον πληθυσμό ετερογενή καρκινικών κυττάρων που έχουν την τελική ευθύνη για την έναρξη του όγκου, καθώς και υποτροπή του καρκίνου και μετάσταση. Οι ΚΕΠ έχουν απομονωθεί από μια ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων και είναι σε θέση να δημιουργήσει ένα ιεραρχικό και ετερογενή πληθυσμό καρκινικών κυττάρων. ΚΕΠ είναι επίσης ανθεκτικά στη συμβατική χημειοθεραπεία και ράδιο-θεραπείες. Εδώ αναφέρουμε ότι η ιοντίζουσα ακτινοβολία μπορεί να προκαλέσει βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με ακίνητα σε ετερογενή καρκινικά κύτταρα. Η έκθεση των καρκινικών κυττάρων μη βλαστικά σε ιονίζουσα ακτινοβολία ενισχυμένη spherogenesis, και αυτό συνοδεύτηκε από ρύθμιση προς τα άνω των γονιδίων pluripotency Sox2 και Oct3 /4. Εξόντωση Sox2 ή Oct3 /4 ανέστειλε προκαλούμενη από ακτινοβολία spherogenesis και αυξημένη κυτταρική ευαισθησία στην ακτινοβολία. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η ιοντίζουσα ακτινοβολία μπορεί να ενεργοποιήσει βλαστική ικανότητα μονοπάτια σε ετερογενή καρκινικά κύτταρα, με αποτέλεσμα τον εμπλουτισμό ενός υποπληθυσμού CSC με υψηλότερη αντοχή σε ακτινοθεραπεία

Παράθεση:. Ghisolfi L, Keates AC, Χου Χ, Lee Dk, Λι CJ (2012) η ιοντίζουσα ακτινοβολία επάγει βλαστική ικανότητα σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 7 (8): e43628. doi: 10.1371 /journal.pone.0043628

Επιμέλεια: Taro Yamashita, Πανεπιστήμιο Καναζάβα, Ιαπωνία

Ελήφθη: 26 του Γενάρη του 2012? Αποδεκτές: 24 Ιούλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 21, Αυγούστου του 2012

Copyright: © Ghisolfi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από Παράλειψη Ackerman Κέντρο Μοριακής Ταμείου Θεραπευτικής και παγκόσμιο Βραβείο Ερευνητικό Εργαστήριο (Υπουργείο Παιδείας Επιστήμης και Τεχνολογίας, την Κορέα). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ), ένα υποπληθυσμό των κακοηθών κυττάρων στον πληθυσμό ετερογενών κυττάρων καρκίνου, θεωρούνται ότι είναι υπεύθυνα για υποτροπής του καρκίνου, της μετάστασης και της αντίστασης στα φάρμακα. Οι ΚΕΠ έχουν απομονωθεί από μια ποικιλία ανθρώπινων κακοηθειών συμπεριλαμβανομένης λευχαιμίας [1], [2], του καρκίνου του μαστού [3], [4], όγκου στον εγκέφαλο [5], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [6], παγκρεατικό καρκίνο [7] και του παχέος εντέρου [8], [9]. ΚΕΠ έχουν την ικανότητα να αυτο-ανανέωση και να διαφοροποιούνται σε πληθώρα των κυττάρων τα οποία αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος της μάζας του όγκου [10], [11]. ΚΕΠ εκφράζουν επίσης υψηλά επίπεδα πρωτεϊνών μεταφορέων αντίστασης φαρμάκου (π.χ. ABC) [12], [13], [14], τα ένζυμα επιδιόρθωσης του DNA [15], [16] και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών [17], [18], [ ,,,0],19], η οποία τις καθιστά ιδιαίτερα ανθεκτικά σε συμβατικές θεραπείες καρκίνου συμπεριλαμβανομένης χημειοθεραπείας και ακτινοβολίας. Για παράδειγμα, μελέτες που δημοσιεύθηκαν από Bao et al [20] έδειξαν ότι η ιοντίζουσα ακτινοβολία μπορεί να εμπλουτίσει CD133 + καρκίνο γλοιώματος βλαστικών κυττάρων

in vitro

και

in vivo

. Επιπλέον, αυτοί οι συγγραφείς έδειξαν ότι αυτή η επίδραση εμπλουτισμός επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση προτιμησιακή ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου βλάβης του DNA σε CD133 + καρκίνο γλοιώματος βλαστικών κυττάρων σε σύγκριση με CD133- μη βλαστικά κύτταρα γλοιώματος. Το μοντέλο CSC, ως εκ τούτου, καλεί για το σχεδιασμό των θεραπευτικών που στοχεύουν ΚΕΠ για τη βελτίωση της θεραπείας του καρκίνου [21], [22].

Αν και υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις για να υποστηρίξει την υπόθεση CSC, η ακριβής προέλευση αυτών των κυττάρων παραμένει αμφιλεγόμενη. Μια πιθανότητα είναι ότι ΚΕΠ προκύπτουν από ογκογόνο μετασχηματισμό των φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων ιστού [23]. Σε αυτό το σενάριο, οι μεταλλάξεις στα ρυθμιστικούς μηχανισμούς ελέγχουν βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση πιστεύεται ότι προάγει τον σχηματισμό ΚΕΠ [24], [25], η οποία στη συνέχεια να δημιουργήσει μία ιεραρχική και ετερογενή καρκινικά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο καρκίνος καταγωγής κύτταρο έχει την ικανότητα να παράγουν είδη πολλαπλές κυτταρικές (δηλαδή multidifferentiative πλαστικότητα), ένα σήμα κατατεθέν των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν [26], [27], [28]. Εναλλακτικά, ΚΕΠ μπορούν να προέρχονται από μη-βλαστικών καρκινικά κύτταρα που έχουν αποκτήσει βλαστική ικανότητα ιδιότητες [22], [29]. Σύμφωνα με αυτό, μελέτες που δημοσιεύθηκαν από Quintana et al, και Roesch et al [30], [31] έχουν δείξει ότι ένας φαινότυπος CSC μπορεί να αποκτηθεί από τα καρκινικά κύτταρα στο παρελθόν αρνητικές για συγκεκριμένους δείκτες CSC.

