Αφηρημένο

επιδερμικού αυξητικού παράγοντα αναστολείς της τυροσινικής κινάσης του υποδοχέα (EGFR-TKIs), συμπεριλαμβανομένων των gefitinib, είναι αποτελεσματικά για τους μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκίνο (NSCLC), οι ασθενείς με

EGFR

μεταλλάξεις. Ωστόσο, αυτοί οι ασθενείς τελικά αναπτύσσουν αντίσταση σε EGFR-ΤΚΙ. Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η συμμετοχή των αυτοφαγία στην αντίσταση gefitinib. Αναπτύξαμε gefitinib-ανθεκτικά κύτταρα (PC-9 /GEF) από το PC-9 κύτταρα (που περιέχουν εξόνιο 19 διαγραφή

EGFR

) μετά από μακροχρόνια έκθεση στο gefitinib. GEF κύτταρα PC-9 /(Β4 και Ε3) ήταν 200 φορές πιο ανθεκτικά στο gefitinib από PC-9 /β κύτταρα. Σε σύγκριση με το PC-9 /β κύτταρα, τόσο PC-9 /κύτταρα gefE3 PC-9 /gefB4 και απέδειξε υψηλότερα βασικά επίπεδα LC3-ΙΙ που είχαν ανασταλεί από 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ, ένας αναστολέας αυτοφαγία) και ενισχύεται από την χλωροκίνη ( CQ, ένας αναστολέας του σχηματισμού autophagolysosomes), δεικνύοντας αυξημένα αυτοφαγία σε PC-9 /GEF κύτταρα. 3-ΜΑ και CQ εξάρτηση από τη συγκέντρωση ανέστειλε κύτταρο επιβίωση τόσο της PC-9wt και PC-9 /GEF κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι η αυτοφαγία μπορεί να είναι προ-επιβίωσης. Επιπλέον, gefitinib αυξημένα επίπεδα LC3-ΙΙ και autolysosome σχηματισμό τόσο PC-9 /β κύτταρα και PC-9 /GEF κύτταρα. Σε PC 9-κύτταρα /κβ, CQ ενίσχυσε την κυτταροτοξικότητα με χαμηλή gefitinib (3ηΜ). Επιπλέον, CQ ξεπέρασε την αποκτήθηκε gefitinib αντίσταση σε PC-9 /GEF κύτταρα ενισχύοντας gefitinib επαγόμενη κυτταροτοξικότητα, η ενεργοποίηση της κασπάσης 3 και πολυ διάσπαση πολυμεράσης (ADP-ριβόζη). Χρησιμοποιώντας μια

in vivo

μοντέλο ξενομεταμόσχευση με PC-9 /β και PC-9 /gefB4 κύτταρα, από του στόματος χορήγηση του gefitinib (50 mg /kg) ανέστειλε πλήρως την ανάπτυξη του όγκου του PC-9 /β αλλά όχι PC -9 /gefB4cells. Συνδυασμός CQ (75 mg /kg, ε.π.) και gefitinib ήταν πιο αποτελεσματική από μόνη της στη μείωση της ανάπτυξης όγκου του PC-9 /gefB4 gefitinib. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η αναστολή της αυτοφαγία μπορεί να είναι μια θεραπευτική στρατηγική για να ξεπεραστεί η επίκτητη αντοχή του gefitinib στο

EGFR

μετάλλαξη ασθενείς με NSCLC

Παράθεση:. Tang MC, Wu ΜΟΥ, Hwang ΜΗ, Chang ΥΤ, Huang HJ, Lin ΑΜ-Y, et al. (2015) χλωροκίνη Ενισχύει Gefitinib κυτταροτοξικότητα σε Gefitinib-ανθεκτική μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 10 (3): e0119135. doi: 10.1371 /journal.pone.0119135

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Jung Weon Lee, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ, Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 1 Μάη του 2014? Αποδεκτές: 26 Γενάρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 25 του Μάρτη του 2015

Copyright: © 2015 Tang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. NSC 101-2314-B-002 -090 -MY3 από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας, Ταϊβάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η αυτοφαγία, που είναι γνωστή ως μια αυτο-τρώει μηχανισμό, χαρακτηρίζεται από de novo σύνθεση διπλής μεμβράνης αυτοφαγοσώματα που απομονώνουν κυτταρικά συστατικά, όπως η υπερβολική ή περιττή πρωτεϊνών και οργανιδίων [1-3]. Σύντηξη των αυτοφαγοσώματα με λυσοσώματα υποβαθμίζει φέρεται κυτοσολικό περιεχόμενο σε βασικά συστατικά για ανακύκλωση. Φυσιολογικά, ένα βασικό επίπεδο της αυτοφαγία είναι ζωτικής σημασίας για την κυτταρική ομοιόσταση. Επιπλέον, αυτοφαγία φέρεται να διεγείρονται για να αντιμετωπίσουν πιέσεις, όπως υποξία, καθώς και θρεπτικά συστατικά στερήσεις και θεωρείται ως μια στρατηγική επιβίωσης [1-3]. Σε αντίθεση, ένας ρόλος προ-θάνατος του autophagy προτείνεται ως προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος τύπου II μέσω υπερ-ενεργοποίηση των αυτο-τρώει [4]. Πράγματι, επαγωγείς αυτοφαγία βρέθηκαν να μειωθεί ο όγκος του όγκου [5-7]. Ωστόσο, η αναστολή της αυτοφαγία φέρεται επάγεται θάνατο των καρκινικών κυττάρων [8-10], υποδηλώνοντας ότι η αυτοφαγία παίζει ρόλο κυτταροπροστατευτική για τα καρκινικά κύτταρα. Προς στήριξη αυτής της έννοιας, η αναστολή αυτοφαγία από 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ), χλωροκίνη (CQ, ένα lysosomotropic παράγοντας για την αναστολή autophagolysosome σχηματισμό) και αυτοφαγία (ATG)-σχετικών γονιδίων 5 αποσιώπηση βρέθηκε να αυξάνουν τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα από χημειοθεραπείες και θεραπεία με στόχο [11-16]. Κατά συνέπεια, αυτοφαγία καθίσταται πιθανός στόχος για τις θεραπείες του καρκίνου.

