Αφηρημένο

Σκοπός

Ο καρκίνος που σχετίζεται ινοβλάστες στρωματικά (CAFS) υποβάλλονται σε μεταγραφικό και φαινοτυπικές αλλαγές που συμβάλλουν στην εξέλιξη του όγκου, αλλά οι μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για τις αλλαγές αυτές δεν είναι καλά κατανοητοί. Παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA είναι μια σημαντική αιτία της μεταγραφικής μεταβολές στα καρκινικά κύτταρα, αλλά δεν είναι γνωστό το πόσο σημαντικό μεθυλίωσης του DNA αλλαγές είναι με τη συμπεριφορά CAF.

Πειραματικός Σχεδιασμός

Εμείς που χρησιμοποιούνται συστοιχίες εξόνιο Affymetrix να συγκρίνουν γονίδια που προκαλείται από τον αναστολέα μεθυλίωσης DNA 5-αζα-dC σε καλλιεργημένα καρκίνο του παγκρέατος που σχετίζεται ινοβλάστες, παγκρεατικό ινοβλάστες ελέγχου και παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές.

Αποτελέσματα

Βρήκαμε ότι η παγκρεατική CAFS και τον έλεγχο του παγκρέατος ινοβλάστες ήταν λιγότερο δεκτικές σε 5-αζα-άΟ με τη μεσολάβηση γονίδιο επανενεργοποίηση από παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (μέση τιμή +/- SD των γονιδίων επάγεται ≥5 φορές ήταν 9 ± 10 γονίδια σε 10 παγκρεατικό CAF καλλιέργειες, 17 ± 14 γονίδια σε 3 καλλιέργειες ελέγχου παγκρεατικής ινοβλαστών, και 134 ± 85 γονίδια σε 4 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές). Εξετάσαμε διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ CAFS και ινοβλάστες ελέγχου για τις υποψήφιες μεθυλιωμένη γονίδια και προσδιόρισε την αποσυνθετίνη και μεταλλοπρωτεάσης,

Adam-12

ως μεθυλιωμένος και υπερεκφράζεται σε παγκρεατικά γραμμές CAF και υπερεκφράζεται σε ινοβλάστες δίπλα στην πρωτοβάθμια παγκρεατικά αδενοκαρκινώματα.

Συμπεράσματα

σε σύγκριση με καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος, τα λίγα γονίδια επανενεργοποιούνται με αναστολή DNMT1 σε παγκρεατικά CAFS υποδηλώνοντας τα κύτταρα αυτά δεν φιλοξενούν πολλά λειτουργικά σημαντικών μεταβολών στο DNA μεθυλίωση. CAFS μπορεί επίσης να μην είναι σε υψηλό βαθμό ετοιμότητας για την θεραπευτική στόχευση με αναστολείς της μεθυλίωσης του DNA

Παράθεση:. Yu J, Walter K, Omura Ν, το Χονγκ S-Μ, Νέοι Α, Li A, et al. (2012) Σε αντίθεση με κύτταρα καρκίνο του παγκρέατος καρκίνο του παγκρέατος Associated ινοβλάστες Display Minimal επαγωγής του γονιδίου μετά από 5-Αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη. PLoS ONE 7 (9): e43456. doi: 10.1371 /journal.pone.0043456

Επιμέλεια: Brock C. Christensen, Geisel της Ιατρικής Σχολής του Dartmouth, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 Απρίλη, 2012? Αποδεκτές: 24 Ιούλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 11 Σεπτεμβρίου, 2012

Copyright: © Yu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τις επιχορηγήσεις του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου (CA62924 και RC2148346), και το Ίδρυμα Μιχάλης Rolfe. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επιγενετικές μεταβολές στη γονιδιακή έκφραση είναι θεμελιώδες χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων [1]. Ένα από τα καλύτερα χαρακτηρισμένο επιγενετικές μεταβολές είναι DNA μεθυλίωση. προτύπων μεθυλίωσης DNA είναι κληρονομικές και διατηρούνται μετά την κυτταρική διαίρεση κυρίως από το DNA μεθυλοτρανσφεράση Dnmt1. Η ανώμαλη υπερμεθυλίωση DNA συχνά εμφανίζεται σε CpG νησιά υποκινητές γονίδιο και συνδέεται με ένα κλειστό χρωματίνη κατάσταση και γονίδιο καταστολής. Αξιόλογη απόδειξη δεικνύει ότι παρεκκλίνουσα υπερμεθυλίωση και γονιδιακή σίγηση του καταστολείς όγκων και άλλων ρυθμιστικών γονιδίων συμβάλλει στην ανάπτυξη των παγκρεατικών και άλλων καρκίνων [2]. Η ανώμαλη υπομεθυλίωση του κανονικά μεθυλιωμένων και σιγήσει γονίδια έχει επίσης περιγραφεί σε παγκρεατικά και άλλων καρκίνων, ως αιτία της ανωμάλου γονιδίου υπερέκφρασης [3], [4].

Οι μηχανισμοί που ευθύνονται για αυτές τις ανώμαλες μορφές μεθυλίωσης σε καρκίνους δεν είναι καλά κατανοητή, αλλά υπάρχουν υποψίες μηχανισμοί περιλαμβάνουν υπερέκφραση του

DNMT1

, συσσώρευση της μεθυλίωσης DNA μεταβολές με την ηλικία [5], [6] και τις επιδράσεις του περιβάλλοντος [7], αλλαγμένη δραστικότητα του

de novo

μεθυλίωση ένζυμα

Dnmt3a

και

DNMT3b

[8], [9], και, ενδεχομένως, από την αλλοιωμένη κυτταρικό μικροπεριβάλλον όπως από χρόνια φλεγμονή [3], [10].

