Αφηρημένο

Ιστορικό

Microseminoprotein-βήτα (MSMB) ρυθμίζει την απόπτωση και χρησιμοποιώντας γονιδίωμα-ευρεία ένωση μελετά την rs10993994 πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου στο

MSMB

υποστηρικτής έχει συνδεθεί σε αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη. Η τοποθεσία υποστηρικτής του αλληλομόρφου κινδύνου, και την ικανότητά της να μειώσει δραστηριότητα υποκινητή, πρότεινε ότι το αλληλόμορφο κινδύνου rs10993994 θα μπορούσε να οδηγήσει σε μειωμένες MSMB σε καλοήθη ιστό που οδηγεί σε αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του προστάτη.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

έκφραση MSMB σε καλοήθεις και κακοήθεις ιστούς του προστάτη εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία και σε σύγκριση με το γονότυπο rs10993994. Ακράτεια συγκεντρώσεις MSMB προσδιορίστηκαν με ELISA και συσχετίστηκε με ουρική PSA, την παρουσία ή απουσία του καρκίνου, rs10993994 γονότυπος και ηλικία έναρξης. επίπεδα MSMB στον προστατικό ιστό και στα ούρα ήταν σημαντικά μειωμένη με ογκογένεση. Ακράτεια MSMB ήταν καλύτερη από ό, τι ουροποιητικού PSA σε διαφοροποίηση των ανδρών με καρκίνο του προστάτη σε όλες τις βαθμίδες Gleason. Ο υψηλός κίνδυνος αλληλόμορφο σχετίστηκε με ετερογένεια των χρώσης MSMB και απώλεια MSMB και στο χαρτί και στα ούρα σε καλοήθη προστάτη.

Συμπεράσματα

Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι ορισμένα αλληλόμορφα υψηλού κινδύνου ανακαλύφθηκε χρησιμοποιώντας γονιδιώματος σε επίπεδο μελέτες συσχετισμού παράγουν φαινοτυπικά αποτελέσματα με πιθανή κλινική χρησιμότητα. Παρέχουμε τον πρώτο κρίκο μεταξύ μιας χαμηλής πολυμορφισμό διεισδυτικότητα για τον καρκίνο του προστάτη και μια πιθανή δοκιμή σε ανθρώπινο ιστό και τα σωματικά υγρά. Υπάρχουν δυνατότητες για την ανάπτυξη των ιστών και των ουροφόρων MSMB για ένα βιοδείκτη του κινδύνου καρκίνου του προστάτη, τη διάγνωση και την παρακολούθηση της νόσου

Παράθεση:. Whitaker HC, Kote-Jarai Ζ, Ross-Adams Η, Warren AY, Burge J, Γιώργος Α, et al. (2010) Η rs10993994 αλληλόμορφο κινδύνου για καρκίνο του προστάτη Αποτελέσματα σε κλινικά σχετικές αλλαγές στις Microseminoprotein-Beta Έκφραση σε ιστούς και ούρα. PLoS ONE 5 (10): e13363. doi: 10.1371 /journal.pone.0013363

Συντάκτης: Andrew Vickers, Memorial Sloan-Kettering,, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 του Ιουνίου, 2010? Δεκτές: 1 Σεπτεμβρίου 2010? Δημοσιεύθηκε: 13 Οκτωβρίου, 2010

Copyright: © 2010 Whitaker et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς θα ήθελα να αναγνωρίσω τη στήριξη του Πανεπιστημίου του Cambridge, Cancer Research UK (κωδικοί επιχορήγηση C522 /A8072 και C5047 /A8385), το Ινστιτούτο Έρευνας για τον Καρκίνο, το Everyman Campaign, Η δέσμη πρωτοβουλιών της ΕΕ ΠΠ7 Promark και Hutchison Whampoa Limited και Η του προστάτη Ίδρυμα Έρευνας για τον Καρκίνο. Οι συγγραφείς θα ήθελαν να αναγνωρίσουμε την υποστήριξη του Εθνικού Ινστιτούτου Ερευνών Υγείας, η οποία χρηματοδοτεί το Cambridge Βιο-ιατρική Κέντρου Ερευνών, Cambridge, UK, το Bio-ιατρικό Κέντρο Ερευνών στο Ινστιτούτο Έρευνας για τον Καρκίνο και η Royal Marsden NHS Foundation Trust και της Βιοϊατρικής Κέντρο Ερευνών της Κεντρικής Μάντσεστερ Foundation Trust. Οι συγγραφείς θα ήθελαν επίσης να αναγνωρίσουμε την υποστήριξη του National Cancer Research Καρκίνος του προστάτη: Μηχανισμοί της εξέλιξης και θεραπεία (ΑΜΕΣΗ) συνεργατική (κωδικός επιχορήγηση G0500966 /75466), η οποία έχει χρηματοδοτήσει συλλογές ιστού και ούρων στο Cambridge. Οι συγγραφείς θα ήθελαν επίσης να αναγνωρίσουμε την υποστήριξη του καρκίνου Συμβουλίων της Βικτόρια και Νότια Αυστραλία, τον προστάτη Ίδρυμα Καρκίνου της Αυστραλίας, της βικτωριανής Οργανισμού Καρκίνου, ο Jack και η Τζούντι Baker για την υποστήριξή τους στο Σύστημα Πανεπιστήμιο NORTHSHORE Υγείας και το Ronald και η Ρίτα Ίδρυμα McAulay η οποία υποστηρίζει τη συλλογή μελέτη IMPACT. Douglas Easton είναι μια Principal Research Fellow του Cancer Research UK. Hans Lilja χρηματοδοτείται από τις [αριθμούς επιχορήγηση R33-CA127768-02] Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου? Σουηδική Εταιρεία Καρκίνου [3455]? και Σουηδικό Συμβούλιο Έρευνας (Ιατρική) [20095]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Δρ. Hans Lilja κατέχει διπλώματα ευρεσιτεχνίας για το ελεύθερο PSA και hK2 δοκιμασίες. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Microseminoprotein-βήτα (MSMB) είναι η δεύτερο πιο άφθονο πρωτεΐνη που βρίσκεται στο σπέρμα μετά ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) [1]. Σε αντίθεση με το PSA, MSMB δεν ρυθμίζεται άμεσα από τα ανδρογόνα και το επίπεδο της δεν επηρεάζεται από τη χειραγώγηση ορμόνη [2], [3], [4]. Προστάτη ειδικότητα της έκφρασης MSMB αρχικά αποδείχθηκε σε τρωκτικά [5], [6] και υποστηρίζεται από την ανάπτυξη ενός μοντέλου ποντικού προστάτη που χρησιμοποίησε το