Η αντοχή στα φάρμακα υπήρξε το επίκεντρο του ενδιαφέροντος στη μελέτη της θεραπείας του καρκίνου. Πολλές γραμμές αποδείξεως έχουν προτείνει την εμπλοκή των αυτοφαγία στην αντοχή σε φάρμακα, τόσο έμφυτη αντίσταση στο φάρμακο και επίκτητη αντίσταση φαρμάκου. Για παράδειγμα, CQ έχει δειχθεί να ξεπεράσει την πρωτογενή αντοχή των αναστολέων της κινάσης τυροσίνης υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) (ΤΚΙδ) σε Α549 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα [16] και trastuzumab σε HER-2 θετικό καρκίνο του μαστού [17]. Αρκετές

in vitro

μελέτες έχουν αποδείξει ότι CQ και βαφιλομυκίνης Α1 αποκαταστήσει την ευαισθησία να crizotinib και trastuzumab σε αποκτήθηκαν ανθεκτικά κύτταρα, αντίστοιχα [18-19]. Περαιτέρω, 3-ΜΑ βρέθηκε ότι ενισχύει την κυτταροτοξική δράση της σισπλατίνης σε σισπλατίνη ανθεκτικά κύτταρα [20], υποδεικνύοντας ότι η αναστολή της αυτοφαγία φαίνεται να είναι ένας θεραπευτικός στόχος για επίκτητη αντίσταση φαρμάκου.

Μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκίνου (NSCLC) είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου στον κόσμο. Επί του παρόντος, ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (αναστολείς EGFR) της τυροσινικής κινάσης (ΤΚΙδ), συμπεριλαμβανομένων των gefitinib, erlotinib και afatinib, είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στην θεραπεία ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα με ειδικές

EGFR

μεταλλάξεις σε δείγματα όγκων τους, όπως εξόνιο 19 διαγραφή ή εξόνιο 21 L858R μετάλλαξη [21-23]. Παρά την επιτυχία του χρησιμοποιώντας EGFR-TKIs στη θεραπεία για τους ασθενείς της Ανατολικής Ασίας NSCLC, όλοι οι ασθενείς που ανταποκρίθηκαν τελικά εξελίχθηκε αποκτήσει αντοχή σε EGFR-TKIs [24-27]. Στην παρούσα μελέτη, η συμμετοχή της αυτοφαγία στην επίκτητη αντοχή gefitinib στο

EGFR

μετάλλαξη κυττάρων NSCLC διερευνήθηκε με τη χρήση υπολογιστή 9-β /β κυττάρων που μεταφέρουν

EGFR

εξόνιο 19 διαγραφή και την αποκτήσει gefitinib- ανθεκτικό PC-9 /GEF κύτταρα (PC-9 /gefB4 και PC-9 /gefE3).

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

χρησιμοποιηθεί

Τα χημικά ήταν gefitinib (ένα ευγενές δώρο από την AstraZeneca, Alderley Park, UK), διφωσφορική χλωροκίνη (CQ? Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA), 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ? Sigma), και Cremophor EL (Sigma). Τα πρωτογενή αντισώματα περιελάμβαναν σχετίζεται με τους μικροσωληνίσκους πρωτεΐνη 1 ελαφρά αλυσίδα 3 (LC3? Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA, # 2775), κασπάσης 3 (Cell Signaling Technology, # 9668), και PARP (Cell Signaling Technology, # 9542) , α-τουμπουλίνης (Cell Signaling Technology, # 2144) και β-ακτίνης αντίσωμα (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA). Τα δευτερεύοντα αντισώματα ήταν συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερεύουσα IgG (Chemicon, Temecula, CA, USA).