μη νεοπλασματικά κύτταρα στρωματικά εντός μικροπεριβάλλον του όγκου υφίστανται επίσης μεταγραφικές και άλλες φαινοτυπικές αλλαγές σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα που πιστεύεται ότι συμβάλλει στην εξέλιξη του όγκου. Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια θανατηφόρα ασθένεια [11] και είναι γνωστό για την εκτεταμένη απόκριση δεσμοπλαστικού στρωματικά του που περιλαμβάνει κατά μέσο όρο το 75% των κυττάρων στη μάζα του όγκου [12]. Υπάρχει η υποψία ότι το συστατικό στρωματικά συμβάλλει στην αντίσταση του παγκρέατος σε θεραπείες ναρκωτικών [13], και αρκετές μελέτες εμπλέκουν διαφορές στη συμπεριφορά στρωματικά με αποτέλεσμα ασθενή σε παγκρεατικά και άλλων καρκίνων [14], [15], [16], [ ,,,0],17], [18]. ινοβλάστες Καρκίνος συνδέεται (CAFS), ο κυρίαρχος τύπος κυττάρου στο μικροπεριβάλλον στρωματικών, εγκρίνει ένα ενεργοποιημένο φαινότυπο κατά την διάρκεια της ογκογένεσης, που υποβάλλονται σε μορφολογικών, λειτουργικών και γονιδιακή έκφραση αλλάζει σε σχέση με τους φυσιολογικούς ινοβλάστες [19]. Αυτά τα ενεργοποιημένα CAFS χαρακτηρίζεται από α-λείου μυός ακτίνη (-SMA α) έκφραση [20], ενισχυμένη συσταλτική και εκκριτική ικανότητα, και αυξημένη σύνθεση κολλαγόνα, πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας [21] και παράγοντες ανάπτυξης συμπεριλαμβανομένων των επιθηλιακών αυξητικού παράγοντα, αιμοπετάλια παράγοντες ανάπτυξης που λαμβάνονται (PDGF), ο βασικός αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών, αυξητικό παράγοντα ηπατοκυττάρων, και παράγοντας μετασχηματισμού ανάπτυξης βήτα (TGF-β) [22]. Μέσω αυτών και άλλων σημάτων, CAFS αλληλεπιδρούν στενά με καρκινικά κύτταρα για την προώθηση της ανάπτυξής τους, και ως εκ τούτου CAFS παρουσιάζουν σημαντικό ενδιαφέρον ως θεραπευτικός στόχος. Πράγματι, πρόσφατες στρατηγικές για τη στόχευση CAFS περιλαμβάνουν τη χρήση του αναστολέα κινάσης, imatinib να μπλοκάρουν τους υποδοχείς στρωματικά PDGF [23], αντισώματα για να εμποδίσει αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) που προέρχεται από τα δύο καρκινικά κύτταρα και CAFS να αναστέλλουν την αγγειογένεση του όγκου [24] και η χρήση των αναστολέων της smoothened (SMO), να εμποδίσει τον όγκο στρωματικών hedgehog σηματοδότησης και καταστρέφουν στρωματικών ινοβλαστών που υπερεκφράζουν τον υποδοχέα hedgehog (Hh) Smo [25], [26], [27], [28]. Ότι οι αρχικές δοκιμές εξομαλυνθεί αναστολέων σε καρκίνους του παγκρέατος δεν παρουσιάζουν ενδείξεις οφέλους υπογραμμίζει την ανάγκη για βασικές μελέτες για τη διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων στρωματικών όγκων. Ένα άλλο πιθανό όφελος της στόχευσης στρώμα του καρκίνου είναι η βελτίωση της προσβασιμότητας των θεραπευτικών σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Για παράδειγμα, το φάρμακο ΝΑΒ-paclitaxel (Abraxane), ένα σκεύασμα νανοσωματιδίων του paclitaxel, δεσμεύεται σε Sparc, μια πρωτεΐνη μήτρα στρωματικά συχνά εντόνως εκφρασμένο σε παγκρεατικά στρώμα καρκίνου που προκαλεί αλληλεπιδράσεις στρωματικών όγκων, έτσι δυνητικά βελτίωση της παροχής του φαρμάκου στον όγκο [29] , [30]. Κλινικές δοκιμές του Abraxane σε καρκίνο του παγκρέατος δείχνουν υπόσχεση και σε ζωικά μοντέλα υπάρχουν στοιχεία που να υποδηλώνουν ότι η παράδοση της γεμσιταβίνης στον όγκο βελτιώνεται με Abraxane, και με σκαντζόχοιρος αναστολείς [25]. Αποτελεσματικότητα του συνδυασμού /Abraxane ναρκωτικών Γεμσιταβίνη ακόμα περιμένει τα αποτελέσματα της φάσης 3 κλινικές δοκιμές.

Η επιρροή του CAFS στην ανάπτυξη του καρκίνου έχει αποδειχθεί σε πολλές μελέτες [31], [32], αλλά οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν το CAF φαινότυπο δεν είναι καλά κατανοητοί. Παρά το γεγονός ότι μια σημαντική επιρροή του CAFS υπάρχει υποψία ότι το μικροπεριβάλλον του όγκου συμπεριλαμβανομένων των επιρροών από τους ίδιους τους καρκινικά κύτταρα, CAFS διατηρούν τις ιδιότητές του όγκου που προάγουν τους

in vitro

μετά από καλλιέργεια κυττάρων παρατεταμένη [33], γεγονός που υποδηλώνει ότι κληρονομική μηχανισμοί είναι υπεύθυνοι . Αν και έχουν περιγραφεί γενετικές αλλοιώσεις στο CAFS, πιο πρόσφατες μελέτες που διερευνούν την πιθανότητα ότι CAFS υφίστανται κλωνική γενετικές αλλοιώσεις παρόμοιες με τα καρκινικά κύτταρα έχουν βρει κανένα στοιχείο για τις τροποποιήσεις αυτές [33], [34], [35], [36], [37 ], [38]. Σε περίπτωση απουσίας εκτεταμένων γενετικών μεταλλάξεων, είναι λογικό να υποπτεύεται ότι επιγενετικών μηχανισμών όπως μεθυλίωση του DNA, τα οποία είναι μιτωτικώς κληρονομική, είναι υπεύθυνες για τις σταθερές μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης σε CAFS. Πράγματι, αρκετά γονίδια που εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις όγκο στρωματικών και διεγείρεται σε CAFS με συγκαλλιέργεια με τα καρκινικά κύτταρα, όπως

SPARC

[29], [30],

COX-2

και μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) [39] ρυθμίζονται από μεθυλίωσης DNA. Επιπλέον, οι CAFS υπόκειται στους ίδιους επιρροές στο μικροπεριβάλλον του όγκου οι οποίες πιστεύεται ότι συμβάλλουν στις αλλαγές μεθυλίωσης σε καρκινικά κύτταρα, όπως η χρόνια φλεγμονή [34].