msmb

υποκινητή /ενισχυτή περιοχής που στοχεύουν σε συγκεκριμένα έκφραση του προστάτη [7], [8]. Ωστόσο μελέτες σε ανθρώπους δείχνουν MSMB μπορεί να εκφραστεί σε μια σειρά εκκρίσεως και βλεννογόνους ιστούς, αν και σε πολύ χαμηλότερα επίπεδα από ό, τι του προστάτη [9], [10], [11], [12], [13], [14].

Δύο γονιδίωμα μελέτες ευρεία ένωση (GWAS) έχουν εντοπίσει μια ετικέτα μικρό νουκλεοτιδίων πολυμορφισμός (SNP), rs10993994, στο 10q που συνδέεται στενά με αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη [15], [16]. Αυτό SNP είναι στην 5 ‘UTR του

MSMB

. Το αλληλόμορφο κινδύνου είναι κοινή, με συχνότητα ~30-40% σε Ευρωπαίους και 70-80% στους άνδρες της αφρικανικής καταγωγής, και προσδίδει αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του προστάτη 1,3 (αναλογία ανά πιθανότητες αλληλόμορφο). Η ένωση αυτή παρατηρείται και στις δύο Ευρωπαίοι και οι Αφρο-Αμερικανοί και φαίνεται να είναι ανεξάρτητη από την ηλικία της διάγνωσης και της ποιότητας του όγκου [17]. χαρτογράφηση πρόστιμο κλίμακα δεν έχει εντοπιστεί κανένα άλλο ανεξάρτητα συνδέονται παραλλαγές στην περιοχή. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη σε κυτταρικές σειρές έχει δείξει ότι το αλληλόμορφο κινδύνου (Τ) μείωσε σημαντικά την δραστηριότητα προαγωγέα του γονιδίου στο 13% εκείνης στον αλληλόμορφο χαμηλού κινδύνου (C) [18]. Δεδομένου ότι αυτό το SNP βρίσκεται μέσα στο

MSMB

δραστηριότητα μειώνεται προαγωγού περιοχή εγγύς υποκινητή προτείνεται να συμβεί μέσω θέσεις δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής αλλαγμένη όπως CREB [19]. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν έντονα ότι η rs10993994 Τ αλληλόμορφο αιτιολογικά σχετίζεται με τον κίνδυνο καρκίνου του προστάτη, και ότι αυτή η σύνδεση μπορεί να διευκολύνεται από μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης MSMB σε καλοήθη ιστό προστάτη. Έχει αναφερθεί ότι

MSMB

mRNA σε κυτταρικές γραμμές ήταν μειωμένη σε κύτταρα ομόζυγα για το αλληλόμορφο κινδύνου, το οποίο προτείνει μια υπόθεση σύμφωνα με την οποία μειώνεται η έκφραση MSMB σε άτομα με το αλληλόμορφο κινδύνου rs10993994 μπορούσε να οδηγήσει σε μειωμένη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης και αυξημένος κίνδυνος ογκογένεση [19].

Αρκετές ομάδες έχουν μελετήσει την έκφραση MSMB στον καρκίνο του προστάτη και όλες έχουν βρει υψηλότερα επίπεδα MSMB σε καλοήθη και φυσιολογικό ιστό ή στον ορό, σε σύγκριση με το υλικό από όγκους [2], [ ,,,0],3], [4], [12], [20], [21], [22], [23]. Μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν μελέτες που έχουν ολοκληρωθεί στα ούρα. Υψηλά επίπεδα MSMB σε καλοήθη ιστό είναι συνεπές με την υπόθεση ότι MSMB προσδένεται σε υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας και ρυθμίζει την ανάπτυξη του προστάτη με τον έλεγχο της απόπτωσης ενδεχομένως μέσω της ΜΑΡ κινάσης /ΑΚΤ σηματοδότηση [24], [25], [26].

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή στερεό αρσενικό καρκίνος στο Ηνωμένο Βασίλειο. Επί του παρόντος, το καλύτερο διαγνωστικό εργαλείο είναι το PSA στον ορό, ενώ το mRNA του ουροποιητικού PCA3 χρησιμοποιείται επίσης ως ένα χρήσιμο διαγνωστικό τεστ κυρίως για τους άνδρες με αυξημένο PSA και μια αρχική αρνητική βιοψία [27]. Ωστόσο, η ανάγκη για μια δακτυλική εξέταση πριν από τη δοκιμή αποκλείει τη χρήση του ως εργαλείο διαλογής. Ακράτεια PSA έχει αναφερθεί ως ένα εν δυνάμει χρήσιμο διαγνωστικό εργαλείο σε άνδρες με PSA ορού 2,5-10 ng /ml και είναι ιδιαίτερου ενδιαφέροντος στον έλεγχο και την παρακολούθηση της νόσου, καθώς είναι πιο αποδεκτή από τους ασθενείς. [28].