Ανάπτυξη gefitinib ανθεκτικών PC-9 κύτταρα

PC9 /gefB4 και PC9 /κυττάρων gefE3 ήταν αναπτύχθηκε στο εργαστήριο μας και δημοσιεύθηκαν προηγουμένως [26]. PC-9 /β κύτταρα, μία ανθρώπινη κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος πνεύμονα που φέρει μία διαγραφή στο εξώνιο 19 του

EGFR

[28], καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C σε RPMI (Roswell Park Memorial Institute) μέσου που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου, 4,5 g /L γλυκόζη, και 1% (ν /ν) πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. κ.β. κύτταρα PC-9 /αναπτύχθηκαν σε μέσα καλλιέργειας που περιέχουν κλιμάκωση συγκεντρώσεις gefitinib. Μετά από 6 μήνες περάσματα, τα κύτταρα που θα μπορούσαν να αναπτυχθούν σε μικρομοριακές συγκεντρώσεις του gefitinib κρατήθηκαν σε στεγνά πολυμέσων για 2 εβδομάδες και κλωνοποιήθηκαν. Δύο κλώνοι (PC-9 /gefB4, και PC-9 /gefE3) ελήφθησαν για μελλοντικές μελέτες.

Ανάπτυξη δοκιμασία αναστολής

Τα διαλύματα παρακαταθήκης του gefitinib και 3-ΜΑ παρασκευάστηκαν σε διμεθυλο σουλφοξείδιο ενώ CQ ήταν ddsH

2O. Δεκαπέντε εκατό κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 96 φρεατίων με επίπεδο πυθμένα πλάκες και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Για τη δημιουργία IC

50 του gefitinib, διάφορες συγκεντρώσεις του gefitinib συμπεριλήφθηκαν στο μέσο καλλιέργειας για 96 ώρες. Χρησιμοποιώντας δοκιμασία σουλφοροδαμίνης Β [29], η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με διαίρεση των τιμών απορρόφησης των επεξεργασμένων κυττάρων με εκείνη των μη κατεργασμένων κυττάρων. IC

50 υπολογίζεται από την καμπύλη συγκέντρωσης-απόκρισης ορίστηκε ως η συγκέντρωση του gefitinib το οποίο ελήφθη 50% αναστολή ανάπτυξης. Για τα αποτελέσματα της 3-ΜΑ και CQ, η αναστολή αύξησης μετρήθηκε μετά από 96 h επώαση του 3-ΜΑ (0.1, 0.3 ή 1 mM) ή CQ (5, 10 ή 15 μΜ). Για την επίδραση της CQ στη gefitinib-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, η αναστολή της ανάπτυξης προσδιορίστηκε μετά από 96 h επώαση του gefitinib συν CQ (5 ή 10 μΜ).

δοκιμασίας πρωτεϊνών

Western blot

για να αξιολογηθεί η εμπλοκή των autophagy του PC-9 /β και gefitinib-ανθεκτικά κύτταρα, κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με gefitinib συν 3-ΜΑ ή CQ για 24 ώρες. Τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και λύθηκαν σε δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως που περιέχει 20 mM Tris HCI, 150 mM NaCl, 1% (ν /ν) ΝΡ-40, 1% (w /v) δεοξυχολικό νάτριο, 1 mM αιθυλενο (EDTA), 0,1% (w /v) πολυακρυλαμιδίου δωδεκυλ θειικό νάτριο (SDS) και 0,01% (β /ο) αζίδιο του νατρίου (ρΗ 7.5) για 20 λεπτά σε πάγο. Τα προϊόντα λύσης στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 12.000 rpm για 10 λεπτά, και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης του υπερκειμένου προσδιορίστηκαν με BCA Protein Assay Kit. Δείγματα πρωτεΐνης (30 μg) έτρεξαν σε ηλεκτροφόρηση SDS-πολυακρυλαμιδίου 12-13.5% και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε ένα διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Bio-Rad, USA) στους 90 V για 120 λεπτά. Οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Μετά την αρχική επώαση αντίσωμα, η μεμβράνη πλύθηκε και επωάστηκε με ένα δευτερεύον αντίσωμα (1: 3000) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η ανοσοαντίδρασης οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Amersham ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Μετά από αυτή την ανίχνευση, τα συνδεδεμένα πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα απογυμνώθηκαν με επώαση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα απογύμνωσης (100 mM 2-μερκαπτοαιθανόλη, 2% SDS) στους 50 ° C για 45 λεπτά. Η μεμβράνη επανελέγχθηκε με ένα πρωτεύον αντίσωμα έναντι β-ακτίνης (1: 5000) /α-τουμπουλίνης (1: 5000).

φθορισμού και ανοσοφθορισμού δοκιμασία χρώσης

Autolysosomes χρώση: Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με gefitinib για 24 ώρες και στη συνέχεια το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 50 ηΜ Lysotracker Red (LysoTR, LysoTracker Red DND-99, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν σε PBS και σταθεροποιήθηκαν με 3,5% παραφορμαλδεΰδη (σε PBS) για 10 λεπτά, διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100 σε TBS για 30 λεπτά, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2% BSA σε TBS για 1 ώρα, σε θερμοκρασία δωματίου . Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα LC3 (1: 200) όλη τη νύκτα στους 4 ° C, ξεπλύθηκαν τρεις φορές με 0,01% Triton Χ-100 σε TBS, και επωάστηκαν για 30 λεπτά με ένα δεύτερο αντίσωμα (ΡΙΤΟ-συζευγμένο IgG κουνελιού σε αραίωση 1: 250 ) στους 37 ° C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα περαιτέρω χρωματίστηκαν με DAPI και παρατηρείται κάτω από ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο (Olympus FV1000, η ​​Olympus America Inc., το Κέντρο Valley, PA, USA).