Σε αυτό το μελέτη, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ακτινοβόληση των καρκινικών κυττάρων ως νέου δυναμικού προέλευση του βλαστική ικανότητα καρκίνου. Η έκθεση των ετερογενών καρκινικών κυττάρων σε ιονίζουσα ακτινοβολία γάμμα ενισχυμένη spherogenesis υπό συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας στελέχους. Παραδόξως, η ακτινοβόληση των CSC-εξαντλημένο ετερογενείς καρκίνος κυτταρικών πληθυσμών προκάλεσε την εμφάνιση των κυττάρων σχηματισμού σφαίρας. Στο μοριακό επίπεδο, η ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου πλειοδυναμία μετά την ακτινοβολία γάμμα έδειξε πάνω ρύθμιση Sox2 και Oct3 /4 mRNA και πρωτεΐνης. Σε αντίθεση, knockdown του Sox2 ή Oct3 /4 αξιοσημείωτα μειωμένη αποικιών που επιβιώνουν μετά την αγωγή ακτινοβολίας, και επίσης ανέστειλε σημαντικά την ακτινοβολία που προκαλείται spherogenesis. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η ακτινοβολία μπορεί να ενεργοποιήσει οδούς βλαστική ικανότητα σε ετερογενή καρκινικά κύτταρα, υποδηλώνοντας ένα νέο μηχανισμό ανθεκτικότητας των καρκινικών κυττάρων στην ακτινοθεραπεία. Μπορούν επίσης να σημαίνει ότι η στόχευση των ΚΕΠ μπορεί να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα της ακτινοθεραπείας.

Αποτελέσματα

γάμμα ακτινοβολία αυξάνει Spherogenesis από τα καρκινικά κύτταρα

Εμείς εξέτασε πρώτα την επίδραση της ιονίζουσας ακτινοβολίας για την ικανότητα του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος κυττάρων, για την οποία ένα συστατικό CSC έχει περιγραφεί προηγουμένως [6], [32], για να αυξηθεί ως σφαίρες κάτω από τα βλαστικά κύτταρα μέσα (SCM) συνθήκες καλλιέργειας. Ενιαία κυτταρικά εναιωρήματα των κυττάρων HepG2 και τα κύτταρα Huh7 εκτέθηκαν σε 0-10 Gy ακτινοβολίας γάμμα (για LD

50 βλέπε σχήμα S1) και, στη συνέχεια, σπάρθηκαν σε κλωνική πυκνότητα σε εξαιρετικά χαμηλές πλάκες στερεώσεως σε SCM χωρίς ορό. σχηματισμό σφαίρα αξιολογήθηκε μετά από 7 ημέρες και 14 ημέρες καλλιέργειας. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές ήταν σε θέση να σχηματίσουν σφαίρες (Σχήματα 1γ, 1δ). Όπως φαίνεται στα σχήματα 1α και 1β, παρατηρήθηκε μία αύξηση 40-50% στον αριθμό των σφαιρών για κύτταρα HepG2 την ημέρα 7 και την ημέρα 14, και για τα κύτταρα Huh7 την ημέρα 14 μετά την αγωγή με 2 Gy ή 4 Gy ακτινοβολίας γάμμα. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η ιονίζουσα ακτινοβολία γάμμα μπορεί να αυξήσει σημαντικά το

in vitro

spherogenesis των κυττάρων HepG2 και Huh7.

Α και Β κύτταρα HepG2 (α) και τα κύτταρα Huh7 (β), εκτέθηκαν σε αυξανόμενες δόσεις της ακτινοβολίας γάμμα, και στη συνέχεια σπέρνονται σε μέσα βλαστικών κυττάρων σε πλάκες 96-φρεατίων εξαιρετικά χαμηλή προσκόλληση στα 500 κύτταρα /φρεάτιο. Οι αριθμοί σφαίρα μετρήθηκαν μετά από 7 ημέρες (κορυφή) και 14 ημέρες (κάτω) του πολιτισμού, και τον σχετικό αριθμό αναφέρθηκαν στις γραφικές παραστάσεις. Χαμηλότερες δόσεις ακτινοβολίας 2 και 4 Gy προκάλεσε μια σημαντική αύξηση στο σχηματισμό σφαίρα στις δύο κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα δείγματα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0.01 έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Γ και Δ Εκπρόσωπος εικόνες της HepG2 (γ) και Huh7 (δ) σφαίρες που σχηματίζονται μετά από 14 ημέρες καλλιέργειας βλαστοκυττάρων μέσα μαζικής ενημέρωσης. Οι εικόνες έχουν ληφθεί με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (AmScope, iScope Corp., Chino, CA), τοποθετημένη σε ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο Zeiss Axiovert 25. Μεγέθυνση:. 100χ

Η

Gamma ακτινοβολία επάγει Spherogenesis σε HepG2 και Huh7 Μη πλευρά Cells Πληθυσμός

Side πληθυσμός κυτταρομετρία ροής (που ορίζεται από την ικανότητα να αποκλείουν τη χρωστική δέσμευσης DNA Hoechst 33342 ) [33], [34] έχει χρησιμοποιηθεί για να εμπλουτίσει CSC και μη CSC από διάφορες κυτταρικές γραμμές καρκίνου, καθώς και καλλιέργειες που προέρχονται από πρωτοπαθείς όγκους [26], [35], [36]. Αυτή η προσέγγιση έχει αποδειχθεί ότι HepG2 και Huh7 ΚΕΠ αντιπροσωπεύουν περίπου 1-2% των κυττάρων του όγκου χύδην [6], [32]. Δεδομένου ότι η ικανότητα να σχηματίζουν σφαίρες

in vitro

υπό συνθήκες μη-προσκολλημένα πολιτισμός θεωρείται ένα ακίνητο των ΚΕΠ [32], [37] τα δεδομένα μας υποδεικνύουν έντονα ότι γάμμα ακτινοβολία των κυττάρων HepG2 και Huh7 αυξήθηκε σημαντικά στο αριθμός των ΚΕΠ και στις δύο κυτταρικές σειρές.