έχουμε χρησιμοποιήσει ανοσοϊστοχημικές μελέτες MSMB σε καλοήθη ιστό του προστάτη για να αποδείξουν μια σχέση μεταξύ της έκφρασης της πρωτεΐνης MSMB και το γονότυπο rs10993994. Έχουμε αναπτύξει μια ουρολογική ανάλυση ELISA για να εξετάσει τη σχέση μεταξύ του ουροποιητικού PSA, τα επίπεδα MSMB και MSMB γονότυπο για να προσδιοριστεί αν αυτό έχει τη δυνατότητα για κλινική χρήση ως διαλογής ή διαγνωστικό εργαλείο.

Υλικά και Μέθοδοι

ηθική Δήλωση

Πλήρης δεοντολογική έγκριση ελήφθη για όλες τις συλλογές ανθρώπινου δείγματος είτε από το Multi-Κέντρο Επιτροπής Δεοντολογίας West Midlands Research ή το Multi-Κέντρο Επιτροπής Δεοντολογίας Έρευνας Trent. Όλα τα δείγματα που λαμβάνονται με γραπτή συναίνεση και να αναλυθούν ανώνυμα.

ομάδες των ασθενών

ιστών, του αίματος και ούρων δείγματα από ασθενείς με διαγνωσμένο καρκίνο του προστάτη ελήφθησαν από το νοσοκομείο Addenbrooke, το Cambridge, UK (ριζικές προστατεκτομές συλλέγονται μεταξύ 2001 και 2008) και το Ινστιτούτο Έρευνας για τον Καρκίνο (βιοψία και trans-ουρήθρας προστατεκτομών συλλέγονται 1995 – 2002). Κανονική /καλοήθης ασθενείς είχαν προσληφθεί ως μέρος της μελέτης των επιπτώσεων, μια μελέτη του κινδύνου καρκίνου του προστάτη σε άνδρες με

BRCA1 /2

μεταλλάξεις βλαστικής σειράς στο Ινστιτούτο Έρευνας για τον Καρκίνο (05 /MRE07 /25) [29]. Αυτή η ομάδα δεν είχε ιστορικό της ασθένειας του προστάτη και περιελάμβανε άνδρες με μεταλλαγμένες και άγριου τύπου (έλεγχος)

BRCA1

και

BRCA2

. Διάμεση ηλικία, τα PSA και Gleason βαθμολογίες των κλάσεων που χρησιμοποιούνται δίνονται στο Σχήμα S1.

Δεν είναι όλοι οι ασθενείς είχαν καλή ποιότητα ιστού για IHC, DNA για προσδιορισμό του γονότυπου, μετρήσεις του PSA στον ορό και στα ούρα διαθέσιμα. Για να ξεπεραστεί αυτό, οι ασθενείς χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες για να απαντήσει σε συγκεκριμένες ερωτήσεις. 168 ασθενείς με καλή ποιότητα ιστού χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη IHC που απεικονίζεται στο Σχήμα 1. Τα δείγματα από 133 από τους ασθενείς έγιναν σε μια μικροσυστοιχία ιστού (ΤΜΑ) που περιέχει πολλαπλούς πυρήνες από φυσιολογικούς /καλοήθεις περιοχές (& gt? 3), προστατική ενδο-επιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ) και τουλάχιστον δύο διακριτές περιοχές του όγκου για κάθε ασθενή. Οι υπόλοιπες περιπτώσεις ήταν μέρος μιας επιπλέον ΤΜΑ των νεαρών ασθενών εμφάνισης καρκίνου του προστάτη (που ορίζεται ως διαγνωστεί σε ≤60 ετών) από τη Μελέτη του Καρκίνου του Ηνωμένου Βασιλείου Γενετική του προστάτη. Αυτό TMA περιλαμβάνονται πολλαπλές κανονικές /καλοήθεις και του όγκου των περιφερειών για 35 ασθενείς. n = δηλώνει τον αριθμό των συμβάντων και όχι ο αριθμός των πυρήνων που εξετάστηκαν δηλαδή όπου ετερογενή παθολογία βρέθηκε δύο περιοχές βαθμολογήθηκαν ανεξάρτητα.

MSMB ανοσοϊστοχημεία έγινε σε TMAs χρησιμοποιώντας ένα Autostainer BondMax. Για όλα τα τμήματα οι πυρήνες εμφανίζονται σε μπλε και MSMB χρώση σε καφέ. (Α) MSMB δεν ήταν παρούσα στο ουροθήλιο (αριστερό πάνελ), μαύρο βέλος – ουροδόχου κύστης, λευκό βέλος – προστάτη, των σπερματοδόχων κυστιδίων (κεντρικό πάνελ), μαύρο βέλος – σπερματοδόχο κύστη, λευκό βέλος – προστάτη, της ουροδόχου κύστης (δεξιά πλευρά), το μαύρο βέλος – λιπώδη κύτταρα, λευκό βέλος – muscularis κύστης propria. (Β) χρώση MSMB στον προστάτη είναι ειδική για καλοήθεις αδένες (λευκά βέλη) και όχι κύτταρα όγκου προστάτη (Gleason 3) (μαύρα βέλη). MSMB παρέλειψε επίσης να λεκιάσει ατροφική καλοήθεις αδένες. Παραδείγματα των κριτηρίων χρώσης (κανένας /αδύναμα, μέτρια και ισχυρή) εφαρμόζεται στην ανοσοϊστοχημεία. Αποτελέσματα της χρώσης ήταν πολύ σημαντική, όπως υπολογίζεται χρησιμοποιώντας μία δοκιμή Kruskal-Wallis. το η παριστά τον αριθμό των παθολογικά γεγονότα σημειωθούν.

Η

Μόνο 145 ασθενείς είχαν DNA το οποίο θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την γονοτυποποίηση όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β. Πλήρης τμήματα ρίζα του προστάτη ή πολύ μεγάλα τμήματα ιστών ήταν διαθέσιμα από 32 ασθενείς από κοόρτη Addenbrookes.