ξενομοσχεύματος ποντικού μοντέλο

εξήντα τρία 6 -Εβδομάδα-old άνδρες Balb /c ποντίκια γυμνά, βάρους 25-30 g, χρησιμοποιήθηκαν. Το πρωτόκολλο ζώων εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση των Ταϊπέι Γενικού Νοσοκομείου Βετεράνων, Ταϊπέι, Ταϊβάν. (Αριθμός Άδειας: 2011-037) .Tumors προκλήθηκαν με έγχυση PC-9 /β και PC-9 /gefB4 κύτταρα (10

7 κύτταρα σε 100 μΙ PBS) υποδορίως στο πίσω μέρος των ποντικών. Για την απόκτηση της καμπύλης ανάπτυξης του όγκου, η καθημερινή μέτρηση του όγκου εκτελέστηκε. Κάθετη διάμετρο με μια ψηφιακή δαγκάνα και όγκοι υπολογίζονται (μήκος x πλάτος

2) /2. Όταν οι όγκοι αναπτύχθηκαν σε 200 mm

3, οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν σε 4 ομάδες από του στόματος αγωγή με φορέα (10% Cremophor EL /10% αιθανόλη /4% δεξτρόζη σε αναπτυξιακής δυσπλασίας του ισχίου

2O), gefitinib μόνο (50 mg /kg, με καθετήρα στομάχου), CQ μόνο (75 mg /kg, ip) και gefitinib συν CQ. Gefitinib παρασκευάστηκε σε 10% Cremophor EL /10% αιθανόλη /4% δεξτρόζη και CQ διαλύθηκε σε PBS.

Στατιστικά

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± S.E.M. Στατιστικές συγκρίσεις της βιωσιμότητας των κυττάρων έγιναν με τη χρήση Ανεξάρτητη t-test του SPSS. τιμή Ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Αυξημένα βασική αυτοφαγία στο PC-9 /GEF κύτταρα

Για να μελετήσουμε την αυτοφαγία και την αντίσταση των ναρκωτικών, το επίπεδο της LC3-II, ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της πρωτεΐνης της αυτοφαγία, μετρήθηκε σε PC-9 /κβ, PC-9 /gefB4 και PC-9 /gefE3 κύτταρα. δοκιμασία κηλίδος Western έδειξαν υψηλότερα βασικά επίπεδα της LC3-ΙΙ σε PC-9 /GEF κύτταρα (Β4 και Ε3), ενώ σε σύγκριση με το βάρος των κυττάρων PC-9 /(Εικ. 1Α). Συνεπής με δοκιμασία κηλίδος Western, η μελέτη κατέδειξε ανοσοχρώση περισσότερο LC3 ανοσοφθορισμού puncta σε PC-9 /gefB4 κυττάρων σε σύγκριση με το PC-9 /β κύτταρα (Σχ. 1Β). Επιπλέον, 3-ΜΑ και CQ χρησιμοποιήθηκαν για να χαρακτηρίσουν την αυτοφαγία. Βρήκαμε ότι η 3-MA μειώθηκε (Σχ. 1C), ενώ CQ αύξησε τα βασικά επίπεδα LC3-ΙΙ σε PC-9 /β, PC-9 /gefB4 κύτταρα και PC-9 /gefE3 μετά φαρμακευτικές αγωγές 24-h (Σχ. 1D ). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το PC-9 /GEF (Β4 και Ε3) κύτταρα έχουν υψηλότερο βασικό επίπεδο autophagy από PC-9 /β κύτταρα. Επιπλέον, ο προσδιορισμός κυτταρικής επιβίωσης χρησιμοποιήθηκε για να περιγραφεί λεπτομερώς ο ρόλος της αυτοφαγία χρησιμοποιώντας 3-ΜΑ και CQ. δοκιμασία SRB έδειξαν ότι η 3-ΜΑ και CQ εξάρτηση από τη συγκέντρωση μειωμένη επιβίωση των κυττάρων σε PC-9 /β, PC-9 /gefB4 και PC-9 κύτταρα /gefE3 (Σχ. 2), γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτοφαγία παίζει ρόλο προ-επιβίωσης σε πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

(Α) Αντιπροσωπευτικά δεδομένα κηλίδας Western έδειξε τα βασικά επίπεδα LC3-II στο PC-9 /κβ και PC-9 /GEF κύτταρα (Β4 και Ε3). (Β) ανοσοφθορισμού μελέτες χρώση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αντίσωμα LC3 να δείξει LC3 puncta στην PC-9 /β και PC-9 /gefB4 κύτταρα. (Γ και Δ): PC-9 /β, PC-9 κύτταρα /gefE3 PC-9 /gefB4 και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ, 10 mM) και χλωροκίνη (CQ, 1 και 10 μΜ) για 24 h. Η συνολική πρωτεΐνη του κατεργασμένων κυττάρων συλλέχθηκε? επίπεδα LC3-Ι και II αναλύθηκαν με δοκιμασία κηλίδος Western. Κάθε λωρίδα περιείχε 30 μg πρωτεΐνης για όλα τα πειράματα. Τα αποτελέσματα επαναλήφθηκαν σε ανεξάρτητα πειράματα.