για να διερευνήσουν κατά πόσον η αυξημένη spherogenesis παρατηρείται μετά από έκθεση σε ακτινοβολία γάμμα ίσως προέρχονται μέσα στην ετερογενή πληθυσμό μη βλαστικών κυττάρων καρκίνου, χρησιμοποιήσαμε τη ροή πλευρά του πληθυσμού κυτταρομετρία για τον εντοπισμό και την απομόνωση μη CSC από κύτταρα HepG2 και Huh7. Ένα τυπικό πείραμα μη-πλευρικής πληθυσμός διαλογής απεικονίζεται στην Εικόνα 2α. Τα κύτταρα ευαίσθητα στην βεραπαμίλη αναστολέα της αντλίας εκροής (R3 πύλη) δείχνουν χαμηλή Hoechst ένταση χρώσης και ταυτοποιήθηκαν ως το συστατικό πλευρά πληθυσμού (SP) του όγκου (δηλαδή CSC-εμπλουτισμένο). Verapamil-insensitive κυττάρων με υψηλή Hoechst ένταση χρώσης (R4 πύλη) απομονώθηκαν ως κύτταρα μη-πλευρικής πληθυσμό (μη-SP). Να αποκλειστεί το ενδεχόμενο της μη-ειδικές επιδράσεις στο σχηματισμό σφαίρα που προκύπτουν από τις FACS διαδικασία διαλογής, HepG2 και Huh7 κύτταρα ήταν επίσης mock-ταξινομημένα με βάση ιωδιούχο προπίδιο χρώση (PI). Μετά από διαλογή κυττάρων στο ΕΑΜ, μη-SP (δηλαδή CSC εξαντλημένο) κύτταρα και κύτταρα ελέγχου (αδιαχώριστα χύμα ή PI-ταξινομημένο HepG2 και Huh7) ακτινοβολούνται με 0, 2 ή 4 Gy ακτινοβολίας γάμμα στο ΕΑΜ. Τα ακτινοβολημένα χύμα, ακτινοβολημένα κύτταρα μη-SP και ακτινοβολήθηκαν ΡΙ-ταξινομημένα κύτταρα στη συνέχεια εμβολιάζονται σε εξαιρετικά χαμηλές πλάκες στερεώσεως και σχηματισμός σφαίρα αξιολογήθηκε μετά από 7 και 14 ημέρες καλλιέργειας.

HepG2 κύτταρα (αριστερά πάνελ) και Huh7 κύτταρα (δεξιά πάνελ) βάφτηκαν χρησιμοποιώντας Hoechst 33342 με (κατώτερο πάνελ) ή χωρίς (άνω πάνελ) Verapamil, και στη συνέχεια ταξινομούνται χρησιμοποιώντας MoFLO2 φθορισμό ταξινομητή ενεργοποιημένων κυττάρων. Η πύλη R3 προσδιοριστεί το κλάσμα Side Πληθυσμού (SP). κύτταρα μη-πλευρικής Πληθυσμός (Μη SP), απομονώθηκε μέσω του R4 πύλη, συλλέχθηκαν, ξεπλύθηκαν σε PBS και επαναιωρήθηκαν σε βλαστοκυττάρων μέσα ενημέρωσης. Β και Γ Αξεδιάλεχτα, μη-SP και ΡΙ-ταξινομημένο HepG2 (β) και Huh7 (γ) κύτταρα εκτέθηκαν σε 0, 2 ή 4 Gy ακτινοβολίας γάμμα και στη συνέχεια σπείρονται επάνω σε 96 φρεατίων εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στερεώσεως στα 500 κύτταρα /φρεάτιο . αριθμοί Σφαίρα μετά μετρήθηκαν μετά από 7 ημέρες (επάνω πάνελ) και 14 ημέρες (κάτω πάνελ) του πολιτισμού, και τον σχετικό αριθμό αναφέρθηκαν στις γραφικές παραστάσεις. Λευκές ράβδοι αντιπροσωπεύουν αδιαχώριστα καρκινικά κύτταρα, μαύρες μπάρες αντιπροσωπεύουν κύτταρα ταξινομημένο μη πλευράς πληθυσμού (μη-SP), και ράβδοι αντιπροσωπεύουν το κύτταρα ΡΙ-ταξινομημένο. Μετά από 14 ημέρες καλλιέργειας σε SCM, δόσεις ακτινοβολίας από 2 και 4 Gy προκάλεσε μια σημαντική αύξηση στο σχηματισμό σφαίρα στο χύμα πληθυσμό του όγκου και στον πληθυσμό μη-SP των δύο κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα δείγματα, ενώ ΡΙ-ταξινομημένα κύτταρα Huh7 έδειξε σημαντικά αυξημένο σχηματισμό σφαίρα ακόλουθες 2 Gy της θεραπείας ακτινοβολίας. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από πέντε ανεξάρτητα πειράματα (αδιαχώριστα και μη SP πληθυσμοί) ή μέση ± SEM δύο ανεξάρτητων πειραμάτων (ΡΙ-ταξινομημένο πληθυσμού). * Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt?. 0.01 έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου

Η

Όπως φαίνεται στο σχήμα 2b και Σχήμα 2c, καμία σημαντική διαφορά στο σχηματισμό σφαίρα παρατηρήθηκε μετά από 7 ημέρες καλλιέργειας σε SCM για τα μη ταξινομημένα , μη-SP, ή ΡΙ-ταξινομημένα κύτταρα HepG2 ή Huh7 υποβληθεί σε 2 ή 4 Gy ακτινοβολίας γάμμα. Σε αντίθεση, μη ταξινομημένα κύτταρα HepG2 εκτεθειμένα σε 2Gy της ακτινοβολίας και μη ταξινομημένα κύτταρα Huh7 εκτίθενται σε 2 ή 4 Gy ακτινοβολίας είχαν σημαντικά αυξημένο σχηματισμό σφαίρα μετά από 14 ημέρες καλλιέργειας σε SCM (Σχήμα 2b, 2c). Επιπλέον, η PI-ταξινομημένα κύτταρα ελέγχου και από τις δύο κυτταρικές σειρές έδειξε παρόμοια ικανότητα σχηματισμού σφαίρας με αδιαχώριστα χύμα HepG2 ή κύτταρα Huh7 μετά από 14 ημέρες καλλιέργειας στο ΕΑΜ. Συγκεκριμένα, PI-ταξινομημένα κύτταρα Huh7 υποβάλλονται σε 2 Gy ακτινοβολίας γάμμα έδειξαν σημαντικά αυξημένο σχηματισμό σφαίρα μετά από 14 ημέρες καλλιέργειας στο SCM (p & lt? 0,05). PI-ταξινομημένα κύτταρα HepG2 εκτεθειμένα σε 2 ή 4 Gy ακτινοβολίας εμφανίζεται, επίσης, σημαντικά αυξημένα σχηματισμό σφαίρα μετά από 14 ημέρες καλλιέργειας στο ΕΑΜ. Οι διαφορές αυτές, ωστόσο, δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Παραδόξως, η έκθεση σε ακτινοβολία γάμμα αισθητά επάγεται spherogenesis στα κλάσματα μη-SP από κύτταρα HepG2 και Huh7 μετά από 14 ημέρες καλλιέργειας σε SCM. Για τα κύτταρα HepG2, κατεργασία του κλάσματος μη-SP με 2 Gy ακτινοβολίας γ προκάλεσε μια αύξηση 150% σε σχηματισμό σφαίρα σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα μη SP (ρ & lt? 0.001). Παρομοίως, κατεργασία του Huh7 κυττάρων μη-SP με 4 Gy ακτινοβολίας γάμμα προκάλεσε μια αύξηση 80% στο σχηματισμό σφαίρα (ρ & lt? 0,01). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η ακτινοβολία γάμμα χαμηλής δόσης μπορεί να προωθήσει το σχηματισμό του ΚΕΠ στο πλαίσιο του ετερογενή πληθυσμό μη-βλαστικών κυττάρων καρκίνου.