(Α) Ένα παράδειγμα χρώσης μέγα-μπλοκ μεγάλων τμημάτων του προστάτη που δείχνει ομοιογενές (αριστερό πάνελ) ή ετερογενείς (δεξί πάνελ ) χρώση. MSMB ανοσοϊστοχημεία ήταν σκόραρε όπως και πριν είναι τόσο ισχυρή, μέτρια, αδύναμα ή χάνονται για κάθε ασθενή και κατανεμημένες ανάλογα με τον γονότυπο? T – υψηλού κινδύνου, C- χαμηλού κινδύνου. ρ-τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα τεστ Kruskal-Wallis. το η παριστά τον αριθμό των παθολογικά γεγονότα σημειωθούν.

Η

Για την MSMB ELISA δείχνεται στην εικόνα 3 89 άνδρες με καρκίνο του προστάτη που είχε ιστό, DNA και ένα δείγμα ούρων χρησιμοποιήθηκαν. Οι συνήθεις ασθενείς /καλοήθη είχαν προσληφθεί ως μέρος της μελέτης των επιπτώσεων, μια μελέτη του κινδύνου καρκίνου του προστάτη σε άνδρες με

BRCA1 /2

μεταλλάξεις βλαστικής σειράς (n = 215). Όλα τα δείγματα ούρων λήφθηκαν πριν από οποιαδήποτε δακτυλική εξέταση, κλασματοποιήθηκαν και καταψύχθηκαν αμέσως στους -80 ° C. Όπου διατίθενται η ηλικία, το PSA και το σκορ Gleason κατά τη διάγνωση προσδιορίστηκε για κάθε ασθενή.

Ακράτεια συγκεντρώσεις MSMB και PSA προσδιορίστηκαν και ομαλοποιήθηκε ως προς κρεατινίνη. (Α) του ουροποιητικού MSMB προσδιορίστηκε με ELISA για την κανονική /καλοήθης ομάδα των ασθενών και μια μικρότερη ομάδα με τη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη. Η ίδια ομάδα ελέγχθηκε επίσης για την ακράτεια PSA και PSA ορού τιμές συγκεντρώνονται. καμπύλες ROC παρήχθησαν? AUC = εμβαδόν υπό την καμπύλη, τα διαστήματα εμπιστοσύνης αναφέρονται εντός παρενθέσεων και ρ τιμές δίνονται σε επίπεδα εμπιστοσύνης 95%. Η διαφορά μεταξύ του ουροποιητικού MSMB και PSA ROC καμπύλες p = 0,0021. Η διαφορά μεταξύ της ουροδόχου MSMB και της κλάσης του όγκου περαιτέρω στρωματοποιημένη ανά βαθμολογία άθροισμα Gleason (Β). Ακράτεια MSMB και PSA από χαμηλή δείγματα Gleason (6 και 7) συγκρίθηκαν με υψηλή Gleason (8 και 9) δείγματα και οι καμπύλες ROC που δημιουργούνται και εμφανίζονται όπως πριν. Ακράτεια MSMB επίσης κατανεμημένες ανάλογα με το αλληλόμορφο κινδύνου rs10993994 (C). n = ο αριθμός των ατόμων που εξετάστηκαν σε κάθε ομάδα.

Η

Γονοτυπικές

Γονοτυπικές ολοκληρώθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. DNA εκχυλίστηκε από πλήρες αίμα για τη σειρά 2 και 3, είτε εμπορικώς με GeneProbe ή με Qia-amp® DNA Mini Kit (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Γονοτυπικός των δειγμάτων διεξήχθη με 5’exonuclease δοκιμασίας (Taqman ™) χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας ΑΒΙ Prism 7900HT σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εκκινητές και ανιχνευτές που παρέχονται άμεσα από την Applied Biosystems, όπως Αναλύσεις-By-Σχεδιασμός ™.

Η ανοσοϊστοχημεία

Όλα ανοσοϊστοχημεία (IHC) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός αυτοματοποιημένου Bondmax χρώσης και αντι-MSMB αντίσωμα (Abcam) (1:400) επί του ιστού από τη σειρά 1 και 2. για την πολυ-κανονική συστοιχία /όγκων α 48 πυρήνας TMA από Stretton Scientific χρησιμοποιήθηκε. Πυρήνες με αιματοξυλίνη και διαφάνειες απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα σάρωσης Aperio. Παθολογία επιβεβαιώθηκε από ειδικό uro-παθολόγο (AW) πριν από την βαθμολόγηση κάθε ανοσοϊστοχημική χρώση. Η βαθμολόγηση έγινε από δύο παρατηρητές, ένας από τους οποίους ήταν ένα uro-παθολόγο (AW), και μια συναίνεση που επιτεύχθηκε. Διαδοχική αιματοξυλίνη και ηωσίνη τομές χρωματίστηκαν χρησιμοποιήθηκαν για να επιβεβαιώσουν παθολογία. Χρώση βαθμολογήθηκε ως? «Κανένα» – καμία χρώση, «ασθενή» – δεν είναι όλα τα επιθηλιακά κύτταρα βάφονται και χλωμό χρώση, «μέτρια» – τα περισσότερα ή όλα τα επιθηλιακά κύτταρα βάφονται μέτρια, «ισχυρή» – όλα τα επιθηλιακά κύτταρα βάφονται έντονα (Εικόνα 1Β). Όταν τα τμήματα που περιέχονται ετερογενή χρώση μια γενική συναίνεση επιτεύχθηκε με βάση τις σχετικές αναλογίες των διαφόρων βαθμολογιών. Όπου ετερογενή παθολογία υπήρχε μέσα πυρήνες π.χ. καλοήθης όγκος και περιοχές side-by-side, κάθε περιοχή βαθμολογήθηκε ως χωριστό συμβάν. n = δηλώνει τον αριθμό των συμβάντων και όχι τον αριθμό των πυρήνων που εξετάστηκαν