Η

PC-9 /β, PC-9 /gefB4 και PC-9 κύτταρα /gefE3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με (Α) 3-ΜΑ (0,1-1 mM) και (Β) CQ (5-15 μΜ) για 96 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία SRB. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος ± S.E.M. (N = 3). *

P

& lt? 0,05 στατιστικά σημαντική στο 3-ΜΑ ή CQ-αγωγή ομάδες σε σύγκριση με τους μάρτυρες.

Η

Gefitinib που προκαλείται από αυτοφαγία

in vitro

Η

Η συμμετοχή των αυτοφαγία στην gefitinib επαγόμενη κυτταροτοξικότητα διερευνήθηκε. δοκιμασία κηλίδος Western κατέδειξε ότι το gefitinib εξάρτηση από τη συγκέντρωση αύξηση των επιπέδων LC3-ΙΙ σε PC-9 /β, PC-9 /gefB4 και PC-9 /κύτταρα gefE3 (Εικ. 3Α). μελέτες χρώση ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι 24 h επώασης της gefitinib (1 μΜ) αυξημένα puncta LC3 τόσο PC-9 /κβ και PC-9 /gefB4 κύτταρα (Εικ. 3Β). Περαιτέρω, συν-εντοπισμό των LC3 ανοσοφθορισμό και φθορισμό LysoTR παρατηρήθηκε σε gefitinib επεξεργασμένα PC-9 /WT και PC-9 /gefB4 κύτταρα (Σχ. 3Β), δεικνύοντας ότι το gefitinib είναι ικανό να επάγει αυτοφαγία και autolysosome σχηματισμού.

(Α) PC-9 /β, PC-9 /gefB4 και PC-9 /gefE3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με gefitinib (ηΜ) σε διάφορες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. Η συνολική πρωτεΐνη του κατεργασμένων κυττάρων συλλέχθηκε? επίπεδα LC3-Ι και II αναλύθηκαν με δοκιμασία κηλίδος Western. Κάθε λωρίδα περιείχε 30 μg πρωτεΐνης για όλα τα πειράματα. Τα αποτελέσματα επαναλήφθηκαν σε ανεξάρτητα πειράματα. (Β) PC-9 /β και PC-9 /gefB4 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με gefitinib (1 μΜ) για 24 ώρες. χρώση ανοσοφθορισμού και φθορίζουσα χρώση μελέτες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αντίσωμα LC3 και κόκκινο LysoTracker (LysoTR) αντίστοιχα για να δείξει puncta στα κύτταρα. Πράσινο, FITC-επισημασμένο LC3? κόκκινο, LysoTR? μπλε, ϋΑΡΙ-επισημασμένο πυρήνα.

Η

Λόγω του gefitinib-αυξημένα αυτοφαγία, η επίδραση των CQ επί gefitinib επαγόμενη κυτταροτοξικότητα διερευνήθηκε. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά φαρμακευτικές αγωγές, CQ αυξήθηκε περαιτέρω επίπεδα gefitinib επαγόμενη LC3-ΙΙ σε PC-9 /β και PC-9 /gefB4 κύτταρα (Σχ. 4Α). Μελέτες επιβίωση των κυττάρων έδειξαν ότι gefitinib (100 ηΜ) μόνο προκαλούσε βαθιά κυτταρικό θάνατο των PC-9 /β κύτταρα? Ωστόσο, CQ (5 και 10 μΜ) δεν ήταν σε θέση να ενισχύσει περαιτέρω gefitinib επαγόμενη κυτταροτοξικότητα (Εικ. 4Β). Ως προς PC-9 /gefB4 κύτταρα, gefitinib (100 nM) και μόνο που προκαλείται από μια μικρή κυτταρικό θάνατο? CQ ενίσχυσε σημαντικά την gefitinib επαγόμενη κυτταροτοξικότητα (Εικ. 4C), δηλαδή, CQ ξεπέρασε αντίσταση gefitinib σε PC-9 /gefB4 κύτταρα. Για περαιτέρω έλεγχο του ενίσχυση των CQ σε PC-9 /β κύτταρα, χαμηλή δόση gefitinib (3 nM) χρησιμοποιήθηκε. Ενώ το 96-h επώαση του gefitinib (3 ηΜ) προκάλεσε αμελητέα κυτταροτοξικότητα σε PC-9 /β κύτταρα, συν-επώαση με CQ (10 ηΜ) και gefitinib μειωθεί ριζικά η επιβίωση των κυττάρων (Εικ. 4D). Η CQ-επαγόμενη ενίσχυση της gefitinib επαγόμενη κυτταροτοξικότητα ερευνήθηκε περαιτέρω με μέτρηση της απόπτωσης που συνδέονται με πρωτεΐνες, που περιλαμβάνουν (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) επίπεδα κασπάσης-3 και πολυ. Βρήκαμε ότι η gefitinib (0,1 μΜ) επήγαγε απόπτωση δείχνοντας κασπάσης ενεργοποίησης 3 και διάσπαση PARP σε PC-9 /β κύτταρα? CQ (10 μΜ) με συνέπεια δεν αυξάνει gefitinib επαγόμενη απόπτωση σε PC-9 /β κυττάρων (Εικ. 5). Σε αντίθεση, όταν gefitinib ή CQ και μόνο δεν ήταν σε θέση να επάγει απόπτωση σε PC-9 /gefB4 και κυττάρων, CQ συν gefitinib σημαντικά επαγόμενη διάσπαση PC-9 /gefE3 κασπάσης 3 ενεργοποίηση και ΡΑΚΡ σε αμφότερα τα PC-9 /GEF κύτταρα (Σχ. 5 ).