βλαστική ικανότητα Gene Expression αυξάνεται σε HepG2 και Huh7 κύτταρα μετά από ακτινοβολία γάμμα Θεραπεία

για να εξεταστεί αν η αύξηση του spherogenesis που προκαλείται από την ακτινοβολία γάμμα μπορεί να οφείλεται σε αυξημένη έκφραση γονιδίου βλαστική ικανότητα, κύτταρα HepG2 και τα κύτταρα Huh7 εκτέθηκαν διάφορες δόσεις ακτινοβολίας γάμμα, και το επίπεδο των Oct3 /4 και Sox2 mRNA εκτιμήθηκε με πραγματικό time PCR. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3α και 3γ, σημαντική αύξηση της Oct3 /4 mRNA και η πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε κύτταρα HepG2 6 ώρες μετά την έκθεση σε 2 ή 4 Gy ακτινοβολίας γάμμα. Αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης Oct4 παρατηρήθηκαν επίσης σε κύτταρα Huh7 6 ώρες μετά την έκθεση σε 4 Gy ακτινοβολίας (Εικόνα 3d). Ακτινοβολία επαγόμενη αυξήσεις στο επίπεδο του Huh7 κυττάρων Oct3 /4 mRNA, ωστόσο, δεν έφθασε στατιστική σημασία (σχήμα 3β).

Α και Β, Ε και F κύτταρα HepG2 και Huh7 εκτέθηκαν σε 0, 2 ή 4 ​​Gy ακτινοβολίας γάμμα και το συνολικό RNA εκχυλίστηκε μετά από 3, 6 ή 24 ώρες. Oct3 /4 (α και β) και Sox2 (ε και στ) τα επίπεδα mRNA σε κάθε κυτταρική σειρά στη συνέχεια προσδιορίστηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR και κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα GAPDH mRNA σε κάθε δείγμα. Σε HepG2 κύτταρα, η θεραπεία με 2 και 4 Gy ακτινοβολίας γάμμα προκάλεσε μια σημαντική αύξηση του Oct3 /4 επίπεδα mRNA. επίπεδα Sox2 mRNA ήταν επίσης έντονα υπερεκφράζεται σε κύτταρα Huh7 μετά από θεραπεία ακτινοβολίας γάμμα χαμηλής δόσης. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0001 σε σχέση με το δείγμα t0 ή μη επεξεργασμένα δείγματα. Η διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει μια σύγκριση με τον μάρτυρα κατά την ίδια χρονική στιγμή. C και D, G και Η HepG2 κύτταρα και κύτταρα Huh7, εκτέθηκαν σε 0, 2 ή 4 Gy ακτινοβολίας γάμμα και έκφραση Oct4 ή πρωτεΐνη Sox2 προσδιορίστηκε με ανάλυση στυπώματος Western μετά από 6 ώρες (για Oct4? Γ και δ), ή μετά από 4 ώρες (για Sox2? g και h). επίπεδα Oct4 και Sox2 πρωτεϊνών αυξήθηκαν μετά τη θεραπεία ακτινοβολίας συνεπείς με τις αυξήσεις στα επίπεδα του mRNA για κάθε γονίδιο.

Η

Σύμφωνα με τα ευρήματά μας σχετικά με Oct3 /4 έκφρασης, διαπιστώσαμε ότι Sox2 mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης, επίσης, ήταν σημαντικά αυξήθηκε σε κύτταρα Huh7 3 και 6 ώρες μετά την έκθεση σε 4 Gy ακτινοβολίας (Σχήμα 3F, 3Η). Ωστόσο, καμία αύξηση στο mRNA και Sox2 επίπεδα πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε σε HepG2 κύτταρα μετά από θεραπεία με ακτινοβολία (Σχήμα 3e, 3g). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ακτινοβολία γάμμα μπορεί να προκαλέσει τον επαναπρογραμματισμό των διαφοροποιημένων κυττάρων καρκίνου σε μια πιο βλαστικά φαινότυπο με επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου βλαστική ικανότητα.

Oct3 /4 και Sox2 Νοκ ντάουν ευαισθητοποιεί HepG2 και Huh7 ηπατοκυτταρικού καρκίνου κύτταρα σε ακτινοβολία γάμμα

από Sox2 και Oct3 /4 προς τα πάνω ρύθμιση συσχετίζεται με αυξημένη βλαστική ικανότητα (spherogenesis) σε κύτταρα HepG2 και Huh7 μετά από έκθεση σε ακτινοβολία γάμμα, είμαστε δίπλα εξέτασε κατά πόσον αυτοί οι παράγοντες θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ικανότητα των κυττάρων HepG2 ή Huh7 να αντισταθεί θεραπεία με ακτινοβολία. Για αυτά τα πειράματα, η έκφραση Sox2 ή γονιδίου Oct4 σίγησε στα κύτταρα Huh7 και HepG2 χρησιμοποιώντας ασύμμετρα RNA παρεμβολής (aiRNA). aiRNA επιλέχθηκαν, αντί του siRNA, λόγω της υψηλής εξειδίκευσης τους [38]. Knockdown αποτελεσματικότητα εκτιμήθηκε με Western blot 48 ώρες μετά την επιμόλυνση aiRNA. aiRNA στόχευση Sox2 ή Oct4 μειωθεί αποτελεσματικά την έκφραση και των δύο πρωτεϊνών (Σχήμα 4α και 4β). Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες που χρησιμοποιούν εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα που επιδεικνύουν Oct4 και Sox2 συνδέονται με το ίδιο ρυθμιστικό μονοπάτι, το οποίο περιλαμβάνει την αυτόματη ρυθμιστική βρόχους και ρύθμιση αμοιβαία αυτόματη μεταγραφή [39], [40]. Μόνο γονίδιο knockdown εντός του ρυθμιστικού κυκλώματος Sox2-Oct4 ήταν επομένως να αναμένεται να μειώσει το επίπεδο έκφρασης αμφοτέρων των πρωτεϊνών.