Η ετερογένεια της CAFS από διαφορετικούς όγκους και ακόμη και εντός της ίδιου όγκου [14], [30] προτείνει, επίσης, ότι CAFS έχουν πολλαπλές πηγές που θα μπορούσαν να συμβάλουν στην επιγενετικές διαφορές. Εκτός από την ενεργοποίηση των ινοβλαστών που κατοικούν στο μικροπεριβάλλον του όγκου, μερικά CAFS είναι μυελό των οστών προερχόμενα μεσεγχυματικά κύτταρα πρόδρομα [40], [41] και ίσως επιθηλιακών ή ενδοθηλιακών κυττάρων που υποβάλλονται σε μεσεγχυματικά μετάβαση [21], [42]. Επειδή αυτές οι διαδικασίες διαφοροποίησης και δια-ρυθμίζεται από επιγενετικών μηχανισμών [43], CAFS προέρχονται από διαφορετικές πηγές έχουν διαφορετικές επιγενετικών και μεταγραφικών προφίλ σε σχέση με κάτοικο ομολόγους του ιστού τους.

Μόνο λίγες μελέτες έχουν αρχίσει να διερευνήσουν επιγενετικών μηχανισμών για την αυτές οι μεταγραφικές αλλαγές στην CAFS. Μία από τις πρώτες μελέτες για να παρέχει απόδειξη των διαφορών μεθυλίωσης DNA μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών συνδέονται στρωματικά κύτταρα πήρε μια προσέγγιση γονιδιώματος σε επίπεδο χρησιμοποιώντας ειδικούς μεθυλίωσης ψηφιακό καρυότυπου (MSDK) στο προφίλ επιθηλιακά κύτταρα, μυοεπιθηλιακά κύτταρα και ινοβλάστες στρωματικά κατά την διάρκεια της προόδου του όγκου του μαστού [35] . Μια άλλη προσέγγιση που συνδυάζει λέιζερ συλλαμβάνει μικροδιατομής με μεθυλίωσης ειδική PCR (MSP) των υποψηφίων γονιδίων εντοπίζονται συχνά μεθυλίωση υποστηρικτής του

GSTP1

και

RARB2

στον προστάτη στρωματικά κύτταρα που σχετίζονται με όγκους σε σχέση με φυσιολογικά στρωματικά κύτταρα του προστάτη [ ,,,0],44]. Μια τρίτη προσέγγιση με τη χρήση ευαίσθητων σε μεθυλίωση SNP ανάλυση της σειράς (MSNP) αποδεικνύεται εστιακό κέρδη στη μεθυλίωση και την παγκόσμια υπομεθυλίωση σε καρκίνο του στομάχου που σχετίζεται με μυοϊνοβλάστες [36].

Μια χρήσιμη στρατηγική για τον εντοπισμό εκδηλώσεις μεθυλίωση είναι να εκτελέσει ένα γονίδιο επανενεργοποίηση Οι αναστολείς της μεθυλίωσης DNA οθόνη χρησιμοποιώντας όπως 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC), η οποία στοχεύει επιλεκτικά το ένζυμο DNMT1 για εξάντληση. Αυτή η μέθοδος έχει το πλεονέκτημα του προσδιορισμού των μεταβολών μεθυλίωσης του DNA που ρυθμίζουν μεταγραφή και ως εκ τούτου πιο πιθανό να είναι λειτουργικά σημαντικές. Αν και αυτή η προσέγγιση έχει εντοπίσει επιτυχώς γεγονότα μεθυλίωσης σε καρκινικά κύτταρα από διάφορους τύπους καρκίνου, [45] με τις γνώσεις μας, αυτή η προσέγγιση δεν έχει χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση γονιδίων που ρυθμίζονται από μεθυλίωση σε CAFS. Για να καθοριστεί εάν το DNA μεθυλίωση είναι παρομοίως σημαντικοί ρυθμιστές των αλλαγών της γονιδιακής έκφρασης σε CAFS και για καρκινικές κυτταρικές σειρές, πραγματοποιήσαμε ένα γονιδίωμα-ευρεία ανάλυση επανέκφραση του ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου που σχετίζονται με ινοβλάστες και παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας 5-αζα-DC.

Υλικά και Μέθοδοι

Πολιτισμός γραμμών κυττάρων

Οι πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών στρωματικών, που ορίζεται από καρκίνο που σχετίζεται ινοβλάστες (CAFS) CAF9, CAF11, CAF12, CAF13, CAF14, CAF15, CAF16, CAF18, CAF19, CAF20, CAF21, CAF22, CAF25 και CAF35 καθιερώθηκαν από χειρουργικά-εκτομή του παγκρέατος καρκινικό ιστό από 13 ασθενείς (6 άνδρες μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) ηλικίας 58 ± 7 έτη) με κλινικά σποραδικές παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα. Οι καρκίνοι ήταν όλα μέτρια έως κακή διαφοροποιούνται με μέσο μέγεθος όγκου του 3,5 cm. Αυτές οι πρωτογενείς καλλιέργειες CAF καθορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27], όπως ήταν δύο ινοβλάστες ελέγχου hTERT-αθανατοποιημένα (SC2 και SC3, που ιδρύθηκε από χειρουργικά μη νεοπλασματικά παγκρέατος ιστού από 2 θηλυκά (μέση ηλικία, 63 ετών) [27]. Η αθανατοποιημένη ανθρώπινη παγκρεατική νεστίνη εκφράζουν (HPNE) κυτταρική γραμμή γενναιόδωρα από τον Dr. Michel Ouellette (University of Nebraska Medical Center) [46]. Τέσσερα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων A32-1, Panc2.8, Panc3.014 και Panc215 εγκατεστημένος από πρωτογενή παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα στο ίδρυμα μας και περιγράφηκε προηγουμένως [47] χρησιμοποιήθηκαν επίσης στη μελέτη αυτή Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε ΟΜΕΜ (4,5 mg /mL γλυκόζη? Invitrogen). που περιέχει 10% FBS κάτω από πρότυπες συνθήκες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [48] . Όλες οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν με την έγκριση από την επιτροπή Johns Hopkins για κλινικές έρευνες.