(Α) PC-9 /β και PC-9 /gefB4 υποβλήθηκαν σε αγωγή με gefitinib (100 ηΜ) και χλωροκίνη (CQ, 5, 10 μΜ) για 24 ώρες. Η συνολική πρωτεΐνη του κατεργασμένων κυττάρων συλλέχθηκε. επίπεδα LC3-ΙΙ αναλύθηκαν με δοκιμασία κηλίδος Western. Κάθε λωρίδα περιείχε 30 μg πρωτεΐνης για όλα τα πειράματα. Τα αποτελέσματα επαναλήφθηκαν σε ανεξάρτητα πειράματα. (Β) PC-9 /β και (C) PC-9 /gefB4 κύτταρα καλλιεργήθηκαν με gefitinib (100 ηΜ) και CQ (5, 10 μΜ) για 96 ώρες. (D) PC-9 /β κύτταρα καλλιεργήθηκαν με gefitinib (3 ηΜ) και CQ (5, 10 μΜ) για 96 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία SRB. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος ± S.E.M. (N = 3). *

P

& lt? 0,05 στατιστικά σημαντική στο gefitinib ή ομάδες CQ-σε σύγκριση με τους ελέγχους? # P & lt? 0,05 στατιστικά σημαντική στο gefitinib συν ομάδες CQ-σε σύγκριση με το gefitinib μόνο ομάδες.

Η

PC-9 /κβ, PC-9 κύτταρα /gefE3 PC-9 /gefB4 και έλαβαν θεραπεία με gefitinib (100 nM ) και χλωροκίνη (CQ, 10 μΜ) για 24 ώρες. Η συνολική πρωτεΐνη του κατεργασμένων κυττάρων συλλέχθηκε. Procaspase 3, δραστική κασπάση 3, τα επίπεδα διάσπασης PARP αναλύθηκε με δοκιμασία κηλίδος Western. Κάθε λωρίδα περιείχε 30 μg πρωτεΐνης για όλα τα πειράματα. Τα αποτελέσματα επαναλήφθηκαν σε ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Gefitinib συν CQ ενίσχυσε δραστικότητα κατά του όγκου gefitinib επαγόμενη σε PC-9 /gefB4 ξενομοσχεύματα

Η CQ-επαγόμενη ενίσχυση της κατά του όγκου δραστικότητα του gefitinib διερευνήθηκε περαιτέρω με τη χρήση Balb /c γυμνά ποντίκια με PC-9 /β και PC-9 ξενομοσχεύματα όγκου /gefB4 ανθρώπου (Εικ. 6). CQ μόνη δεν μετέβαλλε την ανάπτυξη του όγκου του PC-9 /β και PC-9 ξενομοσχεύματα /gefB4 ανθρώπινου όγκου (Εικ. 6). Σε σύγκριση με την ανάπτυξη του όγκου υπό αγωγή με όχημα, gefitinib μονοθεραπεία ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου του wt ξενομοσχευμάτων PC-9 /? συγχορήγηση CQ δεν ήταν σε θέση να αυξήσει την επίδραση κατά του όγκου με gefitinib σε PC-9 /β ξενομοσχεύματα (Σχ. 6Α). Η πλήρης αναστολή της ανάπτυξης του όγκου του wt ξενομοσχευμάτων PC-9 /διήρκεσε μέχρι το τέλος του πειράματος (Σχ. 6Α). Σε αντίθεση, gefitinib μειωμένη ασήμαντα την ανάπτυξη του όγκου του PC-9 /gefB4 ξενομοσχεύματα συγκρίθηκε με εκείνη της PC-9 ξενομοσχεύματα (Σχήμα 6Β?. P = 0.07). PC-9 /gefB4 όγκοι αυξήθηκαν εκ νέου μετά από 15 ημέρες χορήγησης gefitinib (Εικ. 6Β). Παραδόξως, CQ συν gefitinib κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου των PC-9 /gefB4 ξενομοσχεύματα σε σύγκριση με gefitinib μόνο (Σχήμα 6Β?. P & lt? 0,05)

Balb /c γυμνούς ποντικούς που φέρουν PC-9 /κβ (Α. ) και PC-9 /gefB4 (Β) ξενομοσχεύματα υποβλήθηκαν σε αγωγή με οχήματα ως έλεγχος (○, η = 4 για PC-9 /β και PC-9 /gefB4, αντίστοιχα), gefitinib (50 mg /kg /ημέρα από καθετηριασμό , ◆? η = 5 για PC-9 /β και PC-9 /gefB4, αντίστοιχα), χλωροκίνη (CQ, 75 mg /kg, ip ▲? η = 4 για PC-9 /β και PC-9 /gefB4, αντίστοιχα), ή ένα συνδυασμό και των δύο (■? n = 5 για PC-9 /β και PC-9 /gefB4, αντίστοιχα) .Tumors αφέθηκαν να αναπτυχθούν έως 200 mm