Α και Β κύτταρα HepG2 (α) και τα κύτταρα Huh7 (β), επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ aiRNA στόχευσης GFP, Sox2 ή Oct4 και knockdown αποτελεσματικότητα αξιολογήθηκε με στύπωμα Western μετά από 48 ώρες. Sox2 και Oct4 ανήκουν στην ίδια ρυθμιστική κύκλωμα? Ως εκ τούτου, μόνο γονίδιο knockdown οδηγεί σε μειωμένα επίπεδα έκφρασης των δύο πρωτεϊνών. Γ και Δ HepG2 και Huh7 κύτταρα επιμολυσμένα με aiRNA στόχευσης GFP, Sox2 ή Oct4 ακτινοβολήθηκαν με 0, 2, 4, 6, 8 ή 10 Gy ακτινοβολίας γάμμα και ίσο αριθμό κύτταρα επιστρώθηκαν επί πλακών 6-φρεατίων για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας . Την ημέρα 7, οι αποικίες μετρήθηκαν και το κλάσμα των επιζώντων κλωνογόνων κυττάρων εκφράζεται ως φυσικός λογάριθμος παραστάθηκε γραφικά. Οι γραμμές προσαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας ένα πρώτης τάξης πολυωνυμικής παλινδρόμησης και αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt?. 0.001 έναντι κύτταρα GFP-επιμολυσμένα

Η

Για να εκτιμηθεί η επίδραση των Oct4 ή τον Sox2 νοκ ντάουν στη βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από θεραπεία με ακτινοβολία, Huh7 και κύτταρα HepG2 επιμολύνθηκαν με aiRNA στόχευσης Sox2, Oct4 ή GFP. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα χωρίστηκαν και εκτέθηκαν σε 0, 2, 4, 6, 8 ή 10 Gy ακτινοβολίας γάμμα. εναιωρήματα μονών κυττάρων στη συνέχεια σπείρονται σε πλήρες DMEM σε τυποποιημένες πλάκες των 6 φρεατίων να επιτραπεί στα κύτταρα να προσκολληθούν και να σχηματίζουν αποικίες. Μετά από 7 ημέρες καλλιέργειας σε πλήρες DMEM, οι αποικίες που σχηματίζονται κάτω από κάθε θεραπεία χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4c και 4d, αποσιώπηση της έκφρασης του γονιδίου Sox2 ή Oct4 σε κύτταρα HepG2 και Huh7 ως αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση στην ευαισθησία σε ακτινοβολία γάμμα (μειωμένη LD

50 τιμή? Βλέπε Πίνακα 1) σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με ένα aiRNA κατευθύνονται έναντι GFP, ή μη-επιμολυσμένα κύτταρα. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η αρνητική ρύθμιση των γονιδίων βλαστική ικανότητα μπορεί να ευαισθητοποιήσει τα κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος σε γάμμα θεραπεία με ακτινοβολία.

Η

Oct3 /4 και Sox2 νοκ ντάουν στον HepG2 ή Huh7 κύτταρα Αναστέλλει την ακτινοβολία που προκαλείται Σφαίρα Σχηματισμός

από knockdown του Sox2 ή Oct4 αύξησε την ευαισθησία των κυττάρων HepG2 και Huh7 σε θεραπεία ακτινοβολίας, έχουμε την επόμενη εξετάστηκε αν η ικανότητα spherogenesis των HepG2 και Huh7 κύτταρα μετά από ακτινοβόληση γάμμα συσχετίστηκε με την έκφραση αυτών των παραγόντων. Για να αξιολογηθεί η επίδραση της θεραπείας ακτινοβολίας, Huh7 και HepG2 κύτταρα επιμολύνθηκαν με aiRNA κατευθύνεται εναντίον Sox2, Oct4 ή GFP, συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες, και κατόπιν διαιρείται και εκτίθενται σε 0, 2 ή 4 Gy ακτινοβολίας γάμμα. Τα κύτταρα στη συνέχεια σπείρονται σε κλωνική πυκνότητα πάνω εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στερεώσεως σε SCM χωρίς ορό. Μετά από 7 ημέρες καλλιέργειας, γ-ακτινοβολημένα κύτταρα επιμολυσμένα με aiRNA κατευθύνονται έναντι GFP έδειξαν παρόμοια αύξηση στο σχηματισμό σφαίρα προς την ομάδα άνευ αγωγής. Huh7 και HepG2 κύτταρα κατεργασμένα με Sox2 ή Oct4 aiRNA και εκτίθενται σε ακτινοβολία, ωστόσο, σχηματίζεται σημαντικά λιγότερο σφαίρες από κύτταρα ελέγχου που επιμολύνθηκαν με GFP aiRNA (Σχήμα 5α και 5β). Το πιο σημαντικό, κύτταρα κατεργασμένα με Sox2 ή Oct4 aiRNA είχαν σημαντικά μειωμένη ικανότητα να σχηματίζει σφαίρες μετά από έκθεση σε 2 ή 4 Gy ακτινοβολίας γάμμα, σε σύγκριση με μη ακτινοβολημένα κύτταρα. Σε κύτταρα HepG2, μια σημαντική αναστολή του σχηματισμού σφαίρας παρατηρήθηκε επίσης σε μη-ακτινοβολημένα κύτταρα κατά φίμωση του Sox2 ή Oct4. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η έκφραση του Sox2 και Oct3 /4 απαιτείται για CSC σε κύτταρα HepG2 και Huh7, και ότι προς τα πάνω ρύθμιση αυτών των παραγόντων σε μη ΚΕΠ μπορεί να είναι επαρκής για να επάγει την απόκτηση ενός φαινοτύπου CSC, προσδίδοντας έτσι μια υψηλότερη αντίσταση ακτινοβολίας στον πληθυσμό μεγαλύτερο μέρος των κυττάρων του όγκου.