θεραπεία 5-αζα-dC και RNA εξόρυξη

τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 2 × 10

5 κύτταρα ανά φιάλη Τ75 και αντιμετωπίζεται την επόμενη ημέρα με 1 mmol /L 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC, Sigma) [49] για 4 ημέρες κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης ανάπτυξης, με μια αλλαγή των μέσων και του φαρμάκου κάθε 24 ώρες. Την ημέρα 5 όταν τα κύτταρα ήταν σχεδόν συρρέοντα, πλύθηκαν με ψυχρό PBS και το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ Qiagen (Qiagen) ή το κιτ mirVana miRNA (Ambion), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, όπως περιγράφεται προηγουμένως [50].

Το εξόνιο συστοιχία και επιλογή γονιδίων για την επικύρωση

Η πλατφόρμα array Affymetrix GeneChip Human εξόνιο 1.0ST χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης σε μη επεξεργασμένα και 5-αζα-άΟ αγωγή ινοβλάστες και καρκινικές κυτταρικές σειρές, όπως και προηγουμένως περιγράφεται [27]. Είμαστε σε συμμόρφωση με τις ελάχιστες πληροφορίες σχετικά με ένα κατευθυντήριων γραμμών μικροσυστοιχιών Πειραματιστείτε και έχουν υποβάλει τα δεδομένα μικροσυστοιχιών μας που στην έκφραση του γονιδίου Omnibus αποθετήριο (GEO προσχώρησης # GSE20911).

Ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR)

1 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen). Η προκύπτουσα cDNA ενισχύθηκε σε ΑΒΙ 7300 Real-Time PCR θερμοκυκλωτή χρησιμοποιώντας SYBR Green ΡΟΚ Master Mix και τις συνιστώμενες συνθήκες PCR (Applied Biosystems). Το γονίδιο καθαριότητας

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση. Primer ειδικότητα επιβεβαιώθηκε με ανάλυση καμπύλης τήξης. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως κανονικοποιημένες τιμές έκφρασης σε σχέση με την αναφερόμενη κυτταρική γραμμή (= 2

-ΔΔCt). Όλες οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Εναρκτήρες αλληλουχίες είναι ως ακολούθως:

Stratifin

RTsense: 5′-TCTGATCCAGAAGGCCAAG-3 ‘?

Stratifin

RTantisense: 5′-GTTTCGCTCTTCGCAGGAG-3 ‘?

TKTL1

RTsense: 5′-AGCTCCGGCCACCCTACATCATG-3 ‘?

TKTL1

RTantisense: 5′-TGCCACATCCACAAACGACAGTCT-3 ‘?

Adam-12

RTsense: 5′-AAATGAAGGTCTCATTGCCAG-3 ‘?

Adam-12

RTantisense: 5′-AGAATTACCCGTGTAATTTCGAG-3 ‘?

GAPDH

RTsense: 5′-CAACAGCCTCAAGATCATCAG-3 ‘?

GAPDH

RTantisense: 5′-ACTGTGGTCATGAGTCCTTC-3 ‘.

Bisulfite αλληλουχίας

Η κατάσταση μεθυλίωσης των 5′ CpG νησίδων των υποψηφίων γονιδίων προσδιορίστηκε με όξινο θειώδες αλληλουχίας. Τροποποίηση όξινου θειώδους και PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [51]. Θειώδους Τροποποιημένο αλληλουχίας (BMS) εκκινητών ήταν ως εξής:

TKTL1

BMS προς τα εμπρός: 5′-TGTGTAGAGAAAGAAGATTTTGTATT-3 ‘,

TKTL1

BMS αντίστροφη: 5′-CCCTTTAAAATCTAAAAACCCACTC-3′, και εσωτερική αλληλουχίας αστάρι

TKTL1

BMS-Seq: 5′-GATTGTAGGAGAGAAGATGAG-3 ‘?

Adam-12

BMS προς τα εμπρός: 5′-TTTAGTTTTAGTTTGAAAAGTTGGA-3 ‘,

Adam-12

BMS αντίστροφη: 5′-CTAAACTCTTCTAACCTTTCAT-3′, και εσωτερική αστάρι αλληλουχίας

Adam-12

BMS-Seq : 5′-TTCTAACACAAACCAACCTTAACC-3 ‘. Τα καθαρισμένα προϊόντα αλληλουχήθηκαν στην Εγκατάσταση Johns Hopkins Πυρήνα Sequencing.

Ανάλυση Western Blot της έκφρασης DNMT1

ανάλυση κηλίδος Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης από μη επεξεργασμένα ή 5-αζα-άΟ επεξεργασμένα HPNE ή CAF12 κύτταρα. Μια δοκιμασία Bradford χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση συγκέντρωση πρωτεΐνης, χρησιμοποιώντας αλβουμίνη βόειου ορού (BSA, Invitrogen) ως πρότυπο. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (40 μg ανά λωρίδα) διαχωρίστηκαν με 4-12% κλίση ηλεκτροφόρηση γέλης SDS (Invitrogen), μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, και επωάστηκαν σε διάλυμα αποκλεισμού (5% γάλα σε TBS με 0,1% Tween 20) για 30 λεπτά . Οι μεμβράνες επωάστηκαν για 60 λεπτά με ένα αντι-DNMT1 πολυκλωνικό αντίσωμα (γενναιόδωρα από τον Dr. Bill Nelson, JHU) σε 1:200 αραίωση ή ένα μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι GAPDH (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ) σε 1:2000 αραίωση. Δευτερογενής HRP-συνδεδεμένη αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology, και Amersham Biosciences) εφαρμόστηκαν σε 1:2000 αραίωση και πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ ECL (Amersham Biosciences).

παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα ιστικές μικροσυστοιχίες και Adam-12 Ανοσοϊστοχημεία

Η έκφραση της πρωτεΐνης Adam-12 εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημική (IHC) την επισήμανση των μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη μικροσυστοιχίες ιστού (TMAs) χρησιμοποιώντας ϋΑΚΟ Autostainer (DAKO, Carpinteria, CA). Τέσσερις TMAs περιέχει ένα σύνολο 72 διαφορετικών χειρουργικά παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα και αντίστοιχοι φυσιολογικοί ιστοί πάγκρεας κατασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [29]. χρώση Adam-12 IHC διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29] χρησιμοποιώντας ένα κουνελιού αντι-ανθρώπινο αντίσωμα Adam-12 (A2601, Sigma) σε αραίωση 1:100 και χρόνο επώασης 60 λεπτών. Επισήμανση έγινε με τη χρήση του Envision-Splus Detection Kit (DAKO).

Στατιστική Ανάλυση

Περιγραφική στατιστική αξίες και οικόπεδα παρήχθησαν χρησιμοποιώντας πακέτο του Microsoft Excel ή το v6.3 beta Partek® Γονιδιωματική Σουίτα ™ . Η μέθοδος Στιβαρή πολλαπλών μικροπλακετών Μέση (RMA) χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει τις πρώτες μετρήσεις της έντασης όλων των συνόλων καθετήρα. τιμές γονιδιακή έκφραση κατόπιν ελήφθησαν με τη χρήση του ενός σταδίου μέθοδος biweight κατά Tukey. Αμφίδρομη ANOVA έγινε για τον εντοπισμό σημαντικών αλλαγών έκφραση μεταξύ ινοβλάστες χωρίς αγωγή και 5-αζα-dC επεξεργασμένα ή καρκινικές κυτταρικές σειρές, ή μεταξύ CAFS και ινοβλάστες ελέγχου. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε

P

& lt? 0,05, και οι τιμές που αναφέρονται είναι μέσα ± SD

Αποτελέσματα

Συνολική ανάλυση γονιδιακής έκφρασης της ανθρώπινης παγκρεατικής ινοβλάστες και κυτταρικές σειρές καρκίνου αντιμετωπίζεται. με 5-αζα-dC

Εμείς ιδρύθηκε πρωτογενείς παγκρέατος καλλιέργειες CAF και καλλιέργειες ινοβλαστών ελέγχου όπως περιγράφηκε προηγουμένως [38]. Χρησιμοποιώντας παγκόσμιο προφίλ γονιδιακής έκφρασης, εμείς προηγουμένως ταυτοποιηθεί διαφορές έκφρασης γονιδίου σε παγκρεατικά CAFS σχέση με το μάρτυρα ινοβλάστες [27]. Ιεραρχική συσταδοποίηση των προφίλ γονιδιακής έκφρασης των μη επεξεργασμένων CAF και ελέγχου ινοβλάστες παρέχεται στο Σχήμα S1. Υποπτεύεται ότι αυτές οι αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση ήταν εν μέρει διαμεσολαβείται από τις αλλαγές στη μεθυλίωση του DNA, συγκρίναμε τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης των ΚΠΑ και καλλιέργειες ινοβλαστών έλεγχο πριν και μετά τη θεραπεία με 5-αζα-DC με τη βοήθεια Affymetrix εξόνιο Πίνακες (ST 1.0) (CAF11, CAF12, CAF13, CAF15, CAF16, CAF18, CAF19, CAF22, CAF25, και CAF35 για CAFS? HPNE, SC2, SC3 και για τα κύτταρα ινοβλαστών ελέγχου, αντίστοιχα)

Εμείς επιβεβαίωσε την πρώτη 5-αζα-dC εξάντληση. του ενζύμου Dnmt1 με κηλίδα Western. 5-αζα-άΟ θεραπεία του HPNE και CAF12 κυττάρων οδήγησε σε εξάντληση των Dnmt1 πρωτεΐνης σε 1 μΜ συγκεντρώσεις, αλλά όχι πρωτεΐνη ελέγχου GAPDH (Σχήμα 1). Για να εξεταστεί περαιτέρω η επίδραση της 5-αζα-dC συγκεντρώσεις, συγκρίναμε τον αριθμό των γονιδίων που προκαλείται από 1 μΜ και 10 μΜ 5-αζα-dC σε δύο επιπλέον CAFS, CAF19 και CAF35, και δεν βρήκε καμία σημαντική διαφορά στον αριθμό των γονίδια που επάγεται μεταξύ των εν λόγω συγκεντρώσεις φαρμάκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται 1 μΜ συγκεντρώσεις 5-αζα-άΟ για τη θεραπεία κάθε CAF. Εμείς επεξεργασμένα κύτταρα CAF για 4 ημέρες, καθώς αυτό ήταν επαρκούς διάρκειας για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Μεγαλύτερη θεραπείες (για 5-7 ημέρες) συχνά είχε ως αποτέλεσμα CAFS αυξανόμενη μέχρι συρροής (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε συμφωνία με αυτό, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού επί CAF19 σε διαφορετικές συγκεντρώσεις 5-αζα-dC (0 μΜ, 1 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ και 20 μΜ) και διαπιστώθηκε ότι η ανάπτυξη δεν επηρεάστηκε σημαντικά σε συγκέντρωση 1 μΜ χρησιμοποιήσαμε (Εικόνα S2).

πρωτεΐνη DNMT1 έχει εξαντληθεί (σε σχέση με GAPDH) σε 5-αζα-dC αντιμετωπίζονται HPNE και CAF12 κύτταρα.