3 πριν φαρμακευτικές αγωγές. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος ± S.E.M. (N = 4-5). ** Ρ & lt? 0.001, στατιστικά σημαντική σε gefitinib και gefitinib συν CQ ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα οχήματος σε ξενομοσχεύματα PC-9 /wt όγκου. * Ρ & lt? 0,05, στατιστικά σημαντική σε gefitinib συν CQ ομάδα σε σύγκριση με την ομάδα οχήματος? # P & lt? 0,05 στατιστικά σημαντική στο gefitinib συν CQ ομάδα σε σύγκριση με gefitinib και μόνο σε PC-9 /gefB4 ξενομοσχεύματα όγκου από Ανεξάρτητη t-test. (C) Αντιπροσωπευτικά δεδομένα δείχνουν 4 ποντίκια με PC-9 /κβ ξενομοσχεύματα και 4 ποντίκια με PC-9 /gefB4 ξενομοσχεύματα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα, CQ μόνο, gefitinib μόνο και gefitinib συν CQ.

Η

συζήτηση

Autophagy και ναρκωτικών αντίσταση

για την ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών για την επίκτητη ανθεκτικότητα που προκαλείται από το gefitinib, χρησιμοποιήσαμε PC-9 κύτταρα /gefE3 PC-9 /gefB4 και οι οποίες διαθέτουν IC

50 του gefitinib περίπου 200 φορές περισσότερο από αυτό της PC-9 /β κυττάρων [26]. δοκιμασία Western blot και μελέτη ανοσοφθορισμού κατέδειξαν υψηλότερα βασικά επίπεδα της αυτοφαγία τόσο PC-9 /gefB4 και PC-9 κύτταρα /gefE3. Χρησιμοποιώντας 3-MA και CQ να εμποδίσουν το σχηματισμό και τη λειτουργία του αυτοφαγία, προτείνεται ο μηχανισμός για την αυξημένη βασική αυτοφαγία σε gefitinib-ανθεκτικά κύτταρα. Για να αντιμετωπίσει τις δυσμενείς τάσεις, δηλαδή, η συνεχής έκθεση στο gefitinib, τα καρκινικά κύτταρα αυξήθηκε αυτοφαγία να διατηρήσουν τη μεταβολική ομοιόσταση και κατάλληλη ανάπτυξη των κυττάρων [4]. δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας αποκάλυψε ότι αυτοφαγία ήταν προ-επιβίωσης, επειδή 3-ΜΑ και CQ μειωμένη κυτταρική επιβίωση των PC-9 /κβ και PC-9 /GEF κύτταρα (Β4 και Ε3). Εκτός από την αντίσταση gefitinib, προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η τραστουζουμάμπη πυρίμαχα κύτταρα καρκίνου του μαστού και σισπλατίνη ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα πνεύμονα έχουν υψηλότερες autophagy σύγκριση με τα ευαίσθητα καρκινικά κύτταρα [19-20]. Ομοίως, η 3-ΜΑ και βαφιλομυκίνης Α1 (ένας αναστολέας του autolysosome ωρίμανσης) βρέθηκαν να μειώνουν κυτταρική βιωσιμότητα αυτών των ανθεκτικών κυττάρων [19-20]. Σε αντίθεση με την 200-πλάσια διαφορά στην IC

50 του gefitinib [26], 3-ΜΑ και επάγεται CQ κυτταρικό θάνατο σε παρόμοιο βαθμό σε PC-9 και PC-9 /GEF κύτταρα, υποδεικνύοντας PC-9 /gefB4 κύτταρα δεν ήταν ανθεκτικά στην 3-ΜΑ και CQ-επαγόμενης κυτταροτοξικότητας.

Ο ρόλος της αυτοφαγία σε gefitinib επαγόμενη κυτταροτοξικότητα

διάφορες θεραπείες συμπεριλαμβανομένης της θεραπείας ακτινοβολίας [20], χημειοθεραπείες [30] και θεραπείες στόχος [16, 31] έχουν αναφερθεί ότι επάγουν αυτοφαγία. Η μελέτη μας επιβεβαίωσε αυτήν την έννοια ότι το gefitinib αυξημένη αυτοφαγία σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο με τον PC-9 /κβ και PC-9 /GEF κύτταρα (Β4 και Ε3). Ο ρόλος της αυτοφαγία στο gefitinib επαγόμενη κυτταροτοξικότητα περαιτέρω οριοθετείται από συνδυασμό των CQ και gefitinib. Συνεπής με τα προηγούμενα μελέτη μας [26], gefitinib (100 ηΜ) μόνο επάγεται σημειώνονται κυτταροτοξικότητα σε PC-9 /β κύτταρα. Η κυτταροτοξική μηχανισμός του gefitinib είναι γνωστό ότι ανταγωνίζεται την θέση δέσμευσης ΑΤΡ στο PC-9 /β κυττάρων που φέρουν το

EGFR

εξόνιο 19 διαγραφή [32] και ως εκ τούτου επάγει κυτταροτοξικότητα μέσω απόπτωσης [26, 33-35]. Η ενίσχυση από CQ συν gefitinib σε PC-9 /wt κυττάρων παρατηρήθηκε μόνο όταν gefitinib μειώθηκε σε 3 ηΜ, υποδεικνύοντας ότι CQ μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να αυξήσει gefitinib επαγόμενη απόπτωση σε PC-9 /β κύτταρα. Μια κλινική δοκιμή της gefitinib και υδροξυχλωροκίνη υποβάλλεται σε ασθενείς με προχωρημένο NSCL ασθενείς [36], τα στοιχεία μας δείχνουν ότι όταν συν-διαχειρίζομαι με CQ και τα ανάλογά της, χαμηλότερες δόσεις gefitinib μπορεί να είναι αρκετό για τους ασθενείς που έχουν gefitinib ευαίσθητων καρκίνων του πνεύμονα με λιγότερα πλευρά επιδράσεις [37].