κύτταρα Α και Β HepG2 και τα κύτταρα Huh7 επιμολυσμένα με aiRNA στόχευσης GFP, Sox2 ή Oct4 εκτέθηκαν μετά από 24 ώρες σε 0, 2 ή 4 Gy ακτινοβολίας γάμμα και στη συνέχεια επιστρώθηκαν επάνω σε 96 φρεατίων πλάκες εξαιρετικά χαμηλής προσκόλληση στα 500 κύτταρα /φρεάτιο σε μέσο βλαστοκυττάρων. αριθμούς σφαίρα για κάθε νοκ ντάουν ομάδα και ακτινοθεραπεία καταγράφηκαν την ημέρα 7 του πολιτισμού στην βλαστοκυττάρων μέσα μαζικής ενημέρωσης. Αποσιώπηση του Sox2 ή Oct4 μείωσε σημαντικά τον σχηματισμό σφαίρας σε κύτταρα HepG2 και Huh7 αγωγή με χαμηλές δόσεις ακτινοβολίας γάμμα σε σύγκριση με μη-ακτινοβολημένα κύτταρα ή κύτταρα επιμολυσμένα με aiRNA έναντι GFP. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα, η = 4. * ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt?. 0.01, έναντι GFP-επιμολυσμένα κύτταρα ή μη ακτινοβολημένα κύτταρα ελέγχου (0 Gy)

Η

Συζήτηση

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) πιστεύεται ότι αντιπροσωπεύουν ένα μικρό υπο-πληθυσμό των κυττάρων που υπάρχουν στους περισσότερους όγκους που, παρόμοια με τα κανονικά βλαστικά κύτταρα ιστού, έχουν τη δυνατότητα να αυτο-ανανέωση, για να διαιρέσει ασύμμετρα και συμμετρικά, και να υποβληθούν σε πολυ-γράμμωσης διαφοροποίηση [41], [42]. Αυτά τα χαρακτηριστικά των ΚΕΠ είναι ουσιαστικά υπεύθυνη για τη μοναδική ικανότητά του να εκκινεί και να διατηρήσουν τους όγκους [10], [42], [43]. Επιπλέον, ΚΕΠ είναι επίσης πιστεύεται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη μετάσταση του καρκίνου, υποτροπής του καρκίνου, και την αντίσταση φάρμακο για τον καρκίνο [15], [20], [44], [45].

Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να διεγείρονται με ακτινοβολία γάμμα, για να αποκτήσει μια κατάσταση βλαστική ικανότητα που χαρακτηρίζεται από αυξημένη έκφραση γονιδίου βλαστική ικανότητα και ένα κύτταρο-φαινότυπο καρκινικά βλαστικά. Side πληθυσμός κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι ΚΕΠ σε HepG2 και Huh7 αντιπροσωπεύουν περίπου το 1-2% των χύδην καρκινικών κυττάρων [6], [32]. Δεδομένου ότι η ικανότητα να σχηματίζουν σφαίρες in vitro κάτω από μη-προσκολλημένα συνθήκες καλλιέργειας είναι ειδικά για ΚΕΠ [32], [37], τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η γάμμα ακτινοβολία των κυττάρων HepG2 και Huh7 αυξήθηκε σημαντικά ο αριθμός των ΚΕΠ στις δύο κυτταρικές σειρές.

Πρόσφατα δημοσιεύματα έδειξαν ότι, σε αντίθεση με τα καρκινικά κύτταρα χύμα, ΚΕΠ διαθέτουν εγγενή αντίσταση σε θεραπεία με ακτινοβολία

in vitro

και

in vivo

[20], [45], [ ,,,0],46], και ότι αυτή η ιδιότητα πιθανότατα προέρχεται από υψηλότερη έκφραση της ριζοσπαστικής άρση των ενζύμων δωρεάν, αυξημένη αποτελεσματικότητα στην επιδιόρθωση του DNA-ζημιά, και ενεργοποίηση σημείου ελέγχου προνομιακή βλάβη του DNA [15], [16], [20], [47] . Για να διερευνήσουν περαιτέρω την προέλευση των αυξημένων αριθμών των ΚΕΠ σε ακτινοβολία γάμμα HepG2 και Huh7 κύτταρα πραγματοποιήσαμε κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας Hoechst 33342 αποκλεισμού χρώσης για να απομονώσει την πλευρά του πληθυσμού (SP) κύτταρα που είναι εμπλουτισμένα σε CSC, και μη πλευράς πληθυσμού (μη-SP ) κύτταρα που έχουν εξαντληθεί από CSC. Παραδόξως, παρατηρήσαμε σημαντικά αυξημένο σχηματισμό σφαίρα σε κύτταρα μη-SP HepG2 και Huh7 μετά από έκθεση σε 2 ή 4 γκρι ακτινοβολίας γάμμα (Σχήμα 2). Επιπλέον, η αυξημένη σχηματισμός σφαίρα παρατηρήθηκε επίσης σε μη επεξεργασμένα HepG2 και Huh7 κύτταρα μη-SP. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα μη-SP (δηλαδή τα καρκινικά κύτταρα μη-CSC) μπορούν να αποκτήσουν CSC-όπως ιδιότητες, και είναι σύμφωνες με την πρόσφατη ιδέα ότι οι όγκοι αποτελούνται από μια ποικιλία κυττάρων σε διάφορα στάδια ωρίμανσης [48], [49] , με την ικανότητα να μετατρέπουν σε μια πιο βλαστικών κυττάρων κατάσταση που μοιάζει με [50], [51].

Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι προκαλείται από ακτινοβολία εμπλουτισμός του ΚΕΠ συνδέεται με την ενεργοποίηση των οδών σηματοδότησης αυτο-ανανέωση τέτοιων ως Wnt /β-κατενίνης, Notch και σκαντζόχοιρος [52], [53], [54]. Επιπλέον, δεδομένου ότι ΚΕΠ είναι ικανά τόσο ασύμμετρη και συμμετρική διαίρεση κυττάρου [55], [56] ο εμπλουτισμός αποτέλεσμα πιστεύεται ότι προκαλείται κυρίως από ΚΕΠ που υποβάλλονται σε συμμετρική κυτταρική διαίρεση. Τα δεδομένα μας, ωστόσο, δείχνουν ότι ένα επιπλέον συστατικό αυτού του αποτελέσματος μπορεί να είναι η απόκτηση του βλαστική ικανότητα χαρακτηριστικά μετά από θεραπεία με ακτινοβολία από τα καρκινικά κύτταρα μη-στέλεχος. Αυτό το εύρημα υποστηρίζεται περαιτέρω από την παρατήρηση μας αυξημένων Sox2 και Oct3 /4 γονιδιακής έκφρασης πλειοδυναμία σε κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος μετά από ακτινοβολία γάμμα (Σχήμα 3).