η

Μετά την σύγκριση των προφίλ έκφρασης του κάθε CAF πριν και μετά από 5-αζα-dC θεραπεία, πρέπει πρώτα αναγνωρισθέντα γονίδια που υπερεκφράζονται με συνολικό μέσο όρο του ≥2.0 πολλαπλής μεταβολής σε όλες τις δέκα CAFS 5-αζα-άΟ-αγωγή σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα CAFS. Επιλέξαμε ένα 2-φορές αποκοπής ως πιο μέτρια διαφορές στο RNA θεωρήθηκαν πιο πιθανό να σχετίζεται με την πειραματική διακύμανση. Δεδομένου ότι ήμασταν ενδιαφέρονται για τον εντοπισμό γονιδίων σιγήσει στο CAFS των οποίων η έκφραση επάγεται από 5-αζα-dC, τότε να αποκλειστεί το υποσύνολο των γονιδίων που εκφράζονται σε μη επεξεργασμένα CAFS. Το κριτήριο αυτό εντοπίστηκαν 42 υποψήφια γονίδια (Πίνακας 1).

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η μεσολάβηση επαγωγή του γονιδίου 5-αζα-dC πραγματοποιήσαμε qRT-PCR για το γονίδιο

Stratifin

(14- 3-3 Sigma) και

transketolase-σαν πρωτεΐνη 1

(

TKTL1

) επειδή η έκφραση τους ρυθμίζεται από μεθυλίωση σε άλλους τύπους κυττάρων και η ανάλυση συστοιχίας εξόνιο προσδιορίζονται έκφρασή τους ως επάγεται από 5- αζα-dC [52] [53]. Συνεπής με αποτέλεσμα συστοιχία εξόνιο,

stratifin

(

SFN

) mRNA επίπεδα ήταν χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα σε όλες τις μη επεξεργασμένο ινοβλάστες (CAFS και ινοβλάστες ελέγχου), και αυξημένη έκφραση του

SFN

mRNA ανιχνεύθηκε στην πλειονότητα των 5-αζα-dC αγωγή ινοβλάστες (Σχ. 2 Α και Β). Παρατηρήσαμε σχεδόν πλήρη μεθυλίωση του

SFN

περιοχή προαγωγέα σε όλα τα CAFS με όξινο θειώδες αλληλουχίας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Παρομοίως,

TKTL1

επίπεδα mRNA ήταν μη ανιχνεύσιμα σε όλες σχεδόν χωρίς θεραπεία ινοβλάστες εκτός κύτταρα SC2, και αυξημένη έκφραση του

TKTL1

ανιχνεύθηκε στην πλειονότητα του 5-αζα-dC αγωγή ινοβλάστες (Σχ. 2 C). Σε συμφωνία με αυτό, βρήκαμε αποδείξεις από τη μεθυλίωση των 5 ‘CpGs του

TKTL1

σε ινοβλάστες με MSP (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Bisulfite αλληλούχιση της 18ης CpG θέσεων ανάντη του

TKTL1

θέση έναρξης της μεταγραφής (Εικ. 2 D) αποκάλυψε ότι όλοι ή οι περισσότεροι CpG θέσεις ήταν πλήρως μεθυλιωμένα στα μη εκφράζοντα γραμμές ινοβλαστών, HPNE και SC3 και CAF19 και CAF25 (Σχ. 2Ε). Σε αντίθεση, η

TKTL1

εκφράζοντα γραμμή, SC2, έλειπε μεθυλίωση πολλών από αυτά τα sites, υποστηρίζοντας ένα ρόλο για μεθυλίωσης του DNA στη ρύθμιση του

TKTL1

έκφρασης. Ταυτοποιήσαμε επίσης την προς τα πάνω ρύθμιση του

DAZL

και

ANXA3

(τα δεδομένα δεν φαίνονται), τα γονίδια έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι προκαλείται από την 5-αζα-άΟ [36],

NDN

, φέρεται να αποτυπωθεί [54], και

MT1G

, φέρεται να μεθυλιωθεί σε άλλες μορφές καρκίνου [55].

(Α) Affymetrix εξόνιο ανάλυση της σειράς των

SFN

έκφραση mRNA σε πέντε παγκρεατικά CAFS πριν (πράσινο) και μετά (κόκκινο) θεραπεία 5-αζα-dC. (Β) και (Γ) ανάλυση Ποσοτική RT-PCR του

SFN

και

TKTL1

έκφραση mRNA σε σχέση με

GAPDH

mRNA σε καλλιέργειες ινοβλαστών του παγκρέατος πριν (μπλε μπάρες) και μετά (κόκκινες γραμμές) θεραπεία 5-αζα-dC. Κάθε δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν. Τα δεδομένα είναι τα μέσα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? μπαρ είναι τιμές SD. (D) Top:

TKTL1

διάρθρωση και την κατανομή των CpG δινουκλεοτιδίων γονιδίου. Σύντομη κάθετες μπάρες αντιπροσωπεύουν θέσεις CpG. Arrow σημεία για να μεταγραφική θέση έναρξης. Παρακάτω: Bisulfite ανάλυση γονιδιωματικής αλληλουχίας σε παγκρεατικά CAFS και ινοβλάστες ελέγχου. Ανοικτοί κύκλοι αντιπροσωπεύουν μη μεθυλιωμένα CpG θέσεις, στερεά μαύρους κύκλους μεθυλιωμένο CpG θέσεις, και έχουν εκκολαφθεί κύκλους μερικώς μεθυλιωμένες CpG θέσεις. (Ε) Bisulfite χρωματογραφήματα αλληλουχίας του

TKTL1

προαγωγό σε ένα παγκρεατικό CAF (CAF19) και τις γραμμές ινοβλαστών ελέγχου (HPNE και SC2). Τα βέλη δείχνουν τα κατάλοιπα κυτοσίνης.

Η

Εξετάσαμε προφίλ RNA για να καθοριστεί εάν υπήρχαν διαφορική απαντήσεις σε 5-αζα-dc σε CAFS σε σύγκριση με τον έλεγχο των ινοβλαστών. Τριάντα πέντε από τους 42 γονιδίων επάγεται σε CAFS με 5-αζα-DC (Πίνακας 1) επίσης επάγεται σε ένα ή περισσότερα από τον έλεγχο του παγκρέατος γραμμές ινοβλαστών που δείχνει ότι λίγα, εάν υπάρχουν γονίδια επιλεκτικά και σταθερά αυξητικά από την 5-αζα-dC σε CAFS.