Autophagy και επίκτητη αντίσταση των ναρκωτικών

σε σύγκριση με το PC-9 /β κύτταρα, ένα 200-πλάσια διαφορά στην IC

50 gefitinib εντοπίστηκε σε PC-9 /κυττάρων gefB4 [26]. προηγούμενη μελέτη μας διαπίστωσε ότι οι αναστολείς ΜΕΚ (AZD6244 και CI1040) αντιστραφεί ριζικά τα κεκτημένα αντιστάσεις να gefitinib στο PC-9 κύτταρα /gefB4 [26]. Σταθερά, gefitinib (100 ηΜ) μόνο δεν ήταν σε θέση να επάγει σημαντική κυτταροτοξικότητα σε PC-9 /gefB4 (Εικ. 4C), PC-9 /gefE3 και PC-9 /gefE7 [26]. Ωστόσο, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι το gefitinib συν CQ που προκαλούνται σημαντικά κασπάσης 3 ενεργοποίηση και διάσπαση PARP και στις δύο PC 9-κύτταρα PC-9 /gefB4 και /gefE3, υποδεικνύοντας ότι CQ ευαισθητοποιημένα PC-9 /GEF κύτταρα (Β4 και Ε3) στο gefitinib . Σε σύγκριση με το 200-πλάσια διαφορά στην IC

50 gefitinib, gefitinib δεν έδειξε σημαντικές διαφορές στο LC3-II ανύψωση και θάνατο των κυττάρων σε PC-9 /β κυττάρων, PC-9 /gefB4 και PC-9 /κυττάρων gefE3 , αναφέροντας αυτοφαγία δεν μπορεί να είναι υπεύθυνη στην επίκτητη αντοχή gefitinib. Παρ ‘όλα αυτά,

in vitro

δεδομένα μας έδειξαν ότι CQ εξασθενημένος επιβίωση-9 PC /gefB4 κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι το gefitinib και CQ μπορεί να είναι αποτελεσματική για να ξεπεράσει την αντίσταση gefitinib. Επιπλέον, αρκετές

in vitro

μελέτες ανέφεραν ότι η αναστολή αυτοφαγία φαίνεται να ενισχύει την κυτταροτοξικότητα στα crizotinib-ανθεκτικά κύτταρα [18], τραστουζουμάμπη-ανθεκτικά κύτταρα [19] και η σισπλατίνη-ανθεκτικά κύτταρα [20]. Μέχρι στιγμής, περιορίζεται

in vivo

μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην θεραπευτική επίδραση των CQ επί επίκτητης αντοχής φαρμάκου [18]. Τα ευρήματά μας από

in vivo

μοντέλο ξενομοσχεύματος υποστηρίζει τις

in vitro

δεδομένων στην εν λόγω gefitinib με συνέπεια ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου /βάρος PC-9 και CQ δεν ενισχύουν την αντικαρκινική επίδραση του gefitinib. Όσον αφορά την ανάπτυξη του όγκου των PC-9 /gefB4 ξενομοσχεύματα, CQ συν gefitinib καθυστερεί σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου των PC-9 /gefB4 ξενομοσχεύματα σε σύγκριση με τη μονοθεραπεία gefitinib, υποδεικνύοντας ότι η CQ είναι ικανό να ευαισθητοποιήσει τους-9 PC /gefB4 κύτταρα στο gefitinib και τότε μειώνει την ανάπτυξη του όγκου του PC-9 /gefB4 ανθρώπινα ξενομοσχεύματα.

Εν κατακλείδι, EGFR-ΤΚΙδ, όπως gefitinib, είναι γνωστό για τη θεραπεία καρκίνων του πνεύμονα με σημαντική αποτελεσματικότητες. προηγούμενη μελέτη μας απασχολούνται συνδυασμό gefitinib και αναστολείς ERK και απέδειξε με επιτυχία σημαντικές θεραπευτικές δυνατότητες για την επίκτητη ανθεκτικότητα στο gefitinib [26]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι autophagy μπορεί να παίζει ένα κυτταροπροστατευτικό ρόλο στην ογκογένεση και επίκτητη αντίσταση. Επιπλέον, CQ φαίνεται να είναι θεραπευτικά χρήσιμη τόσο για gefitinib-ευαίσθητη και ανθεκτικών NSCLC, γεγονός που υποδηλώνει ότι CQ και τα ανάλογά της μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπεία του καρκίνου [38-39] για ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα με

EGFR

μετάλλαξη που αναπτύσσουν μια επίκτητη αντοχή μετά τη λήψη θεραπείας gefitinib.