Μαζί με c-myc, Klf4 και Nanog, Sox2 και Oct3 /οι 4 παράγοντες μεταγραφής θεωρείται βασικά γονίδια για την παραγωγή ποντικού και επάγεται ανθρώπινα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα [57], [58]. Συγκεκριμένα, Sox2 και /4 έκφραση Oct3 φαίνεται να έχει θεμελιώδη ρόλο στην εξασφάλιση της συντήρησης των αυτο-ανανέωση, την πλαστικότητα και την ικανότητα επαναπρογραμματισμού και στις δύο εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα και τα ΚΕΠ [59], [60], [61], [62] . Αυξημένη έκφραση του Sox2 και Oct3 /4 μετά από αγωγή ακτινοβολίας γάμμα (Σχήμα 3) είναι, ως εκ τούτου, σύμφωνα με την επαγωγή ενός γενετικού προγράμματος σε ορισμένες HepG2 και Huh7 κυττάρων που οδηγεί σε αυξημένη βλαστική ικανότητα, και την απόκτηση ενός βλαστικού κυττάρου που ομοιάζει φαινότυπο [ ,,,0],63], [64], [65]. Δεδομένου ότι το συστατικό CSC στις δύο κυτταρικές σειρές αντιπροσωπεύει ≤2% του συνολικού πληθυσμού κυττάρων (Σχήμα 2) [6], [32], η παρατηρούμενη υπερέκφραση Sox2 και Oct3 /4 σε κύτταρα HepG2 και Huh7 εξής χαμηλής ακτινοβολίας δόση αντιπροσωπεύει πιθανότατα αλλαγές στον πληθυσμό μη-CSC.

σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι τα κάτω ρύθμιση του Sox2 και Oct3 /4 σε κύτταρα HepG2 ή Huh7 σχετίστηκε με μικρότερη αντίσταση στην ακτινοβολία γάμα σε μια δοκιμασία κλωνογονική επιβίωση η οποία επιτρέπει την η επιβίωση και ο πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων μη-βλαστικών καθώς ΚΕΠ (Σχήμα 4). Αυτό το εύρημα είναι σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες που αποδεικνύουν ότι ο ραδιοαντοχή χύδην όγκων κυττάρων φαίνεται να σχετίζεται με τη συνιστώσα CSC του πληθυσμού όγκου [20], [45], [46]. Να εξετάσει περαιτέρω το θέμα, εμείς γκρέμισε Sox2 ή έκφραση Oct4 στα κύτταρα HepG2 ή Huh7 χρησιμοποιώντας την τεχνολογία ασύμμετρης-RNA και εξέτασε την ικανότητά τους να αναπτύσσονται ως καλλιέργειες σφαίρα. Βρήκαμε ότι η εξουδετέρωση του Sox2 ή Oct4 έκφραση συσχετίστηκε με μία σημαντική μείωση του σχηματισμού σφαίρα μετά από αγωγή ακτινοβολίας γάμμα (Σχήμα 5). Από αυτό το πείραμα διεξήχθη υπό συνθήκες καλλιέργειας βλαστικών κυττάρων, τα οποία είναι επιλεκτική για CSC εμπλουτισμό και την επιβίωση, τα αποτελέσματά μας θα πρέπει να αντανακλούν μόνο την επίδραση του Sox2 και Oct3 /4 νοκ ντάουν για ΚΕΠ. Είναι ενδιαφέρον, Sox2 και Oct3 /4 προς τα κάτω ρύθμιση μείωσε σημαντικά την ικανότητα σχηματισμού σφαίρας σε μη-ακτινοβολημένα κύτταρα HepG2 και Huh7, υποδεικνύοντας ότι αυτοί οι παράγοντες μπορεί επίσης να απαιτείται για τη συντήρηση των υφιστάμενων ΚΕΠ. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι το νοκ ντάουν του Sox2 και Oct3 /4 μπορεί να είναι μια πιθανή προσέγγιση για την ευαισθητοποίηση του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος σε ακτινοθεραπεία, δεδομένου αποκλεισμό αυτοί οι παράγοντες μπορεί να αποτρέψει την αυτο-ανανέωση των μη-ΚΕΠ που έχουν αποκτήσει βλαστική ικανότητα ιδιότητες, καθώς και των υφιστάμενων ΚΕΠ.

Μακροχρόνια, οι μη στοχευμένες επιδράσεις, της ιονίζουσας ακτινοβολίας, όπως γονιδιωματική αστάθεια, προσαρμοστικές αντιδράσεις και την επίδραση των παρευρισκομένων θεωρείται ότι έχει σημαντικό ρόλο στην ακτινοβολία που προκαλείται από καρκινογένεση [66], [67], [68] . Η έκθεση των κυττάρων σε ακτινοβολία, ειδικά χαμηλές δόσεις, μπορεί να μεσολαβήσει γενωμική αστάθεια και προσαρμοστικές αντιδράσεις που έχουν τη δυνατότητα να επάγουν γονιδιακή έκφραση, χρωμοσωμική αναδιάταξη, μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις και επιγενετικές μεταβολές που ξεκινούν καρκινογένεση. Αυτές οι αλλαγές μπορούν επίσης να επάγεται σε άλλα κύτταρα που δεν έχουν υποβληθεί σε αρχική ακτινοβολία βλάβη (από το φαινόμενο γειτνιάσεως) που οδηγεί σε ένα πιο ενισχυμένο φαινότυπο. Επιπλέον, είναι κληρονομική, μη-κλωνική, και βασίζονται σε επιγενετικές τροποποιήσεις, όπως η απορύθμιση της μεθυλίωσης του DNA [69], [70], [71]. Μας εύρεση ότι η ακτινοβολία γάμμα μπορεί να προκαλέσει spherogenesis σε καρκινικά κύτταρα μη-στέλεχος, και ότι αυτή η διαδικασία απαιτεί την έκφραση του Sox2 και Oct3 /4, είναι συνεπείς με την ενεργοποίηση ενός «προγράμματος βλαστική ικανότητα» που προκαλείται από μη-στοχευμένες επιγενετικές επιδράσεις σε ακτινοβολημένα κύτταρα όπου ο επαναπρογραμματισμός της γονιδιακής έκφρασης σχετίζεται σημαντικά αυξημένη ραδιο-αντίσταση [72].