DAZL

ήταν η πιο μεγάλη που προκαλείται από το γονίδιο σε τέσσερις CAFS (CAF12, CAF15, CAF16, και CAF19) και ήταν μεταξύ των πρώτων δέκα γονίδια που προκαλούνται σε δύο CAFS (CAF18 και CAF22) και ινοβλαστών, ένας έλεγχος (HPNE) ( τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Πραγματοποιήσαμε ιεραρχική ομαδοποίηση των γονιδίων που προκαλείται από 5-αζα-dC στο CAFS και ινοβλάστες ελέγχου για να προσδιοριστεί αν υπήρχαν παρατηρήσιμες διαφορές στα συνολικά πρότυπα απόκρισης γονιδίου σε 5-αζα-dC, αλλά δεν υπήρξε καμία ομαδοποίηση ανά κατηγορία ινοβλαστών (Εικόνα S3). Πέντε από τα επτά CAFS συγκεντρωμένα μαζί, τα άλλα δύο CAFS ομαδοποίησης με τους ινοβλάστες ελέγχου.

Περαιτέρω στοιχεία για αυτήν την σπανιότητα των γονιδίων σιγήσει μεθυλίωσης του DNA στο CAFS προέρχεται από την αξιολόγηση των γονιδίων υποεκφράζονται στην CAFS. Εντοπίσαμε γονίδια που υποεκφράζονται με μία μέση τιμή ≥4.0 φορές σε κάθε CAFS σχέση με παγκρεατική ινοβλάστες ελέγχου (Πίνακας S2). Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν υπήρχε επικάλυψη μεταξύ αυτή τη λίστα των 86 υποεκφράζονται γονιδίων και των γονιδίων που προκαλείται από ένα μέσο όρο 2 φορές με 5-αζα-dc σε CAFS (Πίνακας 1). Τα δεδομένα αυτά δείχνουν ότι λίγοι, αν τυχόν γονίδια υποεκφράζονται συνέπεια σε CAFS σιγήσει από μεθυλίωση του DNA.

Αναγνώριση των υποψηφίων γονιδίων για ανάλυση υπομεθυλίωση

Έχουμε εντοπίσει προηγουμένως 200 γονίδια, όπως

ΠΕΑ

, υπερεκφράζεται σε παγκρεατικά CAFS σε σχέση με παγκρέατος ινοβλάστες ελέγχου [27]. Για τον προσδιορισμό των υποψήφιων μεθυλιωμένος γονίδια σε CAFS, έχουμε συγχωνευθεί αυτή τη λίστα των γονιδίων υπερεκφράζεται σε παγκρεατικά CAFS με τον κατάλογο των 581 γονιδίων που προκαλείται από ≥3.0 φορές σε τουλάχιστον μία κυτταρική σειρά ινοβλαστών με επεξεργασία 5-αζα-DC. Αυτό το κριτήριο προσδιορίζονται 49 υποψήφια γονίδια (Πίνακας S1) ορισμένα από τα οποία μπορεί να ρυθμίζεται με μεθυλίωση, και ενδεχομένως μεθυλιωμένος εις παγκρεατικά CAFS σχέση με το μάρτυρα ινοβλάστες.

θεραπεία 5-αζα-άΟ της ανθρώπινης παγκρεατικής CAFS, ινοβλάστες ελέγχου και καρκινικές κυτταρικές γραμμές

επόμενο σύγκριση των απαντήσεων των CAFS και ινοβλαστών ελέγχου σε 5-αζα-dC με τις απαντήσεις των παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Δημιουργήσαμε ένα άτομο λίστα γονίδιο για κάθε γραμμή ινοβλαστών ή κυτταρική γραμμή και στη συνέχεια μετρήθηκαν ο συνολικός αριθμός των γονιδίων που προκαλείται από ≥5-φορές σε κάθε γραμμή (Σχήμα 3). Στη συνέχεια συγκρίνεται ο μέσος αριθμός των γονιδίων που προκαλείται από ≥5 φορές με 5-αζα-dC στις δέκα CAFS, τις γραμμές ινοβλαστών 3 ελέγχου, και τα 4 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Σημαντικά λιγότερες γονίδια επάγονται από την 5-αζα-dC στο CAFS ό, τι σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (

P

= 0,0009). Ο αριθμός των γονιδίων που προκαλείται από ≥5 φορές στις δέκα CAFS ήταν μόνο 9 ± 10 γονίδια (μέση τιμή +/- τυπική απόκλιση) σε σύγκριση με το 17 ± 14 γονίδια που επάγονται από ≥5 φορές στις τρεις ινοβλάστες ελέγχου του παγκρέατος, και 123 ± 86 γονίδια που επάγονται από ≥5-φορές στα 4 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 3). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στον αριθμό των γονιδίων που προκαλείται από ≥5.0 φορές σε CAFS και σε παγκρεατικά ινοβλάστες ελέγχου. Για να διασφαλιστεί ότι είχαμε επιλέξει μια λογική αποκοπής φορές αλλαγή για σύγκριση, συγκρίναμε επίσης τον αριθμό των γονιδίων που προκαλείται από ≥3 φορές. Παρόμοιες διαφορές παρατηρήθηκαν επίσης: Ο αριθμός των γονιδίων που προκαλείται ≥3 φορές με 5-αζα-άΟ ήταν 83 ± 47 γονίδια που επάγεται σε ινοβλάστες ελέγχου και 48 ± 42 γονίδια επάγονται σε CAFS και 430 ± 271 γονιδίων στα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (

P

= 0,0006 για CAFS σχέση με καρκινικές κυτταρικές σειρές). Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές που σχετίζονται με την ηλικία ή το φύλο του ασθενούς στον αριθμό των γονιδίων που προκαλείται από 5-αζα-DC.

Ένας μέσος όρος 123 ± 86 γονίδια επάγονται 5-πλάσια ή περισσότερο από την 5-αζα-dC μεταχείριση σε τέσσερις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές, 9 ± 10 γονίδια σε δέκα παγκρεατικά CAFS (

P

= 0,0009) και 17 ± 14 γονίδια σε τρία έλεγχο του παγκρέατος γραμμές ινοβλαστών.

Η

Διαφορική μεθυλίωση του υποψηφίου μεθυλιωμένος γονίδιο Adam-12

η ανάλυσή μας των γονιδίων επιλεκτικά ρυθμίζεται προς τα πάνω από 5-αζα-dC IN CAFS δεν έδωσε τα γονίδια που είναι γνωστό ότι ρυθμίζεται από τη μεθυλίωση του DNA που επηρεάζουν στρωματικά συμπεριφορά των ινοβλαστών. Εξετάσαμε επίσης τις λίστες μας γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά σε CAFS σε σχέση με τον έλεγχο του παγκρέατος ινοβλάστες για τους υποψηφίους που επηρεάζουν τις αλληλεπιδράσεις όγκου /στρωματικών. Ένας υποψήφιος υπερεκφράζεται σε CAFS ήταν

Adam-12

.

Adam-12

(α ντισιντεγκρίνης και μεταλλοπρωτεάση 12), ένας ρυθμιστής του κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-μήτρας, υπερεκφράζεται στον καρκίνο που σχετίζεται με ινοβλάστες και εμπλέκεται στην πρόοδο του όγκου [56]. Εμείς επιβεβαίωσε την πρώτη προς τα πάνω ρύθμιση του

Adam-12

mRNA σε CAFS σε σχέση με τον έλεγχο ινοβλάστες χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR. Συνεπής με αποτέλεσμα συστοιχία εξόνιο μας (Εικ. 4α),

Adam-12

mRNA ήταν ιδιαίτερα υπερεκφράζεται στον παγκρεατικό ινοβλαστών ελέγχου προερχόμενες από ένα παγκρεατίτιδα δείγμα (SC3) και εννέα CAFS σε σχέση με τον έλεγχο ινοβλάστες HPNE και SC2 (Σχ. 4β).

(Α) Affymetrix εξόνιο σειρά ανάλυση του

Adam-12

έκφραση του mRNA σε παγκρεατικά CAFS και ινοβλάστες ελέγχου. (Β) Η ποσοτική ανάλυση RT-PCR του

Adam-12

έκφραση mRNA σε παγκρεατικά CAFS και ινοβλάστες ελέγχου μετά από κανονικοποίηση για

GAPDH

επίπεδα. Κάθε δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν. Τα δεδομένα είναι τα μέσα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? μπαρ είναι SD τιμές.

Η

Για να διαπιστώσετε εάν

Adam-12

ήταν διαφορικά μεθυλιώνεται CAFS σε σύγκριση με τον έλεγχο των ινοβλαστών, εκτελέσαμε θειώδους αλληλουχίας του

Adam-12

γονίδιο υποκινητή 9 CAFS και 3 γραμμές ινοβλαστών ελέγχου. Εμείς ενίσχυσε ένα 481-bp περιοχή άνωθεν της

Adam-12

θέση έναρξης της μεταγραφής που περιέχει 38 θέσεις CpG (Σχήμα 5α). Bisulfite αλληλούχηση αποκάλυψε ότι 29 από 38 (76%) CpG θέσεις ήταν πλήρως μεθυλιωμένα στη γραμμή ινοβλαστών ελέγχου HPNE (Σχήμα 5β). Αντιθέτως, έξι από εννέα CAFS (CAF12, CAF14, CAF15, CAF16, CAF20, και CAF22) ήσαν εντελώς (100%) μη μεθυλιωμένα σε όλες τις CpG θέσεις. Τα υπόλοιπα CAFS ήταν μερική μεθυλιωμένα στους 2 έως 7 από 38 θέσεις CpG και πλήρως μη μεθυλιωμένα σε όλες τις άλλες CpGs (Σχήμα 5α). Οι ινοβλάστες ελέγχου SC2 και SC3 πλήρως μεθυλιωμένα στο CpGs κοντά στο 5 ‘άκρο της περιοχής ακολουθίας και μερικώς μεθυλιωμένη στο CpGs κοντά στο 3’ άκρο της περιοχής αυτής. Ήταν πλήρως μη μεθυλιωμένα σε όλες τις άλλες CpGs. Έτσι, δεν υπήρχε σχετική υπομεθυλίωση σε πολλαπλά CpGs μεταξύ των ινοβλαστών που εκφράζονται

Adam-12

και εκείνων που δεν έκαναν, εμπλέκοντας παρεκκλίνουσα υπομεθυλίωση του

Adam-12

ως μηχανισμός για την υπερέκφραση του σε παγκρεατικά CAFS σύγκριση με τον έλεγχο παγκρέατος ινοβλάστες

(Α) Top:.

Adam-12

διάρθρωση και την κατανομή των CpG δινουκλεοτιδίων γονιδίου. Σύντομη κάθετες μπάρες αντιπροσωπεύουν θέσεις CpG. Arrow σημεία για να μεταγραφική θέση έναρξης. Παρακάτω: Bisulfite ανάλυση γονιδιωματικής αλληλουχίας σε παγκρεατικά CAFS και ινοβλάστες ελέγχου. Ανοικτοί κύκλοι αντιπροσωπεύουν μη μεθυλιωμένα CpG θέσεις, στερεά μαύρους κύκλους μεθυλιωμένο CpG θέσεις, και έχουν εκκολαφθεί κύκλους μερικώς μεθυλιωμένες CpG θέσεις. (Β) Bisulfite χρωματογραφήματα αλληλουχίας του και της γραμμής ινοβλαστών ελέγχου

Adam-12

προαγωγό σε ένα παγκρεατικό CAF (CAF19) (HPNE). Τα βέλη δείχνουν τα κατάλοιπα κυτοσίνης.

Η

Για να προσδιοριστεί εάν Adam-12 πρωτεΐνη υπερεκφράζεται στο στρώμα του πρωτογενούς παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημεία σε μικροσυστοιχίες ιστό. Ενώ η έκφραση της πρωτεΐνης Adam-12 δεν ανιχνεύθηκε σε ινοβλάστες που περιβάλλει την κανονική παγκρεατικού πόρου (Σχήμα 6b), CAFS του πρωτογενούς παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος ήταν θετικά για έκφραση πρωτείνης Adam-12 (Σχήμα 6c).