PSA και MSMB μετρήσεις

ορού και των ούρων PSA (Free & amp? Total). & amp? δοκιμασίες κρεατινίνης πραγματοποιήθηκαν από το Κέντρο Ερευνών Πυρήνα Βιοχημείας Εργαστήριο Δοκιμασία NIHR Cambridge Βιοϊατρικής, το Νοσοκομείο Addenbrookes χρησιμοποιώντας το κιτ ProStratus Free /Total PSA DELFIA (Perkin Elmer Life & amp? Αναλυτική Επιστημών) και αναλυτή Διάσταση RXL (Τομέα Υγείας της Siemens). Για την MSMB ELISA όλες οι διαδικασίες διεξήχθησαν με ανακίνηση σε θερμοκρασία δωματίου. Τα φρεάτια πλύθηκαν μεταξύ κάθε σταδίου τρεις φορές με 0.05% PBS-Tween και platewasher BioTek Elx50. Ενενήντα-έξι κυψελίδων πλάκες (Fisher Scientific) επικαλύφθηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε αντι-PSP94 αντίσωμα ποντικού (1:1000, Abcam) αραιωμένο σε PBS. Τα φρεάτια αποκλείστηκαν με 1% BSA (Sigma) για 1 ώρα πριν από 50 μΐ δείγματος ή προτύπου προσετέθησαν σε έκαστο φρεάτιο εις διπλούν και επωάστηκαν για άλλες 2 ώρες. Διαδοχικές αραιώσεις (25 έως 0,78 μg /ul) ανασυνδυασμένης PSP94 (rPSP94, R &? D Systems) χρησιμοποιήθηκαν ως ένας έλεγχος σε κάθε πλάκα. Goat anti-MSMB (R &? Συστήματα D 0.2 μg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για 1 ώρα που ακολουθείται από α1 ώρες επώαση με γαϊδάρου αντι-κατσίκας-HRP (Abcam, 1:20,000). Για την οπτικοποίηση 100 μΐ ΤΜΒ (Sigma) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για 15 λεπτά. Η αντίδραση σταμάτησε με οξίνιση με 50 μΐ HCl και μετράται η απορρόφηση στα 450 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο Lucy II.

Το δυναμικό εύρος της ELISA προσδιορίστηκε να είναι 0,01-100 μg /ml, ενώ η μη γραμμική περιοχή ήταν πολύ μεγαλύτερη. Κάθε πλάκα εκθεσιακό & gt? 20% μεταβλητότητα στην τυπική καμπύλη θεωρείται ότι έχει αποτύχει και να επαναλαμβάνονται. Ενδο- και δια-δοκιμασίας διακύμανσης ήταν 8,8% και 22% αντίστοιχα. Επιδράσεις σε σταθερότητα πρωτεΐνης αποδείχθηκε ότι είναι & lt? 20% μετά από τη δοκιμή με κατάψυξη απόψυξη 3 φορές πριν από τον προσδιορισμό ή την επώαση προ-αραιωμένο rPSP94 -3 για 4 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τον προσδιορισμό. Ανάκαμψη από διαφορετικά ρευστά προσδιορίσθηκε να είναι & lt? 20% με αραίωση rPRDX-3 είτε σε PBS, 0,1% αλβουμίνη βόειου ορού (Sigma) ή 10% ορό κατσίκας (Dako Cytomation). συγκέντρωση MSMB προσδιορίστηκε με παρεμβολή τιμών από μη-γραμμική παλινδρόμηση της σιγμοειδούς καμπύλης αναφοράς. Η συγκέντρωση όλων των δειγμάτων ούρων ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κρεατινίνη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας κρεατινίνης (R &? D Systems) και η κλίση της πρότυπης καμπύλης προσδιορίζεται με γνωστά πρότυπα (20 έως 0,3125 mg /dL) και η γραμμική παλινδρόμηση. Μόνο τα δείγματα τα οποία θα μπορούσαν να παρεμβληθούν από τις πρότυπες καμπύλες χωρίς παρέκταση συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση.

Στατιστικές Μέθοδοι

Όλες οι στατιστικές συμπεριλαμβανομένων γραμμικής παλινδρόμησης και παρεμβολή για την δοκιμασία ELISA πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism 5. για τη σύγκριση ευαισθησίας και ειδικότητας των μετρήσεων στην κοόρτη όγκου σε σύγκριση με τον καλοήθη κοόρτη καμπύλες δέκτη-χειριστή (ROC) διεξήχθησαν. A 1-way ANOVA test με διόρθωση Kruskal-Wallis χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί εάν τα επίπεδα των ιστών ή του ουροποιητικού MSMB ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των καλοήθων και καρκινικών ομάδες, όταν η ομάδα του όγκου ήταν κατανεμημένες ανάλογα με Gleason βαθμό ή γονότυπο. Ένα Mann Whitney δίπλευρη Student t-test χρησιμοποιήθηκε για όλες τις συγκρίσεις κατά ζεύγη. Για όλα τα πειράματα η p-τιμή των 0,05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

Εκτός από το καλοήθη προστάτη κανονικές ή όγκων ιστούς απέδειξε καμία χρώση MSMB γεγονός που υποδηλώνει ότι στο επίπεδο της πρωτεΐνης στο MSMB ιστού είναι άκρως ειδικού προστατικού (Σχήμα 1Α και το Σχήμα S2). Ειδικότερα, οι ιστοί που περιβάλλουν τον προστάτη π.χ. ουροδόχου κύστης, των σπερματοδόχων κύστεων και του μυϊκού κύστης στρώμα propria δεν έδειξε καμία χρώση, ενώ δίπλα καλοήθεις αδένες του προστάτη ήταν βαριά βάφονται (Εικόνα 1Α).

Σύμφωνα με προηγούμενες εκθέσεις καλοήθεις αδένες του προστάτη έδειξε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα της χρώσης σε σύγκριση με το ογκογόνο περιοχές μας κοόρτη (ρ & lt? 0,0001, Σχήμα 1Β και το Σχήμα S1) [2], [3], [4], [12], [20], [21], [22], [23]. χρώση MSMB χάθηκε επίσης σταθερά στην προστατική ενδο-επιθηλιακή νεοπλασία (PIN) σε σύγκριση με καλοήθη ιστό (p & lt? 0,0001) υποδεικνύοντας ότι μπορεί να είναι ένα πρώιμο, αιτιώδης, εκδήλωση στην ογκογένεση. Η χρώση για MSMB σε καλοήθη ιστό κυμαίνονταν από ομογενή, που πιο συχνά εμφανίζονται με έντονη χρώση (Σχήμα 2Α, αριστερό πάνελ) και μεταβλητή, ετερογενή χρώση συχνά δει με αδύναμο και μέτρια χρώση (Σχήμα 2Α, δεξί πάνελ).

χρώση MSMB στον ιστό συσχετίστηκε σημαντικά με το γονότυπο rs10993994 (p & lt? 0,0001), χρώση είναι πιο αδύναμος σε άνδρες ομόζυγο για το αλληλόμορφο υψηλού κινδύνου (ΤΤ) και ισχυρότερη σε ομοζυγώτες CC (Εικόνα 2Β). Δεν υπήρξε καμία ένδειξη ότι υπάρχει συσχετισμός μεταξύ χρώση MSMB και την ηλικία ή PSA κατά τη διάγνωση σε αυτήν την κακοήθη σειρά των ανδρών (Σχήμα S3).

Εμείς καθορίζεται ουροποιητικού επίπεδα MSMB σε 215 κανονικές /καλοήθη άνδρες χωρίς ιστορικό του προστάτη ασθένεια και 89 άνδρες με καρκίνο του προστάτη (Σχήμα S4). Σύμφωνα με την ένωση στον ιστό του προστάτη υπήρχε σημαντική μείωση στην ουρική MSMB σε άνδρες με όγκους σε σύγκριση με τους άνδρες που δεν είχαν ιστορικό της ασθένειας του προστάτη (Στήριξη 4Α Έγγραφο) (p & lt? 0,0001). Ακράτεια MSMB σημαντικά βελτιωμένη κατά την ουρική PSA, αλλά όχι PSA ορού, για τη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη σε αυτή την ομάδα (διαφορά μεταξύ του ουροποιητικού MSMB και τις καμπύλες ROC PSA 0,21, 95% CI: 0.075, 0.34, ρ = 0.0021) (Σχήμα 3Α). Όταν τα δείγματα όγκου στρωματοποιήθηκαν σε χαμηλό (6 και 7) και υψηλή (8 και 9) άθροισμα Gleason βαθμολογίες ουροποιητικού MSMB καταδειχθεί υψηλά επίπεδα ειδικότητας και ευαισθησίας ιδιαίτερα όταν συγκρίνεται με ουρική PSA (Εικόνα 3Β). Υπήρξε μια σημαντική μείωση στην ουρική MSMB με το αλληλόμορφο υψηλού κινδύνου σε σύγκριση (ΤΤ) με το αλληλόμορφο χαμηλού κινδύνου (CC) (Σχήμα 3C) (p = 0,0319), αν και αυτό δεν αντικατοπτρίζεται σε μια σημαντική διαφορά στις καμπύλες ROC. Αυξημένος καλοήθεις ουροποιητικού MSMB είναι απίθανο να αντανακλά μια αυξημένη καλοήθη όγκο του προστάτη καθώς δεν υπήρχε σημαντική αύξηση στην ουρική MSMB με την ηλικία (Στήριξη Έγγραφο 4Β) (p = 0,543). Για να αποδειχθεί ότι ο συσχετισμός ήταν ειδική για το γονότυπο rs10993994 συγκρίναμε ουροποιητικού επίπεδα MSMB και την κατάσταση μετάλλαξης BRCA1 και BRCA2 βλαστικής σειράς, τα οποία είναι γνωστοί παράγοντες κινδύνου καρκίνου του προστάτη [30], [31], και δεν βρήκε κανένα σύνδεσμο (σχήμα S4).

Συζήτηση

Αυτή είναι η πρώτη μελέτη για να περιγράψει τη σχέση μεταξύ του αλληλόμορφου κίνδυνο της rs10993994 SNP tag και τα επίπεδα MSMB σε καλοήθεις και του όγκου του ιστού του προστάτη και να συσχετίζουν το επίπεδο της πρωτεΐνης με γονότυπο και την επιθετικότητα του προστάτη Καρκίνος. Η σχεδόν πλήρης απώλεια της MSMB το PIN (Εικόνα 1Β) υποδηλώνει ότι η μειωμένη MSMB είναι ένα πρώιμο γεγονός στην ογκογένεσης συνάδει με συσχέτιση μεταξύ του κινδύνου καρκίνου του προστάτη και τον γονότυπο rs10993994.

Υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις που συνδέουν το SNP rs10993994 στην η

MSMB

περιοχής υποκινητή σε αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη [15], [16]. MSMB έχει μελετηθεί από μεγάλο αριθμό ομάδων ως υποθετικό προστάτη βιοδείκτη καρκίνο επειδή τα επίπεδα σε ιστό και ορό μειώνεται ή χάνεται με την ανάπτυξη του καρκίνου [2], [3], [4], [12], [20], [ ,,,0],21], [22], [23] (Εικόνα 1Β). Έχουμε επιβεβαιώσει αυτά τα ευρήματα και επίσης ότι MSMB είναι σε μεγάλο βαθμό ειδικό προστατικό στο πρωτεϊνικό επίπεδο σε ιστό (Σχήμα 1Α και το Σχήμα S2). Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι από τη στιγμή που ανέπτυξαν όγκους του προστάτη rs10993994 έχει μικρή επίδραση στην εξέλιξη της νόσου υποδεικνύοντας ότι οποιαδήποτε αύξηση του κινδύνου επηρεάζει την καλοήθη αδένα και την αρχική ανάπτυξη του όγκου [17]. Αυτό είναι σύμφωνο με την απώλεια του MSMB που έχουμε σημειώνεται στην ΡΙΝ, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μειωμένη ή χάνονται έκφραση MSMB σε καλοήθη προστάτη απαιτείται για κακοήθη μετασχηματισμό. Η σχέση μεταξύ του αλληλόμορφου κινδύνου MSMB και έκφραση σε ιστό ήταν πολύ σημαντική (ρ & lt? 0.0001) (Σχήμα 2Β). Εκφωνημένες ετερογένεια παρατηρήθηκε επίσης σε ιστό με μέτρια έως χαμηλή έκφραση συνηθέστερα συνδέονται με το αλληλόμορφο ΤΤ (Σχήμα 2Α).

Αρκετές ομάδες έχουν εξετάσει τα επίπεδα στον ορό MSMB αποδεικνύοντας προγνωστική αξία μετά από ριζική προστατεκτομή [3], [32 ]. Συνεπής με την απώλεια της MSMB σε ογκογόνο αδένες (Σχήμα 1Β) έχουμε καταδείξει μία πολύ σημαντική απώλεια MSMB στα ούρα από ασθενείς με τόσο χαμηλές και υψηλές Gleason καρκίνος προστάτη βαθμού σε σύγκριση με εκείνους χωρίς γνωστή ασθένεια του προστάτη (Σχήμα 3Α). Αυτά τα αποτελέσματα συγκρίνονται ευνοϊκά με ουρική PSA το οποίο έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι έχει πιθανή κλινική χρησιμότητα σε ασθενείς με PSA 4-10 ng /ml [28] του ορού. Ακράτεια MSMB δεν ήταν τόσο ακριβής όπως PSA ορού, την τρέχουσα χρυσό πρότυπο τεστ για τη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη (AUC 0,97 για την PSA ορού και 0,77 για την ακράτεια MSMB. Ωστόσο, ομάδες μας δεν αντιπροσωπεύει την ψευδή θετικά και τα αρνητικά δει όταν το PSA χρησιμοποιείται για προσυμπτωματικού ελέγχου του πληθυσμού που υποδηλώνει μια λιγότερο προκατειλημμένη ομάδα θα πρέπει να δοκιμαστεί καθοριστεί το πραγματικό όφελος του ουροποιητικού MSMB για τον προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου του προστάτη. Αν και είναι ίσως έκπληξη το γεγονός ότι οι αλλαγές αυτές είναι τόσο εύκολα ανιχνεύσιμη δεδομένου του δυνητικά μικρού αριθμού των όγκων αδένες μέσα σε μια κατά τα άλλα καλοήθη προστάτη. Ωστόσο, έχουμε δείξει σχεδόν πλήρης εξειδίκευση του προστάτη για την πρωτεΐνη MSMB που υποδεικνύει ότι είναι απίθανο ότι σημαντικά επίπεδα MSMB προκύπτουν από οποιοδήποτε άλλο ιστό. είναι πιθανό ότι ένα ποσοστό των ανδρών στην κανονική /καλοήθη μελέτη μας (μέση ηλικία 53 ετών) θα έχουν κάποιο βαθμό της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη (ΚΥΠ) αλλά σημείωσε σημαντική αύξηση στην ουρική MSMB με την αύξηση της ηλικίας γεγονός που υποδηλώνει ότι η αύξηση του όγκου του προστάτη έχει μικρή επίδραση στο ουροποιητικό MSMB (Σχήμα S4).

Ακράτεια διαφορές στην MSMB με το αλληλόμορφο κινδύνου ήταν σημαντικές αλλά όχι επαρκώς διακρίσεις σχετικά μικρή ομάδα μας. Οι αλλαγές ήταν ανεξάρτητες από άλλους καθιερωμένους παράγοντες γενετικού κινδύνου, όπως

BRCA1

και

BRCA2

μετάλλαξη (Σχήμα S4). Αυξημένη ευαισθησία του προσδιορισμού και δοκιμή ενός εκπροσώπου του πληθυσμού με βάση κοόρτης σε σύγκριση με το PSA είναι πιο πιθανό να επιδείξουν οποιαδήποτε πραγματική κλινική σημασία για τη χρήση του ουροποιητικού MSMB για την εκτίμηση του κινδύνου και τη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη. Τα ούρα είναι ένα ιδιαίτερα αποδεκτός βιολογικός μέτρο για τους ασθενείς και τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι MSMB είναι ένας πιθανός στόχος για περαιτέρω διερεύνηση ως ουρική βιοδείκτη για τη διαλογή και τη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη, χωρίς την ανάγκη για μια δακτυλική εξέταση. Σε αντίθεση με την PSA, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα MSMB δεν επηρεάζονται από ορμονοθεραπεία που χρησιμοποιείται συχνά στη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη και πρέπει να καθορίσει εάν MSMB μπορεί να είναι χρήσιμο σε βάρος της νόσου παρακολούθηση σε ασθενείς που υποβάλλονται σε διάφορες μορφές θεραπείας [2], [3] , [4]. MSMB μπορεί επίσης να αποδειχθεί χρήσιμη για την ανίχνευση αυτών των ασθενών με αυξημένο PSA, αλλά αρνητική βιοψία που θα επωφεληθούν από την περαιτέρω έρευνα.

μελετών ποσοτικής RT-PCR των κυτταρικών σειρών έχει προηγουμένως αποδειχθεί η σχέση μεταξύ του αλληλόμορφου rs109939994 Τ και μείωσε MSMB mRNA, πιθανότατα λόγω των διαταραγμένων δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής [19]. Η επίδειξη μιας παρόμοιας σύνδεσης με ουρική MSMB και χρώση MSMB σε καλοήθη ιστό του προστάτη ενισχύει την αιτιολογική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης MSMB και του καρκίνου του προστάτη. Εντός της MSMB προστάτη πιστεύεται ότι ρυθμίζουν την απόπτωση μέσω υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας, την κινάση ΜΑΡ και ΑΚΤ [24], [25]. Υποθέτουμε ότι η μειωμένη έκφραση MSMB σε άνδρες με υψηλή αλληλόμορφο κινδύνου μπορεί να μειώσει κυττάρων του προστάτη απόπτωση και, τελικά, την προώθηση λιγότερο ελεγχόμενη ανάπτυξη του προστάτη. Η απώλεια ενός τόσο σημαντικές ρυθμιστικές μονοπάτι θα μπορούσε να προωθήσει ογκογένεση και να παρέχει μια εξήγηση για τον αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη, ενώ έχει μικρή επίδραση στην έκβαση μια φορά έχει αναπτύξει καρκίνο [17].

Τα ευρήματά μας αυξάνουν την πιθανότητα ότι η ακράτεια MSMB που σχετίζονται με γονότυπο μπορεί να είναι ένα χρήσιμο βιοδείκτη για τη διαλογή για τον κίνδυνο και την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη. Αυτό πρέπει να μελετηθεί περαιτέρω να στοχεύουν τους άνδρες που διατρέχουν αυξημένο κίνδυνο για αυξημένη επιτήρηση και την έγκαιρη παρέμβαση και εντοπισμό των ανδρών με καρκίνο του προστάτη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

(Α) Συνολικά 168 ασθενείς με όγκο μελετήθηκαν, αλλά δεν είναι κάθε ασθενής είχε ιστό, το DNA και τα ούρα διαθέσιμα. Από την κοόρτη 168 είχε ιστού η οποία περιελάμβανε καλοήθης η οποία χρησιμοποιήθηκε στο Σχήμα 1. 145 ασθενείς είχαν ιστού και DNA και περιλαμβάνονται στο Σχέδιο είχαν 2. 89 ασθενείς επίσης ένα δείγμα ούρων και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την ELISA που φαίνεται στο Σχήμα 3. (Β ) Λεπτομέρειες των καλοηθών και καρκινικών ομάδες που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0013363.s001

(0,73 MB EPS)

Εικόνα S2.

MSMB είναι ειδικό προστατικό σε φυσιολογικών και καρκινικών ιστών. Ένα πολυ-φυσιολογικό ιστό ΤΜΑ χρωματίστηκε για MSMB χρησιμοποιώντας immunohostochemistry και Autostainer Bondmax. Η διάταξη που περιλαμβάνεται πολλαπλούς πυρήνες από τους ακόλουθους ιστούς? δέρματος, του μαστού, του θυρεοειδούς αδένα, του οισοφάγου, των νεφρών, της ουροδόχου κύστης, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του ήπατος, των ωοθηκών, της μήτρας και του στομάχου. Εκπρόσωπος εικόνες από τους όρχεις (σεμίνωμα όγκου), του μαστού και του προστάτη εμφανίζονται. χρώση MSMB είναι καφέ, οι πυρήνες είναι μπλε

doi:. 10.1371 /journal.pone.0013363.s002

(7,19 MB EPS)

Εικόνα S3.

Η συσχέτιση μεταξύ του γονότυπου και την ηλικία /PSA κατά τη διάγνωση και την ανοσοϊστοχημική χρώση και την ηλικία /PSA κατά τη διάγνωση. n = ο αριθμός των ατόμων που εξετάστηκαν σε κάθε ομάδα. p-τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση 1-way ANOVA με διόρθωση Kruskal-Wallis

doi:. 10.1371 /journal.pone.0013363.s003

(1.21 MB EPS)

Εικόνα S4.

(Α) του ουροποιητικού επίπεδα MSMB συγκρίθηκαν με ELISA και ένα 2-tailed t-test. (Β) Η ακράτεια τιμές MSMB αναλύθηκαν σύμφωνα με την ηλικία του ατόμου (έτη) κατά τη στιγμή της συλλογής των δειγμάτων. μετρήσεις (C) PSA για την καλοήθη ομάδα στρωματοποιημένη, ανάλογα με το γονότυπο rs10993994. (D) του ουροποιητικού MSMB δεν αλλάζει με μεταλλάξεις BRCA. Καλοήθης άνδρες σε Cohort 3 γονότυπος για μεταλλάξεις στο BRCA 1 και BRCA 2, το οποίο είναι γνωστό ότι προσδίδουν τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη. BRCA γονότυπο συγκρίθηκε με ουρική MSMB. Ελέγχου – δεν μετάλλαξη, BRCA 1 – μετάλλαξη στο BRCA 1, BRCA 2 -. Μετάλλαξη στο BRCA 2. Για όλες τις γραφικές παραστάσεις n = ο αριθμός των δειγμάτων που αναλύθηκαν και p-τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση 1-way ANOVA με διόρθωση Kruskal-Wallis

doi: 10.1371 /journal.pone.0013363.s004

(2,03 MB EPS)

Ευχαριστίες

θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον Δρ William J. Howat και Παθολογικής Ανατομικής /ISH εγκατάσταση, Cancer Research UK Cambridge Research Institute για τη βοήθεια με την ανοσοϊστοχημεία MSMB. Θα θέλαμε επίσης να ευχαριστήσουμε το Cancer Research UK Cambridge Research Institute Βιοπληροφορική Πυρήνα για στατιστικούς βοήθεια. Είμαστε ευγνώμονες στο Εθνικό Ινστιτούτο Έρευνας Υγείας του Cambridge Βιοϊατρικής Κέντρο Ερευνών Πυρήνας Βιοχημείας Εργαστήριο Δοκιμασία για βοήθεια με τις βιοχημικές αναλύσεις.