Για τον τελευταίο αιώνα, η ακτινοθεραπεία έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς ως θεραπευτική ή επικουρική θεραπεία του καρκίνου και την ακτινοβολία χαμηλής δόσης ως παρηγορητική μέτρο για τη διαχείριση των ασθενών με προχωρημένο καρκίνο. Ωστόσο, οι περισσότεροι ανθρώπινων κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου ηπάτωμα, είναι ανθεκτικοί σε αυτό το σημαντικό θεραπευτικό τροπικότητα. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η ακτινοβολία μπορεί να επάγει βλαστοκυττάρων ιδιότητες παρόμοιες όπως ο σχηματισμός σφαίρα και την έκφραση του γονιδίου βλαστική ικανότητα σε μη-ΚΕΠ, καταδεικνύοντας ότι η μη βλαστικά κύτταρα καρκίνου μπορούν να αποκτήσουν ένα πιο βλαστοκυττάρων κατάσταση που μοιάζει με ενισχυμένη ικανότητα να αυτο- ανανεώσει, προτείνοντας ένα νέο μηχανισμό για την ραδιοαντοχή παρατηρείται συνήθως σε ανθρώπινες κακοήθειες.

Μέθοδοι

Cell Culture and Drug Θεραπεία

κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος

HepG2 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ΗΒ-8065). κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος Huh7 παρεσχέθησαν ευγενώς από τον Dr. Raymond Chung [73], [74]. κύτταρα ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος HepG2 και Huh7 καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM? Sigma-Aldrich) συμπληρωμένου με 10% θερμικά απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FBS? Sigma-Aldrich), 2 mM γλουταμίνη, 50 IU /ml πενικιλλίνη και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη σε μία υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C. Για να εκτιμηθεί σφαίρα σχηματισμός (spherogenesis) HepG2 και Huh7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε βλαστοκυττάρων μέσα (SCM) αποτελείται από μέσα DMEM-F12, 1 × Β27 συμπλήρωμα, 200 ng /ml EGF, 10 ng /ml βασικό FGF, 0,4% BSA, 4 μg /ml ινσουλίνη, 50 IU /ml πενικιλλίνη και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη σε μία υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C.

Gamma Ακτινοθεραπεία

Αξεδιάλεχτα HepG2 και τα κύτταρα Huh7 και μη SP ταξινομημένο πληθυσμός αιωρήθηκε σε SCM μοιράστηκαν σε σωλήνες 1.5 ml σε μια συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα /ml. Οι σωλήνες τοποθετήθηκαν σε πάγο και ακτινοβολούνται με 0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy ή 10 Gy ακτινοβολίας γάμμα χρησιμοποιώντας ένα

137Cs ακτινοβολίας (CIS διάγνωσης). Τα κατεργασμένα κύτταρα στη συνέχεια εμβολιάστηκαν σε SCM για δοκιμασία spherogenesis (στα 0,5 × 10

3 /φρεάτιο), ή σε πλήρες DMEM για τη δοκιμασία βιωσιμότητας ΜΤΤ (σε × 10

3 κύτταρα 1 /φρεάτιο) δοκιμασίας και αποικίας σχηματισμός ( σε 3 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο).

Hoechst 33342 χρώσης και Side Πληθυσμός κυτταρομετρία ροής

κυτταρομετρία ροής Side πληθυσμού έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο της Goodell et al. [75] με τροποποιήσεις για να βελτιωθεί η χρώση για ηπατική κυτταρικές γραμμές. Εν συντομία, HepG2 ή Huh7 καλλιέργειες θρυψινοποιήθηκαν, και τα αποκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις 500 r.p.m. για 5 λεπτά. Τα ιζηματοποιημένα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μια συγκέντρωση 10

6 κύτταρα /ml σε προθερμασμένο ϋΜΕΜ, συμπληρωμένο με 2% FBS και 10 mM HEPES, που περιέχει 5 μg /ml Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) με ή χωρίς 50 μΜ βεραπαμίλη (Sigma-Aldrich). Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C σε υδατόλουτρο για 90 λεπτά με ήπια ανάμιξη κάθε 15 λεπτά. Στο τέλος της περιόδου επώασης, τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στα 500 r.p.m. για 5 λεπτά στους 4 ° C, και επαναιωρήθηκαν σε μία τελική συγκέντρωση 2 × 10

7 κύτταρα /ml σε παγωμένο διάλυμα του Hank ρυθμισμένο με αλάτι συμπληρωμένο με 0,2% FBS, 10 mM HEPES, 40 μm mesh-φιλτράρεται και χρωματίζονται με ιωδιούχο 2 μg /ml προπίδιο. Τα δείγματα διατηρούνται σε πάγο έως ότου διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα MoFlo υψηλής ταχύτητας μηχανή FACS (DakoCytomation) σε κλάσματα που περιέχουν κύτταρα Side Πληθυσμός (SP) και κύτταρα μη-Side Πληθυσμός (μη-SP) [6], [32], [ ,,,0],33], [34]. Hoechst 33342 διεγέρθηκε χρησιμοποιώντας ένα λέιζερ υπεριώδους στα 350 nm και ο φθορισμός του ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα 450 nm Hoechst μπλε φίλτρο και ένα 670 nm Hoechst κόκκινο φίλτρο. Προπιδίου φθορισμός ιωδιούχου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο 650 nm. Μη SP και μη ταξινομημένα κύτταρα στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε SCM για θεραπεία γάμμα ακτινοβολία και την ανάλυση του σχηματισμού σφαίρας. Για ΡΙ-διαλογή των χύδην κυττάρων, HepG2 και Huh7 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μια συγκέντρωση 10

6 κύτταρα /ml σε προθερμασμένο ϋΜΕΜ, συμπληρωμένο με 2% FBS και 10 mM HEPES, στη συνέχεια σε επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω.